DE3780000T2 - Peptidverbindungen. - Google Patents

Peptidverbindungen.

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DE3780000T2 DE8787309806T DE3780000T DE3780000T2 DE 3780000 T2 DE3780000 T2 DE 3780000T2 DE 8787309806 T DE8787309806 T DE 8787309806T DE 3780000 T DE3780000 T DE 3780000T DE 3780000 T2 DE3780000 T2 DE 3780000T2
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft neue Peptide mit stimulierender Wirkung im Hinblick auf die Hämopoese und ein Verfahren zu deren Herstellung.
  • Die Knochenmarkzellen leiten sich von pluripotenten Stammzellen ab, welche unter Bildung einer komplexen Population morphologisch unterschiedlicher Zellen, nämlich Megakaryozyten, Erythrozyten, Granulozyten und Lymphozyten, reifen. Lediglich etwa 10% der Stammzellen befinden sich zu einem beliebigen Zeitpunkt in Zellteilung. Bei einer anfänglichen Reifungsphase wird eine jede der proliferierenden Stammzellen auf eine spezielle, morphologisch eigene Form "übertragen", welche schließlich zu einer der vorstehenden vier reifen Zelltypen führt. Während die Zellen proliferieren, verlieren sie allmählich die Fähigkeit zu einer weiteren Proliferation, und die reifen Zellen, z.B. Erythrozyten oder Granulozyten, können sich nicht länger teilen. Demzufolge ist es, da die reifen Zellen kontinuierlich absterben, wesentlich, daß die proliferative Fähigkeit der weniger reifen Zellen und insbesondere der der Myelopoesis übertragenen Stammzellen beibehalten wird.
  • Wir haben nun eine Gruppe neuer Peptide gefunden, die in der Lage sind, die Proliferation von myelopoetischen Stammzellen zu stimulieren.
  • Erfindungsgemäß stellen wir daher Verbindungen der Formel (I)
  • bereit,
  • worin sämtliche Aminosäureeinheiten in der L-Konfiguration vorliegen,
  • A für
  • n und m unabhängig die ganzen Zahlen 1 oder 2 bedeuten; a und b unabhängig die ganzen Zahlen 0 oder 1 bedeuten; R, R' und R" unabhängig für eine Hydroxygruppe oder eine Aminogruppe stehen; und deren physiologisch annehmbare Salze, mit der Maßgabe, daß, wenn A und B ein Wasserstoffatom bzw. eine Hydroxygruppe bedeuten, b nicht die ganze Zahl 0 wiedergeben sollte, und unter Ausschluß der Verbindung (pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)&sub2;.
  • Die Verbindungen der Formel (I) sind somit symmetrische Dimere.
  • Stellt A einen Glutaminrest oder einen Prolinrest dar, ist es bevorzugt, daß a=b=1, n=2, m=1, R und R' Hydroxygruppen bedeuten und B für einen Lysinrest steht.
  • Bedeutet B einen Argininrest, ist es bevorzugt, daß A einen Pyroglutamatrest bedeutet, a=b=1, n=2, m=1 und R und R' Hydroxygruppen bedeuten.
  • Eine bevorzugte Gruppe der Verbindungen sind diejenigen, worin b=1, m=1 und R, R' und R" Hydroxygruppen bedeuten.
  • Besonders bevorzugte, erfindungsgemäße Verbindungen sind wie folgt (unter Verwendung der üblichen biochemischen Bezeichnung für die Aminosäuren und vom N-Ende her lesend):
  • (Cys - Lys)&sub2;
  • (Asp - Cys - Lys)&sub2;
  • (Glu - Asp - Cys - Lys)&sub2;
  • (pGlu - Glu - Asp - Cys)&sub2;
  • (pGlu - Asp - Cys - Lys)&sub2;
  • (pGlu - Asp - Asp - Cys - Lys)&sub2;
  • (pGlu - Glu - Asp - Cys - Arg)&sub2;
  • (Gln - Glu - Asp - Cys - Lys)&sub2;
  • (Pro - Glu - Asp - Cys - Lys)&sub2;
  • Eine weitere, besonders bevorzugte Verbindung in reiner, für die pharmazeutische Verwendung geeigneter Form, insbesondere in fester Form (z.B. lyophilisierter oder kristalliner Form), ist (pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)&sub2;, d.h. die Verbindung, worin a=b=1, m=1, n=2, R und R' Hydroxygruppen bedeuten, A einen Pyroglutamatrest wiedergibt und B einen Lysinrest wiedergibt.
  • Physiologisch annehmbare Salze der erfindungsgemäßen Peptide umfassen Säureadditionssalze, wie Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, etc., sowie Salze mit Basen, wie Alkalimetallsalze, z.B. Natrium- oder Kaliumsalze, Erdalkalimetallsalze, z.B. das Calciumsalz, oder Aminsalze.
  • Einige der Verbindungen der Formel (I) sind Dimere der in unserer europäischen Patentanmeldung 83307210.1 beschriebenen und beanspruchten Verbindungen. Diese letztgenannte Anmeldung betrifft eine kleine Gruppe hämoregulatorischer Peptide mit inhibierender Wirkung auf die Granulopoese.
  • Aufgrund geringer Mengen an verfügbarem, natürlichem Granulopoesefaktor wurde die Struktur der natürlichen Substanz niemals bestimmt. Sie wurde in kristalliner oder vollständig reiner Form niemals erhalten, und es ist nicht bekannt, ob dies unter Verwendung von Material aus lediglich natürlichen Quellen erreicht werden könnte. Man nahm an, daß sie die Struktur pyroGlu-Asp-Asp-Cys-LysOH besitzt, jedoch, wie in unserer vorstehenden europäischen Patentanmeldung berichtet, erwies sich die synthetische Verbindung mit dieser Struktur als inaktiv. Es wurde beobachtet, daß, wenn der natürliche Granulopoese-Inhibitionsfaktor oxidierenden Bedingungen ausgesetzt wird, eine Verbindung mit stimulierender Wirkung gebildet wurde. Dieses Produkt wurde jedoch niemals isoliert oder identifiziert. Im Gegensatz hierzu können die erfindungsgemäßen Peptide in reiner, für die pharmazeutische Verwendung geeigneter Form und in relativ großen Mengen erhalten werden.
  • Es wurde auch berichtet [Exp.Hematol. 12 7 (1984)], daß, wenn eines der Peptide in unserer vorstehenden europäischen Patentanmeldung, nämlich pyroGlu-Glu-Asp-Cys- LysOH, einem Gefrieren und Tauen unterzogen wird, sie stimulierende Aktivität zeigt, die durch Behandlung mit Mercaptoethanol rückgängig gemacht werden kann. Das stimulierende Produkt wurde jedoch niemals in reiner Form erhalten und seine Struktur wurde niemals bestimmt.
  • Die neuen Verbindungen in chemisch reiner Form wurden hinsichtlich ihrer in vitro- und in vivo-hämoregulatorischen Wirkungen untersucht. In vitro-Untersuchungen an myelopoetischen Stammzellen sowohl des Menschen als auch der Maus zeigten Zunahmen in der Agarkoloniebildung von bis zu 1500%. Die stimulierende Wirkung tritt im Konzentrationsbereich 10&supmin;¹³ bis 10&supmin;&sup5; M auf. Bei in vivo-Untersuchungen bei der Naus fanden wir, daß eine einzige Injektion die Anzahl der myelopoetischen Stammzellen um 50% innerhalb von 48 Stunden erhöhen kann und durch kontinuierliche Infusion wurde die Anzahl der Stammzellen innerhalb von 13 Tagen verdoppelt.
  • Die Erfindung besitzt spezielle Anwendbarkeit bei der Stimulierung der Myelopoese bei Patienten, die an verminderter myelopoetischer Aktivität einschließlich Knochenmarkschädigung, Agranulozytose und aplastischer Anämie leiden. Diese umfaßt die Behandlung von Patienten mit verminderter Knochenmarksfunktion aufgrund immunosuppressiver Behandlung zur Unterdrückung von Gewebereaktionen, z.B. bei der Knochenmarktransplantationschirurgie.
  • Die Verbindungen können auch verwendet werden, um eine raschere Regeneration des Knochenmarks nach cytostatischer Chemotherapie und Bestrahlungstherapie bei neoplastischen und viralen Erkrankungen zu fördern.
  • Zusätzlich können die neuen Verbindungen von speziellem Wert sein, wenn Patienten ernsthafte Infektionen aufgrund eines Mangels an Immunreaktion, bedingt durch Knochenmarkversagen, haben.
  • Eine andere klinische Anwendung ist die in Kombination mit den entsprechenden Monomeren oder verwandten Myelopoese-Inhibitoren, wie in unserer vorstehenden europäischen Patentbeschreibung offenbart, um alternierende Peaks hoher und niedriger Aktivität in den Knochenmarkzellen herbeizuführen und so den natürlichen Zirkadian- Rhythmus der Hämopoese zu erhöhen. Auf diese Weise kann die cytostatische Therapie in Perioden niedriger Knochenmarksaktivität verabreicht werden, wodurch das Risiko einer Knochenmarkschädigung vermindert wird, während die Regeneration durch den nachfolgenden Aktivitätspeak gefördert wird.
  • Es sei bemerkt, daß es keine stimulierende Wirkung auf die Zellen anderer Gewebe und insbesondere auf Tumorzellen, die nicht-myelopoetische Gewebe betreffen, gibt. Die neuen Verbindungen stimulieren somit das myelopoetische System selektiv.
  • Die Peptide sind ohne signifikante Toxizität. Weiterhin sind alle beobachteten hämatologischen Effekte reversibel, und es wurden keine makroskopischen Veränderungen in den anderen Organen der mit den Peptiden injizierten Tiere beobachtet.
  • Im allgemeinen können für die Ausübung einer stimulierenden Wirkung die erfindungsgemäßen Peptide an menschliche Patienten durch Injektion in dem Dosisbereich von 0,1 bis 10 mg, z.B. 1 bis 5 mg, je 70 kg Körpergewicht je Tag verabreicht werden. Werden sie durch Infusion oder ähnliche Techniken verabreicht, kann die Dosis im Bereich von 30 bis 300 mg/70 kg Körpergewicht, z.B. etwa 100 mg, über 6 Tage betragen. Im Prinzip ist es erwünscht, eine Peptidkonzentration von etwa 10&supmin;¹³M bis 10&supmin;&sup5;M in der extrazellularen Flüssigkeit des Patienten zu erzeugen.
  • Gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung werden pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt, die als Wirkstoff eine oder mehrere Verbindungen der Formel (I), wie vorstehend definiert, oder (pGlu-Glu-Asp- Cys-Lys)&sub2; oder physiologisch verträgliche Salze hiervon in Assozitation mit einem pharmazeutischen Träger oder Exzipienten enthalten. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können z.B. in einer für die orale, nasale, parenterale oder rektale Verabreichung geeigneten Form vorliegen.
  • Der vorliegend verwendete Ausdruck "pharmazeutisch" umfaßt veterinäre Anwendungen der Erfindung.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in üblichen pharmazeutischen Verabreichungsformen, wie Tabletten, überzogene Tabletten, Nasalsprays, Lösungen, Emulsionen, Pulver, Kapseln oder Formen für eine anhaltende Freigabe, vorliegen. Herkömmliche, pharmazeutische Exzipienten sowie übliche Herstellungsmethoden können zur Herstellung dieser Formen verwendet werden. Tabletten können z.B. durch Mischen des Wirkstoffs oder der Wirkstoffe mit bekannten Exzipienten, wie z.B. mit Verdünnungsmitteln, wie Calciumcarbonat, Calciumphosphat oder Lactose, Zerfallsmitteln, wie Getreidestärke oder Alginsäure, Bindemitteln, wie Stärke oder Gelatine, Gleitmitteln, wie Magnesiumstearat oder Talk, und/oder Mitteln zur Erzielung einer anhaltenden Freigabe, wie Carboxypolymethylen, Carboxymethylcellulose, Celluloseacetatphthalat oder Polyvinylacetat, gebildet werden.
  • Die Tabletten können gewünschtenfalls aus mehreren Schichten bestehen. Überzogene Tabletten können durch Überziehen von Kernen gebildet werden, die auf ähnliche Weise wie die Tabletten mit üblicherweise für Tablettenüberzüge verwendeten Mitteln, z.B. Polyvinylpyrrolidon oder Schellack, Gummiarabikum, Talk, Titandioxid oder Zucker, gebildet werden. Um eine anhaltende Freigabe zu erhalten oder Unverträglichkeiten zu vermeiden, kann der Kern ebenfalls aus mehreren Schichten bestehen. Der Tablettenüberzug kann auch aus mehreren Schichten bestehen, um eine anhaltende Freigabe zu erzielen, in welchem Fall die vorstehend für die Tabletten erwähnten Exzipienten verwendet werden können.
  • Organische spezifische Trägersysteme können auch verwendet werden.
  • Injektionslösungen können z.B. auf herkömmliche Weise, wie durch Zusatz von Konservierungsmitteln, wie p-Hydroxybenzoate, oder Stabilisierungsmitteln, wie EDTA, hergestellt werden. Die Lösungen werden dann in Injektionsfläschchen oder -ampullen gefüllt.
  • Nasalsprays können ähnlich in wäßriger Lösung formuliert werden und in Spraybehälter entweder mit einem Aerosoltreibmittel oder versehen mit Mitteln für die manuelle Komprimierung abgepackt werden. Einen oder mehrere aktive Bestandteile enthaltende Kapseln können gebildet werden, indem man beispielsweise die aktiven Bestandteile mit inerten Trägern, wie Lactose oder Sorbit, mischt und die Mischung in Gelatinekapseln füllt.
  • Geeignete Suppositorien können z.B. gebildet werden, indem man den aktiven Bestandteil oder aktive Bestandteilkombinationen mit herkömmlichen Trägern, die für diesen Zweck ins Auge gefaßt werden, wie natürliche Fette oder Polyethylenglykol oder Derivate hiervon, mischt.
  • Dosierungseinheiten, die die erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten, enthalten vorzugsweise 0,1 bis 10 mg, z.B. 1 bis 5 mg, des Peptids der Formel (I) oder eines Salzes hiervon.
  • Gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Stimulierung der Myelopoese geschaffen, das die Verabreichung einer wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wie vorstehend definiert, an einen Patienten umfaßt.
  • Eine weitere, wichtigere Verwendung der neuen Peptide jedoch beruht auf der Herstellung von Material für immunologische Assaytechniken. Das Peptid kann dann kovalent an einen geeigneten Träger mit hohem Molekulargewicht, wie Albumin, Polylysin oder Polyprolin, gebunden werden, um in Antikörper bildende Tiere (z.B. Kaninchen, Meerschweinchen oder Ziegen) injiziert zu werden.
  • In vitro-Immunisierungstechniken können auch verwendet werden. Antiseren mit hoher Spezifität werden durch Verwendung gut bekannter Absorptionstechniken unter Verwendung des Träger mit hohem Molekulargewicht erhalten. Durch Einführen von Radioaktivität (³H, ¹&sup4;C, ³&sup5;S) in das Peptidmolekül kann auf einfache Weise ein Radioimmuno- Assay konzipiert und für die Bestimmung des Peptids in verschiedenen biologischen Flüssigkeiten, wie Serum (Plasma), Urin und Cerebrospinalflüssigkeit, verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäßen Peptide können auf jede herkömmliche Weise synthetisiert werden. Im allgemeinen werden die vorhandenen reaktiven Seitenkettengruppen (Amino, Thiol und/oder Carboxyl) während der Kupplungsreaktionen der Gesamtsynthese geschützt und die Endstufe wird somit die Abspaltung der Schutzgruppen eines geschützten Derivats der Formel (I) oder von (pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)&sub2; sein. Normalerweise werden sämtliche -COOH-Gruppen, sämtliche -NH²-Gruppen und die -NH-Gruppe des Pyroglutamyl- oder Prolinrestes geschützt sein; solche geshützten Formen der Peptide bilden ein weiteres Merkmal der Erfindung und besitzen die allgemeine Formel (II)
  • eine Hydroxygruppe oder eine Carboxyl-blockierende Gruppe steht;
  • n und m unabhängig die ganzen Zahlen 1 oder 2 bedeuten;
  • a und b unabhängig die ganzen Zahlen 0 oder 1 bedeuten;
  • R¹, R², R&sup8; und R¹&sup0; Amino-, Hydroxy-, geschützte Amino- oder Carboxyl-Schutzgruppen sind;
  • R³, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6;, R&sup7; und R&sup8; für Wasserstoffatome oder Amin-Schutzgruppen stehen;
  • mit der Maßgabe, daß, wenn A ein Wasserstoffatom oder eine Amin-Schutzgruppe bedeutet und B für eine Hydroxygruppe oder eine Carboxyl blockierende Gruppe steht, b nicht die ganze Zahl Null bedeuten sollte.
  • Im allgemeinen können die geschützten Derivate der Formel (II) mit Hilfe von für die Peptidsynthese geeigneten Techniken hergestellt werden.
  • Eine mögliche Syntheseroute verwendet Cystin und unterzieht dieses einer Kupplung an die verbliebenen Aminosäurereste derart, daß zwei identische Ketten des Dimeren über die bereits im Cystin vorhandene Disulfidbindung angeordnet und verknüpft werden. Eine andere Strategie besteht darin, die entsprechende monomere Verbindung in S-geschützter Form unter Verwendung von S-geschütztem Cystein zu synthetisieren, die S-Schutzgruppe zu entfernen und die Dimerisierung durchzuführen. Es ist möglich, S-Schutzgruppen zu verwenden, die durch Oxidationsmittel unter Schaffung einer Disulfidbindung direkt bei der Stufe der Schutzgruppenabspaltung entfernt werden können. Somit können beispielsweise Tritylgruppen selektiv durch Jod, vorzugsweise in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, entfernt werden. Eine derartige Dimerisierung kann an dem C- und N-geschützten Monomeren, gefolgt von einer Entfernung der C- und N-Schutzgruppen durchgeführt werden oder sie kann bei der letzten Synthesestufe unter Verwendung eines Monomeren der Formel (III)
  • worin A, B, n, m, a, b, R und R' wie vorstehend definiert sind und R" für ein Wasserstoffatom oder eine Thiolschutzgruppe, die unter oxidierenden Bedingungen entfernbar ist, steht, durchgeführt werden.
  • Beim Aufbau der Peptidketten kann man im Prinzip entweder an dem C-Ende oder dem N-Ende beginnen, obgleich nur das am C-Ende beginnende Verfahren allgemein angewandt wird.
  • Somit kann man am C-Ende durch Umsetzung eines in geeigneter Weise geschützten Derivats von beispielsweise Lysin mit einem geeignet geschützten Derivat von Cystein oder Cystin beginnen. Das Lysinderivat wird eine freie α-Aminogruppe aufweisen, während die andere Reaktante entweder eine freie oder aktivierte Carboxylgruppe und eine geschützte Aminogruppe tragen wird. Nach der Kupplung kann das Zwischenprodukt gereinigt werden, z.B. durch Chromatographie, und hiernach selektiv N-geschützt werden, um eine Addition eines weiteren Aminosäurerestes zu ermöglichen. Dieses Verfahren wird fortgesetzt, bis die erforderliche Aminosäuresequenz fertiggestellt ist.
  • Carboxylsäure-aktivierende Substituenten, die beispielsweise verwendet werden können, umfassen symmetrische oder gemischte Anhydride oder aktivierte Ester, wie z.B. den p-Nitrophenylester, 2,4,5-Trichlorphenylester, N- Hydroxybenzotriazolester (OBt) oder N-Hydroxysuccinimidylester (OSu).
  • Die Kupplung der freien Amino- und Carboxylgruppen kann z.B. unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) durchgeführt werden. Ein weiteres Kupplungsmittel, das beispielsweise verwendet werden kann, ist N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin.
  • Im allgemeinen ist es zweckmäßig, die Kupplungsreaktionen bei niedrigen Temperaturen, z.B. -20ºC bis zu Raumtemperatur, zweckmäßig in einem geeigneten Lösungsmittelsystem, z.B. Tetrahydrofuran, Dioxan, Dimethylformamid, Methylenchlorid oder einer Mischung dieser Lösungsmittel, durchzuführen.
  • Es kann zweckmäßiger sein, die Synthese an einem in fester Phase vorliegenden Harzträger durchzuführen. Chlormethyliertes Polystyrol (vernetzt mit 1% Divinylbenzol) ist ein verwendbarer Trägertyp; in diesem Fall wird die Synthese am C-Ende, z.B. durch Kupplung von N-geschütztem Lysin an den Träger, beginnen.
  • Eine Anzahl geeigneter feste Phase-Techniken wird von Eric Atherton, Christopher J. Logan und Robert C. Sheppard, J.Chem.Soc. Perkin I, 538-46 (1981); James P. Tam, Foe S. Tjoeng und R.B. Merrifield, J.Am.Chem.Soc. 102 6117-27 (1980); James P.Tam, Richard D.Dimarchi und R.B. Merrifield, Int.J.Peptide Protein Res. 16 412-25 (1980); Manfred Mutter und Dieter Bellof, Helvetica Chimica Acta, 67 2009-16 (1984), beschrieben.
  • Eine breite Auswahl an Schutzgruppen für Aminosäuren ist bekannt und wird in E.Schröder und K.Lübke, The Peptides, Band 1 und 2, Academic Press, New York und London, 1965 und 1966; G.R.Pettit, Synthetic Peptides, Band 1-4, Van Nostrand, Reinhold, New York 1970, 1971, 1975 und 1976; Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Synthese von Peptiden, Band 15, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974; AminoAcids, Peptides and Proteins, Band 4-8, The Chemical Society, London 1972, 1974, 1975 und 1976; Peptides, Synthesis-physical data 1-6, Wolfgang Voelter, Eric Schmidt-Siegman, Georg Thieme Verlag Stuttgart, NY, 1983; The Peptides, Analysis, synthesis, biology 1-7, Ed.: Erhard Gross, Johannes Meienhofer, Academic Press, NY, San Francisco, London; Solid phase peptide synthesis, 2.Auflage, John M.Stewart, Janis D.Young, Pierce Chemical Company, verbeispielt.
  • So umfassen beispielsweise Amin-Schutzgruppen, die verwendet werden können, Schutzgruppen, wie Carbobenzoxy (nachfolgend als Z bezeichnet), t-Butoxycarbonyl (nachfolgend als Boc bezeichnet), 4-Methoxy-2,3,6-trimethyl- benzolsulfonyl (Mtr) und 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (nachfolgend auch als Fmoc bezeichnet). Es versteht sich, daß, wenn das Peptid von dem C-Ende her aufgebaut wird, eine Amin-Schutzgruppe an der α-Aminogruppe eines jeden neuen addierten Restes vorhanden sein wird und selektiv vor der nächsten Kupplungsstufe entfernt werden muß. Eine besonders geeignete Gruppe für einen derartigen vorübergehenden Aminschutz ist die Fmoc-Gruppe, die selektiv durch Behandlung mit Piperidin in einem organischen Lösungsmittel entfernt werden kann.
  • Beispiele für Carboxyl-Schutzgruppen, die verwendet werden können, umfassen leicht spaltbare Estergruppen, wie Benzyl (Bzl)-, p-Nitrobenzyl(ONb)-, Pentachlorphenyl (OPClP)-, Pentafluorphenyl (OPFP)- oder t-Butyl (OtBu)- Gruppen, sowie die Kupplungsgruppen an festen Trägern, beispielsweise an Polystyrol geknüpfte Methylgruppen.
  • Thiol-Schutzgruppen umfassen p-Methoxybenzyl (Mob), Trityl (Trt) und Acetamidomethyl (Acm).
  • Es versteht sich, daß ein breiter Bereich anderer derartiger Gruppen existiert, wie z.B. detailliert in den vorstehend genannten Literaturstellen angegeben, und die Verwendung all derartiger Gruppen in den vorstehend beschriebenen Verfahren fällt in den Bereich der vorliegenden Erfindung.
  • Ein breiter Bereich an Verfahren existiert zur Entfernung von Amin- und Carboxyl-Schutzgruppen. Diese müssen jedoch mit der angewandten Synthesestrategie vereinbar sein. Die Seitenketten-Schutzgruppen müssen gegenüber den zur Entfernung der temporären α-Amino-Schutzgruppe vor der nächsten Kupplungsstufe angewandten Bedingungen stabil sein.
  • Amin- Schutzgruppen, wie Boc, und Carboxyl-Schutzgruppen, wie tBu, können gleichzeitig durch saure Behandlung, beispielsweise mit Trifluoressigsäure, entfernt werden. Thiol-Schutzgruppen wie Trt, können selektiv unter Verwendung eines Oxidationsmittels, wie Jod, entfernt werden.
  • Die folgenden Beispiele dienen lediglich der Erläuterung.
  • Die Lösungsmittel wurden aus im Handel erhältlichem Material redestilliert und auf die folgende Weise aufbewahrt: Dimethylformamid (DMF) über Molekularsieb 4A, Methylenchlorid (DCM) über CaCl&sub2;, Triethylamin (TEA) über Na/Pb- Legierung (Baker) und Trifluoressigsäure (TFA) über Molekularsieb 4A. TLC-Systeme waren wie folgt:
  • S&sub1; = Silica/CHCl&sub3;-MeOH (98/2)
  • S&sub2; = Silica/CHCl&sub3;-MeOH (95/5)
  • S&sub3; = Silica RP 8/0. 1% TFA in 5% EtOH (wäßr.).
  • Die gereinigten Endprodukte wurden durch umgekehrte Phasen- Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) analysiert. Das HPLC-System stammte aus einem HP 1090M Chromatographen mit einem eingebauten automatischen Probensammler und einer HP 1040-Diodenanordnung (Hewlett- Packard, Waldbronn, BRD) und einer Supelcosil LC-18- Säule (250 x 4,6 mm, 5 u Teilchen). Proben wurden in 0,1% (Vol/Vol) TFA (wäßr.) gelöst und mit einem linearen Gradienten von 0 bis 30% Acetonitril in 0,1% TFA (wäßr.) eluiert. Die Fließgeschwindigkeit betrug 2 ml/min. Der Eluent wurde bei 214 nm mit einer Bandbreite von 4 nm überwacht. Das Lösungsmittel-Chromatogramm wurde elektronisch subtrahiert, und die Ergebnisse wurden ausgedrückt als Flächenprozent wiedergegeben. Aminosäureanalyse: Die Cystin enthaltenden Peptide wurden mit Perameisensäure oxidiert, um den säurelabilen Cystinrest in die säurestabile Cysteinsäure vor der Säurehydrolyse in 6M HCl bei 110ºC während 16 Stunden überzuführen. Die trockenen Hydrolysate wurden, wie von Heinrikson (Anal. Bioch. 136, 65-74, 1984) beschrieben, hiernach unter Verwendung von Phenylisothiocyanat derivatisiert und analysiert. Beispiel 1 (pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)&sub2; (Fmoc-Cys-Lys-(Nε -Boc)-0tBu)&sub2; (1)
  • 2 g (2,275 mMol) (Fmoc-Cys-OSu)&sub2;, 2,18 g (5,0 mMol) Lys- (Nε -Boc)-OtBu.HCl und 0,58 g (5 mMol) N-Ethylmorpholin wurden in 7,5 ml DMF gelöst und 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in 50 ml CHCl&sub3; gelöst und mit 3 x 12 ml 0,1N HCl und 3 x 12 ml 1M NaCl gewaschen. Die organische Schicht wurde durch ein Phasentrennfilterpapier (Whatman) filtriert und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft.
  • Das Rohprodukt (3,32 g) wurde aus 5 ml warmem MeOH umkristallisiert (15 Stunden), filtriert, mit MeOH und Ether gewaschen und an der Luft getrocknet. Ausbeute: 1,75 g (61%). Der weiße Feststoff zeigte einen größeren Fleck (UV&sub2;&sub5;&sub4;+ , Cl&sub2;/Dicarboxidin+, Ninhydrin+) bei der TLC (S&sub1;: Rf=0,667; S&sub2;: Rf=0,829). (Cys-Lys-(Nε-Boc)-OtBu)&sub2; (2)
  • 1,5 g (1,19 mMol) Verbindung (1) wurden in 10 ml 20% Piperidin in DMF gelöst und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die TLC (S&sub2;) zeigte, daß sämtliches Ausgangsmaterial verbraucht war und daß lediglich ein neues Produkt (UV&sub2;&sub5;&sub4;+, Cl&sub2;/Dicarboxidin+, Ninhydrin+) gebildet wurde. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck verdampft. Der Rückstand wurde in 20 ml Ether gelöst und mit 2 x 3 ml 0,1N HCl und 3 ml 1M NaHCO&sub3; gewaschen. Die organische Schicht wurde durch ein Phasentrennfilterpapiert filtriert und zur Trockene eingedampft. Ausbeute: 1,2 g. Die TLC zeigte lediglich eine Ninhydrinpositive Komponente (S&sub2;: Rf=0,216). (Fmoc-Asp-(β-OtBu)-Cys-Lys-(Nε-Boc)-OtBu)&sub2; (3)
  • Etwa 1,19 mMol Verbindung (2) und 1,32 g (2,6 mMol) Fmoc- Asp-(β-OtBu)-OSu wurden in 6 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die TLC (S&sub1;) zeigte, daß sämtliches Ninhydrin-positives Material verbraucht war und daß sich ein neues, überwiegendes UV&sub2;&sub5;&sub4;-positives Produkt gebildet hatte. Der Rückstand nach dem Verdampfen wurde in 30 ml EtOAc gelöst, mit 4 x 10 ml 1M NaCl gewaschen, filtriert und wie unter (1) beschrieben eingedampft. Das Rohprodukt wurde in Ether (2,5 ml) gelöst und als halbkristalliner Feststoff durch Zusatz von 4 ml n-Hexan (Kühlschrank 16 Stunden) ausgefällt. Das Lösungsmittel wurde dekantiert, das Produkt mit 5 ml n-Hexan gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute: 1 ,272 g (67%). Die TLC zeigte einen größeren Fleck (UV&sub2;&sub5;&sub4;+, Cl&sub2;/Dicarboxidin+, Ninhydrin+, S&sub1;: Rf=0,333, S&sub2;: Rf=0,658). (Asp-(β-OtBu)-Cys-Lys-(Nε-Boc)-OtBu)&sub2; (4)
  • 1,0 g (0,62 mMol) Verbindung (3) wurde in 5 ml 20% Piperidin in CH&sub2;Cl&sub2; gelöst und wie für (2) beschrieben behandelt. Ausbeute: 0,469 g (65%). Die TLC zeigte lediglich einen Ninhydrin-positiven Fleck (S&sub2;: Rf=0,22). (Fmoc-Glu-(γ-OtBu)-Asp-(β-OtBu)-Cys-Lys-(Nε-Boc)- OtBu)&sub2; (5)
  • 0,469 g (0,407 mMol) Verbindung (4) und 0,47 g (0,90 mMol) Fmoc-Glu-(γ-OtBu)-OSu wurden in 5 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst und 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Aufarbeitungsverfahren war wie für (3).
  • Ausbeute: 0,62 g (77%). Die TLC zeigte einen größeren Fleck (UV&sub2;&sub5;&sub4;+, Cl&sub2;/Dicarboxidin+, Ninhydrin+, S1&sub1;: Rf= 0,312, S&sub2;: Rf=O,536). (Glu-(γ-OtBu)-Asp-(β-OtBu)-Cys-Lys-(Nε-Boc)-OtBu)&sub2; (6)
  • 0,50 g (0,25 mMol) Verbindung (5) wurden in 2,5 ml 20% Piperidin in CH&sub2;Cl&sub2; gelöst und wie für (2) beschrieben behandelt.
  • Die TLC zeigte lediglich einen Ninhydrin-positiven Fleck (S&sub2;: Rf=0,154). (pGlu-Glu-(γ-OtBu)-Asp-(β-OtBu)-Cys-Lys-(Nε-Boc)- OtBu)&sub2; (7)
  • Etwa 0,25 mMol Verbindung (6) und 0,206 g (0,546 mMol) pGlu-OPClP wurden in 2,5 ml DMF gelöst und 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Aufarbeitungsverfahren war wie für (3).
  • Ausbeute: 0,259 g (59%). Die TLC zeigte nur einen Fleck UV&sub2;&sub5;&sub4;+, Ninhydrin+ und Cl&sub2;/Dicarboxidin+ (S&sub2;: Rf=O,117) und lediglich Spuren von Verunreinigungen. (pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)&sub2; (8)
  • 0,110 g (0,063 mMol) Verbindung (7) wurden in 5 ml 80% TFA (CH&sub2;Cl&sub2;) gelöst und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand in 4 ml H&sub2;O + 2 ml CHCl&sub3; gelöst. Die Wasserphase wurde mit 2 x 3 ml CHCl&sub3; gewaschen und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Das Rohprodukt (0,050 g) wurde auf einer Lobar (A) RP 8-Säule (Merck) unter Elution mit 0,1% TFA in 7,5% EtOH (wäßr.) gereinigt. Nach Lyophilisierung des Produkts wurde es erneut auf der gleichen Säule unter Elution mit 0,1% TFA in 5% EtOH (wäßrig) chromatographiert. Das Produkte wurde lyophilisiert. Ausbeute: 0,016 g. Das Ninhydrin+, Cl&sub2;/Dicarboxidin+ und UV&sub2;&sub5;&sub4;+-Produkt war gemäß TLC homogen (S&sub3;: Rf=0,436), und durch HPLC wurden lediglich Spuren von Verunreinigungen aufgezeigt.
  • Aminosäureanalyse: Asp (1,02), Glu (1,91), Cys (1,08), Lys (0,93). Beispiel 2 (Cys-Lys)&sub2; (9)
  • Verbindung (2) von Beispiel 1 wurde in TFA gelöst und 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck (30ºC) eingedampft und der wasserlösliche Teil des Rückstands auf einer Lobar- (B)RP8-Säule (Merck) unter Verwendung von 0,1% TFA (wäßr.) in 5% EtOH (wäßr.) als mobile Phase chromatographiert. Die Säule wurde bei UV&sub2;&sub2;&sub0; überwacht. Die das reine Produkt (TLC) enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert. Das Produkt war gemäß TLC (S&sub3;: Rf=O,57) homogen und zeigte eine positive Reaktion mit Ninhydrin und keine UV&sub2;&sub5;&sub4;-Absorption.
  • HPLC-Analyse: 93,5% rein, flächenbezogen; Aminosäureanalyse: Cys (1,01), Lys (0,99). Beispiel 3 (Asp-Cys-Lys)&sub2; (10)
  • Verbindung (4) wurde wie in Beispiel 2 beschrieben behandelt (2% EtOH in mobiler Phase) und lieferte Verbindung (10). Das Produkt war gemäß TLC homogen (S&sub3;: Rf=0,64) und zeigte eine positive Reaktion mit Ninhydrin und keine UV&sub2;&sub5;&sub4;-Absorption.
  • HPLC-Analyse: 97,9% rein, flächenbezogen; Aminosäureanalyse: Asp (0,99), Cys (1,03), Lys (0,98). Beispiel 4 (Glu-Asp-Cys-Lys)&sub2; (11)
  • Die wie in Beispiel 2 beschrieben behandelte Verbindung (6) lieferte Verbindung (11). Das Produkt war gemäß TLC homogen (S&sub3;: Rf=0,83) und zeigte eine positive Reaktion mit Ninhydrin und keine UV&sub2;&sub5;&sub4;-Absorption. HPLC-Analyse: 100% rein, flächenbezogen; Aminosäureanalyse: Asp (1,08), Cys (0,97), Glu (0,98), Lys (0,98). Beispiel 5 (pGlu-Glu-Asp-Cys)&sub2; (12)
  • Verbindung (12) wurde als Monomeres mit Hilfe der Festphasen-Peptidsynthesemethode unter kontinuierlichem Fluß unter Verwendung eines Biolynx 4170 automatisierten Peptidsynthesisers (LKB) und DMF als Lösungsmittel synthetisiert.
  • Reagentien: FMOC-Cys(Trt)-SASRIN-RESIN (Bachem); Fmoc-Asp-(β-OtBu)-OPFP; Fmoc-Glu-(γ-OtBu)-OPFP; pGlu- OPCLP; HOBT als Katalysator. Fmoc wurde nach jeder Kupplungsstufe mit 20% Piperidin in DMF entfernt. Die Disulfidbrücke und hierdurch das Dimere wurden durch Behandlung des vollständig geschützten Peptids an dem festen Träger mit 0,1M Jod (2-3 Äquiv.) in DMF während 15 Minuten geschaffen. Nach Waschen mit DMF wurde das Peptid von dem festen Träger abgetrennt und verbliebene Schutzgruppen wurden in einer Stufe durch Behandlung mit 50% TFA in CH&sub3;Cl während 40 Minuten entfernt. Das Harz wurde abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck (30ºC) zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in 0,1% TFA (wäßr.) gelöst und an einer Lobar (B)RP8 Säule unter Verwendung von 0,1% TFA (wäßr.) in 4% Propan- 2-ol (wäßr.) als mobile Phase chromatographiert. Die Säule wurde bei UV&sub2;&sub2;&sub0; überwacht. Reines Produkt (HPLC) enthaltende Fraktionen wurden gesammelt und lyophilisiert. Das Produkt zeigte mit Ninhydrin keine Reaktion und keine UV&sub2;&sub5;&sub4;-Absorption. HPLC-Analyse: 96,9% rein, flächenbezogen; Aminosäureanalyse: Asp (1,15), Cys (0,99), Glu (1,85). Beispiel 6 (pGlu-Glu-Cys-Lys)&sub2; (13)
  • Verbindung (13) wurde wie in Beispiel 5 beschrieben unter Verwendung der entsprechenden Aminosäurederivate synthetisiert und gereinigt. Nicht zuvor beschriebene Reagentien: FMOC-Lys-(Nε-BOC)-SASRIN-RESIN; FMOC-Cys-(S-Trt)- OPFP. Das Produkt war aufgrund von TLC homogen (S&sub3;: Rf= 0,49) und zeigte eine positiye Reaktion mit Ninhydrin und keine UV&sub2;&sub5;&sub4;-Absorption.
  • HPLC-Analyse: 100% rein, flächenbezogen; Aminosäureanalyse: Cys (1,01), Glu (1,98), Lys (1,01). Beispiel 7 (pGlu-Asp-Cys-Lys)&sub2; (14)
  • Verbindung (14) wurde wie in Beispiel 5 beschrieben unter Verwendung der entsprechenden Aminosäurederivate synthetisiert und gereinigt. Das Produkt war gemäß TLC homogen (S&sub3;: Rf=0,55) und zeigte eine positive Ninhydrinreaktion und keine UV&sub2;&sub5;&sub4;-Absorption.
  • HPLC-Analyse: 97,5% rein, flächenbezogen; Aminosäureanalyse: Asp (1,04), Cys (0,96), Glu (0,97), Lys (1,02). Beispiel 8 (pGlu-Asp-Glu-Cys-Lys)&sub2; (15)
  • Verbindung (15) wurde wie in Beispiel 5 beschrieben unter Verwendung der entsprechenden Aminosäurederivate synthetisiert und gereinigt. Das Produkt war gemäß TLC homogen (S&sub3;: Rf=0,42) und zeigte eine positive Ninhydrinreaktion und keine UV&sub2;&sub5;&sub4;-Absorption.
  • HPLC-Analyse: 99,3% rein, flächenbezogen; Aminosäureanalyse: Asp (1,03), Cys (0,96), Glu (2,09), Lys (0,94). Beispiel 9 (pGlu-Asp-Asp-Cys-Lys)&sub2; (16)
  • Verbindung (16) wurde wie in Beispiel 5 beschrieben unter Verwendung der entsprechenden Aminosätirederivate synthetisiert und gereinigt. Das Produkt war gemäß TLC homogen (S&sub3;: Rf=O,38) und zeigte eine positive Ninhydrinreaktion und keine UV&sub2;&sub5;&sub4;-Absorption. HPLC-Analyse: 100% rein, flächenbezogen; Aminosäureanalyse: Asp (2,06), Cys (0,98), Glu (0,98), Lys (0,98). Beispiel 10 (pGlu-Glu-Glu-Cys-Lys)&sub2; (17)
  • Verbindung (17) wurde wie in Beispiel 5 beschrieben unter Verwendung der entsprechenden Aminosäurederivate synthetisiert und gereinigt. Das Produkt war gemäß TLC homogen (S&sub3;: Rf=0,39) und zeigte eine positive Ninhydrinreaktion und keine UV&sub2;&sub5;&sub4;-Absorption. HPLC-Analyse: 99,9% rein, flächenbezogen; Aminosäureanalyse: Cys (0,95), Glu (2,90), Lys (1,15). Beispiel 11 (pGlu-Glu-Asn-Cys-Lys)&sub2; (18)
  • Verbindung (18) wurde wie in Beispiel 5 beschrieben unter Verwendung der entsprechenden Aminosäurederivate synthetisiert und gereinigt. Zuvor nicht beschriebene Reagentien: FMOC-Asn-OPFP. Das Produkt war gemäß TLC homogen (S&sub3;: Rf=0,42) und zeigte eine positive Ninhydrinreaktion und keine UV&sub2;&sub5;&sub4;-Absorption. HPLC-Analyse: 98,2% rein, flächenbezogen; Aminosäureanalyse: Asn (1,1), Cys (1,03), Glu (1,9), Lys (0,96). Beispiel 12 (pGlu-Gln-Asp-Cys-Lys)&sub2; (19)
  • Verbindung (19) wurde wie in Beispiel 5 beschrieben unter Verwendung der entsprechenden Aminosäurederivate synthetisiert und gereinigt. Zuvor nicht beschriebene Reagentien: FMOC-Gln-OPFP. Das Produkt war gemäß TLC homogen (S&sub3;: Rf=0,45) und zeigte eine positive Ninhydrinreaktion und keine UV&sub2;&sub5;&sub4;-Absorption. HPLC-Analyse: 98,3% rein, flächenbezogen; Aminosäureanalyse: Asp (1,09), Cys (1,06), Glx (1,89), Lys (0,96). Beispiel 13 (pGlu-Glu-Asp-Cys-Arg)&sub2; (20)
  • Verbindung (20) wurde wie in Beispiel 5 beschrieben unter Verwendung der entsprechenden Aminosäurederivate synthetisiert und gereinigt (5% Propan-2-ol in mobiler Phase). Die endgültige Abspaltung der Schutzgruppen wurde in 10% Thioanisol in TFA durchgeführt. Zuvor nicht beschriebene Reagentien: FMOC-Arg-(Mtr)-SASRIN-RESIN.
  • Das Produkt zeigte keine Reaktion mit Ninhydrin und keine UV&sub2;&sub5;&sub4;-Absorption. HPLC-Analyse: 99,4% rein, flächenbezogen; Aminosäureanalyse: Arg (0,92), Asp (1,12), Cys (1,00), Glu (1,96). Beispiel 14 (Gln-Glu-Asp-Cys-Lys)&sub2; (21)
  • Verbindung (21) wurde wie in Beispiel 5 beschrieben unter Verwendung der entsprechenden Aminosäurederivate synthetisiert und gereinigt. Das Produkt war gemäß TLC homogen (S&sub3;: Rf=0,57) und zeigte eine positive Ninhydrinreaktion und keine UV&sub2;&sub5;&sub4;-Absorption. HPLC-Analyse: 94,7% rein, flächenbezogen; Aminosäureanalyse Asp (1,00), Cys (1,01), Glx (2,02), Lys (0,96). Beispiel 15 (Pro-Glu-Asp-Cys-Lys)&sub2; (22)
  • Verbindung (22) wurde wie in Beispiel 5 beschrieben unter Verwendung der entsprechenden Aminosäurederivate synthetisiert und gereinigt. Das Produkt war gemäß TLC homogen (S&sub3;: Rf=0,57) und zeigte eine positive Ninhydrinreaktion und keine UV&sub2;&sub5;&sub4;-Absorption. HPLC-Analyse: 98,2% rein, flächenbezogen; Aminosäureanalyse: Asp (1,06), Cys (1,01), Glu (0,99), Lys (0,99), Pro (0,96).
  • 1. Verbindungen der Formel (I)
  • worin sämtliche Aminosäureeinheiten in der L-Konfiguration vorliegen,
  • A für
  • n und m unabhängig die ganzen Zahlen 1 oder 2 bedeuten; a und b unabhängig die ganzen Zahlen 0 oder 1 bedeuten; R, R' und R" unabhängig für eine Hydroxygruppe oder eine Aminogruppe stehen; und deren physiologisch annehmbare Salze, mit der Maßgabe, daß, wenn A und B ein Wasserstoffatom bzw. eine Hydroxygruppe bedeuten, b nicht die ganze Zahl 0 wiedergeben sollte, und unter Ausschluß der Verbindung (pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)&sub2;.
  • 2. Verbindungen, wie in Anspruch 1 beansprucht, worin b die ganze Zahl 1 bedeutet, m für die ganze Zahl 1 steht und R, R' und R" Hydroxygruppen darstellen.
  • 3. Verbindungen, wie in Anspruch 2 beansprucht, nämlich
  • (Cys - Lys)&sub2;
  • (Asp - Cys - Lys)&sub2;
  • (Glu - Asp - Cys - Lys)&sub2;
  • (pGlu - Glu -Asp -Cys)&sub2;
  • (pGlu - Asp - Cys - Lys)&sub2;
  • (pGlu - Asp - Asp - Cys - Lys)&sub2;
  • (pGlu - Glu - Asp - Cys - Arg)&sub2;
  • (Gln - Glu - Asp - Cys - Lys)&sub2;
  • (Pro - Glu - Asp -Cys - Lys)&sub2;
  • 4. Die Verbindung (pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)&sub2; in reiner Form, für die pharmazeutische Verwendung geeignet.
  • 5. Die Verbindung (pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)&sub2; in fester Form.
  • 6. Die Verbindung (pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)&sub2; in kristalliner Form.
  • 7. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung, wie in Anspruch 1 oder den Ansprüchen 4 bis 6 beansprucht, das die Stufe einer Schutzgruppenabspaltung von einer Verbindung der Formel (II)
  • eine Hydroxygruppe oder eine Carboxyl-blockierende Gruppe steht;
  • n und m unabhängig die ganzen Zahlen 1 oder 2 bedeuten; a und b unabhängig die ganzen Zahlen 0 oder 1 bedeuten; R¹, R², R&sup8; und R¹&sup0; Amino-, Hydroxy-, geschützte Amino- oder Carboxyl-Schutzgruppen sind;
  • R³, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6;, R&sup7; und R&sup9; für Wasserstoffatome oder Amin-Schutzgruppen stehen;
  • mit der Maßgabe, daß, wenn A ein Wasserstoffatom oder eine Amin-Schutzgruppe bedeutet und B für eine Hydroxygruppe oder eine Carboxyl blockierende Gruppe steht, b nicht die ganze Zahl Null bedeuten sollte.
  • 8. Verfahren, wie in Anspruch 7 beansprucht, worin die Schutzgruppenabspaltung durch saure Hydrolyse, Hydrogenolyse, Ammonolyse oder enzymatische Hydrolyse durchgeführt wird.
  • 9. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung, wie in Anspruch 1 beansprucht, das die Dimerisierung einer Verbindung der Formel (III)
  • umfaßt, worin A, B, n, m, a, b, R und R' wie vorstehend definiert sind und R" für ein Wasserstoffatom oder eine Thiolschutzgruppe, die unter oxidierenden Bedingungen entfernbar ist, steht.
  • 10. Verbindungen der Formel (II), wie in Anspruch 7 definiert.
  • 11. Pharmazeutische Zusammensetzungen, umfassend als wirksamen Bestandteil eine oder mehrere Verbindungen der Formel (I), wie in Anspruch 1 beansprucht, oder (pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys)&sub2; oder ein physiologisch verträgliches Salz hiervon in Assoziation mit einem pharmazeutischen Träger oder Exzipienten.
  • 12. Verwendung einer Verbindung, wie in Anspruch 1 beansprucht, oder (p-Glu-Glu-Asp-Cys-Lys)&sub2; zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Stimulierung des myelopoetischen Systems eines menschlichen oder tierischen Individuums.
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