DE3743903C2 - - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue immuno
enzymatische Methode zur Diagnose von Malaria im mensch
lichen Blut auf der Basis eines Verfahrens zur Bestimmung
und zur Messung von Anti-P.falciparum-Sporozoit-Antikörpern
in Proben von menschlichem Blut und/oder seinen Derivaten,
sowie die Verwendung einer entsprechenden diagnostischen
Ausrüstung zu diesem Zweck.
Malaria stellt eine der schwersten parasitären Erkrankungen
dar und befällt jedes Jahr Hunderte von Millionen von
Menschen, vor allem in den tropischen Regionen von Asien,
Afrika und Amerika, und verursacht dabei eine hohe
Kindersterblichkeit.
Die Ursache der Malaria ist ein Protozoon, das zum Genus
Plasmodium gehört, das auf den Menschen durch den Stich
der Anophelesmücke übertragen wird.
Unter den Hunderten von Species von Plasmodium, die
in der Natur existieren, sind nur vier für den Menschen
pathogen: Plasmodium ovale, Plasmodium maleriae, Plasmodi
um vivax und Plasmodium falciparum.
Dieses letztere stellt insbesondere die am meisten ver
breitete Species dar und verursacht die meiste Erkran
kungshäufigkeit und Mortalität im Zusammenhang mit Malaria.
Die Bestimmung von Antisporozoit-Antikörpern im Blut von
Individuen, die verdächtig sind, malariainfiziert zu
sein, stellt einen wesentlichen klinischen Parameter für
die Diagnose von Malaria dar und die Auswertung der
Wirksamkeit einer Antimalaria-Vakzine.
Im allgemeinen wird die Diagnose von Malariainfektionen
mittels der Blutprüfung unter dem Mikroskop oder durch
immunologische Methoden durchgeführt, die auf Messungen
der Fluoreszenz (IFA), der Radioaktivität (IRMA) und der
enzymatischen Aktivität (EIA) basieren.
Die mikroskopische Analyse des Blutes ist jedoch schwie
rig und für eine epidemiologische Untersuchung,
wo hunderte oder tausende Proben geprüft werden, ungeeignet.
Ein nicht sehr geeignetes Ergebnis liefern weiterhin die
immunologischen Methoden IRMA und IFA, die, abgesehen
davon, daß sie lange Arbeitszeiten benötigen, durch vie
le Schritte, die sie erfordern, kompliziert sind und
durch die Verwendung von Substanzen, die instabil und
für den Menschen schädlich sind.
Unter den EIA-immunoenzymatischen Methoden ist die übli
cherweise verwendete der ELISA (Enzyme-Linked-Immuno-
Sorbent-Assay)-Test, der umfaßt:
- (a) Fixieren durch Absorption oder durch kovalente chemische Bindung eines natürlichen oder synthetischen Antigens auf einen festen Träger;
- (b) Blockieren der restlichen Stellen auf dem Trä ger mit einem geeigneten Protein;
- (c) Inkubieren des an den Träger gebundenden Anti gens mit dem zu untersuchenden Serum, und
- (d) aufeinanderfolgende Zugabe eines Anti-Human- Immunoglobulin-Antikörpers, gebunden an ein Detektor enzym, und eines farblosen Substrats für das Enzym, das im Falle einer positiven Reaktion des Serums ein gefärb tes Produkt ergibt.
Dieser Test erfordert jedoch, obzwar er es ermöglicht,
einige der Nachteile der IRMA- und IFA-Methoden zu über
winden, durch Verwendung stabiler und nicht-radioaktiver
Substanzen, lange Arbeitszeiten (etwa 6 Stunden) und
die Verwendung von Reaktanten, wie Anti-Immunoglobolin-
Antikörper-Enzym, das nur mittels komplexer und kost
spieliger Methoden erhalten werden kann.
Somit existiert das Bedürfnis in der Fachwelt für eine
rasche, preiswerte und empfindliche diagnostische Methode,
die für Massenuntersuchungen in Gegenden, wo Malaria
endemisch ist, oder in Gegenden, wo eine genaue Kontrolle
durchgeführt werden muß, um infektiöse Herde zu lokali
sieren und diesen vorzubeugen, nützlich ist.
Diesem Bedürfnis wird gemäß der vorliegenden Erfindung
nach einer neuen immunoenzymatischen Methode nachgekom
men, welche mit einem synthetischen Antigen-Enzym-Konju
gat arbeitet, das fähig ist, mit den Antisporoit- bzw.
Antisporozoitantikörpern einen stabilen Antikörper-Antigen-
Enzym-Komplex zu bilden und mit den Proteinen, welche
gleichfalls den Antisporozoitantikörper dieses Komplexes
binden.
Daher ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung eine immu
noenzymatische Methode zum Nachweis und zur Messung von
Anti-P.falciparum-Sporozoit-Antikörpern in Proben von
menschlichem Blut und/oder seinen Abkömmlingen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung und Messung von Anti-P.
falcimparumsporozoit-Antikörpern in Proben von menschlichem
Blut und/oder seinen Derivaten durch enzymimmunologische
Bestimmung und Messung ist dadurch gekennzeichnet, daß
- (a) diese Proben mit einem synthetischen Antigen- Enzym-Konjugat, das mit den in der Probe vorhandenen Anti sporozoit-Antikörpern einen stabilen Antikörper-synthetisches Antigen-Enzym-Komplex zu bilden vermag, ohne die enzymatische Aktivität zu entaktivieren, inkubiert werden;
- (b) der Antikörper dieses Komplexes an ein auf einem festen Träger adsorbiertes oder daran chemisch gebundenes Protein, welches seinerseits in der Lage ist, menschliche Immunglobuline zu binden, gebunden wird, und schließlich
- (c) die enzymatische Aktivität des an die Proteine gebundenen Komplexes bestimmt wird durch Zugabe eines farblosen, enzymatischen Substrats, das im Falle eines positiven Ergebnisses ein gefärbtes Produkt zu liefern vermag.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung
dieses synthetischen Antigen-Detektorenzym-
Konjugats zur Herstellung einer Ausrüstung für die Diagnose
von Malaria.
Die Erfindung betrifft daher weiterhin die Verwendung einer
diagnostischen Ausrüstung, bestehend aus einem synthetischen
Antigen-Enzym-Konjugat, wie vorstehend unter a) definiert
und Proteinen, wie vorstehend unter b) für das erfindungsgemäße
Verfahren definiert, für die Bestimmung und
Messung von Anti-P.falciparum-Sporozoit-Antikörpern.
Die Erfindung wird aus der
Lektüre der folgenden Beschreibung und den Beispielen noch weiter
ersichtlich.
Aus der EP 2 09 643 A2 ist bereits ein synthetisches mit
den nachzuweisenden Antikörpern spezifisch reagierendes
Antigen bekannt. Das dort angegebene (besonders Spalte 10,
Beispiel 4) Nachweisverfahren ist jedoch anders
als das erfindungsgemäße Verfahren. Weiterhin sind aus
DE-PS 24 30 357 Proteine bekannt, die mit dem Fc-Teil von
Immunglobulinen eine Bindung eingehen, wenn deren Fab-Teil
an ein Antigen gebunden ist. Jedoch trägt dieses Protein
zusätzlich die markierende Gruppe, während gemäß vorliegender
Erfindung die Markierung mit dem Antigen verbunden ist und
das nachzuweisende Immunglobulin an einen festen Träger
adsorbiert oder gebunden ist.
Das synthetische Antigen-Enzym-Konjugat, das für die er
findungsgemäße Methode geeignet ist, wird durch eine
Polypeptid-Sequenz gebildet, die in der Lage ist, die
Antisporozoit-Antikörper zu erkennen und zu binden, und
durch ein Enzym gebildet.
Insbesondere ist gemäß der vorliegenden Erfindung das
Sequenz-Polypeptid bzw. die Polypeptid-Sequenz (Asn-Ala-
Asn-Pro) n , worin n einen Wert im Bereich von 3 bis 40,
vorzugsweise von 10 bis 20, hat, und exakt das polypepti
dische Segment des natürlichen Circumsporozoit-Proteins bzw. Circumsporozoitoize-Proteins
der Membran des Sporozoits von P.falciparum reprodu
ziert.
Die Anwesenheit von nur zwei endständigen, funktionalen,
chemischen Gruppen, NH2 und COOH, in diesem Polypeptid
macht es besonders geeignet für die Herstellung des Kon
jugats gemäß der vorliegenden Erfindung, da es ermöglicht,
daß eine stabile, kovalente Bindung zwischen dem Poly
peptid und dem Enzym gebildet wird, ohne der katalyti
schen Aktivität desselben Enzyms schädlich zu sein.
Dieses Polypeptid wird in reiner Form und in hoher Aus
beute nach dem Verfahren, wie es in der europäischen
Patentanmeldung 2 09 643 beschrieben ist, mittels Polyme
risation des HCl.H-Asn-Ala-Asn-Pro-OPCP-Polypeptids in
einem inerten, polaren Lösungsmittel in Anwesenheit ei
ner tertiären organischen Base hergestellt.
Enzyme, die für die Herstellung des Konjugats der vorlie
genden Erfindung nützlich sind, werden unter solchen aus
gewählt, die auf einem chromogenen Substrat zu wirken in
der Lage sind. Beispiele solcher Enzyme sind Peroxidase,
α-Galactosidase und alkalische Phosphatase. Vorzugsweise
wird Peroxidase verwendet.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das synthetische
Antigen-Enzym-Konjugat hergestellt mittels eines Verfah
rens, das umfaßt:
- 1. Oxidieren des gereinigten Enzyms in einer 0,1 M Lösung von NaHCO3, wie z. B. Natriummetaperjodat, bei Raumtemperatur (20-25°C) im Dunkeln während etwa 2 Stunden;
- 2. Zugabe des Polypeptids, gelöst in NaHCO3 (pH 9,2) zu dieser Lösung in einem Polypeptid/Enzym-Molver hältnis von etwa 40/1 und Halten der entstandenen Lösung durch Stehen bei Raumtemperatur im Dunkeln während etwa 16 Stunden;
- 3. Zugabe eines reduzierten Mittels zu dieser Lösung, wie z. B. NaBH4, und schließlich
- 4. Abtrennen des Polypeptid-Enzym-Konjugats.
Insbesondere wird gemäß einer praktischen Durchführungs
form der vorliegenden Erfindung ein Konjugat hergestellt,
worin das Polypeptid (Asn-Ala-Asn-Pro)17 und das Enzym
Peroxidase ist. Der Kojugationsgrad, d. h. das Molver
hältnis von Polypeptid zu Enzym in diesem Konjugat ist
0,9-0,92, nahe bei dem erwarteten Wert (1) für das reine
Konjugat.
Die spezifische Aktivität der Peroxidase, bestimmt durch
Spektrophotometrie bei 405 nm, wie von H. Galloti (1979),
J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 17, 1-7, berichtet, ist 75%
derjenigen des nichtkonjugierten Enzyms.
Gemäß der Methode der vorliegenden Erfindung wird dieses
Konjugat in einer Pufferlösung während etwa 20 bis
30 Minuten mit einer Probe von ganzem menschlichen Blut,
Humanserum oder Humanplasma inkubiert.
Das Reaktionsgemisch wird dann weitere 20 bis 30 Minuten
auf einem festen Träger inkubiert, auf dem das A-Protein
adsorbiert und/oder kovalent gebunden ist.
Von diesem Protein ist bekannt, daß es leicht die mensch
lichen Immunoglobuline, ausgenommen IgM und IgG3, bindet
und daher mit dem Antisporozoit-Antikörper, der an das
Antigen-Enzym-Konjugat gebunden ist, einen stabilen Kom
plex bildet.
Feste Träger, die für das erfindungsgemäße Verfahren ge
eignet sind, sind Polysaccharid-Materialien, wie Cellu
lose und Agarose, sowie Kunststoff-Materialien.
Am Ende der Reaktion und nach geeigneten Waschungen wird
zu den Mischungen eine Lösung gegeben, welche das chromo
gene, enzymatische Substrat und H2O2 enthält, und nach
2 bis 3 Minuten wird die Entwicklung von Farbe beobachtet.
In dem Fall, wo das gesamte Blut analysiert wird, wird
die Ausgangsmischung vor der Zugabe zu dem A-Protein zen
trifugiert oder filtriert, um suspendiertes Material zu
entfernen.
Der Threshold-Wert, d. h. die minimale Menge an positivem
Serum, welche eine Farbentwicklung, die mit dem bloßen
Auge sichtbar ist, erzeugt, war 0,1 µl bzw. 0,4 µl für
zwei untersuchte Seren.
Weiterhin wird keine Farbentwicklung beobachtet für die
Leerprobe, welche aus einem Gemisch, das das Konjugat
ohne die Probe von Blut und/oder seinen Derivaten ent
hält, besteht, für Serum und Plasma von gesunden Perso
nen, für nicht-malariainfiziertes Gesamtblut, entweder
haemolysiert oder nicht, und für γ-Globuline (Globuman-
Bern).
Dies zeigt eine vollständige Abwesenheit von Überschnei
dungen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren an.
Die Möglichkeit eines raschen Durchlaufs, etwa 60 Minu
ten, verglichen mit den 6 Stunden, die für den ELISA-
Test erforderlich sind, und die Verwendung einer kleinen
Anzahl von Reaktanten, d. h. nur das Antigen-Enzym und
die Proteine, stellen einen besonderen Vorteil des er
findungsgemäßen Verfahrens dar.
Ein beträchtlicher Vorteil dieser Methode besteht weiter
hin in der Möglichkeit, die Antisporozoit-Antikörper im
Gesamtblut bestimmen und messen zu können. Dies ist verur
sacht durch die hohe Stabilität des Konjugats der vorlie
genden Erfindung, verglichen mit den im Blut enthaltenen
Proteasen.
Weiterhin ist das erfindungsgemäße Verfahren absolut spe
zifisch, und tatsächlich bestätigten alle Proben, welche
nach dem IRMA-, IFA- und ELISA-Tests als positiv befun
den wurden, bei der Analyse mit der erfindungsgemäßen Methode
die Positivität.
Infolgedessen ist das erfindungsgemäße Verfahren beson
ders geeignet für eine epidemiologische Studie von Ma
laria und insbesondere für Massenprüfungen von Malaria
infektion in Gegenden, in denen sanitäre Einheiten und
Strukturen fehlen.
Die folgenden Ausführungsbeispiele sollen die Erfindung
näher erläutern.
Peroxidase-Enzym (Sigma) wurde gereinigt und gefrierge
trocknet, bevor es mit dem Peptid konjugiert wurde.
10 mg reines Enzym (E) wurde dann in 1 ml 0,1 M NaHCO3
gelöst und 2 h mit 1 ml 16 mM NaJO4 (Natriummetaper
jodat) bei Raumtemperatur (20-25°C) im Dunkeln oxidiert.
Am Ende dieses Zeitraums wurde zu dem Reaktionsgemisch
1 ml NaHCO3 (pH 9,2) enthaltend 70 mg (Asn-Ala-Asn-
Pro)17-Peptid (P) in einem Molverhältnis von Peptid/
Enzym gleich 40/1, zugesetzt.
Die so erhaltene Mischung wurde quantitativ in das Innere
einer Pasteur-Pipette überführt, die am Ende mit Glas
wolle verschlossen wurde, und dazu gab man 500 mg Sepha
dex(R) G-25 (Pharmacia Uppsala)-Pulver. Die Pipette wurde
dann weitere 16 h bei Raumtemperatur im Dunkeln stehen
gelassen.
Zu dem Reaktionsgemisch, das aus der Pipette eluiert wur
de, wurden 150 µl 0,1 mM NaOH, enthaltend 5 mg/ml NaBH4,
zugesetzt und 30 min später wurden dazu 450 µl der glei
chen Lösung gegeben.
Nach etwa 1 h wurde das Gemisch, welches das Enzym-
Peptid-Konjugat (E-P) und das nichtreagierte Peptid (P)
und Enzym (E) enthielt, mit 5 mM Natriumacetatpuffer,
pH 4,4, in einer Säule von Sephadex G-10, die zuvor mit
dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden war,
ins Gleichgewicht gebracht (äquilibriert). Das Gemisch wurde dann auf
eine Säule (0,9 × 10 cm) von Carboxymethylcellulose (CM-
Cellulose), äquilibriert mit 5 mM Natriumacetatpuffer,
pH 4,4, gegeben und mit 65 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,4,
eluiert und auf Sephadex G10-Säule, äquilibriert mit
destilliertem Wasser, entsalzt. Das die E-P-Verbindung
enthaltende Eluat und das nichtreagierte Enzym wurden
gefriergetrocknet.
Das nichtreagierte Peptid wurde zuvor mit dem eingeführ
ten Puffer eluiert und seine Unversehrtheit wurde durch
IR-Spektroskopie analysiert.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigten das gleiche Spektrum
für das eluierte Peptid und für das als Rohmaterial ver
wendete Peptid. So war es möglich, zu schließen, daß
keine Veränderungen in dem Peptid während der Konjuga
tionsreaktion aufgetreten waren und daß das an das Enzym
gebundene Peptid unbeschädigt war.
Der Grad der E-P-Konjugation, d. h. das Molverhältnis von
Peptid zu Enzym in dem Konjugat, wurde bestimmt, indem
die Erhöhung an Asn, Ala und Pro-Aminosäureresten in dem
E-P + freies E enthaltenden Gemisch im Verhältnis zu
dem Ausgangsenzym E berechnet wurde.
Die Analyse der Aminosäuren wurde nach saurer Hydrolyse
von E-P + E und mit 6 N HCl bei 100°C während 24 h in
nerhalb verschlossener Ampullen mittels eines automati
schen Beckman-Aminosäureanalysators durchgeführt.
In Anbetracht der Tatsache, daß die Aminosäurezusammen
setzung der beiden peroxidasischen Isoenzyme (B und C),
die in dem Ausgangs-E vorliegen, bekannt ist (L. M.
Shannan et. al., 1966, J. Biol. Chem. 241, 2 166), war es
möglich, für ein E : P-Molverhältnis von 1, entsprechend
dem reinen E-P-Konjugat, eine theoretische Erhöhung an
Asp, Ala und Pro von 63% bzw. 68% bzw. 100% zu berech
nen.
Für die obenerwähnten Aminosäuren wurden Zunahmen von
58%, 62% und 90% gefunden,was einem E : P-Molverhältnis
von 0,90-0,92 entspricht, annähernd äquivalent dem er
rechneten Verhältnis für das reine Konjugat.
Die spezifische Restaktivität des an das Peptid gebunde
nen Peroxidase-Enzyms, bestimmt durch Spektrophotometrie
bei 405 nm mit 1,7 nM ABTS [2,2′-Azino-di-(3-ethylbento
thiazolyl-sulfonsäure)] und 0,83 mM H2O2 in 50 mM Phos
phatpuffer, pH 6,0, (H. Gallati, J. Clin. Chem. Clin. Bio
chem. 17, 1-7, 1979), war etwa gleich 75% derjenigen des
Ausgangsenzyms.
Für diesen Test wurden 8 malariainfizierte Seren, das
heparinisierte Plasma von 4 gesunden Spendern, das Serum
von 3 gesunden Personen und eine Probe von malariainfi
ziertem Gesamtblut verwendet, indem in einem Volumenver
hältnis 1 : 1 das malariainfizierte Serum mit dem hämoly
sierten und nicht-hämolysierten Gesamtblut einer gesun
den Person vermischt wurde.
Zu 100 µl von 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, enthaltend
0,15 M NaCl, 0,05% Tween-20 (PBS-T) und 200 ng E-P-Kon
jugat, wurden zugesetzt: 1 bis 5 µl Blut oder Plasma
oder Serum von geunden Personen; oder 10 µl von PBS-T,
enthaltend 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,6; 3,2 µl Serum
von malariainfizierten Personen.
Die Lösungen wurden 15 bis 20 min bei Raumtemperatur ste
hengelassen.
Im Falle des Gesamtbluts wurde die Lösung zentrifugiert
oder filtriert, um suspendiertes Material zu entfernen.
Anschließend wurden die Lösungen in farblose und transpa
rente Mikropipettenspitzen aus Kunststoffmaterial gegeben,
die an ihrem Ende Glaswolle und darauf ein Bett, bestehend
aus einer Menge von etwa 6 µl A-Protein-Sepharose Cl-4B
(Pharmacia Uppsala), vorgewaschen mit PBS-T, enthielten.
Die Lösungen wurden durch Schwerkraft während einer Zeit
von 20 bis 30 min perkoliert, die Mikrosäulen wurden drei
mal mit jeweils 200 µl PBS-T und zweimal mit jeweils
200 µl PBS (der Puffer ohne Tween-20) gewaschen.
Anschließend wurden zu jeder Mikrosäule 200 µl einer Sub
stratlösung von 4-Chlor-1-naphtol (Biorad) und H2O2,
hergestellt durch Vermischen zum Zeitpunkt der Verwen
dung von 1 Vol-Teil 4-Chlor-1-naphtol (Biorad) (3 mg/ml
in kaltem Methanol) und 5 Vol-Teilen einer Lösung von
6 µl H2O2 von 30% (Vol/Vol), zugesetzt zu 10 ml PBS, ge
geben. Nach 2 bis 3 min wurde die Entwicklung einer tief
blauen Farbe für die positiven Proben beobachtet.
Der Threshold-Wert, d. h. die minimale Menge an positivem
Serum, welche eine leicht sichtbare blaue Bande bzw. Ring
erzeugte, ergab 0,1 µl-0,4 µl für zwei getestete posi
tive Seren.
Die Spezifität des Tests wurde an einem positiven, mala
riaverseuchten Serum (Entwicklung eines blauen Ringes
mit E-P) überprüft unter Verwendung von 200 ng freiem
Enzym ohne E-P in einem Test und in einem anderen Test
eines großen Überschusses (3 µg) (etwa 100fach) von frei
em P in Konkurrenz mit dem vorhandenen E-P-Konjugat
(200 ng). Am Ende der Reaktion wurde keine Farbentwick
lung beobachtet.
Keine Farbentwicklung wurde ferner in der Mikrosäule be
obachtet für die Leerprobe, gebildet durch das Reaktions
gemisch mit E-P ohne Zugabe von Blut, Serum oder Plasma;
für das Serum oder Plasma von gesunden Personen; für das
nicht-malariainfizierte Gesamtblut; oder für menschliche
γ-Globuline (Globuman-Bern), getestet in einer Menge,
äquivalent etwa 60 µl Serum. Dies zeigte eine vollstän
dige Abwesenheit von Störungen bzw. Überlagerungen in dem
Test unter Verwendung des E-P-Konjugats an.
Die Stabilität des an das Peptid gebundenen Per
oxidase-Enzyms (E-P) wurde auf spektrophotometrischem Wege be
stimmt, indem in Zeiträumen von 0 bis 2 h von einer Lö
sung von PBS-T (100 µl), enthaltend 200 ng E-P, zu der
Proben von Serum oder Plasma zugesetzt waren, Zeichnun
gen bzw. Skizzen gemacht wurden.
Nach 2 h zeigten die erhaltenen Ergebnisse eine unverän
derte Peroxidase-Aktivität.
Claims (12)
1. Verfahren zur Bestimmung und Messung von Anti-P.
falciparum-Sporozoit-Antikörpern in Proben von menschli
chem Blut und/oder seinen Derivaten durch enzymimmunologische
Bestimmung und Messung, dadurch gekennzeichnet, daß
- (a) diese Proben mit einem synthetischen Antigen- Enzym-Konjugat, das mit den in der Probe vorhandenen Anti sporozoit-Antikörpern einen stabilen Antikörper-synthetisches Antigen-Enzym-Komplex zu bilden vermag, ohne die enzymatische Aktivität zu entaktivieren, inkubiert werden;
- (b) der Antikörper dieses Komplexes an ein auf einem festen Träger adsorbiertes oder daran chemisch gebundenes Protein, welches seinerseits in der Lage ist, menschliche Immunglobuline zu binden, gebunden wird, und schließlich
- (c) die enzymatische Aktivität des an die Proteine gebundenen Komplexes bestimmt wird durch Zugabe eines farblosen, enzymatischen Substrats, das im Falle eines positiven Ergebnisses ein gefärbtes Produkt zu liefern vermag.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das synthetische Antigen die Polypeptid-Sequenz
(Asn-Ala-Asn-Pro) n ist, worin n einen Wert im Bereich von 3 bis 40 hat, und das
Protein ein A-Protein ist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
n im Bereich von 10 bis 20 liegt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe, beste
hend aus den Enzymen, die eine colorimetrische Reaktion
mit einem spezifischen Substrat zu liefern vermögen.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß das Enzym Peroxidase und/oder alkalische Phosphatase
ist.
6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das Konjugat hergestellt wird, indem in homogener
Phase in NaHCO₃ bei Raumtemperatur (20-25°C) im
Dunkeln das oxidierte Enzym mit einem
molaren Überschuß von (Asn-Ala-Asn-Pro) n -Polypeptid,
worin n die oben angegebene Bedeutung hat, umgesetzt
wird.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß das Molverhältnis des Polypeptids zu dem Enzym
in dem Konjugat gleich oder etwa gleich 0,92 ist.
8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß in Stufe (a) die Reaktion bei Raumtemperatur
(20-25°C) während einer Reaktionszeit im Bereich von
15 bis 20 Minuten durchgeführt wird.
9. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß der feste Träger ein Polysaccharid oder
Kunststoffmaterial ist.
10. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Polysaccharid-Träger Cellulose oder
Agarose sind.
11. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß in Stufe (b) die Reaktion bei Raumtemperatur
(20-25°C) während einer Reaktionszeit im Bereich von
20 bis 30 Minuten durchgeführt wird.
12. Verwendung einer diagnostischen Ausrüstung, bestehend
aus einem synthetischen Antigen-Enzym-Konjugat, definiert
im Anspruch 1(a), und Proteinen, definiert im Anspruch 1(b),
für die Bestimmung und die Messung von
Anti-P.falciparum-Sporozoit-Antikörpern.
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