DE3700911A1

DE3700911A1 - System zur zufuehrung eines arzneimittels

Info

Publication number: DE3700911A1
Application number: DE19873700911
Authority: DE
Inventors: Lisbeth Illum
Original assignee: COSMAS-DAMIAN Ltd; COSMAS DAMIAN Ltd
Current assignee: Kyowa Kirin Services Ltd
Priority date: 1986-01-17
Filing date: 1987-01-14
Publication date: 1987-07-23
Anticipated expiration: 2007-01-15
Also published as: DE3700911C2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Systeme zur Zuführung von Arzneimitteln und insbesondere auf ein System zur Unterstützung bei der Zuführung eines Arzneimittels oder eines radiodiagnostischen Mittels zu einer gewünschten Stelle innerhalb des tierischen oder des menschlichen Körpers.

Kolloidale Partikel in der Form von Mikrokugeln, Mikrokapseln, Emulsionen und Liposomen sind als Mittel vorgeschlagen worden, um darin enthaltene Arzneimittel an spezielle Stellen im Körper zu bringen. Dieses auch als "Arzneimittel-Einschießen" (drug targeting) bekannte Konzept ist in einer Anzahl von Publikationen, Artikeln und Büchern gut beschrieben worden (vgl. z. B. Davis, Illum, Tomlinson und McVie (Herausgeber), Microspheres an Drug Therapy, Elsevier, Amsterdam 1984). Es wurde gezeigt, daß kolloidale Träger in In-vitro-Tests gut wirken, aber ihre Brauchbarkeit in-vivo war enttäuschend. Es ist bekanntlich eine relativ einfache Angelegenheit, Teilchen der Lunge oder der Leber durch Ausnutzung physikalischer Faktoren, wie der Teilchengröße, zuzuführen. Jedoch bietet das schnelle und wirksame Einfangen injizierter Partikel durch die Zellen des reticuloendothelialen Systems das in der Leber besteht (nämlich die Kupffer-Zellen) ein wesentliches Hindernis zum Einschießen kolloidaler Partikel an andere Stellen. In einem kürzlich erschienen Artikel von Poste und Kirsch (Biotechnology 1: 869, 1984) und Posnansky und Juliano (Pharmacol. Revs. 36, 277, 1984) wurde genau dieser Punkt betont. In gleicher Weise schlossen viele Vortragende bei einem Treffen der New York Academy of Science, das im März 1984 abgehalten wurde (veröffentlicht in Proceedings of the New York Academy of Sciences, Vol. 446, Editors Tirrell, D. A., Donaruma, L. G. und Turek, A. B., 1985) und das sich mit Polymeren zur Zuführung von Arzneimitteln befaßte, daß es fast unmöglich wäre, kolloidale Partikel an andere Stellen als die Leber und die Milz zu bringen, wenn die Verabreichung auf intravenösem Weg erfolgt.

Die Erfindung schafft ein Verfahren, durch das es möglich ist, Partikel von dem reticuloendothelialen System, das in der Leber und in der Milz besteht, weg zu leiten durch die Verwendung von Oberflächen-Überzügen (und Oberflächen-Propf- Techniken).

Modellpartikel zur Verwendung beim Studium des Schicksals von Arzneimittelträgern werden oft verwendet, um die wissenschaftliche Basis des Arzneimittel-Einschießens zu bestimmen. Polystyrol-Mikrokugeln verschiedener Größen waren in dieser Beziehung besonders nützlich. Die kleinen Polystyrol-Partikel einer Größe von weniger als 100 nm werden intravenös verabreicht. Sie werden in der Leber schnell und wirksam aufgenommen, wie es durch die nicht-angreifende Technik der Gamma- Scintigraphy oder durch Studien an Tieren gemessen werden kann, denen Organe entnommen werden und wobei die in diesen Organen vorhandenen Beträge von Radioaktivität bestimmt werden. Typischerweise ist mehr als 90% der injizierten Dosis in einem Zeitraum von etwa drei Minuten in der Leber zu finden (Illum, Davis, Wilson, Frier, Hardy und Thomas, Intern. J. Pharmaceutics 12, 135 (1982)).

Durch die Erfindung soll ein System zur Zuführung eines Arzneimittels geschaffen werden, das das oben genannte Problem beseitigt und eine solche schnelle Aufnahme einer injizierten Dosis durch die Leber verhindert.

Gemäß der Erfindung wird ein System zur Zuführung eines Arzneimittels geschaffen, das eine Anzahl von Partikeln aufweist, die ein aktives Arzneimittel oder ein diagnostisches Mittel enthalten, wobei radioaktive Materialien eingeschlossen sind. Die Partikel können beispielsweise Emulsionen, Mikrokugeln, hergestellt aus natürlichen und synthetischen Polymeren, oder phospholipide Bläschen sein, wobei jedes Partikel mit einem Material überzogen ist, um ein Verbund-Partikel zu bilden, das die Aufnahme des Verbund-Partikels durch die Leber im wesentlichen verhindert.

Vorzugsweise sind die Partikel mit einem Material überzogen, das sie sowohl mit einem hydrophilen Überzug versieht, der die Aufnahme von Blutkomponenten minimiert, als auch mit einer sterischen Barriere einer Wechselwirkung von Partikeln und Zellen. Es wurde gefunden, daß die durch die Leber aufgenommene Menge stark vermindert wird. Ein bevorzugtes Material ist das als Tetronic 908 bekannte Block-Copolimerisat. Dies ist ein nicht-ionischer, grenzflächenaktiver Stoff (Tensid), der durch Polykondensation von Propylen-Oxid und Äthylen-Oxid auf Äthylen-Diamin erhalten wird. Dieses Überzugsmaterial gestattet es intravenös injizierten Partikeln, innerhalb des systemischen Kreislaufs zu bleiben mit minimaler Aufnahme in der Leber und der Milz. Ein anderes bevorzugtes Material ist das als Poloxamer 407 bekannte Block-Copolymerisat, eine Mischung von Poly-Oxy-Äthylen- und Poly-Oxy-Propylen-Bereichen. Auch dieses Material ist wirksam bei der Verhinderung der Aufnahme von überzogenen Partikeln in der Leber und der Milz, aber es führt sie fast ausschließlich zum Knochenmark. Andere Mitglieder der Poloxamer- und Poloxamin-Serien haben ähnliche Wirkungen, vorausgesetzt, daß das ausgewählte Material einen ausreichend großen hydrophilen Bereich zur sterischen Stabilisation hat. Typischerweise ist eine adsorbierte Schichtdicke von etwa 100 Ångström oder größer erforderlich. Dies stellt in der Poloxamer-Serie 60 oder mehr Äthylen-Oxid-Einheiten dar.

Der Mechanismus der Wirkung der Materialien liegt in der Struktur des Überzugsmittels, nämlich darin, daß es hydrophile und hydrophobe Bereiche hat. Der hydrophobe Bereich verankert den Überzug an der Partikeloberfläche und verhindert seine Verlagerung durch Plasma-Proteine. Ein geeignetes Molekulargewicht für diesen Bereich ist etwa 4000 bis 5000 Daltons. Die hydrophoben Bereiche schließen Poly-Oxy-Propylen-Gruppen wie auch andere hydrophobe Stoffe (Moeities) ein, die in Polymer-Ketten eingebaut werden können, beispielsweise veresterte Malein-Säure-Gruppen.

Der hydrophile Bereich sollte von genügender Größe und hydrophiler Natur sein, um zu verhindern (oder wenigstens zu minimieren), daß die Teilchen durch Blutkomponenten überzogen werden (d. h. das als Opsonisation bekannte Phänomen zu minimieren), sowie auch eine sterische Barriere zu schaffen, um eine sterische Sterilisation zu bieten, ein Phänomen, das im Bereich der Kolloid-Wissenschaft bekant ist (Napper, Polymeric Stabilisation of Colloidal Dispersions, Academic Press, London, 1983). Eine solche sterische Stabilisation dient dazu, eine Wechselwirkung der Partikel mit den makrophagen Zellen des reticuloendothelialen Systems zu verhindern. Ein geeignetes Molekulargewicht für den hydrophilen Bereich liegt in der Größenordnung von 5000 bis 22 000 Daltons.

Ausführungsbeispiele der Erfindung werden nun unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben.

Fig. 1 zeigt die Beziehung der Dicke der Überzugsschicht von Poloxameren und Poloxaminen auf Polystyrol- Partikeln;

Fig. 2 zeigt Scintigramme von Kaninchen drei Stunden nach der intravenösen Verabreichung von (a) unbeschichteten und (b) mit Poloxaminen 908 beschichteten Polystyrol-Partikeln (60 nm);

Fig. 3 zeigt Wirksamkeits-Zeit-Profile für die Aufnahme von unbeschichteten (⚫) und (908)-beschichteten (o) Partikeln in der Leber (n = 3, Mittelwert ± SEM);

Fig. 4 zeigt eine graphische Darstellung der Aufnahme von Fettemulsionen, die mit Iodin-123 markiert sind, in der Leber (Milz);

Fig. 5 zeigt eine graphische Darstellung der Blut-Entlastung oder -Freigabe von Fettemulsionen, die mit Iodin-123 markiert sind;

Fig. 6 zeigt Gamma-Kamera-Scintigramme von Kaninchen drei Stunden nach der intravenösen Verabreichung von Polystyrol- Mikrokugeln (60 nm), markiert mit ¹³¹I, und zwar (a) unbeschichtet und (b) mit Poloxamer 407 beschichtet;

Fig. 7 zeigt Aktivitätsprofile für den Leber-Milz-Bereich nach der Verabreichnung von ¹³¹I-markierten Polystyrol- Mikrokugeln, und zwar (○) unbeschichtet und (⚫) mit Poloxamer 407 beschichtet;

Fig. 8 zeigt eine graphische Darstellung der Aufnahme von mit Poloxamer 407 beschichteten Mikrokugeln im Hinterlauf des Kaninchen, gemessen durch Gamma-Scintigraphie;

Fig. 9 zeigt eine graphische Darstellung der Aktivität im zirkulierenden Blut nach der Verabreichung von ¹³¹I- markierten Polystyrol-Mikrokugeln, und zwar (⚫) unbeschichtet und (o) mit Poloxamer 407 beschichtet; und Fig. 10 zeigt die Verteilung von ¹³¹I-markierten Polystyrol- Mikrokugeln in verschiedenen Organen, acht Tage nach der intravenösen Verabreichung, und zwar schwarz angelegt - unbeschichtete Mikrokugeln und schraffiert - mit Poloxamer 407 beschichtete Mikrokugeln.

Praktische Studien, die in vitro mit Serum über die Aufnahme von beschichteten und unbeschichteten Partikeln durch peritoneale Makrophagen der Maus durchgeführt wurden, haben die Wichtigkeit der Verankerung des Polymer-Überzugs an der Oberfläche der Partikel und der Dicke der Oberflächenschicht demonstriert.

Dicke der Oberflächenschicht

Polystyrol-Partikel (Durchmesser 60 nm) wurden gegen destilliertes Wasser über drei Tage dialysiert. 4,0% Gewicht/Volumen- wässrige Lösungen der verschiedenen Poloxamere und Poloxamine wurden verwendet, um sicherzustellen, daß die endgültige Konzentration, nach der Verdünnung zur Durchführung von Photonen- Korrelations -Spectrophotometer-Messungen (PCS), oberhalb des Plateau-Niveaus der Adsorptions-Isotherme blieb, d. h. oberhalb der kritischen Micell-Konzentrationen. Aliquote von 2,5% Gewicht/Volumen Polystyrol-Partikeln und der Überzugslösung wurden gemischt und bei Raumtemperatur übernacht inkubiert. Die Partikel-Suspension wurde dann mit destilliertem Wasser ((20 µl) pro 10,0 ml) verdünnt und der pH-Wert mit HCl oder NaOH eingestellt. Die Dicken der Überzugsschichten wurden dann durch Messen der Partikelgrößen für unbeschichtete und beschichtete Partikel bei pH 2,1, 3,0, 5,5 und 9,5 Verwendung der Photonen-Korrelations-Spectroscopie bestimmt.

Studien der peritonealen Makrophagen der Maus

Polystyrol-Mikrokugeln mit 5,25 µm Durchmesser wurden für die Studien der peritonealen Makrophagen der Maus gewählt, weil die Aufnahme durch ein mikroskopisches Verfahren gemessen werden konnte und van-der-Waals'sche Anziehungskräfte ein dominanter Faktor sind, wodurch eine Unterscheidung der stabilisierenden Eigenschaften verschiedener Block-Copolymerisate gestattet wurde. Die Polystyrol-Mikrokugeln wurden gegen destilliertes Wasser drei Tage lang dialysiert, um jeden vorhandenen grenzflächenaktiven Stoff (Tensid) zu entfernen. Die Teilchen wurden dann für 24 Stunden mit den verschiedenen 2%-Gewicht/Volumen-Poloxamer- und Poloxamin-Lösungen inkubiert. Die Konzentrationen des Überzugsmittels wurden so gewählt, daß bei Gleichgewicht die Menge des adsorbierten Materials im Plateau-Bereich der jeweiligen Adsorptions- Isothermen lag.

Weibliche NMRI Mäuse (Bommice, Monholtgaard Breeding and Research Centre Ltd., Ry, Dänemark), die 20 bis 25 g wogen, wurden zur Lieferung der peritonealen Makrophagen verwendet. Die Tiere wurden durch Genickschlag bzw. Halsbruch getötet, die peritoneale Wand wurde freigelegt und 5 ml eines Versuchsmediums (lavage medium) (10 ml Gewebekultur-Medium E199-Konzentrat (10 ×) (Flow Laboratories), 10 ml Schweineserum, 2,5 ml Natriumkarbonat 7,5%, 0,1 ml Crystamycin, 6 mg Heparin, 77,4 ml steriles Wasser) wurde in die Bauchhöhle (peritoneal cavity) injiziert, gefolgt von einem kleineren Volumen steriler Luft. Das Bauchfell (peritoneal wall) wurde sanft massiert und das die Makrophagen enthaltende Medium wurde abgezogen und in einem sterilen Behälter gesammelt, der auf Eis gehalten wurde. Die Exsudate von mehreren Tieren wurde routinemäßig auf diese Weise gesammelt und gepoolt. Es wurde ein Zellzählung unter Verwendung eines Coulter-Zählers (Modell TAII) durchgeführt. Die Lebensfähigkeit der Makrophagen wurde durch den Ausschluß oder Abschluß von Trypan-Blau getestet und als in der Größenordnung von 95% liegend gefunden. Die Makrophagen- Suspension wurde auf eine endgültige Zellzählung von 1,0 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt, und 1,25 ml dieser Suspension wurden jeweils in eine 30-mm-Schale pipettiert, um 1,25 × 10⁶ Zellen pro Platte zu ergeben. Die Platten wurden bei 37°C in 95% Luft/5% CO₂ drei Stunden lang inkubiert, um ein Anhaften der Makrophagen am Boden der Platte zu gestatten. Nach dem Anhaften wurde das Medium von den Platten entfernt, die Zellen wurden einmal mit sterilem PBS gewaschen, 1,25 ml des Zellkultur- Mediums wurden zugesetzt (10 ml Medium E199-Konzentrat (10 X), 10 ml Schweineserum, 2,5 ml Natriumbikarbonat, 0,1 ml Crystamycin, 10 mg L-Glutamin und 79,9 ml steriles Wasser), und die Platten wurden bei 37°C 24 Stunden lang in 95% Luft/5% CO₂ inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Medium entfernt und die Zellen einmal mit sterilem PBS gewaschen. Dann wurden 2,5 ml Zellkultur-Medium, die die geeingnete Zahl von beschichteten oder unbeschichteten Mikrokugeln (5 Partikel pro Makrophage) enthielten, jeder Platte zugegeben, und die Platten wurden in Dreier-Gruppen 15, 30, 45, 60 und 90 Minuten lang inkubiert, wie es zuvor durch ein Zeit-Verlauf- Experiment bestimmt wurde. Bevor die Anzahl der durch die Makrophagen phagozytosierten Partikel gezählt wurde, wurde das Medium von den Platten entfernt, und die Zellen wurden zweimal mit sterilem PBS gewaschen und mit Methanol fünf Minuten lang fixiert. Dann wurden die Zellen mit Giemsa (1 : 10) fünfzehn Minuten lang gefärbt oder gebeizt und mit Wasser gewaschen. Die Platten wurden trocknen gelassen, und die Anzahl der Mikrokugeln, die durch die Makrophagen phagozytosiert wurden, wurde für insgesamt 100 Makrophagen gezählt, wobei ein Mikroskop mit einer Vergrößerung von 500x verwendet wurde. Die Experimente wurden dreifach ausgeführt, und die Ergebnisse wurden als Anzahl von Mikrokugeln ausgedrückt, die durch 100 Makrophagen phagozytosiert wurden.

Es wurden auch Experimente durchgeführt, um zu bestimmten, ob freies Poloxamer und Poloxamin irgendeinen Einfluß auf die Fähigkeit der Makrophagen hatte, Partikel zu phagozytosieren. 2% Gewicht/Gewicht wässrige Lösungen der Überzugsmittel wurden den Zellen zugesetzt und für eine Stunde inkubieren gelassen. Die Lösung wurde entfernt und die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Dann wurde das Zellkultur-Medium, das die unbeschichteten Mikrokugeln enthielt, zugesetzt und der Grad der Phagozytose wurde wie zuvor bestimmt. Es wurde gefunden, daß freies Polymer die Phagozytose nicht beeinflußt, und daher wurde in allen Experimenten das überschüssige Poloxamer oder Poloxamin vor der Inkubation mit Makrophagen nicht entfernt.

Die relative Aufnahme der verschiedenen beschichteten 5,25 µm Polystyrol-Partikel durch peritoneale Makrophagen der Maus und die Beziehungen zu der Dicke der Oberflächenschicht sind in Tabelle 1 und Fig. 1 dargestellt. Allgemein ist zu sehen, daß je größer die adsorbierte Schichtdicke ist, desto kleiner die relative phagozytische Aufnahme ist. Diese Ergebnisse stimmen überein mit den Vorhersagen der verschiedenen Theorien, die aufgestellt wurden, um das Phänomen der sterischen Stabilisation zu erklären. Daher scheint es, daß diese Theorien auch auf die Wechselwirkung von Partikeln mit phagozytischen Zellen angewendet werden können. Eine Extrapolation der fallenden Linie in Fig. 1 bis zu einer phagozytischen Aufnahme von Null läßt vorhersehen, daß eine adsorbierte Schichtdicke von etwa 230 Å nötig wäre, um die van der Waals'schen Anziehungskräfte zwischen den Makrophagen und den 5,25 µm-Partikeln zu überwinden.

Es ist schwer, genau vorauszusagen, welche Größe die Schicht haben müßte, die ausreichend wäre, um den gleichen Stabilisiereffekt für sehr viel kleinere Partikel (z. B. 60 nm) zu ergeben. Da jedoch die van der Waal'schen Anziehungskräfte (VA) direkt mit dem Partikelradius (a) zusammenhängen wobei A die Hamaker-Konstante des Verbunds und h die Planck'sche Konstante ist, ist zu erwarten, daß eine adsorbierte Schichtdicke von etwa 100 Å angemessen sein sollte, um nicht nur sterische Stabilisation von 60 nm Polystyrol-Partikeln in bezug auf ihre aggregaten Eigenschaften (prospensity) sondern auch in bezug auf ein Fehlen einer Wechselwirkung mit den Makrophagen zu liefern.

Ausführungsbeispiele der Erfindung werden im folgenden beschrieben:

Beispiel 1 DIE ORGANVERTEILUNG UND ZIRKULATIONSZEIT VON INTRAVENÖS INJIZIERTEN KOLLOIDALEN TRÄGERN, DIE STERISCH MIT EINEM BLOCK- COPOLYMERISAT-POLOXAMIN 908 stabilisiert sind. Verfahren

Polysytrol-Mikrokugeln im Größenbereich 50-60 nm wurden von Polyscience (Northhampton, UK), bezogen. Die Partikelgröße wurde durch Verwendung von Photonen-Correlations-Spektroskopie bestätigt. Die Partikel wurden oberflächenmarkiert mit Iodin-131, wie zuvor beschrieben durch L. ILLUM, S. S. DAVIS, C. G. WILSON, N. W. THOMAS, M. FRIER und J. G. HARDY, Int. J. Pharm. 12, 135; 1982.

Poloxamin 908 (durchschnittliches Molekulargewicht MW 25 000: durchschnittlich 80% Gewichtsprozente von Polyoxyäthylen- Ketten) wurde von Ugine Kuhlman Ltd., Bolton, UK, bezogen und verwendet wie erhalten.

Eine Inkubation der Polystyrol-Mikrokugeln mit einer 2%- Gewicht/Volumen-Lösung von Poloxamin 908 ergab eine adsorbierte Schichtdicke von 134 Å.

In vivo-Experimente wurden mit Gruppen von weißen Neuseelandkaninchen (3 kg) (n = 3) durchgeführt. Intravenöse Injektionen wurden gegeben durch die Ohr-Randader (Polystyrol-Mikrokugeln 0,3 ml, 4 × 10¹³ Partikel, 3 MBq Aktivität; Emulsion 1,0 ml, 10¹² Partikel, 3-4MBq). Unbeschichtete Polystyrol-Partikel wurden in destilliertem Wasser verabreicht (Kontrolle). Mit Poloxamin 908 überzogene Partikel (25 Stunden-Gleichgewicht) wurden entweder als Inkubationsmischung (enthaltend 1% Poloxamin 908) oder in destilliertem Wasser verabreicht, nachdem das überschüssige Poloxamin in einer Sepharose-CL48-Säule abgetrennt worden war.

Einer Gruppe der Kaninchen wurden ähnliche, wiederholte Injektionen von mit Poloxamin beschichteten Polystyrol-Mikrokugeln an fünf aufeinanderfolgenden Tagen gegeben. Einer anderen Gruppe wurde eine Dosis von unbeschichteten Polystyrol-Mikrokugeln eine Stunde nach der Injektion des beschichteten Materials gegeben.

Blutproben wurden in geeigneten Abständen entnommen und die Aktivität in einem Gamma-Zähler gezählt. Die Verteilung der markierten Partikel in der Leber wurde durch Gamma-Scintigraphie verfolgt. Die dynamischen und statischen Bilder der Leberverteilung wurden analysiert durch Schaffung von Interessenbereichen und mit der Ganzkörperaktivität verglichen. Die Aktivität in der Leber, die mit dem Blut in Verbindung gebracht wurde (associated with the blood pool), wurde mit 25% der Zirkulations- Aktivität bestimmt, bei aufeinanderfolgender Verabreichung von Tc-99m-markiertem Pyrophosphat (rote Blutzellen Markierung) und Iodin-131-markierten Mikrokugeln (um ein Leberbild zu schaffen). Dieser Wert stimmte gut überein mit Daten für Mensch und Ratte (siehe z. B. H. P. J. BENNETT und C. McMARTIN, J. Endocr. 82, 33, 1979; J. W. TRIPLETT, T. L. HAYDEN, L. K. McWHORTER, S. R. GAUTAM, E. E. KIM und D. W. A. BOURNE, J. Pharm. Sci. 74, 1007 , 1985).

Acht Tage nach der Verabreichung wurden die Kaninchen geopfert und die Organe entfernt. Die gesamte Aktivität in ausgewählten Bereichen und im Kadaver wurde bestimmt, wobei ein Gamma-Zähler für großvolumige Proben verwendet wurde.

ERGEBNISSE

Unbeschichtete Polystyrol-Partikel wurden durch die Leber und die Milz schnell (t_50% = 55 s) und wirksam (90% der Dosis in zwei Minuten) aufgenommen, während Partikel, die mit Poloxaminen 908 beschichtet waren, im wesentlichen in dem Gefäßbereich blieben und eine geringe Aufnahme im Leber/Milz- Bereich zeigten (Fig. 2 und 3). Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt für beschichtete Partikel, die von überschüssigem Poloxamin 908 durch Verwendung einer Sepharose-CL4B-Säule abgetrennt wurden. Wiederholte Injektionen von Polystyrol-Partikeln, beschichtet mit Poloxamin 908 (eine Injektion pro Tag über fünf Tage), ergaben eine gewisse Aufnahme in der Leber und der Milz, aber dies stand weitgehend in Zusammenhang mit dem Blutgehalt in der Leber. Die Injektion von unbeschichteten Polystyrol-Partikeln in Kaninchen, eine Stunde nachdem sie eine Dosis von Polystyrol-Partikeln beschichtet mit Poloxamin 908 erhalten hatten, demonstrierte, daß die unbeschichteten Partikel hauptsächlich durch die Leber/Milz wie bei unbehandelten Tieren entfernt wurden, wodurch demonstriert wurde, daß das Poloxamin 908 keine Beeinträchtigung des retoculoendothelialen Systems verursacht hatte.

Die Messung der zirkulierenden Beträge von Aktivität zeigte, daß die beschichteten Partikel weitgehend im Gefäßbereich blieben, während in Übereinstimmung mit der scintigraphischen Information wenig von dem unbeschichteten Material im Blut gefunden werden konnte (Tabelle 2). Es ist interessant, daß ein beträchtlicher Anteil der verabreichten Dosis nicht für die Meßergebnisse der Beträge im Blut verantwortlich war. Scintigraphische Messungen und Bestimmungen der Beträge in den Organen (siehe unten) ergaben keine bedeutenden Aufnahmebereiche (einschließlich des Knochenmarks). Infolgedessen ist anzunehmen, daß die beschichteten Partikel lose mit den endothelialen Zellen verbunden sein könnten, die die Gefäße auskleiden.

Die Beträge der Aktivität in den verschiedenen Organen acht Tage nach der Injektion sind in Tabelle 3 gezeigt. Die unbeschichteten Teilchen wurden weitgehend in der Leber und in der Milz gefunden, während die beschichteten Teilchen sich weitgehend in dem Kadaver fanden.

Beispiel INTRAVENÖSE VERABREICHUNG VON STRAHLENMARKIERTEN EMULSIONEN UND DIE ROLLE DES BLOCK-COPOLYMERISATS - POLOXAMIN 908

Diese Studie wurde durchgeführt, um zu untersuchen, ob das Beschichtungsmittel Poloxamin 908 ein biologisch abbaubares Emulsionssystem allein innerhalb der systemischen Zirkulation aufrechterhalten würde. Emulsionen, die mit dem Gammastrahlung emittierenden Mittel Iodin-123 markiert waren, wurden intravenös in Kaninchen injiziert. Zwei Kontroll-Zusammensetzungen bestanden aus Emulsionen, die unter Verwendung von Ei-Lezithin als Emulgator mit und ohne zugesetzte Gelatine hergestellt wurden. Das Kontrollsystem mit Gelatine wurde gewählt, da es allgemein bekannt ist, daß Gelatine eine wichtige Rolle bei der Zuführung kolloidaler Partikel zu der Leber haben kann; dieser Prozß wird zustandegebracht durch die Adsorption der Blutkomponente Fibronectin. Die Rolle der verschiedenen Emulgatoren bei der Steuerung der Leberaufnahme als auch die Freigabe aus dem Kreislauf wurde bestimmt durch scintigraphische Abbildung der Lebern von Kaninchen über einen geeignten Zeitraum und durch die Entnahme von Blutproben und durch Zählung der Gamma-Aktivität. Das für diese Arbeit gewählte Öl war Sojabohnenöl, die gleiche Komponente wie sie in dem kommerziellen Produkt Intralipid verwendet wird. Da dieses Material durch den Körper metabolisiert wird, wurden scintigraphische Blut-Daten über einen Zeitraum von sechs Stunden gesammelt.

VERFAHREN TIERE

Weibliche Neuseelandkaninchen mit einem ungefähren Gewicht von 2 kg wurden als Experimetiermodelle gewählt; drei Kaninchen wurden pro Gruppe gewählt.

Preparation der Emulsionen

Sojabohnenöl wurde unter Verwendung des Verfahrens von Lubran und Pearson (J. Clin. Pathol. 11 (165) (1985) vorbereitet.

Iodin-123 wurde als das geeignetste Radionuklid vom Standpunkt seiner guten Abbildungseigenschaften, seiner kurzen Halbwertszeit und seiner größeren Sicherheit gegenüber Iodin-131 gewählt. Das Iodin-123 wurde von Harwell bezogen. Die Iodinations- Methode beinhaltet die kovalente Bindung geringer Mengen des markierten Iodins über die Doppelbindung der ungesättigten Komponenten des vegetabilischen Öls. Diese Methode wurde früher erfolgreich benutzt und ähnliche iodinisierte Fettsäuren wurden im radio-diagnostischen Bereich als Myocard-Abbilde- Mittel verwendet. Das strahlenmarkierte Öl wurde mit einem weiteren Anteil von unmarkiertem Öl gemischt, und das gemischte Öl wurden dann emulgiert entweder mit Poloxamin 908 (BASF) (2%) oder mit Ei-Lezithin (Lipoid) (1,2%). Ein Ultraschall- Versuchssystem (zehn Minuten Beschallung) (Dawe Soniprobe) wurde für diese Prozedur verwendet. Vorhergehende Untersuchungen unter Verwendung von unmarkierten Ölen hatten gezeigt, daß die durch dieses Verfahren erzeugte Partikelgröße in der Größenordnung von 150 nm lag. Diese Größe ist sehr ähnlich zu derjenigen, die in kommerziellen Fettemulsionsprodukten (z. B. Intralipid) gefunden wird. Eine Probe der durch Ei- Lezithin stabilisierten Emulsion wurde mit Gelatine (2%) gemischt gemäß dem durch Tonaki eta al (Exp. Mol. Pat. 25 ₁₈₉ (1976) beschriebenen Verfahren.

Bei diesem Verfahren wird etwas Gelatine auf die Oberfläche der Partikel adsorbiert oder kann eine gemischte emulgierende Schicht mit dem Ei-Lezithin bilden und verstärkt dadurch die Aufnahme der Emulsion in der Leber, vermittelt durch adsorbiertes Fibronectin.

Experimentelles Vorgehen

Die Versuchstiere wurden injiziert über die Ohrrandader unter Verwendung von 1-ml-Proben der markierten Emulsionen. Der Ölgehalt in den Emulsionen war 10%. Den Emulsionen folgte eine 2-ml-Spülung mit normaler Salzlösung. Nach der Injektion wurden die Tiere auf die Maßfläche eine Gamma-Kamera gesetzt (Maxikamera, GEC, 40 cm Blickfeld), die auf die Photoenergie- Spitzen des Iodin-123 abgestimmt war. Dynamische Bilder wurden alle 15 Sekunden über einen Zeitraum von 15 Minuten aufgenommen. Blutproben wurden von dem entgegengesetzten Ohr entnommen (0,5 ml). Die scintigraphischen Bilder wurden mittels Computer gespeichert und dann analysiert, um Informationen über die Aufnahme in der Leber (Milz) zu erhalten. Die Blutproben wurden verdünnt und in einem konventionellen Gamma-Zähler gezählt. Es ist hier zu bemerken, daß bei der Gamma-Scintigraphie es schwierig ist, zwischen der Leber und der Milz in einem lebenden Tier zu unterscheiden, aber in bezug auf Fig. 10 und andere Ergebnisse steht fest, daß die Leber das dominante Organ ist.

Ergebnisse

Die Aufnahme der markierten Emulsionen im Bereich der Leber und der Milz ist in Fig. 4 gezeigt. Es ist zu sehen, daß das Ausmaß der Aufnahme von der Natur der Emulgators abhängt, der zur Zubereitung der Emulsionen verwendet wurde. Diejenigen Emulsionen, die unter Verwendung von Poloxamin 908 hergestellt wurden, lieferten eine Aufnahme in der Leber von etwa 25%, während diejenigen, die mit Ei-Lezithin emulgiert wurden, einen Wert hatten, der näher bei 40% lag. Die Emulsionen, die die zugesetzte Gelatine enthielten, hatten einen Aufnahmewert von etwa 60%. Diese Leber-Aufnahmewerte für Ei-Lezithin und P-908-Systeme spiegeln sich wieder in dem Diagramm des Blutgehalts gegen die Zeit, indem die durch die Ei-Lezithin stabilisierten Emulsionen eine viel schnellere Befreiung von dem Blut als die durch Poloxamin 908 stabilisierten Emulsionen demonstrieren (Fig. 5). Der schnelle Abfall im Blutgehalt, der für die beiden Kurven ersichtlich ist, kann der Anwesenheit von geringen Mengen freien Iodins zugeschrieben werden, das verabreicht wurde. Eine kinetische Analyse der Daten (Erste Ordnung) zeigt, daß die durch Ei-Lezithin stabilisierte Emulsion aus dem Blut mit einer Halbwertzeit von etwa fünf Minuten freigegeben wird, während die durch P-908 stabilisierte Emulsion mit einer Halbwertzeit von etwa 208 Minuten freigegeben wird. Das Plateau-Niveau der Aktivität, das für die Ei-Lezithin- Daten ersichtlich ist, spiegelt die Tatsache wider, daß die Emulsion metabolisiert wird, und iodinisierte Spaltprodukte (breakdown products) werden in das Plasma freigegeben, um ein mehr oder weniger stetiges Niveau zu ergeben.

Die in der Leber des Tieres festgestellte Aktivität nach der Verabreichung eines kolloidalen Systems enthält Aktivität, die aus der Aufnahme der Partikel durch die Leberzellen (höchstwahrscheinlich die Kupffer-Zellen) resultiert als auch aus der normalen Zirkulationsaktivität als Teil des Blutgehalts. Dieser Wert liegt bei etwa 25%. Somit kann für die mit Poloxamin 908 durchgeführten Studien geschlossen werden, daß die gesamte im Leber-(Milz)-Bereich festgestellte Aktivität auf der zirkulierenden, nicht entfernten oder nicht abgeschiedenen Emulsion beruht und daß das Block-Copolymerisat eine Aufnahme der Emulsion in der Leber effektiv verhindert.

Die Ergebnisse dieser Studie bestätigen die Untersuchungen, die unter Verwendung von Polystyrol-Mikrokugeln durchgeführt wurden, die mit dem Block-Copolymerisat Poloxamin 908 überzogen waren, nämlich daß solche Systeme von der Leber weitgehend ignoriert werden und über eine ausgedehnte Zeitdauer in Zirkulation gehalten werden. Solche Systeme könnten große Vorteile für die Zuführung pharmakologischer Mittel haben, wenn die Aufnahme von Emulsionspartikeln durch die Leber vermieden werden soll, um nachteilige Reaktionen und Nebenwirkungen zu vermeiden.

Beispiel 3 EINSCHIESSEN VON KOLLOIDALEN PARTIKELN IN DAS KNOCHENMARK UNTER VERWENDUNG DES BLOCK-COPOLYMERISATS-POLOXAMER 407

Zweck dieser Studie war, das Ausmaß und die Anordnung der Verteilung von mit Poloxamer 407 beschichteten Polystyrol- Partikeln in dem intakten Versuchstier zu bestimmen. Dieses Material hat die Fähigkeit, kolloidale Partikel modellhaft ausgewählt dem Knochenmark zuzuführen.

Verfahren

Polystyrol-Partikel (60 nm Durchmesser) wurden von Polyscience (Northampton, UK) gekauft. Die Partikelgröße wurde unter Verwendung der Photonen-Korrelations-Spektroskopie (PCS) bestätigt. Die Partikel wurden wie oben beschrieben an der Oberfläche mit Iodin 131 markiert. Poloxamer 407 (durchschnittliches Molekulargewicht MW 10 500) wurde von Ugine Kuhlman Ltd., Bolton, UK, geliefert und verwendet wie empfangen.

Die markierten Polystyrolpartikel wurden 24 Stunden lang mit einer 2% Gewicht/Volumen-Lösung von Poloxamer 407 inkubiert, was eine Oberflächenbeschichtungsschicht von 123 Å Dicke, gemessen durch PCS, ergab.

Gruppen von weißen Neuseeland-Kaninchen (3 kg) (n = 3) wurden intravenös über die Ohrrandader entweder mit unbeschichteten Polystyrol-Partikeln (0,3 ml, 4 × 10¹³ Partikel, 3 MBg Aktivität) oder mit mit Poloxamer 407 beschichteten Partikeln (0,6 ml, 4 × 10¹³ Partikel, 3 MBq Aktivität) injiziert. Die mit Poloxamer 407 beschichteten Partikel wurden als Inkubationsmischung verabreicht, die unbeschichteten Partikel in destilliertem Wasser.

Blutproben wurden in geeigneten Zeitabständen entnommen, und die Aktiviät wurden unter Verwendung eines Gamma-Zählers gemessen. Die Verteilung der markierten Partikel in dem Körper wurden durch Gamma-Scintigraphie verfolgt. Dynamische und statische Bilder der Leber, des Milzbereichs und des linken Hinterlaufs wurden durch Schaffung von Interessenbereichen analysiert und mit der Ganzkörperaktivität verglichen. Acht Tage nach der Verabreichung wurden die Kaninchen geopfert und die Organe entfernt. Die gesamte Aktivität in ausgewählten Organen, im Blut, im Oberschenkel und im restlichen Kadaver wurde bestimmt unter Verwendung eines Gamma-Zählers für großvolumige Proben.

Ergebnisse

Die Meßergebnisse der Gamma-Kamera-Scintillationszähler der Kaninchen zeigten klar, daß unbeschichtete Polystyrol-Partikel nach der Injektion weitgehend durch die Leber und die Milz aufgenommen wurden, während die mit Poloxamer 407 beschichteten Partikel im Knochenmark abgelagert wurden, wodurch ein deutliches Bild des Kaninchenskeletts geliefert wurde. Ferner konnten keine Bilder des Leber/Milz-Bereichs oder anderer Organbereiche sichtbar gemacht werden (Fig. 6).

Die Aufnahme der unbeschichteten Partikel durch den Leber/Milz- Bereich ging sowohl schnell als auch wirksam vor sich, wobei 90% der Partikel innerhalb von zwei Minuten in diesen Organen abgelagert wurden. Dies wird veranschaulicht durch die Leber/ Milz-Aktivitätszeit-Profile (Fig. 7) für die ersten 15 Minuten nach der Injektion. Die mit Poloxamer 407 beschichteten Partikel zeigten eine merkliche verminderte Leber/Milz-Aktivität, die ein Maximum von 25% nach zwei Minuten erreichte und dann allmählich auf ein Niveau von 17% abfiel. Etwa 10% dieser Aktivität kann der Aktivität in dem Kreislauf (Blutgehalt) zugerechnet werden und stellt nicht eine Partikelentfernung dar. Während des gleichen Zeitraums waren die mit Poloxamer 407 beschichteten Partikel schnell im Knochenmark angesammelt mit einer Halbwertzeit der Aufnahme von etwa zwei Minuten, wie aus dem Aktivitäts-Zeit-Profil (Fig. 8) ersichtlich ist, das durch Schaffung eines Interessenbereichs um den linken Hinterlauf herum erhalten wurde. Im Vergleich wurden nur Hintergrundbeträge von Aktivität für denselben Interessenbereich bei Kaninchen beobachtet, die die unbeschichteten Partikel erhalten hatten. Gemessene Blut-Aktivitäten zeigten, daß sowohl die unbeschichteten als auch die beschichteten Partikel schnell aus dem Blutstrom entfernt wurden. Die geschätzte Halbwertzeit der Blutbefreiung entspricht ganz gut den gemessenen Halbwertzeiten der Aufnahme in der Leber bzw. Milz und im Knochenmark (Fig. 9).

Acht Tage nach der Verabreichung der Partikel gemessene Beträge in den Organen zeigen schlüssig, daß eine Beschichtung der Partikel mit Poloxamer 407 zu einer Verminderung der Aufnahme in der Lunge, der Milz und der Leber führt; aber noch wichtiger ist es, daß ein dramatischer Anstieg der Aufnahme in den Knochen durch die gemessene Aktivität in dem Schenkel und dem restlichen Kadaver angezeigt wird (Fig. 10).

ANWENDUNGEN DER ANZNEIMITTELZUFÜHRUNG

Die mit Poloxamin 908 beschichteten Partikel, die im Blutstrom enthalten sind, könnten verwendet werden, um andere Gebiete in dem Mikro-Gefäßsystem zu beschießen, beispielsweise bestimmte Bereiche im Knochenmark, die Leber selbst, das Herz, die Nieren, die Lunge und selbst Tumorzellen, wenn der Tumor ein Gefäßsystem hat, das einen Bluterguß oder Blutaustritt gestattet. Diese Art des Beschießens ist ein aktives, gezieltes Beschießen und erfordert die Anbringung eines geeigneten Liganden an dem Partikel oder an seinem Polymer-Überzug. Geeignete Liganden umfassen monoklonale Antikörper oder deren Fragmente, Apolipoproteine, Zucker und Lectine.

Arzneimittel, die unter Verwendung von mit Poloxamin 908 beschichteten Partikeln verabreicht werden könnten, umfassen Anti-Infektionsmittel (z. B. Amphotericin), makrophage Aktivierungsmittel, Anti-Thrombosemittel, Herzmittel (z. B. Prostaglandine) und Arzneimittel gegen Leukämie.

Die mit Poloxamer 407 beschichteten Teilchen könnten verwendet werden, um Arzneimittel und radio-diagnostische Mittel dem Knochenmark zuzuführen. Diese Mittel umfassen Immuno-Unterdrücker (immunosuppressants), wie Cyclosporin, Peptid-Arzneimittel, wie Kolonie-stimulierende Faktoren (colony stimulating factors) und Radio-Isotope für diagnostische Zwecke (z. B. Iodin-Isotope, Technetium-99m).

Während das oben wiedergegebe Beispiel hauptsächlich auf ein nicht abbaubares Modellpartikel Bezug nimmt, nämlich Polystyrol, würde das gleiche Konzept gleich gut mit Partikeln arbeiten, die im Körper biologisch abbaubar sind. Beispiele hierfür umfassen Albumin, Gelatine, Polyalkyl-Cyanoakrylate, Polylaktide, Polyglykolide, Polyhydroxybutyrate und deren Mischungen in der Form von Copolymerisaten; sie umfassen auch Emulsionen und phospholipide Bläschen.

Das Überzugsmittel muß nicht notwendigerweise ein Block- Copolymerisat sein, das Polyoxy-Äthylen-Polyoxy-Propylen- Gruppen aufweist, wie in dem Beispiel gezeigt. Andere Materialien, die eine gleichartige Wirkung erzielen, könnten verwendet werden. Beispiele hierfür umfassen Poloxamere, Polymalein- Säure, veresterte Polymere, um geeignete hydriphile und hydrophobe Bereiche zu bilden, sowie auch natürliche Materialien, wie Polysaccaride und Hyaluron-Säure. Polymere Überzüge, die nicht nur eine sterische Barriere sondern auch eine elektrostatische Barriere schaffen, sind ebenfalls wirksam, um die Partikel von dem reticuloendothelialen System weg zu leiten, und Materialien, wie Xanthan oder Xanthan-Harz, die nicht nur aus einer hydrophilen Kette bestehen, sondern auch aufgeladene Carboxyl-Gruppen, sind ein geeigneter Ausgangspunkt, vorausgesetzt, daß sie gut an der Oberfläche der in Frage kommenden kolloidalen Partikel angebracht werden können. Kolloidale Partikel in der Form von Liposomen und Emulsionen könnten auch mit ähnlichen Arten von Materialien überzogen werden. Die Ergebnisse zeigen auch, daß das Polymer-Material Tetronic 908 und Makromoleküle mit ähnlichen hydrophilen/ hydrophoben Bereichen ebenfalls verwendet werden könnten als lösliche makromolekulare Träger für Arzneimittel-Moleküle durch direkte Verbindung oder durch abbaubare Zwischenräume und Verbindungen.

Das Anbringen geeigneter hydrophiler Gruppen wurde erreicht durch Oberflächen-Propf-Techniken, entweder während des Polymerisationsprozesses, wodurch das Partikel anfänglich hergestellt wird, oder durch nachträgliche Propfmethoden, die energetische Quellen beinhalten, wie ultraviolettes Licht und Gamma-Strahlung.

Poloxamin 908 und Poloxamer 407 (CFTA-Namen) sind auch kommerziell unter den Bezeichnungen TETRONIC und PLURONIC (eingetragene Warenzeichen) von der BASF WYANDOTTE Corporation, 100 Cherry Hill Road, P. O. Box 181, Parsippany, N. J. 07054, USA, zu beziehen.

Tabelle 1

Oberflächen-Eigenschaften und phagocytische Aufnahmen von Polystyrol-Partikeln, überzogen mit nicht-ionischen Tensiden.

Tabelle 2

Blut-Aktivität 15 min. und 1 Stunde nach Verabreichung von unbeschichteten und beschichteten Polystyrol-Mikrokugeln an Kaninchen.

Tabelle 3

Ablagerung von unbeschichteten und beschichteten Polystyrol-Mikrokugeln in verschiedenen Organen 8 Tage nach intravenöser Verabreichung in Kaninchen. Die Werte sind ausgedrückt in Prozent der Gesamtaktivität (±SEM)

Claims

1. System zur Zuführung eines Arzneimittels mit einer Anzahl von Partikeln eines aktiven Arzneimittels, wobei jedes Partikel mit einem Material zur Bildung eines Verbund- Partikels überzogen ist, das im wesentlichen die Aufnahme des Verbund-Partikels durch die Leber verhindert.

2. System zur Zuführung eines Arzneimittels nach Anspruch 1, bei dem die Teilchen mit einem Material überzogen sind, das sie mit einem hydrophilen Überzug und einer sterischen Barriere gegenüber einer Wechselwirkung von Partikeln und Zellen versieht.

3. System zur Zuführung eines Arzneimittels nach Anspruch 2, bei dem das Überzugsmaterial das als Tetronic 908 bekannte Block-Copolymerisat ist.

4. System zur Zuführung eines Arzneimittels nach Anspruch 1, bei dem das Überzugsmaterial ein Poloxamer, eine Polymaleinsäure oder ein Polymer ist, das verestert ist, um geeignete hydrophile und hydrophobe Bereiche zu erzeugen.

5. System zur Zuführung eines Arzneimittels nach Anspruch 1, bei dem das Überzugsmaterial ein natürliches Material ist, das aus den Polysacchariden oder der Hyaluron-Säure ausgewählt ist.

6. System zur Zuführung eines Arzneimittels nach Anspruch 1, bei dem das Überzugsmaterial ein Polymer ist, das so gewählt ist, daß es sowohl eine elektrostatische Barriere als auch eine sterische Barriere bildet.

7. System zur Zuführung eines Arzneimittels nach Anspruch 1, bei dem das Überzugsmaterial ein Xanthan (xanthan gum) ist.