DE3689927T2 - Reagens und Verfahren. - Google Patents

Reagens und Verfahren.

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Proteinreagens mit der Fähigkeit, Gewebeplasminogenaktivator in seiner zweikettigen Form (tissue Plasminogen Activator = tPA) und/oder in seiner einkettigen Form (nachfolgend als Pro-tPA bezeichnet) reversibel aus diesen enthaltenden, wäßrigen Medien zu binden, auf die Herstellung des Reagens, auf immobilisierte Formen des Reagens und die Verwendung des Reagens bei der Isolation von tPA und/oder Pro-tPA.
  • Das Reagens hat die einzigartige Eigenschaft, für tPA und Pro-tPA selektiv zu sein, unter Ausschluß von anderen Plasminogenaktivatoren, sogar von Urokinase, die in einigen Geweben zusammen mit tPA vorkommt.
  • Durch DNA-Rekombinationstechnologie sind seit kurzem mutagene Varianten von tPA und Pro-tPA verfügbar geworden, die sich von den natürlichen Proteinen durch Ersatz, Fehlen oder Zusatz eines oder mehrerer Aminosäurereste unterscheiden. Die Ausdrücke "tPA" und "Pro-tPA", wie sie hier verwendet werden, umfassen solche Varianten, vorausgesetzt, daß sie noch die Stelle oder Stellen aufweisen, die eine Affinität für das erfindungsgemäße Reagens haben.
  • Plasminogenaktivatoren sind Enzyme, die durch ihre Wirkung auf Plasminogen (einen Vorläufer von Plasmin) zur Bildung von Plasmin führen. Plasmin wirkt seinerseits auf Fibrin (oder Blutgerinnsel), indem es das Fibrin verflüssigt oder auflöst. Plasmin bewirkt ferner Lysis von Fibrinogen, das ein Fibrinvorläufer ist.
  • Die genannten Effekte spielen eine wichtige Rolle in den natürlichen fibrinolytischen Systemen. Sie werden ferner bei der therapeuthischen Verabreichung von Plasminogenaktivatoren zur Behandlung, Heilung und Prophylaxe von thrombotischen Erkrankungen oder anderen Zuständen verwendet, wo es erwünscht ist, lokale fibrinolytische oder proteolytische Aktivität über den Mechanismus der Plasminogenaktivierung zu erzeugen.
  • Sie findet darüber hinaus Anwendung in Reagentien für diagnostische, pathologische oder wissenschaftliche Tests, bei denen in-vitro-Fibrinolyse vorkommt.
  • Zwei Typen von Aktivatoren von menschlichem Plasminogen werden extensiv angewendet. Der erste von diesen ist das Bakterienenzym Streptokinase, das durch einen nicht proteolytischen Mechanismus wirkt. Der zweite ist die Protease Urokinase, die aus Urin oder kultivierten Nierenzellen sowie durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt wird. Diese zwei Verbindungen haben den Nachteil, daß ihre Wirkung insofern nicht lokalisiert ist, als daß sie sich nicht auf das Fibrin im Blutgerinnsel beschränkt. Sie wirken auf Plasminogen allgemein im Blutkreislauf und rufen infolgedessen eine weiträumige Plasminerzeugung mit extensiver Lysis von Fibrinogen, dem Vorläufer von Fibrin, hervor. Dies kann wiederum zu einer weiträumigen systemischen Blutung als Ergebnis einer ineffektiven Gerinnung des Blutes führen.
  • Die Neigung von tPA, Fibrin zu binden, seine stark erhöhte fibrinolytische Wirkung in Gegenwart von Fibrin und im Vergleich mit Urokinase und Streptokinase, und seine relativ schwache Wirkung als Plasminogenaktivator in Abwesenheit von Fibrin machen zusammen tPA zum Medikament der Wahl für thrombolytische Therapie am Menschen. Wechselwirkungen zwischen Fibrin und tPA lokalisieren in beträchtlichen Maß die Plasminerzeugung an der Stelle des Blutgerinnsels und verringern oder vermeiden die Folgen von ungehemmter Plasminogenaktivierung, wie sie bei Verwendung von Urokinase oder Streptokinase beobachtet wird. Darüber hinaus ist tPA ein Protein, das immunchemisch mit dem Menschen kompatibel ist, während Streptokinase als körperfremdes Protein das nicht ist.
  • Nach P. Walden et al. [Prog. Chem. Fibrinolysis Thrombolysis 5, 16-23 (1981)] tritt tPA in zwei verschiedenen Formen auf, von denen eine eine einkettige Form ist, die durch Plasmin oder Trypsin in zwei durch Disulfidbrücken verbundene Ketten umgewandelt wird.
  • Menschliches tPA kommt in Gewebeextrakten, Gefäßperfusaten und Säugerzellkulturen vor. Seit kurzem beschäftigt man sich damit, die Expression von tPA mittels DNA-Rekombinationstechnologie in bestimmten Säugerwirtszellen, Hefen und Bakterien herbeizuführen. Um tPA effizient in kommerziellem Maßstab herzustellen, wird ein Verfahren benötigt, um das tPA-Enzym, das in kleinen Mengen in einem komplexen Gemisch von störenden Proteinen, Zellbruchstücken und dergleichen, die in den Zellkulturmedium vorliegen, vorkommt, auf einfache Weise zu extrahieren. Darüber hinaus muß ein solches Verfahren es ermöglichen, eine hohe Ausbeute von tPA aus der Lösung zu erzielen und ein Produkt von hoher Reinheit herzustellen, wenn das Enzym menschlichen Patienten intravenös verabreicht werden soll. Darüber hinaus muß ein Verfahren eine hohe Produktionsrate erreichen, wenn es im kommerziellen Maßstab angewendet werden soll.
  • Die japanische Patentanmeldung Nr. 5148-83 beschreibt ein Affinitätsreagens und ein Verfahren zum selektiven und reversiblen Adsorbieren von tPA und/oder Pro-tPA aus wäßrigen Medien, mit dem eine hohe Reinheit und hohe Ausbeuten von tPA erzielt werden können, oft im wesentlichen in einem einzigen Schritt. Dieses Affinitätsreagens basiert auf einer mit DE-3 numerierten, immobilisierten chromatographischen Proteinfraktion, die das tPA-Enzym inhibierende Eigenschaften zeigt und aus Samen von Erythrina-Arten, zum Beispiel E. latissima, gewonnen werden kann. Es unterscheidet sich von anderen Enzyminhibitoren, die bei solchen Arten auftreten, durch die folgende Kombination von Merkmalen:
  • (a) Es ist ein Kunitz-Inhibitor;
  • (b) Es hat keine Wirkung auf Urokinase;
  • (c) Es inhibiert tPA und/oder Pro-tPA;
  • (d) Es inhibiert Trypsin und Plasmin.
  • Es hat ferner keine Wirkung auf Thrombin.
  • Die Samen von Erythrina latissima (breitblättrige Erythrina) und anderen Erythrina-Arten enthalten verschiedene Proteaseinhibitoren [Joubert et al., Hoppe-Seylers Z. Phy- Dsiol. Chem., 362, 531-538, (1981)]. Zwei Fraktionen, erste und dritte Eluate aus einer DEAE-Sepharosesäule, die in der Publikation als DE-1 bzw. DE-3 bezeichnet wurden, zeigten Trypsin-Inhibitionsaktivität. In einer nachfolgenden Publikation [Francois J. Joubert, Phytochem., 21, (6), 1213-1217, (1982)] wurden vier getrennte Proteinfraktionen (willkürlich mit DE-1, DE-2, DE-3 und DE-4 numeriert) chromatographisch aus Samen von Erythrina lysistemon extrahiert. Wieder zeigten alle vier Fraktionen Trypsin-Inhibitionsaktivität.
  • Nachfolgend wurde festgestellt, daß die Fraktion DE-3 aus E. latissima die wertvolle Eigenschaft besaß, zusätzlich zu Trypsin, wie von Joubert et al. berichtet, auch tPA und Pro-tPA zu inhibieren. Diese Entdeckung wurde in der genannten japanischen Patentanmeldung offenbart. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben seither herausgefunden, daß Samen anderer Erythrina-Arten auch Fraktionen ähnlich den genannten DE-3-Fraktionen enthalten, die in der Lage sind, tPA und Pro-tPA selektiv zu inhibieren. Die DE-3-Proteinfraktion und andere tPA und Pro-tPA inhibierende Fraktionen (nicht zwangsläufig in der gleichen Reihenfolge aus DEAE-Sepharose eluiert) sind in Samen all der zahlreichen bisher untersuchten Erythrina-Arten festgestellt worden und werden daher als im wesentlichen allen Erythrina-Arten gemeinsam angesehen.
  • Die DE-3-Fraktion und ähnliche Fraktionen aus Samen von Erythrina-Arten sind die einzigen bekannten Proteinaseinhibitoren, die nicht aus Körperflüssigkeiten extrahiert werden und die die Eigenschaft haben, tPA zu inhibieren.
  • Trotz seines großen Wertes basierte der obige Beitrag zur Technik auf einem unvollständigen Verständnis und unvollständiger Charakterisierung der betreffenden Substanzen. Insbesondere wurde seinerzeit nicht erkannt, daß die damals beanspruchten, tPA-inhibierenden Fraktionen nicht rein waren und tatsächlich nur einen Bruchteil der spezifischen tPA-Inhibitionskapazität der für die tPA-Inhibitionseigenschaften verantwortlichen reinen Substanz hatten. Den Erfindern der vorliegenden Erfindung ist eine wesentlich vollständigere Reinigung dieser tPA-inhibierenden Fraktionen gelungen, und sie haben das aktive tPA-Inhibitor- Protein identifiziert und charakterisiert.
  • Als ein überraschendes Ergebnis einer solchen Reinigung wurde herausgefunden, daß das originale DE-3 Produkt von E. latissima und die entsprechenden tPA inhibierenden Fraktionen von anderen Erythrina-Arten verunreinigende, proteolytische Enzyme enthielten, die tPA und/oder Pro-tPA abbauen können.
  • Wenn diese beseitigt werden, steigt die Effizienz des resultierenden, gereinigten Inhibitors stark an, so daß praktisch kein proteolytischer Abbau des gewünschten tPA und/oder Pro-tPA beobachtet wird und die therapeutische Qualität des tPA und/oder Pro-tPA beträchtlich gesteigert ist. Dieses ist überraschend, da die früheren Veröffentlichungen über DE-3 dieses als im wesentlichen homogen beschrieben.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung geben wir ein Proteinreagens an, das die Fähigkeit hat, reversibel an tPA und/oder Pro-tPA zu binden, das einen Kunitz-Proteinaseinhibitor umfaßt, der aus Samen einer Erythrina-Art erhältlich ist und ein Molekulargewicht im Bereich zwischen 17- 23000 Dalton hat, nicht cytotoxisch ist und die Fähigkeit hat, tPA, Pro-tPA und Trypsin zu inhibieren, nicht aber Urokinase oder Thrombin, der zwei Disulfidbrücken hat, der Val als N-Terminus-Aminosäurerest hat und frei von Proteasen ist.
  • Der obige Kunitz-Inhibitor inhibiert ferner Plasmin und eluiert aus einer DEAE-Sepharosesäule bei Verwendung eines linearen Natriumchloridgradienten (0-0,2 M über 1 Liter) in 0,05 Tris/HCl-Puffer bei pH 8, bei 20ºC und einem Retentionsvolumen im Bereich zwischen 600-690 ml.
  • Wie oben schon erwähnt wurde, kann das Proteinreagens von Samen der Erythrinaarten wie zum Beispiel E. caffra, E. latissima, E. acanthrocarpa, E. corallodendron, E. lysistemon, E. humeana, E. seyheri und E. decora erhalten werden.
  • Der Kunitz-Inhibitor, der das aktive Mittel in dem erfindungsgemäßen Reagens ist, kann die folgende Aminosäuresequenz haben:
  • und umfaßt zwei Disulfidbrücken an den folgenden Positionen:
  • Cys³&sup9; nach Cys&sup8;³ und Cys¹³² nach Cys¹³&sup9;, oder hat eine funktionsmäßig analoge Aminosäuresequenz mit der Eigenschaft, tPA und/oder Pro-tPA zu inhibieren, einschließlich von Derivaten und Fragmenten des genannten Polypeptids, bei denen die Eigenschaft, tPA oder Pro-tPA zu inhibieren, erhalten bleibt.
  • Das Vorhandensein der zwei Disulfidbrücken (oder zumindest einer von diesen) ist für die Inhibitionswirkung auf tPA und Pro-tPA wichtig. Aufbrechen der Ketten mit Trypsin unter Intakterhaltung der Disulfidbrücken führte nicht zum Verlust der Aktivität. Die Reduktion der Disulfidbrücken resultiert in einem Verlust der Aktivität. Dies führt zu dem Schluß, daß die Geometrie oder die dreidimensionale Konformation von gewisser Bedeutung ist, um zu bestimmen, ob ein Molekül mit im wesentlichen der genannten Aminosäuresequenz tPA oder Pro-tPA inhibiert oder nicht.
  • Es gibt starke Anzeichen dafür, daß es wichtig ist, daß die N-Terminus-Aminosäure Valin ist, da dies normalerweise nicht in Kunitz-Proteaseinhibitoren, aber in allen bisher untersuchten tPA-Inhibitoren aus Erythrina-Arten vorkommt.
  • Es scheint jedoch, daß gewisse Änderungen oder Abbau des Kunitz-Inhibitors erfolgen kann, ohne daß die tPA-Bindungsaktivität verloren geht. So zerstört, wie oben angegeben, gewisse begrenzte Proteolyse des Moleküls, insbesondere Spaltung an der Trypsin-Bindungsstelle, die tPA-Bindungsaktivität nicht, vorausgesetzt, daß die Disulfidbindungen erhalten bleiben. Ferner kann die Trypsin-Bindungsstelle blockiert werden, um ein Biosorptionsmittel von noch größerer Selektivität herzustellen. So kann der Inhibitor z. B. mit einem Arginin-blockierenden Wirkstoff, z. B. 1,2-Cyclohexandion, zur Reaktion gebracht werden, um die Trypsin-Bindungsstelle zu blockieren. Wenn erforderlich, kann solche Blockierung durch Behandlung mit Hydroxylamin aufgehoben werden.
  • Es kann angenommen werden, daß, damit die gewünschte tPA-Inhibitions-Aktivität vorliegt, die Homologie mit der obigen Aminosäuresequenz 85%, vorzugsweise 90% übersteigen sollte, zumindest in dem Bereich, der die Positionen 39 bis 139 der Aminosäuresequenz umfaßt, insbesondere in dem Bereich ungefähr zwischen den Positionen 50 bis 80.
  • Die Aminosäurezusammensetzungen der Kunitz-Inhibitoren mit tPA-Inhibitionsaktivität, wie aus den verschiedenen untersuchten Erythrina-Arten erhalten, ähneln sich stark, zeigen aber eine gewisse Veränderlichkeit, wie nachfolgend gezeigt. Im allgemeinen fällt die Aminosäurezusammensetzung unter die folgenden Grenzwerte:
  • Asp (15-18), Thr (7-9), Ser (12-14), Glu (21-26), Pro (10-14), Gly (14-15), Ala (6-8), Cys (4), Val (15-16), Met (0-1), Ile (6-7), Leu (16-17), Tyr (7-8), Phe (4-6), Lys (10-13), His (1-3) , Arg (5-8) und Trp (2-3).
  • Die Gesamtzahl der Aminosäurereste beträgt in jedem Fall 172. Wie oben angegeben, sind in jedem Fall zwei Disulfidbrücken vorhanden und die N-Terminus-Aminosäure ist immer Valin.
  • Der Kunitz-tPA-Inhibitor von B. latissima hat die folgende Aminosäuresequenz:
  • Insbesondere ist das Proteinreagens so, daß es in seiner konzentrierten Form vor jeder Verdünnung mit einem Lösungsmittel, Verdünnungsmittel oder Streckmittel eine spezifische Aktivität von wenigstens 60 000 IU/mg (wie hier definiert), vorzugsweise von mehr als 70 000 IU/mg, hat. Der tPA-Inhibitor umfaßt vorzugsweise zumindest 80 Gew.-%, besonders bevorzugt mindestens 90 Gew.-% an Proteinreagens.
  • Die gesteigerte Reinheit des aktiven Proteins führt zu erstaunlich höherer spezifischer Aktivität. So hatten die früher beschriebenen Chromatographie-Eluatfraktionen DE-3 spezifische tPA-Inhibitionsaktivitäten unter 40 000 IU/mg und oft deutlich darunter, wohingegen nun gemäß der Erfindung gereinigte Fraktionen erhalten worden sind, die spezifische Aktivitäten von 90 000 IU/mg oder größer haben. Wenn das Protein auf einer Matrix immobilisiert ist, um ein Affinitätsreagens zu bilden, wird festgestellt, daß die resultierende, wesentlich höhere Beladung der Matrix mit aktivem Protein eine wesentlich schnellere Verarbeitung der tPA und/oder Pro-tPA enthaltenden Flüssigkeiten ermöglicht, so daß der spontane Abbau reduziert wird, der normalerweise bei längerer Handhabung von empfindlichen Proteinen beobachtet wird. Das führt auch zu Einsparungen an Matrixmaterial und Bearbeitungszeit.
  • Wir haben beobachtet, daß die in der Fraktion DE-3 und ähnlichen tPA-inhibierenden Fraktionen, wie oben beschrieben, vorhandenen Verunreinigungen andere Erythrina-Proteaseinhibiatoren enthalten. Diese nachfolgend angegebenen anderen Proteaseinhibitoren haben Molekulargewichte, die denen der entsprechenden tPA-Inhibitoren stark ähneln. Wenn diese anderen Proteaseinhibitoren in der immobilisierten Form des Reagens vorhanden sind, können sie zusätzlich zu tPA und Pro-tPA andere Proteasen absorbieren, so daß bei Desorption das Produkt deutlich weniger rein ist. Solche anderen Proteasen kommen gewöhnlich sowohl in den Gewebeflüssigkeiten als auch in den Zellkulturmedien vor, aus denen tPA und Pro-tPA normalerweise isoliert werden.
  • Das erfindungsgemäße Reagens kann vorteilhafterweise in immobilisierter Form verwendet werden. Ein solches immobilisiertes Reagens ist sehr stabil und behält seine Spezifizität für tPA auch nach extensivem wiederholtem Gebrauch, möglicherweise aufgrund des Fehlens von Proteasen im immobilisiertem Reagens. Es ist daher für die Extraktion und Reindarstellung von tPA aus komplexen Proteingemischen in industriellem Maßstab geeignet, wo eine wiederholte Sorption und Desorption von tPA ohne Abbau oder Denaturierung des Affinitätsreagens und ohne Verlust der Spezifizität des Affinitätsreagens für tPA erforderlich ist. Die Säule kann gereinigt und sterilisiert werden, ohne die Stabilität des immobilisierten Reagens zu beeinträchtigen. Die Bindungsrate von tPA an das immobilisierte Reagens ist hoch. Deswegen ist die Flußrate durch eine Säule mit dem immobilisierten Reagens wesentlich höher als beispielsweise im Fall, daß Größenausschlußchromatographie angewendet wird, um eine Trennung von tPA von den vielen anderen in der Zellflüssigkeit vorhandenen störenden Proteinen zu erzielen.
  • Verfahren zum Immobilisieren des erfindungsgemäßen Reagens umfassen Verfahren zum kovalenten Binden des Reagens an einen Träger. Z.B. kann das erfindungsgemäße Reagens auf eine Fachleuten bekannte Weise an Bromcyan-aktivierte Agarose angebunden werden. Es können jedoch auch andere feste Träger und andere Anbindungsmittel benutzt werden, je nach den chemischen Eigenschaften der Oberfläche, an die das Proteinreagens angebunden werden soll. Beispiele sind:
  • (a) eine Carbodiimid-Anbindung, die freie Aminogruppen an freie Carboxygruppen anbindet;
  • (b) eine Glutaraldehyd-Anbindung, die NH&sub2;-Gruppen an vorher in die Aminoalkyl-Form umgewandelte Agarose anbindet;
  • (c) Perjodat-Aktivierung von Agarose zur Erzeugung von Aldehydgruppen, die anschließend bei pH 4-6 mit Aminen des Inhibitors zur Reaktion gebracht werden, um Schiff'sche Basen zu bilden, die dann mit Natriumborhydrid oder Natriumzyanoborhydrid reduziert werden;
  • (d) Agarose kann in das Hydrazidosuccinylderivat umgewandelt werden; an dieses können mit EDC Carboxyl-Liganden angebracht, oder durch Diazotierung Amine angebunden werden;
  • (e) Zellulosefasern oder -Perlen können in ein Hydrazidoderivat umgewandelt und nach dem Verfahren von Parikh et al. (Methods in Enzymology, Bd. 34, s. 77-102, Hrsg. Jakobi und Wilcheck, Academic Press NY) verwendet werden;
  • (f) Polyacrylamid-Perlen können durch direktes Glutaraldehydverfahren oder durch Diazotierung der p-Aminobenzamidoethylderivate oder der Hydrazidoderivate angebunden werden;
  • (g) schließlich wird auf Glasperlen (oder andere feste Körper) hingewiesen, die mit einem Protein, z. B. Gelatine beschichtet werden können, das quervernetzt und an den Inhibitor durch Verfahren angebunden werden kann, die analog einem der in der deutschen Patentanmeldung P 3 224 387.7, der japanischen Patentanmeldung 116 086/1982, dem britischen Patent 2 103 791 und dem US-Patent 4 478 946 beschriebenen Verfahren sind.
  • Die genannten Verfahren sind als solche Fachleuten bekannt und/oder in der zitierten Literatur beschrieben.
  • Die Verfahren zur Verwendung des immobilisierten Reagens wie in der genannten japanischen Patentanmeldung Nr. 5148/83 offenbart können identisch auf die in der vorliegenden Beschreibung offenbarten Affinitätsreagenzien angewandt werden. Dies gilt auch für die spezifischen Beispiele.
  • Menschlicher Gewebeplasminogenaktivator kommt in Blut, Gewebeextrakten, Gefäßperfusaten und Zellkulturen vor, jedoch in äußerst niedrigen Konzentrationen. Eine alternative Quelle von tPA ist in der EP-Anmeldung Nr. 81200643-5 aufgeführt, die eine Melanomzellkultur beschreibt, die in der Lage ist, tPA in höheren Konzentrationen zu erzeugen, als sie im allgemeinen in den vorgenannten Quellen gefunden werden.
  • Es wird festgestellt, daß Pro-tPA durch Wirkung von Proteasen in tPA umgewandelt wird. Folglich könnte ein weiterer Vorteil der Entfernung von Proteasen aus dem erfindungsgemäßen Reagens eine Verbesserung im Verhältnis von Pro-tPA zu tPA im Endprodukt sein. Es ist vorgeschlagen worden, daß Pro-tPA bei der Verabreichung gegenüber tPA bevorzugt werden sollte, da er in Abwesenheit von Fibrin weniger aktiv ist, aber von Fibringerinnseln stark selektiv absorbiert wird; wenn er einmal absorbiert ist, wird es schnell in tPA umgewandelt und löst die Lysis des Gerinnsels aus.
  • In jüngerer Zeit ist der Anwendung von DNA-Rekombinationstechniken für die Expression von tPA in relativ hoher Konzentration, hauptsächlich in Säugerzellinien, Fibroblasten, Hefen und Bakterien, gesteigerte Aufmerksamkeit gewidmet worden. Durch solche DNA-Rekombinationstechnologie wird das für tPA codierende menschliche Gen in die Trägerzelle übertragen, die dadurch so verändert wird, daß sie das tPA-Enzym synthetisiert. Durch das Verfahren der Genamplifikation wird eine Steigerung der tPA-Konzentration erreicht; diese Verfahren sind in der S.A.-Patentanmeldung Nr. 83/3174 und den EP-Veröffentlichungen Nr. 117059 und 1170560 beschrieben. Wie oben angegeben, können durch solche Techniken mutagene Varianten von tPA und Pro-tPA erzeugt werden.
  • Das erfindungsgemäße Proteinreagens inhibiert Urokinase nicht und reagiert nicht mit ihr und kann daher vorteilhaft in immobilisierter Form verwendet werden, um tPA und/oder Pro-tPA aus wäßrigen Lösungen zu isolieren, die diese in Verbindung mit Urokinase enthalten, z. B. aus verschiedenen Körpergewebeflüssigkeiten. Ferner kann es möglich sein, ein Gemisch aus tPA, Pro-tPA und Urokinase aus solchen Flüssigkeiten mit einem weniger selektiven Biosorptionsmittel zu isolieren und dann das erfindungsgemäße Reagens zu benutzen, um den tPA und Pro-tPA zu entfernen, wodurch gereinigte Urokinase erhalten wird.
  • Die vorliegende Lehre basiert auf einem wesentlich verbesserten Verfahren zur Reindarstellung des aktiven Proteinreagens aus seinen natürlichen Quellen, insbesondere aus Samen von Erythrina-Arten, die den Inhibitor im wesentlichen frei von Proteaseaktivität liefern.
  • So geben wir gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung eines erfindungsgemäßen Proteinreagens an, das die Fähigkeit hat, tPA und/oder Pro-tPA reversibel zu binden, wobei eine das Reagens zusammen mit Verunreinigungen enthaltende wäßrige Lösung, z. B. ein wäßriger Extrakt von Samen einer Erythrina-Art einem oder mehreren Fraktionierungsschritten unterworfen wird, einschließlich Chromatographie unter Verwendung eines hydrophoben Gels, mit Auswahl jener Fraktionen, die als das gewünschte Reagens enthaltend identifiziert werden, und unter Ausschluß aller proteasehaltigen Fraktionen.
  • Ein erfindungsgemäßes Verfahren mag in mancher Hinsicht dem von Joubert (a.a.O.) beschriebenen Verfahren ähneln.
  • Es ist jedoch erstaunlicherweise festgestellt worden, daß deutlich verbesserte Reinigungsergebnisse erreicht werden, wenn die Fraktionierungsschritte hydrophobe Chromatographie unter Verwendung eines hydrophoben Gels, insbesondere Phenylagarose, umfassen. Verwendung von Phenylsepharose (CL 4B) oder eines technischen Äquivalents ist besonders bevorzugt. Das gewünschte Protein wird bei pH 6,0-8,0, vorzugsweise um pH 7,0 eluiert.
  • Der oben beschriebene Exklusionschromatographieschritt wird vorzugsweise kombiniert mit Ionenaustauschchromatographie auf DEAE-Zellulose, z. B. DEAE-Zellulose DE-52 oder einem technischen Äquivalent, und/oder Größenausschlußchromatographie, z. B. auf einem quervernetzten Dextran-Absorptionsmittel wie Sephadex G-50 oder einem technischen Äquivalent, im Anschluß an eine Anfangsfraktion durch Ammomiumsulfatausfällung.
  • So wird z. B. in einem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren vor der Exklusionschromatographie mit Phenylsepharose Chromatographie auf DEAE-Zellulose, vorzugsweise bei pH 7- 9, besonders bevorzugt bei ungefähr pH 8,0 und anschließend Chromatographie auf Sephadex G-50 oder einem technischen Äquivalent, vorzugsweise bei pH 7-9, besonders bevorzugt bei pH 8,2-8,3, durchgeführt.
  • Unsere Experimente weisen darauf hin, daß die Chromatographie auf einem hydrophoben Gel wie Phenylsepharose verantwortlich für die Entfernung von Proteasen aus dem Kunitz- Inhibitor ist.
  • Die folgenden nicht einschränkenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung verdeutlichen.
  • Beispiel 1 Bereitung eines tPA-Inhibitors aus Samen einer Erythrina- Art
  • Gemahlene entölte Samen einer Erythrina-Art, z. B. E. latissima (10 kg), werden mit 100 l 0,5 M Natriumchloridlösung über Nacht extrahiert. Die Suspension wird dann 5 Minuten lang in einem Waring-Mischer mazeriert. Der Extrakt wird geklärt, mit Ammoniumsulfat zu 60% gesättigt und das Präzipitat durch Zentrifugierung gewonnen. Das Präzipitat wird in 0,05 M Natriumchloridlösung wieder aufgelöst, gegen destilliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet.
  • Der Rohextrakt wird auf DEAE-Zellulose (DE-52) mit einem linearen Natriumchloridgradienten (0-0,2 M) in 0,05 M Tris/HCl-Puffer bei pH 8 weiter fraktioniert. Die 0,2 M Natriumchloridfraktion wird gesammelt und in eine Phenylsepharosesäule (Cl 4B) geladen. Die Säule wird mit 10% w/v Ammoniumsulfat in 0,01 M Na P, pH 7,0 eluiert und der tPA-Inhibitorpeak gesammelt.
  • Der partiell gereinigte tPA-Inhibitor wird dann in eine Sephadex-G-50-Säule geladen und mit 0,2 M Ammoniumbicarbonat bei pH 8,2 eluiert.
  • Mit dem obigen Verfahren wurde 90% reiner tPA-Inhibitor erhalten, frei von nachweisbaren Mengen von Proteasen.
  • Beispiel 2 Bestimmung der tPA-Inhibitionsaktivität
  • Die Inhibitionsaktivität eines aus Samen einer Erythrina- Art gewonnenen tPA-Inhibitors kann ausgedrückt werden in Inhibitionseinheiten (IU, inhibitor units), die wie folgt experimentell definiert sind:
  • (i) Eine Probe von reinem tPA wird nach dem Verfahren von Zimmermann et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978), 75, 750] fluorometrisch getestet, wobei als fluorogenes Substrat N-Alpha-Benzyloxycarbonyl-Glycyl-Glycyl-L-Arginin-7-Amido-4-Methylkumarin (Cbz-Gly-Gly- Arg-AMC, Bachem, Schweiz) verwendet wird und auf einen Gehalt von 50 fluorometrischen Einheiten Enzym pro ml von 0,01 M Tris/HCl mit einem Gehalt von 0,02% Triton X-100 eingestellt wird.
  • (ii) Die tPA-Inhibitorprobe wird in 0,1 M Tris-HCl bei pH 8,1 in passender Konzentration (normalerweise 0,1-2 mg/ml, je nach erwarteter spezifischer Aktivität des Inhibitors) gelöst.
  • (iii) Aufeinanderfolgende zweifache Verdünnungen der Inhibitorlösungen werden mit 0,1 M Tris-HCl bei pH 8,1 bis zu einer Endverdünnung von 1 : 2048 hergestellt.
  • (iv) Jede Inhibitorverdünnung (10 ul Volumen) wird gemischt mit 90 ul der tPA-Lösung und die Röhrchen werden 30 min. lang bei Zimmertemperatur inkubiert.
  • (v) Anschließend wird jedes Röhrchen auf Restaktivität getestet und die Logit-Transformierte des Bruchteils der Restaktivität wird als Funktion des Logarithmus der Inhibitorverdünnung aufgetragen. Eine lineare Regressionsgrade wird an diese Punkte angepaßt und wird verwendet, um die Koordinaten für 50% Inhibition durch Interpolation zu erhalten.
  • (vi) Eine Einheit der Inhibitionsaktivität wird definiert als die Menge, die eine fluorometrische Einheit tPA zu 50% inhibiert.
  • Die Standard-Gehaltsbestimmung wird durchgeführt, indem Enzym zum Starten der Reaktion in folgendem Gemisch zugesetzt wird.
  • ml
  • Tris-HCl 0,1 M, pH 8,1 0,43
  • Substrat, 25 mM in DMSO 0,01
  • DMSO 0,01
  • Enzymlösung 0,05
  • gesamt 0,05 ml.
  • Das Gemisch wird kurz gewirbelt und in die Probenkammer eines Spektrofluorophotometers mit Aufzeichnungsgerät plaziert. Die Freisetzung von AMC wird bei einer Aktivierungswellenlänge von 383 nm und einer Emissionswellenlänge von 455 nm überwacht.
  • Das Instrument wird mit reinem AMC geeicht, so daß ein Vollskalenausschlag des Aufzeichnungsgeräts mit dem obigen Testgemisch erreicht wird, bei dem 10 ul von 2 · 10&supmin;&sup5; M AMC in DMSO die 10 ul DMSO ersetzt (d. h. ein Vollskalenausschlag wird durch 200 pmol AMC oder durch 0,5 ml einer 4 · 10&supmin;&sup7; M Lösung von AMC im Probengemisch erzeugt).
  • Eine fluorometrische Einheit der Emzymaktivität ist definiert als die Menge, die die Freisetzung von 10 pmol AMC pro Minute bei 20 Grad Celsius katalysiert.
  • Es folgt ein spezifisches Beispiel für solch eine Bestimmung.
  • Eine teilgereinigte Fraktion, die 5 mg/Vial gefriergetrockneten tPA-Inhibitor enthält, wird mit 2,5 mg/ml rekonstituiert.
  • Zweifachverdünnungen durchgeführt mit 0,1 M Tris-HCl bei pH 8,1.
  • Standard-tPA-Lösung 47,3 u/ml, 10 ul Inhibitorverdünnung + 90 ul tPA; 30 Minuten bei Zimmertemperatur; Bestimmung der Enzymaktivität im Gemisch. Ergebnisse Probe Inhibitorverdünnung Enzymaktivität (FU/ml) Restaktivität (R) (%) (Logit = log (R/100-R) keine
  • Regressionsgleichung:
  • Logit R = 0,885 log (1/dil) = 2.3232
  • wobei R = Restaktivität und Logit R = log (R/100-R)
  • 50% Inhibitionslösung = 1/423
  • 10 ul einer 1/423-Verdünnung von 2,5 mg/ml Inhibitorlösung inhibierten 50% von 4,26 Einheiten. Die spezifische Aktivität ist daher 4,26 Einheiten · 1/0,01 ml · 423 · 1/2,5 mg = 72100 Einheiten pro mg.
  • Beispiel 3
  • Samen der folgenden Erythrina-Arten wurden wie in Beispiel 1 verarbeitet, bis einschließlich des Schritts der DEAE- Zellulose-Chromatographie. Die so erhaltenen tPA-Inhibitor- Vorkonzentrate hatten die folgenden Aktivitäten, bestimmt nach dem Verfahren von Beispiel 2.
  • Art IU/mg
  • E. lysistemon 27 247
  • E. decora 20 833
  • E. seyheri 15 797
  • E. humeana 20 533
  • E. abussinia 5 050
  • Mittels der wie in Beispiel 1 beschriebenen Prozeduren können diese Materialien verbessert werden. So wurde z. B. das Vorkonzentrat von E. lysistemon von 27246 IU/mg auf 94339 IU/mg verbessert, wohin gegen das Vorkonzentrat von E. seyheri von 15797 IU/mg auf 71428 IU/mg verbessert wurde.
  • Beispiel 4
  • Alternative Prozedur zur Bereitung von tPA-Inhibitor aus Samen einer Erythrina-Art
  • 1. Samen einer Erythrina-Art in einer Kaffeemühle zu feinem Pulver mahlen.
  • 2. 200 gr. reinen Samen nehmen und mit 2 l 0,5 M Natriumchloridlösung extrahieren. Über Nacht bei 4 Grad Celsius rühren.
  • 3. Lösung durch Glaswolle filtern und durch einstündiges Zentrifugieren bei 10.000 Umdrehungen/Min. klären. Überstehendes aufbewahren und Rückstand fortwerfen.
  • 4. Samenbrei ein zweites Mal mit 2 l 0,5 M Natriumchloridlösung extrahieren, filtern, zentrifugieren und überstehende Lösung mit der vom ersten Extrakt kombinieren.
  • 5. Den kombinierten Extrakten Ammoniumsulfat zusetzen, um 60% Sättigung zu ergeben (390 g/l), über Nacht bei 4 Grad Celsius sanft rühren.
  • 6. Lösung 30 Minuten lang bei 5000 Umdrehungen/Minute zentrifugieren, Überstehendes fortwerfen und das Präzipitat in 0,5 M Natriumchloridlösung (ca. 200 ml) erneut auflösen.
  • 7. Über Nacht gegen Leitungswasser bei 4ºC dialysieren. 8. 30 Minuten lang bei 5000 Umdrehungen/Minute zentrifugieren.
  • 9. Überstehende Flüssigkeit gefriertrocknen, um den Rohinhibitor zu erhalten (Ausbeute ca. 4 g/200g Samenpulver).
  • 10. Den Rohinhibitor mit einer Konzentration von 50 mg/ml in 0,05 M Tris/HCl bei pH 8,0 lösen.
  • 11. Auf eine DEAE-Zellulose-Säule (DE52) aufgeben.
  • 12. Spülen mit 0,1 M NaCl in Tris/HCl bei pH 8,0.
  • 13. Eluieren mit 0,22 M NaCl in 0,05 M Tris/HCl bei pH 8,0.
  • 14. Dialysieren und gefriertrocknen.
  • 15. Lösen in einer Konzentration von 50 mg Protein/ml in 0,01 M NaPO&sub4; in 10% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; bei pH 7.
  • 16. Auf eine Phenylsepharosesäule (Cl4B) aufgeben.
  • 17. Spülen mit 15% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;.
  • 18. Eluieren mit 8% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;.
  • 19. Eluat überwachen, z. B. mit HPLC-Analysechromatographie, und aktive Proben sammeln.
  • 20. Dialysieren und gefriertrocknen.
  • 21. Lösen in einer Konzentration von 25 mg pro ml Protein in 0,2 M (NH&sub4;)HCO&sub3; bei pH 8,3 und auf eine Sephadex- G-50-Säule aufgeben.
  • 22. Eluieren mit 0,2 M (NH&sub4;)HCO&sub3; bei pH 8,3 und Eluat, z. B. mit HPLC, überwachen. Ca. 1 g reiner gefriergetrockneter tPA-Inhibitor wird pro Kilogramm Samen erhalten.
  • Die Prozedur im wesentlichen wie oben beschrieben wurde auf Proben von Samen einer Mehrzahl von Erythrina-Arten angewandt, und die tPA-Inhibitionsaktivität jedes Endprodukts wurde wie in Beispiel 2 bestimmt.
  • Typische Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 gegeben.
  • Tabelle I
  • Art IU/mg
  • E. acanthrocarpa 78 000
  • E. caffra 68 500
  • E. corallodendron 63 300
  • E. lysistemon 94 300
  • E. seyheri 71 400
  • Beispiel 5
  • HPLC-Analysen von aus Samen von E. caffra reindargestellten tPA-Inhibitor.
  • tPA-Inhibitor wurde aus E. caffra-Samen nach den Verfahren von Joubert et al. (Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 362, 531-534 ) gereinigt. Der DE-3-Peak der DEAE-Sepharosesäule wurde dialysiert und gefriergetrocknet, um ein Produkt mit 52 000 IU/mg zu ergeben (Probe 1).
  • tPA-Inhibitor wurde auch nach den Verfahren von Beispiel 4 aus E. caffra-Samen reindargestellt. Die Aktivität des Endprodukts wurde auf 80000 IU/mg bestimmt. (Probe 2).
  • Beide Proben von gereinigtem tPA-Inhibitor wurden durch HPLC analysiert, mit einem Waters-HPLC-Chromatographiesystem, ausgerüstet mit einer C18-Säule. Ein linearer Gradient von 0,05% Trifluoressigsäure in Wasser zu 0,05% Trifluoressigsäure in 70% Acetonitril wurde mit 1 ml/min durch die Säule gepumpt und eluiertes Protein wurde durch UV-Absorption bei 205 nm nachgewiesen.
  • Die unter Verwendung ungefähr gleicher Mengen der Proben 1 und 2 erhaltenen HPLC-Profile sind in Fig. 1a bzw. 1b gezeigt.
  • Fig. 1a, aber nicht Fig. 1b, zeigt Verunreinigungspeaks. Aus Fig. 1a kann geschlossen werden, daß etwa 20% des Proteins in Probe 1 nicht tPA-Inhibitor war.
  • Beispiel 6 Analysen von aus Samen von E. caffra und E. latissima reindargestelltem tPA-Inhibitor durch SDS-PAGE (i) tPA-Inhibitor-Zubereitungen
  • Drei tPA-Inhibitor-Zubereitungen wurden analysiert:
  • 1. Aus Samen von E. caffra nach den Verfahren von Joubert et al. [Hoppe-Seyler's Z. Physiol.Chem. (1981), 362, 531-538) reindargestelltem tPA-Inhibitor.
  • 2. Aus Samen von E. LATISSIMA nach den Verfahren von Joubert et al. (siehe oben) reindargestellter tPA-Inhibitor.
  • 3. Aus Samen von E. caffra nach den Verfahren von Beispiel 4 reindargestellter tPA-Inhibitor.
  • (ii) SDS-PAGE
  • Elektrophorese wurde auf 15%-Polyacrylamidgelstreifen in Gegenwart von 0,1% SDS durchgeführt. Banden wurden identifiziert durch Färben mit Coomassie Brilliant Blue (CBB), Silber oder mittels der "Western Blot"- Technik unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers für den tPA-Inhibitor.
  • (iii) Ergebnisse
  • Bei der aus E. latissima-Samen gewonnenen Zubereitung wurde nur eine Bande beobachtet, die mit CBB gefärbt wurde, doch zwei Banden wurden mit der "Western Blot"-Technik beobachtet.
  • 0,01 mg der Zubereitung 3 wanderten mit einer relativen Molekülmasse (Mr) von ungefähr 20000 und erschienen auf mit CBB gefärbten Gels als eine homogene Bande. Analyse der Zubereitung 1 auf der selben Weise zeigte eine dominierende Komponente mit einer Mr von 20000 und zwei mindere verunreinigende Proteine, das erste mit einer relativen Molekülmasse von ungefähr 22000 und das zweite mit einer relativen Molekülmasse von ungefähr 23000.
  • Wenn aus den Zubereitungen 1 und 3 nach SDS-PAGE erhaltene identische Gele auf Nitrocelluloseblätter für die Analyse nach "Western Blot"-Technik übertragen wurden, gab der monoklonale Antikörper bei beiden Zubereitungen ein starkes Signal bei einen Protein mit Mr 20000. Im Fall der Zubereitung 1 band sich der Antikörper jedoch auch an ein Epitop an einer Spurenverunreinigung mit Mr 18000. Die Empfindlichkeit der immunchemischen Technik waren derart, daß das Protein deutlich sichtbar war, obwohl es in einem silbergefärbten Gel kaum erkennbar und in dem CBB- gefärbten Gel überhaupt nicht sichtbar war. Die Mr-18000-Bande war nicht sichtbar in dem aus Zubereitung 3 erhaltenen "Western Blot".
  • Beispiel 7 In den Samen unterschiedlicher Erythrina-Arten vorkommende Proteinfraktionen
  • Die nachfolgende Tabelle II gibt die Ergebnisse von Molekülgewichtsbestimmungen von Proteinfraktionen, die aus Samen unterschiedlicher Erythrinaarten nach den Verfahren von Joubert et al. [Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem. (1981) 362, 531-538] isoliert wurden. Tabelle II Fraktion latissima caffra lysistemon corallodendron Cristagalli acanthrocarpa humeana seyheri
  • Molekülgewichtsbestimmungen wurden durch SDS-Gel-Elektrophorese durchgeführt:
  • (i) Im Fall von E. latissima-Samen nach den Verfahren von Shapiro et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1967) 28, 815-830.
  • (ii) Im Fall von Samen von E.caffra, E. lysistemon und E. humeana nach dem Verfahren von Weber und Osborn, J. Biol. Chem. (1969) 144, 4406.
  • (iii) Im Fall von Samen von E. lysistemon, E. crista galli und E. acanthrocarpa nach dem Verfahren von Ornstein und Davis, (1962) "Disc electrophoresis", nachgedruckt von Destillation Products Industries, Rochester, N.Y.
  • (iv) Im Fall von Samen von E. seyheri nach dem Verfahren von Andrews, Methods Biochem. Anal. (1970), 18, 1.
  • Die Fraktionen, die starke tPA-Inhibitionsaktivität zeigten, sind unterstrichen.
  • Diese Ergebnisse verdeutlichen zusätzlich, daß eine von verunreinigenden Proteinen freie Reindarstellung von tPA-Inhibitor aus Samen einer Erythrina-Art abhängt von der vollständigen Trennung des tPA-Inhibitors von anderen Molekülen ähnlichen Molekülgewichts. Wie die Ergebnisse von Beispielen 5 und 6 zeigen, wird dies durch das Verfahren von Beispiel 4, nicht aber durch das Verfahren von Joubert et al. (siehe oben) erreicht.
  • Beispiel 8 Wirkung von in den Samen von Erythrina-Arten vorkommenden pflanzl. Proteasen auf tPA
  • Es wurde festgestellt, daß Erythrina-Samenextrakte proteolytische Aktivität enthalten, die durch die standardmäßige fluorometrische Gehaltsbestimmung nach Zimmerman et al. (siehe oben) durch Quantifizieren der katalysierten Freisetzung von Aminomethylkumarin (AMC) aus den synthetischen Substrat Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC meßbar ist.
  • Unter Verwendung der gleichen fluorometischen Gehaltsbestimmung wurde festgestellt, daß auch nach dem Verfahren von Joubert et al. (siehe oben) gewonnene tPA-Inhibitor- Zubereitungen aus Samen von E. caffra proteolytische Aktivität (ca. 1,4 FU/mg Protein) enthielten. Keine solche amidolytische Aktivität war in einer nach den Verfahren von Beispiel 4 aus Samen von E. caffra abgeleiteten tPA-Inhibitor-Zubereitung meßbar.
  • Eine Probe mit einem tPA-Gehalt von 31,4 FU/ml wurde mit einem gleichen Volumen einer aus E. caffra-Samen abgeleiteten Proteaselösung vermischt, die 20,6 FU/ml enthielt, und die durch elektrophoretische und immunchemische Analyse als frei von tPA-Inhibitor bestimmt worden war. Das resultierende Gemisch enthielt wie erwartet 26,0 FU/ml. Diese Lösung wurde bei Zimmertemperatur zwei Stunden lang inkubiert und an den in der nachfolgenden Tabelle III angegebenen Zeitpunkten wurden Proben zur fluorometrischen Gehaltsbestimmung entnommen. Tabelle III Zeit Gemisch Erythrina Protease (FU/ml) Rest tPA
  • Aus diesem Experiment ist erkennbar, daß die Erythrinaprotease in der Lage ist, die katalytische Aktivität des tPA zu zerstören. Diese Wirkung wurde festgestellt bei einer Dauer der Exposition der tPA an der Erythrinaprotease, die vernünftigerweise auch unter Präparationsbedingungen erwartet werden kann, wenn tPA-haltige Lösungen mehrere Stunden lang auf eine Affinitätssäule gepumpt werden.
  • Beispiel 9 Cytotoxititätstest
  • UCT-BR-1-Zellen (ursprünglich abgeleitet von einer knöchernen metastatischen Ablagerung aus einem primären Brustkazinom) wurden angesetzt in einer 96-löchrigen Mikrotiter- Gewebekulturplatte, mit einer Dichte von 1,8 · 10 4 Zellen/Loch in 0,1 ml RPM1-1640-Medium, bezuschlagt mit 10% fetalem Rinderserum und Antibiotika.
  • Nach 24 Stunden Inkubation bei 37ºC in feuchter Atmosphäre mit 95% Luft und 5% CO&sub2; (zu diesem Zeitpunkt waren die Zellen adhärent und subkonfluent) wurde aus Samen einer Erythrinaart nach den Verfahren von Beispiel 4 rein dargestellter tPA-Inhibitor, gelöst in sterilem RPM1-10, in unterschiedlichen Testkonzentrationen zugesetzt. Nach weiteren 48 Stunden Inkubation wurde jedes Loch 18 Stunden lang mit ³H-Thymidin mit einer Konzentration von 0,1 ug und 0,2 uCi/Loch gepulst.
  • Anschließend wurden die Zellen geerntet und in die in Zell- DNA inkorporierte Radioktivität gemessen. Die Cytotoxitität wurde gemessen als Inhibition der Inkorporierung von ³H-Thymidin, ausgedrückt als Prozentsatz der tPA-Inhibitor freien Kontrollmessung.
  • Auch wenn tPA-Inhibitor in einer Konzentration von bis zu 1,0 mg/ml vorhanden war, wurde keine meßbare Wirkung auf die Zellvermehrung oder DNA-Synthese festgestellt.
  • Im wesentlichen ähnliche Resultate wurden unter Verwendung von aus normalen menschlichen Brustgewebe gewonnenen Zellen erhalten.
  • Die Nicht-Cytotoxitität des tPA-Inhibitors wurde durch Experimente bestätigt, bei denen dieses Protein Mäusen durch subkutane intramuskuläre Injektion oder intraperitoneale Injektion verabreicht wurde.
  • Beispiel 10 Aminosäuresequenzanalyse der Bereiche mit trypsinaktiven Stellen von aus einer Mehrzahl aus Erythrina-Arten gewonnenen tPA-Inhibitoren
  • Aus Samen unterschiedlicher Erythrina-Arten rein dargestellte tPA-Inhibitoren wurden begrenzter Hydrolyse durch Trypsin bei pH 3 unterworfen. Die Digestion wurde 7 Tage lang bei 20 Grad Celsius durchgeführt. Die Aminosäuresequenz um die Trypsin-reaktive Stelle jedes tPA-Inhibitors wurde bestimmt unter Verwendung von Fragmenten, die durch SDS-Gelelektrophorese in Gegenwart eines Reduktionsmittels und mit den standardmäßigen EDMAN-Verfahren konzentriert wurden. Aminosäurereste 63-74 sind angegeben in der nachfolgenden Tabelle IV. Die Trypsin-reaktive Stelle ist in jedem Fall Arg63-Ser64. Tabelle IV
  • Aus einem Vergleich der obigen Sequenzen können die folgenden Schlüsse gezogen werden:
  • (1) Die Homologie der obigen Fragmente ist größer als 90%
  • (2) Eine gewisse Abweichung von den Aminosäuresequenzen der tPA-Inhibitoren von E. latissima und E. caffra kann toleriert werden, ohne das die Fähigkeit zu tPA-Inhibition verloren geht.
  • (3) Manche Abwandlungen sind möglich, ohne daß die tPA-Inhibitionswirkung ausgeschaltet wird, obwohl der Grad der Aktivität in Abhängigkeit von solchen Änderungen zu- oder abnehmen kann.
  • Beispiel 11 Vergleich von Aminosäurezusammensetzungen von tPA-Inhibitoren verschiedener Erythrina-Arten
  • Die Aminosäurezusammensetzungen werden durch sieben tPA Inhibitor-Preparationen von Samen verschiedener Erythrina- Arten bestimmt. Die Ergebnisse werden in der Tabelle V dargestellt: Tabelle V Aminosäure acan* caffra* coral* lat* lys* sey* dec*
  • Die obige Tabelle ermöglicht einen gewissen Grad von Korrelation zwischen den Aminosäuresequenzen der Inhibitoren.
  • * Abkürzungen
  • E. acan - E. acanthrocarpa, E. coral - E.corallodendron, E. lat - E. latissima, E. lys - E. lysistemon, E. sey - E. seyheri, E. dec. - E. decora
  • Beispiel 12 Untersuchung der Bedeutung der Disulfidbrücken in einem aus Samen einer Erythrina-Art abgeleiteten tPA-Inhibitor für die Inhibitionsaktivität
  • Alle aus Samen von Erythrina-Arten gewonnenen Kunitz-Proteaseinhibitoren enthalten zwei Disulfidbindungen.
  • Es wurde festgestellt, daß eine beschränkte Hydrolyse eines solchen Inhibitors unter Verwendung von Trypsin bei pH 3 [Birk et al. (1967) Biochem. Biophys. Acta 147, 402-404] ohne Reduktion Disulfid-verknüpfte Fragmente ergibt, die die tPA-Inhibitionsaktivität bewahren.
  • Wenn jedoch die begrenzte Hydrolyse gefolgt wurde von Reduktion der zwei Disulfidbrücken und S-Carboxymethylierung mit Jodazetat, ging die tPA-Aktivität verloren.
  • Reduktion der Disulfidbrücken des intakten tPA-Inhibitors, gefolgt von S-Carboxymethylierung, führte auch zum Verlust der tPA-Inhibitionsaktivität.
  • Diese Untersuchungen stützen die Ansicht, daß die zwei Disulfidbrücken für die tPA-Inhibitionsaktivität wichtig sind.
  • Beispiel 13 Isolation von tPA und Pro-tPA aus dem Medium einer menschlichen Melanomzellkultur durch Affinitätschromatographie (i) Zubereitung von immobilisiertem tPA-Inhibitor zur Verwendung als Affinitätsreagens
  • tPA-Inhibitor wurde aus Samen von Erythrina caffra wie im Beispiel 4 beschrieben isoliert. Zur Bereitung eines zur Verwendung als Affinitätsreagens geeigneten tPA-Inhibitors wurden 200 mg des gereinigten Inhibitors an 40 ml gequollene, CNBr-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia) nach Herstellerangaben angebunden. Die Bindung wurde durchgeführt bei Zimmertemperatur und wurde überwacht durch A&sub2;&sub8;&sub0; Messungen am Überstehenden und durch SDS-PAGE. Binnen zweieinhalb Stunden war anhand des Spektrums kein Protein in der Lösung nachweisbar, und dies wurde durch SDS-PAGE bestätigt. Immobilisierter tPA-Inhibitor wurde zum sofortigen Gebrauch vorbereitet durch Ausgleich in einer Pufferlösung (0,01M Natriumphosphat, pH 7,4, mit 0,04 M Natriumchlorid, 0,1% Triton X-100 und 0,02% Natriumazid als Stabilisator).
  • Das vorbereitete Affinitätsreagens wurde dann in eine gebrauchsfertige Säule (2,3 · 9,6 cm) gepackt.
  • Als alternative Prozedur wurde der Inhibitor auch auf anderen Matrizen immobilisiert, die mechanisch stabiler als Sepharose 4 B sind, wie z. B. Fractogel oder quervernetzte Agarose, um Chargenverarbeitung bei Produktion im großen Maßstab als mögliche Alternative zum Säulenverfahren zu erleichtern.
  • (ii) Zellkultur und Zubereitung eines tPA/Pro-tPA-haltigen konditionierten Mediums
  • Die menschliche Melanomzellinie RPM 1 7272 (Bowes- Melanom), eingerichtet von Dr. George Moore aus Denver, Colorado, lieferte eine tPA-Quelle. Eine Unterkultur dieser Linie wurde zur Verfügung gestellt von Dr. E. Reich von der Rockefeller Universität, New York. Die Zellen wurden gehalten in 75cm²-Flaconflaschen bei 37ºC in einer feuchten Atmosphäre aus 95% Luft und 5% CO&sub2;. Konfluente adhärente Einzelschichtkulturen enthielten ca. 1 · 10&sup7; Zellen. Diese wurden bedeckt mit 20 ml RPMI 1640-Medium, bezuschlagt mit 10% wärmeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 300 Einheiten pro ml Penicillin und 200 ug/ml Streptomycin. Serumfreie Ernteflüssigkeiten wurden gewonnen durch mehrmaliges Spülen der Einzelschichten mit vorgewärmtem (37ºC) RPMI 1640 und Bedecken der Zellen mit 20 ml desselben Mediums. Nach 24 Stunden wurde das tPA/Pro-tPA-haltige konditionierte Medium gesammelt und durch frisches, serumfreies Medium ersetzt. Mehrere (normalerweise 3-4) serumfreie Ernteflüssigkeiten von aufeinanderfolgenden 24 Stunden konnten gesammelt werden, bevor die Kulturen Auffrischung durch erneute Zugabe von serumhaltigem Medium erforderten. Aprotinin (Sigma) wurde den Medien in einer Konzentration von 20 KIU/ml zugesetzt, um die Umwandlung von einkettigem Pro-tPA in zweikettigen tPA zu verhindern.
  • Für die Lagerung wurden die Ernteflüssigkeiten zentrifugiert, um Zellbruchstücke zu beseitigen und bezüglich Triton X-100 0,1% gemacht. Derart behandelte Ernteflüssigkeiten konnten bei -20 Grad Celsius mindestens 6 Monate lang ohne erkennbaren Verlust von Enzymaktivität gelagert werden.
  • (iii) Affinitätschromatographie
  • Chargen von in (ii) beschrieben zubereiteter Melanomzellernteflüssigkeit wurden aufgetaut und mit 0,1 M in NaOH auf pH 7,4 eingestellt und bezüglich NaCl und 0,1% Triton X-100 0,4 M gemacht. Natriumazid wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,02% zugesetzt. Jede Charge, mit Volumina zwischen 1-8 Litern, wurde dann durch Whatman-541-Papier gefiltert und mit 90 ml/h bei 4 Grad Celsius durch eine 40-ml-Säule mit tPA-Inhibitor-Agarose, wie oben unter (i) beschrieben vorbereitet, gepumpt. In allen Fällen beseitigte die Säule wirksam alle Enzymaktivität aus der Ernteflüssigkeit. Anschließendes Spülen mit 5 Säulen-Volumina von Ausgleichspuffer konnte das Enzym nicht verdrängen. Elution des tPA/Pro-tPA wurde erreicht mit einer Lösung von 1,6 M KSCN in Ausgleichspufferlösung.
  • Die Ergebnisse eines typischen Chromatographiedurchlaufs sind in Fig. 2 dargestellt. In diesem Experiment wurden 6 Liter Ernteflüssigkeit, die in Gegenwart von Aprotinin gesammelt worden war, durch die Säule gepumpt. Die nicht absorbierte Fraktion enthielt keine meßbare tPA-Aktivität, aber eine große Anzahl anderer Proteine, die durch SDS-PAGE sichtbar waren. Der absorbierte tPA/Pro-tPA wurde mit 1,6 M KSCN als einzelner Peak amidolytischer Aktivität eluiert, der einem einzelnen, ähnlich geformten Peak bei 280 nm Absorption entsprach. Die amidolytische Aktivität dieses Peaks [bestimmt nach den Verfahren von Zimmerman et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1987) 75, 750] wurde durch Behandlung mit Plasmin ungefähr achtfach verstärkt, was darauf hinweist, daß diese Fraktion im wesentlichen einkettigen Pro-tPA enthielt.
  • Analysen des enzymhaltigen Peaks zeigten, daß die Säule hochselektiv als Affinitätsreagens für tPA/Pro-tPA war, und daß das meiste Enzym tatsächlich in einkettiger Form vorlag. Elektrophorese des gereinigten Enzyms unter nicht reduzierenden Bedingungen zeigte zwei hervorstechende, eng benachbarte Proteinbanden mit scheinbaren Molekülgewichten von 73000 und 70000 Dalton. Eine dritte weniger starke Bande bei 68000 Dalton war auch sichtbar. Bei manchen Durchläufen wurden Spuren einer Spezies mit 115000 Mr beobachtet. All diese entsprachen Banden fibrinolytischer Aktivität, die durch einen Antikörper gegen die tPA-Komponente mit 70000 Dalton spezifisch inhibiert wurden. Keine Proteine außer solchen der tPA-Familie wurden in silbergefärbten Gels der gereinigten Enzymprobe gesehen.
  • Unter reduzierenden Bedingungen elektrophoriert blieb das Dublett bei 72000 Dalton erhalten, und nur Spuren zweier Streifen mit scheinbaren Molekülgewichten von 38000 und 35000 wurden sichtbar. Inkubation des eluierten Enzyms mit Plasmin wandelte das ganze Protein in die Formen mit 38000 und 35000 Dalton um.
  • Wir geben eine Zusammenfassung der Ergebnisse von 6 Reinigungsdurchläufen.
  • Im Durchschnitt enthielten mit Melanomzellen konditionierte Medien zirka 90 mg Protein/Liter, von denen 0,3 mg/Liter in der Säule absorbiert und mit KSCN eluiert wurden. Der Gesamt-tPA-Gehalt der Ernteflüssigkeit war zirka 15000 FU/Liter. Das KSCN-Eluat enthielt durchschnittlich 96% der amidolytischen Aktivität, die 270-fach gereinigt war.
  • Eine befriedigende Eluierung des tPA aus dem tPA-Inhibitor-Affinitätsreagens am Ende des Reinigungsvorgangs kann auch mit anderen Lösungen, so z. B. einer sauren Harnstofflösung (2 M Harnstoff, 0,2 M NH&sub4;OAc, pH 4) erreicht werden.
  • Beispiel 14 Reinigung von durch DNA-Rekombinationstechnologie erhaltenem tPA und Pro-tPA unter Verwendung eines immobilisiertem tPA-Inhibitors
  • tPA/Pro-tPA-haltige Lösungen wurden durch Anwendung von DNA-Rekombinationstechnologie wie zuvor in der europäischen Patentanmeldung 0093619 (4.5.1983) offenbart erhalten.
  • Ein für tPA codierendes Gen wurde in einen Expressionsvektor an einer zur Expression geeigneten Stelle eingefügt, und der resultierende Vektor wurde verwendet, um Trägerzellen zu transformieren. Die transformierte Trägerzellinie, in der das für tPA codierende Gen exprimiert wurde, wurde auf einem festen Träger in flüssigem Medium oder durch Wachstum in einer nährstoffhaltigen Suspension gehalten. Nährstoffe wurden im wesentlichen zugefügt durch Zusatz von Serum zum Medium. Antiplasmine, z. B. Aprotinin wurden vor der Ernte zugesetzt, um unerwünschte Umwandlung von einkettigem tPA (Pro-tPA) in die zweikettige Form zu verhindern.
  • Bei diesem Verfahren enthält tPA/Pro-tPA-haltige Ernteflüssigkeit auch unerwünschte Serumproteine, die entfernt werden sollten, um tPA/Pro-tPA von medizinischer Qualität zu erhalten, der zur Behandlung menschlicher Patienten geeignet ist.
  • Die Reindarstellung von tPA/Pro-tPA aus mit Serum angereichertem Medium wurde auf die folgende Weise erreicht:
  • tPA/Pro-tPA-haltige Lösungen mit neutralem pH oder leicht darüber wurden mit ca. 30 ml/h bei 4ºC in eine 1,5 · 7 cm Säule mit wie im Beispiel 6 (i) vorbereitetem, immobilisierten tPA-Inhibitor geladen. Der adsorbierte tPA/pro-tPA wurde mit 1,6 M KSCN eluiert. Die Rückgewinnung des tPA erreichte 90%, gemessen durch A&sub2;&sub8;&sub0; und tPA-Aktivität. Die Reinheit des eluierten tPA war 85%, gemessen anhand spezifischer Aktivität und mit SDS-PAGE.
  • Es wurde festgestellt, daß die Säulenkapazität 2-5 mg tPA pro ml betrug. Die Säulenkapazität einer mit nach dem Verfahren von Joubert et al. [Joubert et al., Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem. (1981), 362, 531-538] bereitetem immobilisiertem tPA-Inhibitor gefüllten Säule wurde mit circa 1 mg tPA/pro ml Säule als wesentlich niedriger festgestellt.
  • Um tPA aus serumhaltigen Medien zum medizinischen Gebrauch angemessen zu reinigen, sind zusätzlich zur Affinitätsreinigung unter Verwendung immobilisierten tPA-Inhibitors wie oben zusätzliche Schritte erforderlich. Z.B. hat sich das folgende Protokoll als angemessen erwiesen:
  • SCHRITT 1 - Affinitätschromotographie unter Verwendung von wie im Beispiel 6 (i) zubereitetem immobilisierten tPA-Inhibitor, um das Flüssigkeitsvolumen zu verringern und hohe Ausbeute und hohe Reinheit in einem Schritt zu erreichen.
  • SCHRITT 2 - Carboxymethylsepharose (Ionenaustauschreinigung) oder Lektine oder HPLC.
  • SCHRITT 3 - S-200 oder S-300 (Pharmacia) (Sephacryl).
  • Nach einem herkömmlichen Feinfiltrationsschritt liefern diese drei Prozeßschritte tPA von 98-100% Reinheit.

Claims (12)

1. Proteinreagens mit der Fähigkeit, reversibel an tPA und/oder Pro-tPA zu binden, mit einem Kunitz-Proteaseinhibitor, der aus Samen einer Erythrina-Art erhältlich ist, ein Molekulargewicht im Bereich 17000-23000 Dalton hat, nicht cytotoxisch ist, die Fähigkeit hat, tPA, Pro-tPA und Trypsin, nicht aber Urokinase oder Trombin zu inhibieren, der zwei Disulfidbrücken hat, der Val als N-Terminus-Aminosäurerest hat und frei von Proteasen ist.
2. Proteinreagens mit der Fähigkeit, tPA und/oder Pro-tPA reversibel zu binden, mit einem Kunitz-Proteaseinhibitor, der folgende Aminosäuresequenz hat:
und zwei Disulfidbrücken an den folgenden Positionen besitzt:
Cys 39 nach Cys 83 und Cys 132 nach Cys 139,
oder der eine funktionsmäßig analoge Aminosäuresequenz besitzt, die mit der angegebenen Sequenz in dem Bereich, der die Positionen 39 bis 139 enthält, zu mehr als 85% homolog ist, zwei Disulfidbrücken hat und Val in der N-Terminusposition besitzt, wobei das Proteinreagens nicht cytotoxisch ist, die Fähigkeit hat, tPA, Pro-tPA und Trypsin, nicht aber Urokinase oder Trombin zu inhibieren und frei von Proteasen ist.
3. Reagens nach Anspruch 2, bei dem der Inhibitor die folgende Aminosäuresequenz hat:
4. Reagens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei den der Inhibitor wenigstens 80 Gew.-% des Proteinreagens bildet.
5. Reagens nach Anspruch 4, bei dem der Inhibitor wenigstens 90 Gew.-% des Proteinreagens bildet.
6. Reagens nach einen der Ansprüche 1-3, bei dem die spezifische tPA-und/oder Pro-tPA- Inhibitionsaktivi taut des Proteinreagens wenigstens 60000 IU/mg beträgt.
7. Reagens nach einen der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Trypsin-Bindungsstelle blockiert ist.
8. Reagens nach Anspruch 1, modifiziert durch begrenzte Proteolyse unter Erhaltung der zwei Disulfidbrücken.
9. Reagens nach einen der vorhergehenden Ansprüche, auf einem Träger immobilisiert.
10. Verwendung eines Reagens nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Isolation von tPA und/oder Pro-tPA aus einer wäßrigen Lösung desselben, die Verunreinigungen enthält.
11. Verwendung nach Anspruch 10, bei der die wäßrige Lösung mit dem Proteinreagens in immobilisierter Form in Kontakt gebracht wird, wobei der tPA und/oder Pro-tPA in der Lösung selektiv absorbiert wird, Entfernen des immobilisierten Reagens aus der wäßrigen Lösung und den nicht absorbierten Verunreinigungen, und Entfernen des tPA und/oder Pro-tPA vom immobilisierten Reagens.
12. Verfahren zur Herstellung eines Proteinreagens nach Anspruch 1, bei dem eine wäßrige Lösung, die das Reagens zusammen mit Verunreinigungen enthält, einem oder mehreren Fraktionierungsschritten unterworfen wird, einschließlich (A) Chromatographie unter Verwendung eines hydrophoben Gels; (B) Größenausschluß-Chromatographie; (C) Ionenaustausch-Chromatographie; mit Auswahl jener Fraktionen, die als das Reagens enthaltend identifiziert werden und Ausschluß aller proteasehaltigen Fraktionen.
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