DE3645095C2 - Antikörper - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen 1 bis 8 angegebenen Antikörper, die spezifisch für ein aus
Leukozyten erhältliches Polypeptid sind, sowie die Verwendung
dieser Antikörper zur Detektion der Polypeptide nach Anspruch 9.
Leukozyten, sowohl Lymphozyten als auch Monozyten wurden mit
einbezogen in die Inhibierung von Tumorwachstum bei verschiedenen
Tier-Tumor-Modellen. Das erhöhte Auftreten von bösartigen
Erkrankungen bei immunokompromittierten Menschen stützt
das Argument, daß die weißen Blutzellen eine Rolle in der Regulierung
des neoplastischen Wachstums spielen. Proteinfaktoren,
die durch diese weißen Zellen produziert sind, die das
Tumorwachstum inhibieren oder Immunfunktionen modulieren,
welche bereits isoliert und charakterisiert sind, schließen
die Interferone, α- und γ-Tumor-Nekrosefaktor, Lymphotoxin,
Interleukin-2 und andere Lymphokine ein. Da jeder dieser
isolierten Faktoren ein verschiedenes Aktivitätsspektrum
besitzt und in Verbindung mit anderen Faktoren unterschiedlichen
Einfluß ausüben kann, besteht weiterhin ein fortgesetztes
und ernsthaftes Interesse an der Isolation und Charakterisierung
all der Faktoren, welche weiße Zellen bei der
Modulierung von Zellwachstum oder Immunfunktionen produzieren.
Diese Verbindungen können einzeln oder zusammen Anwendung
bei der Behandlung oder Diagnose von Krebs, als Beschleuniger
bei der Wundheilung oder als Immunmodulatoren
für die Behandlung von Patienten mit Immun-Mangelerscheinungen,
Autoimmunität, Organtransplantaten u. dgl. finden.
Es gibt zahlreiche Schwierigkeiten, die bei der Auffindung,
Isolierung, Reinigung oder Charakterisierung von natürlich
vorkommenden Faktoren auftreten können. Es müssen Arbeitsweisen
zum Abtrennen und Reinigen eines interessierenden Faktors
von anderen Faktoren im rohen Ausgangsmaterial ohne Denaturierung
der Aktivität des gewünschten Faktors entwickelt werden.
Bioassays müssen entwickelt werden, welche die Identifizierung
der Fraktionen während der Abtrennungen, welche einen
bestimmten Faktor konzentrieren, erlauben. Ein neuer Faktor
muß unterschieden werden von Faktoren, die bereits bekannt
sind oder anderen Faktoren, welche vorliegen können und den
erstrebten Faktor entweder negativ oder positiv in seiner
Wirkung beeinflussen können. Der gereinigte Faktor muß charakterisiert
werden. Der gereinigte Faktor muß auf ausreichende
Mengen aufkonzentriert werden, um seine Identifizierung
und Charakterisierung zu ermöglichen. Mit der ansteigenden
Zahl der Faktoren, die isoliert sind, wird jeder neue
Faktor schwieriger zu identifizieren, da seine Rolle und
Funktion durch die zahlreichen anderen vorliegenden Faktoren
verdeckt sein kann.
Beal et al., Cancer Biochem. Biophys. (1979) 3: 93-96 berichten
über das Vorhandensein von Peptiden in menschlichem Urin,
welche das Wachstum und die DNA-Synthese eher in transformierten
als in normalen Zellen inhibieren. Holley et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. (1980) 77: 5989-5992 beschreiben die
Reinigung von Epithelzellen-Wachstumsinhibitoren. Letansky,
Biosci. Rep. (1982) 2: 39-45 berichtet, daß aus Rinderplacenta
gereinigte Peptide das Tumorwachstum und die Thymidin-Einlagerung
in DNA in einem größeren Maße in Neoplasma inhibieren
als in normalen Zellen. Chen, Trends Biochem. Sci. (1982)
7: 364-365 berichtet über die Isolierung eines Peptids aus
Ascites-Flüssigkeit mit einer krebsunterdrückenden Eigenschaft.
Redding und Schally, Proc. Natl. Acad. Sci. (1982)
79: 7014-7018 berichten über die Isolation von gereinigtem
Peptid bzw. Peptiden aus Schweine-Hypothalamus, welche antimitogene
Aktivität gegen mehrere normale und Tumorzellinien
zeigen. Sone et al., Gann (1984) 75: 920-928 berichten über
die Produktion eines oder mehrerer Faktoren, die durch
menschliche Makrophagen produziert werden und das Wachstum
gewisser Tumorzellen in vitro inhibieren. Ransom et al.,
Cancer Res. (1985) 45: 851-862 berichten über die Isolation
eines Leukoregulin genannten Faktors, der die Replikation von
bestimmten Tumorzellinien inhibiert und sich vom Lymphotoxin,
Interferon und Interleukin 1 und 2 zu unterscheiden scheint.
Die meisten dieser Faktoren sind weder vollständig charakterisiert
noch sind ihre Primärstrukturen bekannt.
Aggarwal et al., J. Biol. Chem. (1984) 259: 686-691 reinigten
und charakterisierten menschliches Lymphotoxin (LT), das
durch eine Lymphoblastoid-Zellinie produziert wird, und
klärten anschließend die Sequenz von LT auf (Aggarwal et
al., J. Biol. Chem. (1985) 260: 2334). Gamma-Interferon (γ-IF),
welches von Lymphoid-Zellen produziert wird und immunmodulatorische
und tumorinhibitorische Wirkung hat, wurde kloniert
und exprimiert. (Gray et al., Nature (1982) 295: 503-508).
Der Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), welcher das Wachstum
von einigen Tumoren inhibiert und durch Makrophagen und bestimmte
Leukämie-Zellinien produziert wird, wurde charakterisiert,
und die TNF-cDNA wurde kloniert und in E. coli
exprimiert (Pennica et al., Nature (1984) 312: 724).
Durch die Erfindung werden Antikörper, die spezifisch für ein
aus Leukozyten erhältliches Polypeptid sind, zur Verfügung
gestellt, wobei das Polypeptid zur Inhibition der Prolideration
von neoplastischen Zellen fähig ist, die Proliferation
von normalen menschlichen Fibroplasten zu stimulieren vermag,
menschlichen proliferativen und zytotoxischen T-Zell-Response
nicht inhibiert und granulozytische/myelozytische Knochenmarkskolonie-Zellbildung
nicht inhibiert, ein Molekulargewicht
im Bereich von 17 bis 19 kD, bestimmt durch Gel-Exklusionschromatographie,
und von 28 kD, bestimmt durch SDS-PAGE,
besitzt und relativ unempfindlich gegenüber mäßiger Säure
bzw. Base und stabil gegen Wärmebehandlung bei 56°C ist.
Bevorzugte Antikörper gemäß der Erfindung sind Gegenstand der
Unteransprüche 2 bis 8.
Die beiliegende Zeichnung zeigt
Fig. 1 die Aminosäuresequenz von Fragmenten des
Polypeptids Oncostatin M.
Ein Polypeptid, das unter die angegebene Definition fällt und
als Oncostatin M bezeichnet wird, ist erhältlich aus Leukozyten,
z. B. aus konditionierten Medien von stimulierten U937-Zellen
oder konditionierten Medien von stimulierten normalen
menschlichen Peripheren-Blutlymphozyten (PBL). Für Fragmente
und Mutanten des Polypeptids mit der biologischen Aktivität
des intakten Oncostatin M, wie Zellwachstumsmodulations-Aktivität
oder immunologische Aktivität, sind die erfindungsgemäßen
Antikörper ebenfalls spezifisch.
Die Polypeptid-Fragmente sind Polypeptide mit mindestens 8
Aminosäuren, die biologisch aktiv sind, zumindest immunologisch
kreuzaktiv mit natürlich vorkommendem Oncostatin M.
Unter immunologisch kreuzreaktiv wird verstanden, daß ein
durch ein Polypeptid induzierter Antikörper kreuzreagiert mit
intaktem Oncostatin M, zumindest wenn Oncostatin M in einem
denaturierten Zustand vorliegt. Diese Polypeptide sind deshalb
nützlich zur Induzierung von Antikörpern für Oncostatin
M, welche zur Bestimmung der Konzentration von Oncostatin M
in einer Körperflüssigkeit verwendet werden können, weiterhin
zur Bindung an Oncostatin M und somit zur Modulation seiner
Aktivität, und zur Reinigung von Oncostatin M, z. B. durch
Verwendung in einer Affinitätssäule. Ein Anteil der Polypeptide
kann auch die Zellwachstumsmodulations-Aktivität des intakten
Oncostatin M behalten, obwohl die Aktivität moduliert
sein kann, gewöhnlich reduziert im Vergleich zum intakten
Oncostatin M.
Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenz von Poly(aminosäure bzw.
-säuren), die kreuzreaktiv mit Oncostatin M sind, wobei die
erste Sequenz das N-Ende von Oncostatin M darstellt.
Die Poly(aminosäure bzw. -säuren) enthalten eine Aminosäuresequenz
mit mindestens 8 aufeinanderfolgenden Aminosäuren,
die einer in Fig. 1 dargestellten Aminosäuresequenz entsprechen
und von dieser Sequenz durch nicht mehr als 3, gewöhnlich
nicht mehr als eine Aminosäure verschieden sind. Die
Differenz kann entweder in der Einfügung einer Aminosäure,
der Fehlstelle einer Aminosäure oder der Substitution einer
Aminosäure durch eine andere, insbesondere in einer konservativen
Substitution, bestehen. Normalerweise enthalten die
Poly(aminosäure bzw. -säuren) mindestens 10, insbesondere
mindestens 12 aufeinanderfolgende Aminosäuren, die der in der
Figur dargestellten Sequenz entsprechen und durch nicht mehr
als eine Aminosäure unterschieden sind.
Für die Zwecke der Erläuterung sind verschiedene Aminosäuren
in eine Anzahl von Unterklassen eingeteilt. Die folgende Tabelle
zeigt die Unterklassen:
Unter konservativer Substitution wird verstanden, daß Aminosäuren
aus derselben Unterklasse (d. h. entweder neutrale aliphatische,
saure aliphatische, basisch aliphatische oder
aromatische), insbesondere derselben Polarität für einander
ausgetauscht werden können. Vorzugsweise bilden Aminosäuren
mit zwei bis vier C-Atomen oder fünf bis sechs C-Atomen Monomer-Gruppierungen
in der aliphatischen Unterklasse.
Die Poly(aminosäure)n besitzen nicht mehr als ca. 1000 Aminosäuren
in der Länge. Gewöhnlich haben sie weniger als 100
Aminosäuren, insbesondere weniger als 50 Aminosäuren. So können
die Poly(aminosäure)n leicht synthetisiert werden. Wenn
die Poly(aminosäure)n über 100 Aminosäuren in der Länge besitzen,
dann können die Poly(aminosäure)n Polymere von Fragmenten
von Oncostatin M mit jeweils weniger als 100 Aminosäuren
sein oder Fusions-Proteine, bei denen das Fragment
durch Fusion an ein Antigen, Enzym, Enzymfragment u. dgl.
gebunden ist. Insbesondere die Poly(aminosäure)n mit höherem
Molekulargewicht können mindestens ein Polypeptid-Fragment
mit weniger als 100 Aminosäuren sein, das kovalent an einen
großen immunogenen Polypeptidträger gebunden ist, um immunogene
Eigenschaften zu schaffen. Beispiele für solche Proteinträger
sind Rinderserumalbumin, Keyhole-Limpet-Hämozyanin
(KLH) u. dgl. Diese konjugierten Polypeptide sind nützlich
für das Induzieren von Antikörpern in einem geeigneten Wirtsorganismus.
U937-Zellen sind eine Zellinie, die aus einer histiozytischen
Lymphom-Zellinie abgeleitet sind (Sundstrom und Nilsson, Int.
J. Cancer (1976) 17: 565-577), die induziert werden können,
in Zellen mit Charakteristika von Makrophagen zu differenzieren,
gefolgt von einer Behandlung mit einer Vielzahl von
Mitteln (Harris et al., Cancer Res. (1985) 45: 9-13). Für die
Herstellung von Oncostatin M kann man die U937-Zellen in
einem konventionellen Nährmedium mit Serum wachsen lassen und
mit einem geeigneten Inducer behandeln. Herkömmliche Phorbole
oder Ingenole können verwendet werden, insbesondere 12-0-Tetradecanoylphorbol-13-acetat
(TPA). Gewöhnlich werden ca. 5-20 ng/ml
des Inducers verwendet. Die anfängliche Zellzahl
liegt bei etwa 10⁵-10⁶ Zellen/ml.
Nachdem man den Inducer eine ausreichende Zeit auf die Zellen
einwirken ließ, normalerweise drei bis sechs Tage, wird der
Überstand entfernt, die Zellen werden mit serumfreien Nährmedium
gewaschen, angeheftete Zellen werden wiederum mit serumfreiem
Medium gewaschen und dann werden die Zellen während
mindestens 12 Stunden, gewöhnlich nicht mehr als ca. 48 Stunden,
in einem serumfreien Nährmedium z. B. RPMI-1640 inkubiert.
Überstände werden dann gesammelt, und die Zellen werden
durch Zentrifugation entfernt. Die zellfreien Überstände
werden auf Zellwachstum-Inhibitionsaktivität (GIA) geprüft.
Der Überstand enthält ungefähr 50 bis 500 Einheiten GIA/ml.
Oncostatin M kann auch erhalten werden aus Mitogen-stimulierten
normalen menschlichen peripheren Blutlymphozyten (PBL′s).
PBL′s können isoliert werden aus Leuko-Fraktionen durch Verdünnen
der Fraktionen und Zentrifugieren über Ficoll-Gradienten.
Zellen, die aus der Gradienten-Zwischenschicht gesammelt
werden, werden gewaschen und schocklysiert, um die roten
Blutzellen zu entfernen. Die verbleibenden Zellen werden aus
der Lösung durch Zentrifugation abgetrennt, in Serum und
Thrombin enthaltendem Puffer resuspendiert, aufgeschüttelt,
und dann läßt man das plättchenartige Aggregat während einer
kurzen Zeitdauer absetzen. Die suspendierten Zellen werden
transperiert, durch Zentrifugation wiedergewonnen, in Serum
resuspendiert und auf eine Nylonwolle enthaltende Säule
transferiert. Die Säule wird inkubiert, um das Anheften von
Monozyten und B-Lymphozyten zu ermöglichen, und dann gewaschen.
Die meisten peripheren Blutt-T-Lymphozyten haften nicht
und werden aus der Säule eluiert. Diese Zellen werden bei
37° in Kulturmedium, z. B. RPMI-1640-Medium kultiviert und
mit einem geeigneten Inducer, z. B. Phytohämagglutinin (ca. 1
bis 5 mg/l) während ca. 100 Stunden behandelt, worauf die
Überstände gesammelt werden. Die Überstände werden zentrifugiert,
um Zellen zu entfernen und durch Ultrafiltration oder
Dialyse konzentriert.
Nach der Isolation des zellfreien Überstandes aus entweder
U-937-Zellen oder normalen PBL′s, wird das konditionierte
Medium konzentriert, herkömmlich unter Verwendung eines Hohlfasersystems
oder einer Ultrafiltrationsmembran, gefolgt von
Verdünnung mit Essigsäure (bis zu einer Konzentration von
0,1N-Essigsäure), gefolgt von einer Konzentrierung auf das
ungefähr Zehnfache und eine wiederholte Verdünnung und Konzentrierung.
Die Konzentrate können lyophilisiert und direkt
verwendet werden, oder das gefriergetrocknete Produkt kann
für eine weitere Reinigung verwendet werden.
Das Oncostatin M kann durch ein Gel-Permeations-Chromatographie-Verfahren
gereinigt werden unter Verwendung von wäßrigem
40% Acetonitril-0,1% Trifluoressigsäure als isokratische
mobile Phase auf einer Bio-sil TSK250-Säule, unter Überwachung
der Aktivität jeder der Fraktionen. Durch Reinigung
wird eine Zusammensetzung erhalten, die mindestens ca. 0,5-5×10⁴-GIA-Einheiten/ml
in den aktiven Fraktionen besitzt.
Das teilweise gereinigte Produkt aus der Gel-Permeations-Chromatographie
kann weitergereinigt werden durch Anwendung
der Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie unter
Anwendung eines linearen Gradienten, wobei das primäre Lösungsmittel
0,1%ige Trifluoressigsäure in Wasser und das
sekundäre Lösungsmittel Acetonitril ist, das 0,1% Trifluoressigsäure
enthält. Das Schema kann variiert werden, wobei
die Chromatographie im allgemeinen ca. 3-4 Stunden dauert
und der Hauptzeit-Aufwand von mehr als ca. 50% der Zeitdauer
und nicht mehr als ca. 80% der Zeitdauer im Bereich von 30-45%
des sekundären Lösungsmittels verstreichen. Unter diesen
Bedingungen eluieren die aktiven Fraktionen bei ca. 41-42%
Acetonitril.
Die gepoolten Fraktionen können weiter gereinigt werden durch
Wiederholung der Umkehrphasen-HPLC, wobei ein schnellerer
Wechsel bei den Gradienten-Bedingungen vorgenommen und eine
langsamere Durchflußrate angewendet wird. Unter diesen Bedingungen
taucht die Aktivität bei ungefähr 40,5-41,5% Acetonitril
auf.
Die Umkehrphasen-HPLC kann dann wiederholt werden, indem das
Lösungssystem geändert wird, wobei das sekundäre Lösungsmittel
n-Propanol-0,1% Trifluoressigsäure ist. Ein linearer
Gradient wird angewendet, wobei der Gradient im Bereich zwischen
23 und 35% n-Propanol langsam verändert wird. Die
Hauptaktivität wird im Bereich von 25,5-27,5% Propanol
beobachtet und ein im wesentlichen homogenes Produkt erhalten
mit einer spezifischen Aktivität größer als 10 GIA-Einheiten/ng-Protein.
Normalerweise wird das Produkt gereinigt, um eine
spezifische Aktivität von mindestens ca. 100 GIA-Einheiten/ng-Protein
zu erreichen, insbesondere 150 GIA-Einheiten/ng.
Wie beschrieben sind die Polypeptide charakterisiert durch
ein Molekulargewicht von ca. 17 bis 19 KiloDalton (kD), insbesondere
ca. 18 kD, bestimmt durch Größenausschlußchromatographie.
Die Verbindungen sind weiterhin gekennzeichnet durch
ein scheinbares (apparent) Molekulargewicht von annähernd 28
kD, bestimmt durch Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unter reduzierenden
oder nichtreduzierenden Bedingungen.
Die Aminosäuresequenz von Fragmenten von gereinigtem Oncostatin M
wurde analysiert. Oncostatin hat im wesentlichen die
Aminosäuresequenzen, die in Fig. 1 angegeben sind. In Fig. 1
erläutert die erste Sequenz das N-Ende von Oncostatin M, während
die verbleibenden Sequenzen innere Fragmente des Polypeptids
darstellen.
Oncostatin M ist weiterhin gekennzeichnet durch seine Aktivität
gegenüber bestimmten Zellstämmen. Dem Polypeptid fehlt
zytotoxische Aktivität gegen WI26 und WI38 menschliche Fibroplasten
und Mäuse L929-Zellen, welche sensitiv gegenüber Tumor-Nekrosefaktor
sind, und gegen eine γ-Interferonempfindliche
menschliche Tumorzellinie. Es hat sich auch herausgestellt,
daß es die Proliferation von normalen menschlichen T-Lymphozyten
nicht inhibiert und auch nicht die granulozytische/myelozytische
Koloniebildung von Knochenmarkszellen bei
Konzentrationen bis zu 100 GIA-Einheiten/ml. Weiterhin stimuliert
Oncostatin M Proliferation von normalen menschlichen
Fibroplasten, wie am Beispiel von WI38- und WI26-Zellen gezeigt,
und inhibiert die Proliferation von Tumorzellen wie
A375, HBT10, A549 und SK-MEL28, und kann das Wachstum von
Koloniebildungszellen von normalem Knochenmark vermehren.
Oncostatin M unterdrückt nicht den menschlichen proliferativen
oder zytotoxischen T-Zell-Response im gemischten Leukozytenkulturreaktionen
(MLC) bei Konzentrationen von 500 GIA-Einheiten/ml.
Es wurde gefunden, daß das erfindungsgemäße Polypeptid stabil
gegen mäßige Säure bzw. Base und auch gegen Wärmebehandlung
bei 56°C ist.
Die Aminosäuresequenz der Polypeptide kann vollständig bestimmt
werden unter Anwendung handelsüblich erhältlicher
Sequenzanalysier-Einrichtungen. Das Polypeptid kann synthetisiert
werden in Übereinstimmung mit bekannten Techniken,
unter Anwendung automatisierter Syntheseeinrichtungen, die
ebenfalls kommerziell erhältlich sind.
Alternativ können die Polypeptide durch Rekombinaten-DNA-Techniken
hergestellt werden. Aus einer partiellen Aminosäuresequenz
können Proben abgeleitet werden, welche dann für
das Screening einer menschlichen Genom-Bank verwendet werden
können. Die Bank kann eine cDNA-Bank oder eine Chromosomen-Bank
sein. Sind der oder die Klone einmal identifiziert als
ansprechend auf die Probe, dann können die Fragmente, welche
das Gen von Interesse enthalten, auf verschiedene Weise
identifiziert und in vielfältiger Weise manipuliert werden.
Das Fragment kann durch Endonuklease-Restriktion in der Größe
reduziert werden, wobei die erhaltenen Fragmente kloniert und
auf das Vorliegen der gewünschten Gene geprüft werden. Zellen,
die die Peptide produzieren oder vergrößerte Mengen des
Peptids produzieren, können zur Herstellung der Messenger-RNA
verwendet werden. Aus der Messenger-RNA kann Einzelstrang-cDNA
hergestellt werden. Die cDNA kann man dann an Gesamt-Messenger-RNA
aus einer Zelle, die, wenn überhaupt, nur wenig
von dem Polypeptid produziert, ansprechen lassen. Die nicht
ansprechende bzw. angeheftete cDNA kann dann isoliert und zur
Herstellung von ds cDNA verwendet werden, welche mit den Proben
gescreent werden kann.
Alternativ können DNA-Fragmente in λgt11 eingesetzt werden,
so daß die Kodierung der Fragmente abwärts von und im Rahmen
mit dem β-galactosidase-Gen erfolgen kann. Antikörper können
zu dem Oncostatin M-Polypeptid hergestellt und zum Screening
der erhaltenen fusionierten Proteine auf Kreuzreaktivität
verwendet werden. Auf diese Weise können Fragmente, die das
Polypeptid oder ein Fragment davon kodieren, identifiziert
und zur Identifizierung des gewünschten Gens verwendet
werden.
Ist einmal das vollständige Gen identifiziert, entweder als
cDNA oder als Chromosomen-DNA, dann kann es auf verschiedene
Weise zur Herbeiführung einer Expression manipuliert werden.
Wenn das Gen in einen Wirt exprimiert wird, der die Wildtyptranskriptionalen
und translationalen Regulationsregionen von
Oncostatin M erkennt, dann kann das vollständige Gen mit seinen
Wildtyp 5′- und 3′-Regulationsregionen in einen geeigneten
Expressionsvektor eingeführt werden. Verschiedene Expressionsvektoren
existieren unter Anwendung von Replikationssystemen
aus Säugetier-Viren, wie Simian-Virus 40, Adenovirus,
Rinder-Papillom-Virus, Vaccinia-Virus, Insekten-Baculo-Virus
u. dgl. Diese Replikationssysteme wurden entwickelt, um Marker
zu schaffen, welche eine Selektion von Transfektanten erlauben,
sowie bequeme Restriktionsstellen zu schaffen, in
welche die Gene eingesetzt werden können.
Wenn das Gen in einen Wirt exprimiert werden soll, welcher
die natürlich vorkommenden Wildtyp-transkriptionalen und
translationalen Regulationsregionen nicht erkennt, sind
weitere Manipulationen erforderlich. Eine Vielzahl von 3′-transkriptionalen
Regulationsregionen sind bekannt und können
außer- bzw. unterhalb des Stopcodons eingesetzt werden. Die
nichtkodierende 5′-Region oberhalb des strukturellen Gens
kann durch Endonuklease-Restriktion, Bal31-Resektion o. dgl.
entfernt werden. Andererseits kann, wo eine bequeme Restriktionsstelle
nahe dem 5′-Ende des strukturellen Gens vorhanden
ist, das strukturelle Gen restriktiert werden und ein Adaptor
verwendet werden zur Bindung der strukturellen Gene an die
Promoter-Region, wobei der Adaptor die verlorenen Nukleotide
des strukturellen Gens liefert. Verschiedene Strategien können
angewendet werden zur Schaffung einer Expressions-Kassette,
welche in der 5′-, 3′-Richtung der Transkription eine
transkriptionelle und translationelle Initiierungsregion besitzt,
welche auch Regulatorsequenzen für die Induzierung der
Regulation, das strukturelle Gen unter der transkriptionellen
und translationellen Steuerung der Initiierungsregion und
eine transkriptionelle und translationelle Terminierungsregion
einschließen kann.
Beispielhafte transkriptionelle Initiierungsreaktionen oder
Promoter umfassen für Bakterien, β-gal-Promoter, TAC-Promoter,
Lambda-Links- und -Rechts-Promoter usw.; für Hefe, glykolytische
Enzympromoter, wie ADH-I und -II-Promoter, GPK-Promoter
und PGI-Promoter sowie TRP-Promoter usw.; für Säugetier-Zellen,
SV40 Früh- und Spät-Promoter, Adenovirus Major-Spät-Promoter
usw. Wie bereits angedeutet, kann die Expressions-Kassette
innerhalb eines Replikationssystems für episomale
Aufrechterhaltung in einem geeigneten zellulären Wirt
vorhanden sein oder ohne ein Replikationssystem vorhanden
sein, wo es in das Wirts-Genom integriert werden kann. Die
DNA kann in den Wirt nach bekannten Techniken eingeführt
werden, z. B. durch Transformation unter Verwendung von mit
Calciumphosphat ausgefällter DNA, Transfektion durch Inkontaktbringen
der Zellen mit dem Virus, Mikroinjektion der DNA
in die Zellen u. dgl.
Ist das Gen einmal in den geeigneten Wirt eingeführt, dann
kann der Wirt wachsen und wird das strukturelle Gen exprimiert.
In einzelnen Fällen kann es wünschenswert sein, eine
Signalsequenz (Sekretionsleiter) oberhalb von und im Leserahmen
mit dem strukturellen Gen vorzusehen, wodurch die Sekretion
des strukturellen Gens und die Spaltung der Sekretionsleiter
ermöglicht wird, so daß das reife Polypeptid im
Überstand bereitgestellt wird. Ist eine Sekretion nicht vorgesehen,
dann können die Wirtzellen geerntet, unter herkömmlichen
Bedingungen lysiert und das gewünschte Produkt isoliert
und nach bekannten Techniken gereinigt werden, wie z. B.
durch Chromatographie, Elektrophorese, Lösungsmittelextraktion
u. dgl.
Die beschriebenen Polypeptide können zur Herstellung spezifischer
Antikörper für die Polypeptide verwendet werden, die
ihrerseits Anwendung in vivo oder in vitro finden können. Erfindungsgemäße
Verwendung sind Gegenstand von Anspruch 9.
Die Antikörper können auf herkömmliche Weise hergestellt werden,
z. B. durch Verwendung des Polypeptids als Immunogen
und Injizieren des Polypeptids in einen Säugetier-Wirt, z. B.
eine Maus, eine Kuh, eine Ziege, ein Schaf, ein Kaninchen u.
dgl., insbesondere zusammen mit einem Hilfsmittel, z. B. komplettem
Freunds-Hilfsstoff, Aluminiumhydroxid-Gel u. dgl. Der
Wirt kann dann geblutet werden und das Blut kann dann zur
Isolation der polyklonalen Antikörper verwendet werden, oder
im Falle der Maus, können die Peripheren-Blut-Lymphozyten
oder Milz-Lymphozyten (B-Zellen) zur Fusion mit einer geeigneten
Myelom-Zelle verwendet werden, um die Chromosomen für
die monoklonale Expression von für die Stoffe spezifischen
Antikörpern unsterblich zu machen.
Es können sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper
hergestellt werden, welche dann zur Diagnose oder Aufspürung
der Polypeptide in einer Probe, wie Zellen oder physiologischer
Flüssigkeit, z. B. Blut, verwendet werden können. Die
Antikörper können auch in der Affinitäts-Chromatographie zur
Reinigung der Polypeptide und zu ihrer Isolierung aus natürlichen
oder synthetischen Quellen verwendet werden. Die Antikörper
können auch Anwendung bei der Kontrolle bzw. Steuerung
der Menge der Polypeptide in Verbund mit Zellen in einer Kultur
oder in vivo Anwendung finden, wobei das Zellwachstum
modifiziert werden kann.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung,
insbesondere bevorzugter Ausführungsformen, nicht jedoch
zur Beschränkung.
U937-Zellen, eine histiozytische Lymphom-Zellinie (Sunstrom
und Nilsson, Int. J. Cancer (1976) 17: 565-577, wurden in
Rollflaschen bei einer Konzentration von
4×10⁵-Zellen/ml in einem Totalvolumen von 300 ml RPMI-1640-Medium,
das mit 10% fötalem Kalbsserum (FCS), Penicillin/Streptomycin
(PS), L-Glutamin und 10 ng/ml 12-0-Tetradecanoylphorbol-13-acetat
(TPA) ergänzt war. Vier Tage
später wurden die Überstände, die FCS und TPA enthielten,
entfernt. Die Rollflaschen wurden fünfmal mit serumfreiem
RPMI-1640 gewaschen, und die losgelösten Zellen (1×10⁵-Zellen/ml)
wurden dreimal mit serumfreiem Medium gewaschen
und in die Flaschen zurückgegeben, wobei ein Endvolumen von
125 ml serumfreiem RPMI-1640-Medium pro Rollflasche erhalten
wurde. Einen Tag später wurden die Überstände gesammelt, zur
Entfernung der Zellen zentrifugiert, durch 0,45 Mikron (µ)
Nalgen-Filter filtriert und unter Verwendung eines
Hohlfasersystems auf einem Volumen
von 150 ml (Anfangsvolumen 1500 ml) konzentriert. Oncostatin M
wurde auch aus Überständen von serumfreien, TPA-behandelten
U937-Zellen in 150 cm² Gewebekultur-Kolben isoliert.
Die Überstände wurden mit einer Amicon Diaflo-Membran PM-10
konzentriert, 10 kD abgeschnitten und dialysiert. Im Anschluß
an die Dialyse wurde das Konzentrat mit Essigsäure
verdünnt bis auf eine Endkonzentration von 0,1N Essigsäure
in 500 ml und auf 50 ml unter Verwendung eines Amicon-PM-10-Filters
konzentriert. Das 50-ml-Konzentrat wurde auf
400 ml mit 0,1N Essigsäure verdünnt und mit demselben Filter
auf 40 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde mit 1N Essigsäure
verdünnt und das erhaltene Präzipitat wurde durch Zentrifugation
entfernt. Das erhaltene Konzentrat wurde eingefroren
und gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Material
wurde für Reinigungsstufen verwendet.
Eine Bio-Sil TSK-250-Säule (600×21,5 mm) wurde
an ein Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie-System angeschlossen.
Die rohe Fraktion (10 mg/ml) wurde in 40% Acetonnitril
in 0,1% wäßriger Trifluoressigsäure (0,1% TFA)
aufgelöst. Eine 2-ml-Aliquot-Menge der Mischung wurde injiziert,
und die Elution isokratisch mit einer mobilen Phase
von 40% Acetonnitril in 0,1% TFA durchgeführt. Die Durchflußmenge
betrug 2,5 ml/min und die Geschwindigkeit der Verschiebung
wurde auf 0,25 cm/min eingestellt. 5 ml Fraktionen
wurden gesammelt. Die Chromatographie wurde bei Raumtemperatur
durchgeführt. Aliquote Mengen einer jeden Fraktion wurden
eingedampft und dreifach auf die Wachstumsinhibitor-Aktivität
(GIA) auf A375-Zellen untersucht.
Die aktiven Fraktionen 21 und 22) aus sechs
Durchläufen wurden gepoolt. Das gepoolte Material hatte eine
Gesamtmenge von annähernd 4,8×10⁵-GIA-Einheiten. Es wurde
gefunden, daß der Faktor ein scheinbares Molekulargewicht
(apparent molecular weight) von 18 kD besaß, bestimmt durch
Größenausschluß-Chromatographie (Bio-Sil TSK-250-Säule).
Gepoolte TSK-250-Fraktionen 21 und 22, die oben beschrieben
wurden, wurden mit 0,1% TFA auf das Zweifache verdünnt. Die
Mischung wurde auf eine µ-Bondapak-C18-Säule (7,8×300 mm)
(als C18¹ bezeichnet) bei Raumtemperatur isokratisch injiziert.
Die Durchflußmenge wurde auf 2,0 ml/min eingestellt
und die Fließgeschwindigkeit auf 0,25 cm/min.
Der lineare Gradient wurde verwendet zwischen dem primären
Lösungsmittel 0,1% TFA und dem sekundären Lösungsmittel
Acetonnitril-TFA 0,1%. Die Gradienten-Bedingungen waren 0-30%
in 20 min; dann 30-45% in 150 min; 45-55% in
20 min; und 55-100% in 10 min. Alle Lösungsmittel waren
von HPLC-Qualität. 4 ml Fraktionen wurden gesammelt und
gleiche Anteile von jeder Fraktion wurden auf die wachstumshemmende
Aktivität untersucht. Es wurde gefunden, daß die
Fraktionen 72-75 die Hauptaktivität enthielten. Die aktiven
Fraktionen wurden zwischen 41 und 52% der Acetonnitril-Konzentration
eluiert.
Die Fraktionen 72-75 wurden gepoolt. 16 ml von 0,1% TFA
wurden den gepoolten Fraktionen zugegeben. Die Mischung wurde
in eine µ-Bondapak-C18-Säule (3,9×300 mm) (als C18²
bezeichnet) bei Raumtemperatur injiziert. Die Durchflußmenge
wurde auf 1 ml/min eingestellt und die Verschiebe- bzw.
Fließgeschwindigkeit auf 0,25 cm/min. Die Gradienten-Bedingungen
waren 0-35% in 10 min; 35-45% in 100 min; und
45-100% in 10 min. Die Fraktionen wurden gesammelt und
gleiche Anteile wurden genommen und auf GIA untersucht. Das
meiste der Aktivität kam aus der Säule zwischen 40,7 und
41,3% Acetonnitril-Konzentration (Verweilzeit 83-86 min).
Aktive Fraktionen wurden gepoolt und zweifach mit 0,1% TFA
verdünnt und isokratisch auf eine µ-Bondapak-C18-Säule
(3,9×300 mm) (als C18³ bezeichnet) bei Raumtemperatur injiziert.
Die Durchflußmenge war 1 ml/min und die Fließgeschwindigkeit
0,25 cm/min. Ein linearer Gradient wurde verwendet
zwischen dem primären Lösungsmittel 0,1% TFA und dem
sekundären Lösungsmittel n-Propanol-TFA (0,1%). Die Gradienten-Bedingungen
waren 0-23% in 20 min und 23-35%
in 120 min. Fraktionen wurden gesammelt und gleiche Anteile
einer jeden Fraktion wurden auf GIA geprüft. Das meiste der
Aktivität erschien zwischen 25 und 26,5% Propanol-Konzentration
(Verweilzeit 59 min). Diese offensichtlich homogene
Fraktion enthielt annähernd 300 ng Protein und ungefähr
4000 GIA-Einheiten.
Das Peptid entsprach den Resten 6-19
des Oncostatin M-Proteins und wurde durch Fest-Phasentechnik,
wie beschrieben, auf einem Beckman-automatisierten
Gerät synthetisiert (Gentry et al., J. Biol.
Chem. (1983) 258: 11 219). Das Peptid wurde vom Harz
unter Verwendung der "low-high" HF-Verfahrensweise (Tam
et al., J. Amer. Chem. Soc. (1983) 105: 6442-6445) gespalten.
Das Peptid wurde an Rinder-γ-Globulin
wie beschrieben gekuppelt (Genty und Lawton,
Virology (1986) 152: 421-431). Weiße Neuseeland-Kaninchen
wurden geprimed und fünfmal verstärkt und zwar subkutan
an 4 Stellen, wie beschrieben (Gentry und Lawton,
Virology (1986) 152: 421-431). Antiseren wurden 2 Wochen
nach der fünften Verstärkung (boost) erhalten.
Eine Probe von partiell
gereinigtem Oncostatin M wurde mit Jod¹²⁵ unter Anwendung
veröfffentlichter Verfahrensweise radiomarkiert
(Linsley et al., PNAS (1985) 82: 356-360). Eine aliquote
Menge der markierten Präparation, die 100 000 cpm enthielten,
wurde mit Kaninchen-Antiserum vermischt, welches
gegen die N-endständigen 17 Aminosäuren von Oncostatin M
gerichtet war (Endverdünnung 1 : 20), und zwar
in Abwesenheit oder Anwesenheit des N-endständigen Peptids
(die N-endständigen 17 Aminosäuren von Oncostatin M)
(2 µg) und der Immunpräzipitationsanalyse unterworfen,
wie beschrieben (Linsley et al., Biochemistry
(1986) 25: 2978-2986).
Speziell wurde ein 5 µl enthaltendes Rohr präinkubiert
mit 2 µg des N-endständigen Peptids in 10 ml TNEN (20 mM
Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,05% Nonidet P-40),
das 0,1% BSA enthielt, und zwar während 30 Minuten
bei 4°C, bevor die Zugabe von I¹²⁵ Oncostatin M in 85 µl
TNEN, das 0,1% BSA und 40 mM Dithiothreitol (DTT) enthielt,
erfolgte. Sieben Rohre, die 5 µl Antiseren enthielten,
wurden mit I¹²⁵ Oncostatin M in 85 µl TNEN, das
0,1% BSA und 40 mM DTT enthielt, während 30 Minuten bei
4°C inkubiert, bevor die Zugabe von 50 µl 10% formalinfixiertem
Staphylococcus aureus
erfolgte.
Im Anschluß an eine zusätzliche Inkubation während 30 Minuten
bei 4°C wurden die Rohre mikrofugiert und die Pellets wurden
viermal mit 1 ml TNEN gewaschen, bevor sie der PAGE-Analyse
unterworfen wurden. Eine diffuse Bande von Mr=32 kD wurde
nach der SDS/PAGE-Analyse des Immunpräzipitats beobachtet.
Die Präzipitation dieser Spezies wurde durch den Einschluß
eines Überschusses an unmarkiertem Peptid inhibiert, das den
N-endständigen 17 Aminosäuren von Oncostatin M entsprach, was
anzeigt, daß die Präzipitation spezifisch für dieses Peptid
ist.
Das beschriebene intakte Polypeptid oder Fragment davon können
als Immunogene verwendet werden, um die Antikörperbildung
zu induzieren. Die induzierten Antikörper finden erfindungsgemäß
Verwendung zum Titern von in einer Körperflüssigkeit
vorhandenem Oncostatin M oder zur Modulierung der Aktivität
des Faktors durch Bindung an ihn. Weiterhin können diese Antikörper
zusammen mit gereinigtem Oncostatin M oder Fragmenten
davon als Komponente von diagnostischen Kits verwendet
werden in Verbindung mit anderen Reagenzien, insbesondere Antikörpern,
um Oncostatin M aufzuspüren und zu quantifizieren.
Obwohl die vorhergehende Erfindung zum Zwecke der Erläuterung
und zum guten Verständnis im Detail beschrieben wurde, so ist
es für den Fachmann klar, daß Abweichungen und Modifikationen
durchgeführt werden können, ohne den Umfang der Ansprüche zu
verlassen.
Claims (9)
1. Antikörper spezifisch für ein Polypeptid, welches aus
Leukozyten erhältlich ist, zur Inhibition der Proliferation
von neoplastischen Zellen fähig ist, die Proliferation
von normalen menschlichen Fibroplasten zu stimulieren
vermag, menschlichen proliferativen und zytotoxischen
T-Zell-Response nicht inhibiert und granulozytische/myelozytische
Knochenmarkskolonie-Zellbildung nicht
inhibiert, ein Molekulargewicht im Bereich von 17 bis 19
kD, bestimmt durch Gel-Exklusionschromatographie, und
von 28 kD, bestimmt durch SDS-PAGE, besitzt und relativ
unempfindlich gegenüber mäßiger Säure bzw. Base und
stabil gegen Wärmebehandlung bei 56°C ist.
2. Antikörper spezifisch für ein Polypeptid nach Anspruch
1, das erhältlich ist aus Leukozyten, die mitogenaktivierte
normale menschliche periphere Blutlymphozyten
sind.
3. Antikörper spezifisch für ein Polypeptid nach Anspruch
1, das erhältlich ist aus Leukozyten, die Phorbol-Diester-induzierte
menschliche histiozytische Lymphomzellen
sind.
4. Antikörper spezifisch für eine Polyaminosäure mit mindestens
acht Aminosäuren, die immunologisch kreuzreaktiv
ist mit dem Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3.
5. Antikörper spezifisch für eine Polyaminosäure nach Anspruch
4, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyaminosäure
eine Aminosäuresequenz mit mindestens zehn aufeinanderfolgenden
Aminosäuren besitzt, welche einer der folgenden
Aminosäuresequenzen entspricht
und von dieser Sequenz durch nicht mehr als drei Aminosäuren
abweicht.
6. Antikörper nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß
die Polyaminosäure zwölf aufeinanderfolgende Aminosäuren
enthält, welche einer der folgenden Aminosäuresequenzen
entspricht
und von dieser Sequenz durch nicht mehr als eine Aminosäure
abweicht, wobei diese Abweichung entweder eine
Leerstelle oder eine konservative Substitution ist.
7. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das
Polypeptid Bestandteil einer Zusammensetzung ist, die im
wesentlichen frei von Zellbestandteilen ist.
8. Antikörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche als
monoklonale Antikörper.
9. Verwendung der Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis
8 zur Detektion eines aus Leukozyten erhältlichen Polypeptids
charakterisiert nach den Ansprüchen 1 bis 6.
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