DE3645095C2 - Antikörper - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen 1 bis 8 angegebenen Antikörper, die spezifisch für ein aus Leukozyten erhältliches Polypeptid sind, sowie die Verwendung dieser Antikörper zur Detektion der Polypeptide nach Anspruch 9.

Leukozyten, sowohl Lymphozyten als auch Monozyten wurden mit einbezogen in die Inhibierung von Tumorwachstum bei verschiedenen Tier-Tumor-Modellen. Das erhöhte Auftreten von bösartigen Erkrankungen bei immunokompromittierten Menschen stützt das Argument, daß die weißen Blutzellen eine Rolle in der Regulierung des neoplastischen Wachstums spielen. Proteinfaktoren, die durch diese weißen Zellen produziert sind, die das Tumorwachstum inhibieren oder Immunfunktionen modulieren, welche bereits isoliert und charakterisiert sind, schließen die Interferone, α- und γ-Tumor-Nekrosefaktor, Lymphotoxin, Interleukin-2 und andere Lymphokine ein. Da jeder dieser isolierten Faktoren ein verschiedenes Aktivitätsspektrum besitzt und in Verbindung mit anderen Faktoren unterschiedlichen Einfluß ausüben kann, besteht weiterhin ein fortgesetztes und ernsthaftes Interesse an der Isolation und Charakterisierung all der Faktoren, welche weiße Zellen bei der Modulierung von Zellwachstum oder Immunfunktionen produzieren. Diese Verbindungen können einzeln oder zusammen Anwendung bei der Behandlung oder Diagnose von Krebs, als Beschleuniger bei der Wundheilung oder als Immunmodulatoren für die Behandlung von Patienten mit Immun-Mangelerscheinungen, Autoimmunität, Organtransplantaten u. dgl. finden.

Es gibt zahlreiche Schwierigkeiten, die bei der Auffindung, Isolierung, Reinigung oder Charakterisierung von natürlich vorkommenden Faktoren auftreten können. Es müssen Arbeitsweisen zum Abtrennen und Reinigen eines interessierenden Faktors von anderen Faktoren im rohen Ausgangsmaterial ohne Denaturierung der Aktivität des gewünschten Faktors entwickelt werden. Bioassays müssen entwickelt werden, welche die Identifizierung der Fraktionen während der Abtrennungen, welche einen bestimmten Faktor konzentrieren, erlauben. Ein neuer Faktor muß unterschieden werden von Faktoren, die bereits bekannt sind oder anderen Faktoren, welche vorliegen können und den erstrebten Faktor entweder negativ oder positiv in seiner Wirkung beeinflussen können. Der gereinigte Faktor muß charakterisiert werden. Der gereinigte Faktor muß auf ausreichende Mengen aufkonzentriert werden, um seine Identifizierung und Charakterisierung zu ermöglichen. Mit der ansteigenden Zahl der Faktoren, die isoliert sind, wird jeder neue Faktor schwieriger zu identifizieren, da seine Rolle und Funktion durch die zahlreichen anderen vorliegenden Faktoren verdeckt sein kann.

Beal et al., Cancer Biochem. Biophys. (1979) 3: 93-96 berichten über das Vorhandensein von Peptiden in menschlichem Urin, welche das Wachstum und die DNA-Synthese eher in transformierten als in normalen Zellen inhibieren. Holley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1980) 77: 5989-5992 beschreiben die Reinigung von Epithelzellen-Wachstumsinhibitoren. Letansky, Biosci. Rep. (1982) 2: 39-45 berichtet, daß aus Rinderplacenta gereinigte Peptide das Tumorwachstum und die Thymidin-Einlagerung in DNA in einem größeren Maße in Neoplasma inhibieren als in normalen Zellen. Chen, Trends Biochem. Sci. (1982) 7: 364-365 berichtet über die Isolierung eines Peptids aus Ascites-Flüssigkeit mit einer krebsunterdrückenden Eigenschaft. Redding und Schally, Proc. Natl. Acad. Sci. (1982) 79: 7014-7018 berichten über die Isolation von gereinigtem Peptid bzw. Peptiden aus Schweine-Hypothalamus, welche antimitogene Aktivität gegen mehrere normale und Tumorzellinien zeigen. Sone et al., Gann (1984) 75: 920-928 berichten über die Produktion eines oder mehrerer Faktoren, die durch menschliche Makrophagen produziert werden und das Wachstum gewisser Tumorzellen in vitro inhibieren. Ransom et al., Cancer Res. (1985) 45: 851-862 berichten über die Isolation eines Leukoregulin genannten Faktors, der die Replikation von bestimmten Tumorzellinien inhibiert und sich vom Lymphotoxin, Interferon und Interleukin 1 und 2 zu unterscheiden scheint. Die meisten dieser Faktoren sind weder vollständig charakterisiert noch sind ihre Primärstrukturen bekannt.

Aggarwal et al., J. Biol. Chem. (1984) 259: 686-691 reinigten und charakterisierten menschliches Lymphotoxin (LT), das durch eine Lymphoblastoid-Zellinie produziert wird, und klärten anschließend die Sequenz von LT auf (Aggarwal et al., J. Biol. Chem. (1985) 260: 2334). Gamma-Interferon (γ-IF), welches von Lymphoid-Zellen produziert wird und immunmodulatorische und tumorinhibitorische Wirkung hat, wurde kloniert und exprimiert. (Gray et al., Nature (1982) 295: 503-508). Der Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), welcher das Wachstum von einigen Tumoren inhibiert und durch Makrophagen und bestimmte Leukämie-Zellinien produziert wird, wurde charakterisiert, und die TNF-cDNA wurde kloniert und in E. coli exprimiert (Pennica et al., Nature (1984) 312: 724).

Durch die Erfindung werden Antikörper, die spezifisch für ein aus Leukozyten erhältliches Polypeptid sind, zur Verfügung gestellt, wobei das Polypeptid zur Inhibition der Prolideration von neoplastischen Zellen fähig ist, die Proliferation von normalen menschlichen Fibroplasten zu stimulieren vermag, menschlichen proliferativen und zytotoxischen T-Zell-Response nicht inhibiert und granulozytische/myelozytische Knochenmarkskolonie-Zellbildung nicht inhibiert, ein Molekulargewicht im Bereich von 17 bis 19 kD, bestimmt durch Gel-Exklusionschromatographie, und von 28 kD, bestimmt durch SDS-PAGE, besitzt und relativ unempfindlich gegenüber mäßiger Säure bzw. Base und stabil gegen Wärmebehandlung bei 56°C ist.

Bevorzugte Antikörper gemäß der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche 2 bis 8.

Die beiliegende Zeichnung zeigt

Fig. 1 die Aminosäuresequenz von Fragmenten des Polypeptids Oncostatin M.

Ein Polypeptid, das unter die angegebene Definition fällt und als Oncostatin M bezeichnet wird, ist erhältlich aus Leukozyten, z. B. aus konditionierten Medien von stimulierten U937-Zellen oder konditionierten Medien von stimulierten normalen menschlichen Peripheren-Blutlymphozyten (PBL). Für Fragmente und Mutanten des Polypeptids mit der biologischen Aktivität des intakten Oncostatin M, wie Zellwachstumsmodulations-Aktivität oder immunologische Aktivität, sind die erfindungsgemäßen Antikörper ebenfalls spezifisch.

Die Polypeptid-Fragmente sind Polypeptide mit mindestens 8 Aminosäuren, die biologisch aktiv sind, zumindest immunologisch kreuzaktiv mit natürlich vorkommendem Oncostatin M. Unter immunologisch kreuzreaktiv wird verstanden, daß ein durch ein Polypeptid induzierter Antikörper kreuzreagiert mit intaktem Oncostatin M, zumindest wenn Oncostatin M in einem denaturierten Zustand vorliegt. Diese Polypeptide sind deshalb nützlich zur Induzierung von Antikörpern für Oncostatin M, welche zur Bestimmung der Konzentration von Oncostatin M in einer Körperflüssigkeit verwendet werden können, weiterhin zur Bindung an Oncostatin M und somit zur Modulation seiner Aktivität, und zur Reinigung von Oncostatin M, z. B. durch Verwendung in einer Affinitätssäule. Ein Anteil der Polypeptide kann auch die Zellwachstumsmodulations-Aktivität des intakten Oncostatin M behalten, obwohl die Aktivität moduliert sein kann, gewöhnlich reduziert im Vergleich zum intakten Oncostatin M.

Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenz von Poly(aminosäure bzw. -säuren), die kreuzreaktiv mit Oncostatin M sind, wobei die erste Sequenz das N-Ende von Oncostatin M darstellt.

Die Poly(aminosäure bzw. -säuren) enthalten eine Aminosäuresequenz mit mindestens 8 aufeinanderfolgenden Aminosäuren, die einer in Fig. 1 dargestellten Aminosäuresequenz entsprechen und von dieser Sequenz durch nicht mehr als 3, gewöhnlich nicht mehr als eine Aminosäure verschieden sind. Die Differenz kann entweder in der Einfügung einer Aminosäure, der Fehlstelle einer Aminosäure oder der Substitution einer Aminosäure durch eine andere, insbesondere in einer konservativen Substitution, bestehen. Normalerweise enthalten die Poly(aminosäure bzw. -säuren) mindestens 10, insbesondere mindestens 12 aufeinanderfolgende Aminosäuren, die der in der Figur dargestellten Sequenz entsprechen und durch nicht mehr als eine Aminosäure unterschieden sind.

Für die Zwecke der Erläuterung sind verschiedene Aminosäuren in eine Anzahl von Unterklassen eingeteilt. Die folgende Tabelle zeigt die Unterklassen:

Unter konservativer Substitution wird verstanden, daß Aminosäuren aus derselben Unterklasse (d. h. entweder neutrale aliphatische, saure aliphatische, basisch aliphatische oder aromatische), insbesondere derselben Polarität für einander ausgetauscht werden können. Vorzugsweise bilden Aminosäuren mit zwei bis vier C-Atomen oder fünf bis sechs C-Atomen Monomer-Gruppierungen in der aliphatischen Unterklasse.

Die Poly(aminosäure)n besitzen nicht mehr als ca. 1000 Aminosäuren in der Länge. Gewöhnlich haben sie weniger als 100 Aminosäuren, insbesondere weniger als 50 Aminosäuren. So können die Poly(aminosäure)n leicht synthetisiert werden. Wenn die Poly(aminosäure)n über 100 Aminosäuren in der Länge besitzen, dann können die Poly(aminosäure)n Polymere von Fragmenten von Oncostatin M mit jeweils weniger als 100 Aminosäuren sein oder Fusions-Proteine, bei denen das Fragment durch Fusion an ein Antigen, Enzym, Enzymfragment u. dgl. gebunden ist. Insbesondere die Poly(aminosäure)n mit höherem Molekulargewicht können mindestens ein Polypeptid-Fragment mit weniger als 100 Aminosäuren sein, das kovalent an einen großen immunogenen Polypeptidträger gebunden ist, um immunogene Eigenschaften zu schaffen. Beispiele für solche Proteinträger sind Rinderserumalbumin, Keyhole-Limpet-Hämozyanin (KLH) u. dgl. Diese konjugierten Polypeptide sind nützlich für das Induzieren von Antikörpern in einem geeigneten Wirtsorganismus.

U937-Zellen sind eine Zellinie, die aus einer histiozytischen Lymphom-Zellinie abgeleitet sind (Sundstrom und Nilsson, Int. J. Cancer (1976) 17: 565-577), die induziert werden können, in Zellen mit Charakteristika von Makrophagen zu differenzieren, gefolgt von einer Behandlung mit einer Vielzahl von Mitteln (Harris et al., Cancer Res. (1985) 45: 9-13). Für die Herstellung von Oncostatin M kann man die U937-Zellen in einem konventionellen Nährmedium mit Serum wachsen lassen und mit einem geeigneten Inducer behandeln. Herkömmliche Phorbole oder Ingenole können verwendet werden, insbesondere 12-0-Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA). Gewöhnlich werden ca. 5-20 ng/ml des Inducers verwendet. Die anfängliche Zellzahl liegt bei etwa 10⁵-10⁶ Zellen/ml.

Nachdem man den Inducer eine ausreichende Zeit auf die Zellen einwirken ließ, normalerweise drei bis sechs Tage, wird der Überstand entfernt, die Zellen werden mit serumfreien Nährmedium gewaschen, angeheftete Zellen werden wiederum mit serumfreiem Medium gewaschen und dann werden die Zellen während mindestens 12 Stunden, gewöhnlich nicht mehr als ca. 48 Stunden, in einem serumfreien Nährmedium z. B. RPMI-1640 inkubiert. Überstände werden dann gesammelt, und die Zellen werden durch Zentrifugation entfernt. Die zellfreien Überstände werden auf Zellwachstum-Inhibitionsaktivität (GIA) geprüft. Der Überstand enthält ungefähr 50 bis 500 Einheiten GIA/ml.

Oncostatin M kann auch erhalten werden aus Mitogen-stimulierten normalen menschlichen peripheren Blutlymphozyten (PBL′s). PBL′s können isoliert werden aus Leuko-Fraktionen durch Verdünnen der Fraktionen und Zentrifugieren über Ficoll-Gradienten. Zellen, die aus der Gradienten-Zwischenschicht gesammelt werden, werden gewaschen und schocklysiert, um die roten Blutzellen zu entfernen. Die verbleibenden Zellen werden aus der Lösung durch Zentrifugation abgetrennt, in Serum und Thrombin enthaltendem Puffer resuspendiert, aufgeschüttelt, und dann läßt man das plättchenartige Aggregat während einer kurzen Zeitdauer absetzen. Die suspendierten Zellen werden transperiert, durch Zentrifugation wiedergewonnen, in Serum resuspendiert und auf eine Nylonwolle enthaltende Säule transferiert. Die Säule wird inkubiert, um das Anheften von Monozyten und B-Lymphozyten zu ermöglichen, und dann gewaschen. Die meisten peripheren Blutt-T-Lymphozyten haften nicht und werden aus der Säule eluiert. Diese Zellen werden bei 37° in Kulturmedium, z. B. RPMI-1640-Medium kultiviert und mit einem geeigneten Inducer, z. B. Phytohämagglutinin (ca. 1 bis 5 mg/l) während ca. 100 Stunden behandelt, worauf die Überstände gesammelt werden. Die Überstände werden zentrifugiert, um Zellen zu entfernen und durch Ultrafiltration oder Dialyse konzentriert.

Nach der Isolation des zellfreien Überstandes aus entweder U-937-Zellen oder normalen PBL′s, wird das konditionierte Medium konzentriert, herkömmlich unter Verwendung eines Hohlfasersystems oder einer Ultrafiltrationsmembran, gefolgt von Verdünnung mit Essigsäure (bis zu einer Konzentration von 0,1N-Essigsäure), gefolgt von einer Konzentrierung auf das ungefähr Zehnfache und eine wiederholte Verdünnung und Konzentrierung. Die Konzentrate können lyophilisiert und direkt verwendet werden, oder das gefriergetrocknete Produkt kann für eine weitere Reinigung verwendet werden.

Das Oncostatin M kann durch ein Gel-Permeations-Chromatographie-Verfahren gereinigt werden unter Verwendung von wäßrigem 40% Acetonitril-0,1% Trifluoressigsäure als isokratische mobile Phase auf einer Bio-sil TSK250-Säule, unter Überwachung der Aktivität jeder der Fraktionen. Durch Reinigung wird eine Zusammensetzung erhalten, die mindestens ca. 0,5-5×10⁴-GIA-Einheiten/ml in den aktiven Fraktionen besitzt.

Das teilweise gereinigte Produkt aus der Gel-Permeations-Chromatographie kann weitergereinigt werden durch Anwendung der Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie unter Anwendung eines linearen Gradienten, wobei das primäre Lösungsmittel 0,1%ige Trifluoressigsäure in Wasser und das sekundäre Lösungsmittel Acetonitril ist, das 0,1% Trifluoressigsäure enthält. Das Schema kann variiert werden, wobei die Chromatographie im allgemeinen ca. 3-4 Stunden dauert und der Hauptzeit-Aufwand von mehr als ca. 50% der Zeitdauer und nicht mehr als ca. 80% der Zeitdauer im Bereich von 30-45% des sekundären Lösungsmittels verstreichen. Unter diesen Bedingungen eluieren die aktiven Fraktionen bei ca. 41-42% Acetonitril.

Die gepoolten Fraktionen können weiter gereinigt werden durch Wiederholung der Umkehrphasen-HPLC, wobei ein schnellerer Wechsel bei den Gradienten-Bedingungen vorgenommen und eine langsamere Durchflußrate angewendet wird. Unter diesen Bedingungen taucht die Aktivität bei ungefähr 40,5-41,5% Acetonitril auf.

Die Umkehrphasen-HPLC kann dann wiederholt werden, indem das Lösungssystem geändert wird, wobei das sekundäre Lösungsmittel n-Propanol-0,1% Trifluoressigsäure ist. Ein linearer Gradient wird angewendet, wobei der Gradient im Bereich zwischen 23 und 35% n-Propanol langsam verändert wird. Die Hauptaktivität wird im Bereich von 25,5-27,5% Propanol beobachtet und ein im wesentlichen homogenes Produkt erhalten mit einer spezifischen Aktivität größer als 10 GIA-Einheiten/ng-Protein. Normalerweise wird das Produkt gereinigt, um eine spezifische Aktivität von mindestens ca. 100 GIA-Einheiten/ng-Protein zu erreichen, insbesondere 150 GIA-Einheiten/ng.

Wie beschrieben sind die Polypeptide charakterisiert durch ein Molekulargewicht von ca. 17 bis 19 KiloDalton (kD), insbesondere ca. 18 kD, bestimmt durch Größenausschlußchromatographie. Die Verbindungen sind weiterhin gekennzeichnet durch ein scheinbares (apparent) Molekulargewicht von annähernd 28 kD, bestimmt durch Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unter reduzierenden oder nichtreduzierenden Bedingungen.

Die Aminosäuresequenz von Fragmenten von gereinigtem Oncostatin M wurde analysiert. Oncostatin hat im wesentlichen die Aminosäuresequenzen, die in Fig. 1 angegeben sind. In Fig. 1 erläutert die erste Sequenz das N-Ende von Oncostatin M, während die verbleibenden Sequenzen innere Fragmente des Polypeptids darstellen.

Oncostatin M ist weiterhin gekennzeichnet durch seine Aktivität gegenüber bestimmten Zellstämmen. Dem Polypeptid fehlt zytotoxische Aktivität gegen WI26 und WI38 menschliche Fibroplasten und Mäuse L929-Zellen, welche sensitiv gegenüber Tumor-Nekrosefaktor sind, und gegen eine γ-Interferonempfindliche menschliche Tumorzellinie. Es hat sich auch herausgestellt, daß es die Proliferation von normalen menschlichen T-Lymphozyten nicht inhibiert und auch nicht die granulozytische/myelozytische Koloniebildung von Knochenmarkszellen bei Konzentrationen bis zu 100 GIA-Einheiten/ml. Weiterhin stimuliert Oncostatin M Proliferation von normalen menschlichen Fibroplasten, wie am Beispiel von WI38- und WI26-Zellen gezeigt, und inhibiert die Proliferation von Tumorzellen wie A375, HBT10, A549 und SK-MEL28, und kann das Wachstum von Koloniebildungszellen von normalem Knochenmark vermehren. Oncostatin M unterdrückt nicht den menschlichen proliferativen oder zytotoxischen T-Zell-Response im gemischten Leukozytenkulturreaktionen (MLC) bei Konzentrationen von 500 GIA-Einheiten/ml.

Es wurde gefunden, daß das erfindungsgemäße Polypeptid stabil gegen mäßige Säure bzw. Base und auch gegen Wärmebehandlung bei 56°C ist.

Die Aminosäuresequenz der Polypeptide kann vollständig bestimmt werden unter Anwendung handelsüblich erhältlicher Sequenzanalysier-Einrichtungen. Das Polypeptid kann synthetisiert werden in Übereinstimmung mit bekannten Techniken, unter Anwendung automatisierter Syntheseeinrichtungen, die ebenfalls kommerziell erhältlich sind.

Alternativ können die Polypeptide durch Rekombinaten-DNA-Techniken hergestellt werden. Aus einer partiellen Aminosäuresequenz können Proben abgeleitet werden, welche dann für das Screening einer menschlichen Genom-Bank verwendet werden können. Die Bank kann eine cDNA-Bank oder eine Chromosomen-Bank sein. Sind der oder die Klone einmal identifiziert als ansprechend auf die Probe, dann können die Fragmente, welche das Gen von Interesse enthalten, auf verschiedene Weise identifiziert und in vielfältiger Weise manipuliert werden. Das Fragment kann durch Endonuklease-Restriktion in der Größe reduziert werden, wobei die erhaltenen Fragmente kloniert und auf das Vorliegen der gewünschten Gene geprüft werden. Zellen, die die Peptide produzieren oder vergrößerte Mengen des Peptids produzieren, können zur Herstellung der Messenger-RNA verwendet werden. Aus der Messenger-RNA kann Einzelstrang-cDNA hergestellt werden. Die cDNA kann man dann an Gesamt-Messenger-RNA aus einer Zelle, die, wenn überhaupt, nur wenig von dem Polypeptid produziert, ansprechen lassen. Die nicht ansprechende bzw. angeheftete cDNA kann dann isoliert und zur Herstellung von ds cDNA verwendet werden, welche mit den Proben gescreent werden kann.

Alternativ können DNA-Fragmente in λgt11 eingesetzt werden, so daß die Kodierung der Fragmente abwärts von und im Rahmen mit dem β-galactosidase-Gen erfolgen kann. Antikörper können zu dem Oncostatin M-Polypeptid hergestellt und zum Screening der erhaltenen fusionierten Proteine auf Kreuzreaktivität verwendet werden. Auf diese Weise können Fragmente, die das Polypeptid oder ein Fragment davon kodieren, identifiziert und zur Identifizierung des gewünschten Gens verwendet werden.

Ist einmal das vollständige Gen identifiziert, entweder als cDNA oder als Chromosomen-DNA, dann kann es auf verschiedene Weise zur Herbeiführung einer Expression manipuliert werden. Wenn das Gen in einen Wirt exprimiert wird, der die Wildtyptranskriptionalen und translationalen Regulationsregionen von Oncostatin M erkennt, dann kann das vollständige Gen mit seinen Wildtyp 5′- und 3′-Regulationsregionen in einen geeigneten Expressionsvektor eingeführt werden. Verschiedene Expressionsvektoren existieren unter Anwendung von Replikationssystemen aus Säugetier-Viren, wie Simian-Virus 40, Adenovirus, Rinder-Papillom-Virus, Vaccinia-Virus, Insekten-Baculo-Virus u. dgl. Diese Replikationssysteme wurden entwickelt, um Marker zu schaffen, welche eine Selektion von Transfektanten erlauben, sowie bequeme Restriktionsstellen zu schaffen, in welche die Gene eingesetzt werden können.

Wenn das Gen in einen Wirt exprimiert werden soll, welcher die natürlich vorkommenden Wildtyp-transkriptionalen und translationalen Regulationsregionen nicht erkennt, sind weitere Manipulationen erforderlich. Eine Vielzahl von 3′-transkriptionalen Regulationsregionen sind bekannt und können außer- bzw. unterhalb des Stopcodons eingesetzt werden. Die nichtkodierende 5′-Region oberhalb des strukturellen Gens kann durch Endonuklease-Restriktion, Bal31-Resektion o. dgl. entfernt werden. Andererseits kann, wo eine bequeme Restriktionsstelle nahe dem 5′-Ende des strukturellen Gens vorhanden ist, das strukturelle Gen restriktiert werden und ein Adaptor verwendet werden zur Bindung der strukturellen Gene an die Promoter-Region, wobei der Adaptor die verlorenen Nukleotide des strukturellen Gens liefert. Verschiedene Strategien können angewendet werden zur Schaffung einer Expressions-Kassette, welche in der 5′-, 3′-Richtung der Transkription eine transkriptionelle und translationelle Initiierungsregion besitzt, welche auch Regulatorsequenzen für die Induzierung der Regulation, das strukturelle Gen unter der transkriptionellen und translationellen Steuerung der Initiierungsregion und eine transkriptionelle und translationelle Terminierungsregion einschließen kann.

Beispielhafte transkriptionelle Initiierungsreaktionen oder Promoter umfassen für Bakterien, β-gal-Promoter, TAC-Promoter, Lambda-Links- und -Rechts-Promoter usw.; für Hefe, glykolytische Enzympromoter, wie ADH-I und -II-Promoter, GPK-Promoter und PGI-Promoter sowie TRP-Promoter usw.; für Säugetier-Zellen, SV40 Früh- und Spät-Promoter, Adenovirus Major-Spät-Promoter usw. Wie bereits angedeutet, kann die Expressions-Kassette innerhalb eines Replikationssystems für episomale Aufrechterhaltung in einem geeigneten zellulären Wirt vorhanden sein oder ohne ein Replikationssystem vorhanden sein, wo es in das Wirts-Genom integriert werden kann. Die DNA kann in den Wirt nach bekannten Techniken eingeführt werden, z. B. durch Transformation unter Verwendung von mit Calciumphosphat ausgefällter DNA, Transfektion durch Inkontaktbringen der Zellen mit dem Virus, Mikroinjektion der DNA in die Zellen u. dgl.

Ist das Gen einmal in den geeigneten Wirt eingeführt, dann kann der Wirt wachsen und wird das strukturelle Gen exprimiert. In einzelnen Fällen kann es wünschenswert sein, eine Signalsequenz (Sekretionsleiter) oberhalb von und im Leserahmen mit dem strukturellen Gen vorzusehen, wodurch die Sekretion des strukturellen Gens und die Spaltung der Sekretionsleiter ermöglicht wird, so daß das reife Polypeptid im Überstand bereitgestellt wird. Ist eine Sekretion nicht vorgesehen, dann können die Wirtzellen geerntet, unter herkömmlichen Bedingungen lysiert und das gewünschte Produkt isoliert und nach bekannten Techniken gereinigt werden, wie z. B. durch Chromatographie, Elektrophorese, Lösungsmittelextraktion u. dgl.

Die beschriebenen Polypeptide können zur Herstellung spezifischer Antikörper für die Polypeptide verwendet werden, die ihrerseits Anwendung in vivo oder in vitro finden können. Erfindungsgemäße Verwendung sind Gegenstand von Anspruch 9. Die Antikörper können auf herkömmliche Weise hergestellt werden, z. B. durch Verwendung des Polypeptids als Immunogen und Injizieren des Polypeptids in einen Säugetier-Wirt, z. B. eine Maus, eine Kuh, eine Ziege, ein Schaf, ein Kaninchen u. dgl., insbesondere zusammen mit einem Hilfsmittel, z. B. komplettem Freunds-Hilfsstoff, Aluminiumhydroxid-Gel u. dgl. Der Wirt kann dann geblutet werden und das Blut kann dann zur Isolation der polyklonalen Antikörper verwendet werden, oder im Falle der Maus, können die Peripheren-Blut-Lymphozyten oder Milz-Lymphozyten (B-Zellen) zur Fusion mit einer geeigneten Myelom-Zelle verwendet werden, um die Chromosomen für die monoklonale Expression von für die Stoffe spezifischen Antikörpern unsterblich zu machen.

Es können sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper hergestellt werden, welche dann zur Diagnose oder Aufspürung der Polypeptide in einer Probe, wie Zellen oder physiologischer Flüssigkeit, z. B. Blut, verwendet werden können. Die Antikörper können auch in der Affinitäts-Chromatographie zur Reinigung der Polypeptide und zu ihrer Isolierung aus natürlichen oder synthetischen Quellen verwendet werden. Die Antikörper können auch Anwendung bei der Kontrolle bzw. Steuerung der Menge der Polypeptide in Verbund mit Zellen in einer Kultur oder in vivo Anwendung finden, wobei das Zellwachstum modifiziert werden kann.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, insbesondere bevorzugter Ausführungsformen, nicht jedoch zur Beschränkung.

Experimentelles Materialien und Methoden 1. Vorbereitung eines Polypeptids Oncostatin M, isoliert aus U937-Zellen Herstellung eines Tumorzellwachstums-Inhibitors aus einer histiozytischen Lymphom-Zellinie

U937-Zellen, eine histiozytische Lymphom-Zellinie (Sunstrom und Nilsson, Int. J. Cancer (1976) 17: 565-577, wurden in Rollflaschen bei einer Konzentration von 4×10⁵-Zellen/ml in einem Totalvolumen von 300 ml RPMI-1640-Medium, das mit 10% fötalem Kalbsserum (FCS), Penicillin/Streptomycin (PS), L-Glutamin und 10 ng/ml 12-0-Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) ergänzt war. Vier Tage später wurden die Überstände, die FCS und TPA enthielten, entfernt. Die Rollflaschen wurden fünfmal mit serumfreiem RPMI-1640 gewaschen, und die losgelösten Zellen (1×10⁵-Zellen/ml) wurden dreimal mit serumfreiem Medium gewaschen und in die Flaschen zurückgegeben, wobei ein Endvolumen von 125 ml serumfreiem RPMI-1640-Medium pro Rollflasche erhalten wurde. Einen Tag später wurden die Überstände gesammelt, zur Entfernung der Zellen zentrifugiert, durch 0,45 Mikron (µ) Nalgen-Filter filtriert und unter Verwendung eines Hohlfasersystems auf einem Volumen von 150 ml (Anfangsvolumen 1500 ml) konzentriert. Oncostatin M wurde auch aus Überständen von serumfreien, TPA-behandelten U937-Zellen in 150 cm² Gewebekultur-Kolben isoliert. Die Überstände wurden mit einer Amicon Diaflo-Membran PM-10 konzentriert, 10 kD abgeschnitten und dialysiert. Im Anschluß an die Dialyse wurde das Konzentrat mit Essigsäure verdünnt bis auf eine Endkonzentration von 0,1N Essigsäure in 500 ml und auf 50 ml unter Verwendung eines Amicon-PM-10-Filters konzentriert. Das 50-ml-Konzentrat wurde auf 400 ml mit 0,1N Essigsäure verdünnt und mit demselben Filter auf 40 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde mit 1N Essigsäure verdünnt und das erhaltene Präzipitat wurde durch Zentrifugation entfernt. Das erhaltene Konzentrat wurde eingefroren und gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Material wurde für Reinigungsstufen verwendet.

Gel-Permeations-Chromatographie

Eine Bio-Sil TSK-250-Säule (600×21,5 mm) wurde an ein Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie-System angeschlossen. Die rohe Fraktion (10 mg/ml) wurde in 40% Acetonnitril in 0,1% wäßriger Trifluoressigsäure (0,1% TFA) aufgelöst. Eine 2-ml-Aliquot-Menge der Mischung wurde injiziert, und die Elution isokratisch mit einer mobilen Phase von 40% Acetonnitril in 0,1% TFA durchgeführt. Die Durchflußmenge betrug 2,5 ml/min und die Geschwindigkeit der Verschiebung wurde auf 0,25 cm/min eingestellt. 5 ml Fraktionen wurden gesammelt. Die Chromatographie wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Aliquote Mengen einer jeden Fraktion wurden eingedampft und dreifach auf die Wachstumsinhibitor-Aktivität (GIA) auf A375-Zellen untersucht.

Die aktiven Fraktionen 21 und 22) aus sechs Durchläufen wurden gepoolt. Das gepoolte Material hatte eine Gesamtmenge von annähernd 4,8×10⁵-GIA-Einheiten. Es wurde gefunden, daß der Faktor ein scheinbares Molekulargewicht (apparent molecular weight) von 18 kD besaß, bestimmt durch Größenausschluß-Chromatographie (Bio-Sil TSK-250-Säule).

Umkehrphasen-Hochdruck-Chromatographie (HPLC) von TSK-250-Fraktionen

Gepoolte TSK-250-Fraktionen 21 und 22, die oben beschrieben wurden, wurden mit 0,1% TFA auf das Zweifache verdünnt. Die Mischung wurde auf eine µ-Bondapak-C18-Säule (7,8×300 mm) (als C18¹ bezeichnet) bei Raumtemperatur isokratisch injiziert. Die Durchflußmenge wurde auf 2,0 ml/min eingestellt und die Fließgeschwindigkeit auf 0,25 cm/min. Der lineare Gradient wurde verwendet zwischen dem primären Lösungsmittel 0,1% TFA und dem sekundären Lösungsmittel Acetonnitril-TFA 0,1%. Die Gradienten-Bedingungen waren 0-30% in 20 min; dann 30-45% in 150 min; 45-55% in 20 min; und 55-100% in 10 min. Alle Lösungsmittel waren von HPLC-Qualität. 4 ml Fraktionen wurden gesammelt und gleiche Anteile von jeder Fraktion wurden auf die wachstumshemmende Aktivität untersucht. Es wurde gefunden, daß die Fraktionen 72-75 die Hauptaktivität enthielten. Die aktiven Fraktionen wurden zwischen 41 und 52% der Acetonnitril-Konzentration eluiert.

Die Fraktionen 72-75 wurden gepoolt. 16 ml von 0,1% TFA wurden den gepoolten Fraktionen zugegeben. Die Mischung wurde in eine µ-Bondapak-C18-Säule (3,9×300 mm) (als C18² bezeichnet) bei Raumtemperatur injiziert. Die Durchflußmenge wurde auf 1 ml/min eingestellt und die Verschiebe- bzw. Fließgeschwindigkeit auf 0,25 cm/min. Die Gradienten-Bedingungen waren 0-35% in 10 min; 35-45% in 100 min; und 45-100% in 10 min. Die Fraktionen wurden gesammelt und gleiche Anteile wurden genommen und auf GIA untersucht. Das meiste der Aktivität kam aus der Säule zwischen 40,7 und 41,3% Acetonnitril-Konzentration (Verweilzeit 83-86 min).

Aktive Fraktionen wurden gepoolt und zweifach mit 0,1% TFA verdünnt und isokratisch auf eine µ-Bondapak-C18-Säule (3,9×300 mm) (als C18³ bezeichnet) bei Raumtemperatur injiziert. Die Durchflußmenge war 1 ml/min und die Fließgeschwindigkeit 0,25 cm/min. Ein linearer Gradient wurde verwendet zwischen dem primären Lösungsmittel 0,1% TFA und dem sekundären Lösungsmittel n-Propanol-TFA (0,1%). Die Gradienten-Bedingungen waren 0-23% in 20 min und 23-35% in 120 min. Fraktionen wurden gesammelt und gleiche Anteile einer jeden Fraktion wurden auf GIA geprüft. Das meiste der Aktivität erschien zwischen 25 und 26,5% Propanol-Konzentration (Verweilzeit 59 min). Diese offensichtlich homogene Fraktion enthielt annähernd 300 ng Protein und ungefähr 4000 GIA-Einheiten.

2. Antikörper zu einem synthetischen Peptid von Oncostatin M reagiert in ¹²⁵I-markierten Oncostatin M in Radioimmun-Präzipitation a) Peptid-Synthese

Das Peptid entsprach den Resten 6-19 des Oncostatin M-Proteins und wurde durch Fest-Phasentechnik, wie beschrieben, auf einem Beckman-automatisierten Gerät synthetisiert (Gentry et al., J. Biol. Chem. (1983) 258: 11 219). Das Peptid wurde vom Harz unter Verwendung der "low-high" HF-Verfahrensweise (Tam et al., J. Amer. Chem. Soc. (1983) 105: 6442-6445) gespalten.

b) Herstellung von Antikörpern

Das Peptid wurde an Rinder-γ-Globulin wie beschrieben gekuppelt (Genty und Lawton, Virology (1986) 152: 421-431). Weiße Neuseeland-Kaninchen wurden geprimed und fünfmal verstärkt und zwar subkutan an 4 Stellen, wie beschrieben (Gentry und Lawton, Virology (1986) 152: 421-431). Antiseren wurden 2 Wochen nach der fünften Verstärkung (boost) erhalten.

c) Jodierung von Oncostatin M

Eine Probe von partiell gereinigtem Oncostatin M wurde mit Jod¹²⁵ unter Anwendung veröfffentlichter Verfahrensweise radiomarkiert (Linsley et al., PNAS (1985) 82: 356-360). Eine aliquote Menge der markierten Präparation, die 100 000 cpm enthielten, wurde mit Kaninchen-Antiserum vermischt, welches gegen die N-endständigen 17 Aminosäuren von Oncostatin M gerichtet war (Endverdünnung 1 : 20), und zwar in Abwesenheit oder Anwesenheit des N-endständigen Peptids (die N-endständigen 17 Aminosäuren von Oncostatin M) (2 µg) und der Immunpräzipitationsanalyse unterworfen, wie beschrieben (Linsley et al., Biochemistry (1986) 25: 2978-2986).

Speziell wurde ein 5 µl enthaltendes Rohr präinkubiert mit 2 µg des N-endständigen Peptids in 10 ml TNEN (20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,05% Nonidet P-40), das 0,1% BSA enthielt, und zwar während 30 Minuten bei 4°C, bevor die Zugabe von I¹²⁵ Oncostatin M in 85 µl TNEN, das 0,1% BSA und 40 mM Dithiothreitol (DTT) enthielt, erfolgte. Sieben Rohre, die 5 µl Antiseren enthielten, wurden mit I¹²⁵ Oncostatin M in 85 µl TNEN, das 0,1% BSA und 40 mM DTT enthielt, während 30 Minuten bei 4°C inkubiert, bevor die Zugabe von 50 µl 10% formalinfixiertem Staphylococcus aureus erfolgte.

Im Anschluß an eine zusätzliche Inkubation während 30 Minuten bei 4°C wurden die Rohre mikrofugiert und die Pellets wurden viermal mit 1 ml TNEN gewaschen, bevor sie der PAGE-Analyse unterworfen wurden. Eine diffuse Bande von Mr=32 kD wurde nach der SDS/PAGE-Analyse des Immunpräzipitats beobachtet. Die Präzipitation dieser Spezies wurde durch den Einschluß eines Überschusses an unmarkiertem Peptid inhibiert, das den N-endständigen 17 Aminosäuren von Oncostatin M entsprach, was anzeigt, daß die Präzipitation spezifisch für dieses Peptid ist.

Das beschriebene intakte Polypeptid oder Fragment davon können als Immunogene verwendet werden, um die Antikörperbildung zu induzieren. Die induzierten Antikörper finden erfindungsgemäß Verwendung zum Titern von in einer Körperflüssigkeit vorhandenem Oncostatin M oder zur Modulierung der Aktivität des Faktors durch Bindung an ihn. Weiterhin können diese Antikörper zusammen mit gereinigtem Oncostatin M oder Fragmenten davon als Komponente von diagnostischen Kits verwendet werden in Verbindung mit anderen Reagenzien, insbesondere Antikörpern, um Oncostatin M aufzuspüren und zu quantifizieren.

Obwohl die vorhergehende Erfindung zum Zwecke der Erläuterung und zum guten Verständnis im Detail beschrieben wurde, so ist es für den Fachmann klar, daß Abweichungen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne den Umfang der Ansprüche zu verlassen.

Claims (9)

1. Antikörper spezifisch für ein Polypeptid, welches aus Leukozyten erhältlich ist, zur Inhibition der Proliferation von neoplastischen Zellen fähig ist, die Proliferation von normalen menschlichen Fibroplasten zu stimulieren vermag, menschlichen proliferativen und zytotoxischen T-Zell-Response nicht inhibiert und granulozytische/myelozytische Knochenmarkskolonie-Zellbildung nicht inhibiert, ein Molekulargewicht im Bereich von 17 bis 19 kD, bestimmt durch Gel-Exklusionschromatographie, und von 28 kD, bestimmt durch SDS-PAGE, besitzt und relativ unempfindlich gegenüber mäßiger Säure bzw. Base und stabil gegen Wärmebehandlung bei 56°C ist.

2. Antikörper spezifisch für ein Polypeptid nach Anspruch 1, das erhältlich ist aus Leukozyten, die mitogenaktivierte normale menschliche periphere Blutlymphozyten sind.

3. Antikörper spezifisch für ein Polypeptid nach Anspruch 1, das erhältlich ist aus Leukozyten, die Phorbol-Diester-induzierte menschliche histiozytische Lymphomzellen sind.

4. Antikörper spezifisch für eine Polyaminosäure mit mindestens acht Aminosäuren, die immunologisch kreuzreaktiv ist mit dem Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 3.

5. Antikörper spezifisch für eine Polyaminosäure nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyaminosäure eine Aminosäuresequenz mit mindestens zehn aufeinanderfolgenden Aminosäuren besitzt, welche einer der folgenden Aminosäuresequenzen entspricht und von dieser Sequenz durch nicht mehr als drei Aminosäuren abweicht.

6. Antikörper nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Polyaminosäure zwölf aufeinanderfolgende Aminosäuren enthält, welche einer der folgenden Aminosäuresequenzen entspricht und von dieser Sequenz durch nicht mehr als eine Aminosäure abweicht, wobei diese Abweichung entweder eine Leerstelle oder eine konservative Substitution ist.

7. Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Polypeptid Bestandteil einer Zusammensetzung ist, die im wesentlichen frei von Zellbestandteilen ist.

8. Antikörper nach einem der vorhergehenden Ansprüche als monoklonale Antikörper.

9. Verwendung der Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Detektion eines aus Leukozyten erhältlichen Polypeptids charakterisiert nach den Ansprüchen 1 bis 6.