DE3626421A1 - Peptid, pharmazeutisches mittel und verwendung desselben zur stimulierung der lipolyse - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Peptid und die Verwendung desselben zur Stimulierung der Lipolyse im Fettgewebe.

Es ist bekannt, daß Proopiomelanocorticotropin (POMC) im Molekül Peptidsequenzen aufweist, die stimulierend auf die Lipolyse oder die Insulinsekretion wirken. Der C-terminale Teil von POMC umfaßt ACTH und β-Lipotropin zusammen. Das genannte β-Lipotropin (b-LPH) umfaßt wiederum die Aminosäuresequenzen von β-Melanocyten-stimulierendem Hormon (β-MSH), Met-Enkephalin und β-Endorphin. β-Endorphin setzt sich aus insgesamt 31 Aminosäuren zusammen. Es ist bekannt, daß β-Endorphin eine die Insulinsekretion stimulierende Aktivität besitzt.

Die vom Hypothalamus und der Hypophyse ausgehende Kontrolle des Lipidmetabolismus in Säugern kann sich an drei Wirkzentren richten, nämlich an das Gehirn (z. B. durch Beeinflussung der Nahrungsaufnahme), den gastrointestinalen Trakt (z. B. durch Wirkung auf die Nahrungsabsorption und die Pankreasfunktionen) und an das Fettgewebe (z. B. durch Beeinflussung der Lipidmobilisierung).

Es besteht ein Bedarf nach einem Wirkstoff zur Bekämpfung bzw. Verhinderung von Übergewichtigkeit bei Mensch und Tier. Dabei ist es erforderlich, daß dieser Wirkstoff auf eines oder mehrere der vorstehend genannten Wirkzentren bereits in physiologischen Konzentrationen wirkt und es dabei nicht zum Auftreten toxischer Nebenerscheinungen kommt. Der Wirkstoff soll den Stoffwechsel des Fettgewebes entweder durch direkte Einwirkung auf das Fettgewebe oder über Mediatoren regulieren. Im weiteren ist ein Wirkstoff bevorzugt, der hinsichtlich seiner Zusammensetzung genau definiert ist, in einfacher Weise in den erforderlichen Mengen synthetisiert werden kann, und an welchem exponierte Gruppen gegebenenfalls mit Hilfe von Schutzgruppen vor einem vorzeitigen Abbau geschützt sind.

Die vorstehende Aufgabe wird durch ein Peptid der folgenden Sequenz gelöst:

A-Thr-Leu-Phe-Lys-Asn-Ala-Ile-B-Lys-Asn-Ala-C-Lys-Lys-Gly-D

wobei A Wasserstoff oder das Pentapeptid Thyr-X-Gly-Phe-Y bedeutet, wobei X Glycin oder Alanin darstellt, Y Methionin oder Prolin bedeutet, B die Bedeutung von Isoleucin oder Valin hat, C Tyrosin oder Histidin darstellt und D Glutamin oder Glutaminsäure bedeutet.

Die vorstehenden Modifikationen gemäß den unterschiedlichen Bedeutungen von B, C und D entsprechen den genetisch vorliegenden Abweichungen der jeweiligen Aminosäuren am C-terminalen Ende von Human- und Schweine-β-Endorphin. Offensichtlich sind die in den Positionen B, C und D angegebenen Aminosäuren nicht von zentraler Bedeutung, so daß es denkbar ist, daß sie durch weitere, insbesondere sterisch ähnliche Aminosäuren ersetzt werden können.

Die in der vorstehenden Teilsequenz von β-Endorphin vorliegenden Aminosäurereste stellen L-Aminosäurereste dar. Es ist jedoch auch möglich, durch Austausch bestimmter L-Aminosäuren gegen D-Aminosäuren in der Teilsequenz, letztere resistenter gegenüber Abbau zu machen.

Nach einer weiteren Ausführungsform gemäß der Erfindung ist es bevorzugt, exponierte Gruppen in der erfindungsgemäßen Peptidsequenz durch Einführung von Schutzgruppen zu schützen. Dadurch soll das erfindungsgemäße Peptidmolekül stabilisiert werden, und es soll einem vorzeitigen Abbau desselben vorgebeugt werden.

Ein derart geschütztes Peptid gemäß der Erfindung weist folgende allgemeine Formel auf:

wobei A Wasserstoff oder das Pentapeptid

bedeutet und X, Y, B, C und D die vorstehend angegebene Bedeutung haben, und die Schutzgruppen P die folgende Bedeutung haben können:
Wasserstoff, Alkyl, wie Methyl, Ethyl, tert.-Butyl, 2-Halogenalkyl, Benzyl, Alkoxy(alkyl)benzyl, wie 2,4-Dimethoxybenzyl, Dimethoxydimethylbenzyl, 1-Ferrocenylalkyl, wie Ferrocenylmethyl (Fem), Phenyl, Nitrophenyl, Nitrophenylsulfenyl (Nps), Alkoxycarbonyl, wie tert.-Butyloxycarbonyl (Boc), 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), 2-Halogenalkoxycarbonyl, wie 2,2,2-Trichlor-tert.-butyloxycarbonyl (Tcboc), Benzyloxycarbonyl (Z), Alkoxy(alkyl)benzyloxycarbonyl, wie Dimethoxybenzyl und Dimethoxydimethylbenzyl (Ddz).

Die Schutzgruppe P stellt vorzugsweise tert.-Butyl, tert.-Butyloxycarbonyl, 2,2,2-Trichlor-tert.-butyloxycarbonyl oder Ferrocenylmethyl dar. Im besonderen Maße bevorzugt ist der Ferrocenylmethylrest (siehe Publikation "Der Ferrocenylmethyl(Fem)-Rest als hochlipophile und chromophore Gruppe zur Maskierung von Peptidbindungen" von H. Eckert und C. Seidel in Angewandte Chemie, 98 (1986), S. 168-170). Die am N- oder C-Terminus der Peptidkette und/oder an funktionellen Gruppen in den Seitenketten mehrfunktioneller Aminosäuren und/oder an Amidfunktionen, insbesondere Peptidbindungen des Peptids eingeführten Schutzgruppen bewirken Änderungen in den Löslichkeitseigenschaften und der Stabilität dieser Peptid-Derivate; außerdem ermöglicht die Einführung von Schutzgruppen die Manipulation bzw. Unterdrückung der Sekundärstruktur der Peptid-Derivate, was Auswirkungen auf die enzymatische Abbaubarkeit und die pharmakologische Wirkung der Peptid-Derivate haben kann.

Die Erfindung umfaßt im weiteren ein pharmazeutisches Mittel und ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Peptids sowie eines mit Schutzgruppen versehenen Peptids. Die Synthese des erfindungsgemäßen Peptids erfolgt in an sich bekannter Weise, wobei insbesondere auf die in den Patentanmeldungen P 27 47 724 und P 26 19 247 offenbarten Verfahren verweisen wird.

Im weiteren sieht die Erfindung die Verwendung des vorstehend genannten Peptids zur Stimulierung der Lipolyse vor. Insbesondere eignet sich das Peptid gemäß der Erfindung zur Verabreichung als Appetitzügler bei Mensch und Tier.

Als Verabreichungsformen eignen sich alle üblicherweise für Peptide vorgesehenen Verabreichungsformen. Besonders bevorzugt ist die intravenöse Verabreichung sowie die intranasale.

Die Verabreichungsmengen sind abhängig vom Zustand und dem Alter des Patienten sowie der Verabreichungsform. Versuche an Fettzellen von Kaninchen haben ergeben, daß bereits Konzentrationen von 10^-6 bis 10^-8 M des erfindungsgemäßen Peptids eine deutliche Stimulierung der Lipolyse in Fettzellen bewirken.

Die folgenden Versuche sollen die lipolytische Aktivität der erfindungsgemäßen Peptidsequenz zeigen.

Versuchsdurchführung und Materialien

Es wurden insgesamt 30 unterschiedliche Aminosäuresequenzen von β-Endorphin bzw. Teilsequenzen desselben als Stimulatoren der Lipolyse an isolierten Kaninchen-Fettzellen untersucht. Außerdem wurden Untersuchungen an Adipozyten von Kaninchen unter Nahrungsentzug durchgeführt.

Bei den nachfolgend aufgeführten β-Endorphin-Sequenzen handelt es sich um synthetisch hergestellte Sequenzen sowie um isoliertes und gereinigtes Human- und Schweine-β-Endorphin.

Das für die Untersuchungen dienende perirenale Fettgewebe stammte von weiblichen Kaninchen (Körpergewicht zwischen 3 und 6,5 kg), wobei diese entweder ad libitum gefüttert, 12 bis 72 Stunden unter Nahrungsentzug gehalten oder 48 Stunden unter Nahrungsentzug und daraufhin 24 Stunden erneut gefüttert wurden. Isolierte Fettzellen wurden nach Rodbell (Metabolism of isolated fat cells, J. Biol. Chem. 239 (1964), S. 375) durch Abbau von Fettgewebe mit Hilfe von Collagenasen, die im wesentlichen frei von kontaminierenden spezifischen Proteasen waren, gewonnen. Für die Lipolyseuntersuchung wurden ca. 70.000 Adipozyten in 1 ml Krebs-Ringer-Bicarbonatpuffer (ph 7,4), der 4% entfettetes Rinderserumalbumin Fraktion V und 3 mM Glucose enthielt, bei 37°C eine Stunde unter Schütteln inkubiert. Die Peptide wurden in Konzentrationen von 10^-6 bis 10^-9 M den Zellen zugegeben. Die Überlebensfähigkeit der Adipozyten wurde aufgrund ihres mikroskopischen Aussehens und ihrer Fähigkeit, auf β-Lipotropin anzusprechen, getestet. Die Inkubation wurde durch Eiskühlung und 4minütiges Zentrifugieren bei 12 000 g gestoppt. Der erhaltene Unterstand wurde bei -35°C zur Bestimmung von Glycerin tiefgefroren. Glycerin wurde mit Hilfe eines automatisierten enzymatischen Verfahrens, wie dies in Clin. Chem. 27 (1981) S. 512, beschrieben ist, bestimmt.

Ergebnisse

Der folgenden Tabelle 1 sind die untersuchten Aminosäuresequenzen zu entnehmen.

Von den insgesamt 28 unterschiedlichen Teilsequenzen des β-Endorphins zeigten nur zwei eine lipolytische Aktivität, nämlich β-Endorphin 6-31 und β-Endorphin (1-5)-(16-31). Im weiteren wurde die lipolytische Aktivität von Human- und Schweine-β-Endorphin bestimmt.

Aus diesem Ergebnis läßt sich ableiten, daß insbesondere die Aminosäuren (16-31), nämlich ein 16er Peptid, zur Stimulierung der Lipolyse erforderlich sind. Von Bedeutung ist, daß eine Eliminierung der letzten zwei Aminosäuren am C-terminalen Ende oder der letzten 4 oder 5 Aminosäurereste den vollständigen Verlust der lipolytischen Aktivität bewirkten. Daraus ist abzuleiten, daß zur lipolytischen Wirkung insbesondere die C-terminalen Aminosäuren von Bedeutung sind. Es zeigte sich aber auch, daß zumindest ein Decahexapeptid vorliegen muß, um eine Stimulierung der Lipolyse bewirken zu können. Teilsequenzen, i.e. 25-31 oder 21-31, waren lipolytisch inaktiv.

Im Gegensatz zu den C-terminalen Aminosäuren, scheinen die N-terminalen Aminosäuren zur Stimulierung der Lipolyse nicht von besonderer Bedeutung zu sein. N-terminale Aminosäuresequenzen von β-Endrophin 1-5 (Met-Enkephalin) bis zu β-Endorphin 1-17 (gamma-Endorphin) zeigten keine lipolytische Wirkung; dies trifft ebenfalls für die modifizierten Peptide Leu-Enkephalin, D-Met²-Pro⁵-Enkephalinamid und das Straussen-Sequenz-β-Endorphin 1-9 zu. Aus der Tatsache, daß β-Endorphin (1-5)-(16-31) lipolytisch aktiv ist, jedoch β-Endorphin 1-5 und β-Endorphin D-Ala²-Leu⁵ (1-5)-(16-29) inaktiv sind, läßt sich ableiten, daß für die lipolytische Wirkung des β-Endorphins die Aminosäuresequenz 16-31 von Bedeutung ist. Dabei kann die Sequenz an den mit B, C und D bezeichneten Positionen unterschiedliche Aminosäuren aufweisen.

Es wird angenommen, daß die C-terminalen Aminosäuren des β-Endorphins, insbesondere das Decahexapeptid 16-31, an Fettzellrezeptoren bindet, wie dies in jüngster Zeit für Human-Komplement oder Lymphozyten gezeigt wurde. Dies wurde im weiteren durch eigene Versuche bestätigt, wonach eine Preinkubation von Adipozyten mit β-Endorphin 28-31 zu einer Inhibierung der lipolytischen Aktivität von β-Endorphin 1-31 führte.

Tabelle 2 gibt eine qualitative Aussage zur Aktivität der untersuchten β-Endorphin-Sequenzen wieder.

Tabelle 2

Tabelle 3 gibt die quantitativen Ergebnisse zur lipolytischen Wirkung von Human-β-Endorphin (1-5)-(16-31) und 6-31 sowie als Vergleichssubstanzen Human- und Schweine-β-Endorphin in Adipozyten von 12 Stunden lang unter Nahrungsentzug gehaltenen Kaninchen (n = 6) wieder.

Tabelle 3

Claims (6)

1. Peptid der folgenden Sequenz A-Thr-Leu-Phe-Lys-Asn-Ala-Ile-B-Lys-Asn-Ala-C-Lys- Lys-Gly-Dwobei A Wasserstoff oder das Pentapeptid Thyr-X-Gly-Phe-Y bedeutet, wobei X Glycin oder Alanin darstellt, Y Methionin oder Prolin bedeutet, B die Bedeutung von Isoleucin oder Valin hat, C Tyrosin oder Histidin darstellt und D Glutamin oder Glutaminsäure bedeutet.

2. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es, wie nachstehend angegeben, durch eine oder mehrere Schutzgruppen geschützt ist: wobei A Wasserstoff oder das Pentapeptid bedeutet; P folgende Bedeutungen haben kann:Wasserstoff, Alkyl, wie Methyl, Ethyl, tert.-Butyl, 2-Halogenalkyl, Benzyl, Alkoxy(alkyl)benzyl, wie 2,4-Dimethoxybenzyl, Dimethoxydimethylbenzyl, 1-Ferrocenylalkyl, wie Ferrocenylmethyl (Fem), Phenyl, Nitrophenyl, Nitrophenylsulfenyl (Nps), Alkoxycarbonyl, wie tert.-Butyloxycarbonyl (Boc), 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), 2-Halogenalkoxycarbonyl, wie 2,2,2-Trichlor-tert.-butyloxycarbonyl (Tcboc), Benzyloxycarbonyl (Z), Alkoxy(alkyl)benzyloxycarbonyl, wie Dimethoxybenzyl und Dimethoxydimethylbenzyl (Ddz); und X, Y, B, C und D die vorstehend angegebene Bedeutung haben.

3. Pharmazeutisches Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es in therapeutisch wirksamer Menge ein Peptid bzw. ein mit Schutzgruppen versehenes Peptid gemäß den Ansprüchen 1 oder 2 zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Exzipienten umfaßt.

4. Pharmazeutische Mittel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel im weiteren ein Schutzpeptid umfaßt.

5. Pharmazeutisches Mittel nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß dasselbe in einem Liposom vorliegt.

6. Verwendung des Peptids gemäß den Ansprüchen 1 und 2 zur Stimulierung der Lipolyse.