DE3621448A1 - Verfahren zur bestimmung von ammoniak (oder atp) - Google Patents

Verfahren zur bestimmung von ammoniak (oder atp)

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Description

Ammoniak wurde bisher hauptsächlich nach einer chemischen Methode (der sogenannten Indophenolmethode) bestimmt. Ammoniak kann auch nach verschiedenen enzymatischen Methoden bestimmt werden. In Frage kommt dabei eine Methode unter Verwendung von Glutamathydrogenase (JA-OS 21 995/'82), welche eine große Menge an Enzym zur Messung erfordert infolge seines großen Km-Wertes für Ammoniak. Eine andere enzymatische Methode verwendet Carbamate-Kinase (JA-PS 2 13 399/'84). Dieses Enzym, das im allgemeinen instabil ist und dazu neigt, seine Aktivität nach einer Dialyse und anderen Behandlungen zu verlieren, muß gereinigt oder in Gegenwart eines SH-Gruppenschutzmittels, wie reduziertem Glutathion und 2-Marcaptoethanol, gelagert werden. Wird Ammoniak in einer Lösung bestimmt, die ein Oxidase/ Peroxidase/Chromogen-System enthält, dann inhibiert das Vorliegen eines derartigen SH-Gruppenschutzmittels in dem Carbamatkinasepräparat das Farbreaktionssystem, wodurch negative Fehler erzeugt werden und keine genauen Messungen möglich sind. Eine dritte bekannte enzymatische Methode verwendet Carbamoylphophatsynthetase (JA-PS 47 698/'85). Diese Synthetase kann nur aus Säugetierorganen erhalten werden und eine konstante Lieferung in größeren Mengen ist nicht zu erwarten.
Es sind zwei Methoden bekannt zur Bestimmung von ATP: eine besteht darin, Hexokinase mit ATP in Gegenwart von Glukose unter Bildung von Glukose-6-phosphat umzusetzen, dann die Glukose-6-phosphatdehydrogenase auf dieses Phosphat in Gegenwart von NADP zur Umsetzung zu bringen und colorimetrisch die Menge an NADPHbei 340 nm zu messen (Methods of Enzymatic Analysis, 7, 346, 1985), während die andere Methode darin besteht, Luciferase mit ATP in Gegenwart von Luciferin und Mg2+-Ionen umzusetzen und die Menge an ATP durch Messung der Luminozität bei 562 nm zu messen (ibid., 7, 357, 1985). Die erstere Methode ist mit dem Nachteil einer geringen Empfindlichkeit behaftet, da nur ein Molekül NADPH aus einem Molekül ATP gebildet wird, während der Nachteil der letzteren Methode in den hohen Kosten von Luciferin und Luciferase liegt.
Aufgabe der Erfindung ist daher die Schafffung eines sehr empfindlichen, einfachen und billigen Verfahrens zur Bestimmung von Ammoniak oder ATP.
Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß Patentanspruch 1 gelöst.
Zusammengefaßt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung von Ammoniak (oder ATP) in einer Probelösung und besteht darin, Glutaminsynthetase auf die Probelösung in Gegenwart von L-Glutaminsäure und ATP (oder Ammoniak) und dann eine Kinase auf das gebildete Kinasesubstrat und ADP einwirkenzulassen und die Menge des erhaltenen Produkts der Kinasereaktion zu messen.
Das erfindungsgemäße Verfahren verwendet eine Zyklusreaktion mit hoher Empfindlichkeit, eine colorimetrische Bestimmung und die Verwendung von Glutaminsynthetase, die sehr stabil ist und billig in größeren Mengen aus Mikroorganismen erhalten werden kann (insbesondere Micrococcus- und Brevibacterium-Mikroorganismen, die in der Lage sind, Glutaminsynthetase in Mengen von 2 bis 3% des gesamten intrazellularen Proteins, das sie erzeugen, zu bilden). Auf diese Weise wird eine neue Methode der Bestimmung von Ammoniak und ATP geschaffen, die sehr wertvoll zur Durchführung von klinischen Tests ist.
Jede Probelösung, die Ammoniak oder ATP enthält, kann zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden. Erwähnt seien Lösungen, die Ammoniak oder ATP enthalten, die durch enzymatische Reaktion gebildet worden sind. Nachfolgend werden typische enzymatische Reaktionen, die Ammoniak bilden, aufgezählt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in erfolgreicher Weise zur Messung der Aktivität dieser Enzyme und zur Bestimmung der Substrate und Produkte dieser Reaktionen eingesetzt werden.
  • 1. Asparaginase (EC3.5.1.1)
    L-Asparagin + H2O →L-Asparaginsäure + NH3
  • 2. Aspartase (EC4.3.1.1)
    L-Asparagin → Fumarsäure + NH3
  • 3. Adenindeaminase (EC3.5.4.2)
    Adenin + H2O → Hypoxanthin + NH3
  • 4. Adenosindeaminase (EC3.5.4.4)
    Adenosin + H2O → Inosin + NH3
  • 5. Adenosinmonophosphatdeaminase (EC3.5.4.6)
    AMP + H2O → IMP + NH3
  • 6. Adenosinphosphatdeaminase (EC3.5.4.17)
    Adenosinphosphat + H2O → Inosinphosphat + NH3
  • 7. Amindehydrogenase (EC1.4.99.3)
    Amin + oxidiertes Phenazinmethosulfat + H2O2 → Aldehyd + reduziertes Phenazinmethosulfat + NH3
  • 8. Arginindeiminase (EC3.5.3.6)
    L-Arginin → L-Citrullin + NH3
  • 9. Amidase (EC3.5.1.4)
    Monocarbonsäureamid + H2O → Monocarbonsäure + NH3
  • 10. ω-Amidase (EC3.5.1.3)
    2-Ketoglutaraminsäure + H2O → 2-Ketoglutarsäure + NH3
  • 11. Urease (EC3.5.1.5)
    Harnstoff + H2O → 2NH3 + CO2
  • 12. Ureidsuccinase (EC3.5.1.7)
    N-Carbamoyl-L-Asparaginsäure + H2O → L-Asparaginsäure + CO2 + NH3
  • 13. Guanindeaminase (EC3.5.4.3)
    Guanin + H2O → Xanthin + NH3
  • 14. Guanosindeaminase (EC3.5.4.15)
    Guanosin + H2O → Xanthosin + NH3
  • 15. Glutaminase (EC3.5.1.2)
    L-Glutamin + H2O → L-Glutaminsäure + NH3
  • 16. Creatinindeaminase (EC3.5.4.21)
    Creatinin + H2O → N-Methylhydantoin + NH3
  • 17. Cytidindeaminase (EC3.5.4.5)
    Cytidin + H2O → Uridin + NH3
  • 18. Cytosindeaminiase (EC3.5.4.1)
    Cytosin + H2O → Uracil + NH3
  • 19. Citrullinase (EC3.5.1.20)
    L-Citrullin + 2H2O → L-Ornitin + CO2 + NH3
  • 20. Trans-glutaminase (EC2.3.2.13)
    N2-R-Glutaminylpeptid + RNH2 → NH3 + N2-R-N5-R-Glutaminylpeptid
  • 21. Threonindehydratase (EC4.2.1.16)
    L-Threonin + H2O → 2-Ketobuttersäure + NH3 + H2O
  • 22. Nikotinamidase (EC3.5.1.19)
    Nikotinamid + H2O → Nikotinsäure + NH3
  • 23. Nikotinamidnukleotidamidase (EC3.5.1.42)
    Nikotinamidmononukeotid + H2O → Nikotinsäure-D-ribonukleotid + NH3
  • 24. L-Histidinammoniaklyase (EC4.3.1.3)
    L-Histidin → Urocansäure + NH3
  • 25. Phenylalaninammoniaklyase (EC4.3.1.5)
    L-Phenylalanin → Trans-zimtsäure + NH3
Nachfolgend werden typische enzymatische Reaktionen, die ATP bilden aufgezählt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in erfolgreicher Weise zur Messung der Aktivität dieser Enzyme und zur Bestimmung der Substrate und Produkte dieser Reaktionen verwendet werden.
  • 1. Tyrosyl-tRNA-Synthetase (EC6.1.1.1)
    L-Tyrosyl-tRNA + AMP PPi ⇄ L-Tyrosin + ATP + tRNA
  • 2. Acetyl-CoA-Synthetase (EC6.2.1.1)
    AMP + PPi + Acetyl-CoA ⇄ ATP + Essigsäure + CoA
  • 3. Asparagin-Synthetase (EC6.3.1.1)
    L-Asparagin + AMP + PPi ⇄ L-Asparaginsäure + NH3 + ATP
  • 4. NAD-Synthetase (EC6.3.1.5)
    AMP + Pyrophosphorsäure + NAD ⇄ ATP + Deamido + NH3
  • 5. Ribosephosphatpyrophosphokinase (EC2.7.6.1)
    AMP + 5-Phospho-α-D-ribosylpyrophosphat ⇄ ATP + D-Ribose-5-phosphat
  • 6. Pyruvatorthophosphatdikinase (EC2.7.9.1)
    AMP + Phosphoenolbrenztraubensäure + PPi ⇄ ATP + Brenztraubensäure + Pi
Die vorstehend angegebenen enzymatischen Reaktionen dienen nur zur Erläuterung, ohne die Erfindung zu beschränken.
Die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens einzusetzende Glutaminsynthetase findet sich im Hirm und in der Leber von verschiedenen höheren Tieren, im Saatgut von Hülsenfrüchten sowie in Escherichia colie und anderen Mikroorganismen. Davon werden Glutaminsynthetase erzeugende Spezies, die zum dem Genus Micrococcus oder Brevibacterium gehören, am als vorteilhafteste Quellen bezüglich der billigen Verfügbarkeit in größeren Mengen bevorzugt (vgl. die JA-PS 33 594/'82). In den folgenden Beispielen der vorliegenden Erfindung wird Glutaminsynthetase, die unter Einsatz von Brevibacterium flavum ATCC 14067 erzeugt wird, verwendet.
Die Wirkung und die Methode der Messung der enzymatischen Aktivität der erfindungsgemäß eingesetzten Glutaminsynthetase werden nachfolgend erläutert.
1. Wirkung
Dieses Enzym katalysiert die Biosynthese von L-Glutamin aus L-Glutaminsäure und Ammoniak unter Verwendung der chemischen Energie von ATP
L-Glutaminsäure + Ammoniak + ATP → L-Glutamin + ADP + anorganisches Phosphat
2. Messung der enzymatischen Aktivität
Eine Mischung aus 0,1 ml 500 mM Natrium-L-glutamatlösung, 0,1 ml 250 mM Ammoniakchloridlösung, 0,1 ml 75 mM ATP-Lösung, 0,1 ml 300 mM MgCl2-Lösung, 0,1 ml 1M Imidazol-HCl-Puffer (pH 7,0), 0,4 ml destilliertem Wasser und 0,1 ml Enzymlösung mit geeigneter Konzentration wird bei 37°C 10 Minuten stehengelassen. Nach Beendigung der Reaktion wird die Menge an gebildetem anorganischem Phosphat nach der Fiske-Subbarow-Methode gemessen oder das gebildete Glutamin wird durch Papierchromatographie abgetrennt und durch die Ninhydrin-Farbreaktion bestimmt. Eine Einheit Glutaminsynthetase wird durch die Menge an Enzym zum Ausdruck gebracht, die 1 µMol anorganisches Phosphat oder Glutamin in 1 Minute in den vorstehend beschriebene Reaktionssystemen zu erzeugen vermag.
Bestimmung von Ammoniak oder ATP:
Es wurde festgestellt, daß Ammoniak oder ATP in einer Probelösung in sehr einfacher Weise mit hoher Empfindlichkeit sowie preisgünstig durch Verwendung von Glutaminsynthetase bestimmt werden kann. Bei dieser Methode läßt man in der Probelösung enthaltenes Ammoniak mit L-Glutaminsäure und ATP durch Wirkung von Glutaminsynthetase unter Bildung von Glutamin, ADP und anorganischen Phosphat reagieren. ATP in einer Probelösung läßt man andererseits mit L-Glutaminsäure und Ammoniak durch Wirkung der Glutaminsynthetase unter Bildung von L-Glutamin, ADP und anorganischen Phosphat reagieren. Das durch diese enzymatischen Reaktionen gebildete ADP läßt man dann mit einer Kinase in Gegenwart von Kinasesubstrat unter Bildung von Kinasereaktionsprodukten und ATP reagieren. Die Reaktion von ADP mit Phosphoenolbrenztraubensäure (Kinasesubstrat), katalysiert durch Pyruvatkinase unter Gewinnung von ATP und Brenztraubensäure ist ein typisches Beispiel für diesen Typ von Reaktion. In diesem Falle kann die Menge an durch diese Reaktion gebildeter Brenztraubensäure nach jeder bekannten Methode gemessen werden. Beispielsweise läßt man NADH und Lactatdehydrogenase mit der Brenztraubensäure reagieren, worauf sich die Messung der Reduktion des Absorptionsvermögens bei 340 nm infolge von NADH anschließt. Ferner kann man Pyruvatoxidase auf die Brenztraubensäure einwirken lassen, worauf sich eine Messung des Sauerstoffverbrauchs nach der Sauerstoffelektrodenmethode anschließt oder eine Bestimmung von gebildetem Wasserstoffperoxid durch die Peroxidasefarbreaktion folgt (beispielsweise Messung des Absorptionsvermögens bei 500 nm, wenn das 4-Aminoantipyrin/Phenol/Peroxidase-System verwendet wird).
Bezüglich des Typs der für diese enzymatischen Reaktionen verwendeten Pufferlösungen gibt es keine besonderen Einschränkungen in vorteilhafter Weise werden jedoch Phosphat-, Imidazol-, Tris- und Glyzylglyzin-Pufferlösungen verwendet. Vorzugsweise liegt der pH zwischen 6 und 9, wobei ein pH von 7 am meisten bevorzugt wird. Die Glutaminsynthetase sollte vorzugsweise in einer Menge von 0,2 bis 20 Einheiten und insbesondere von 1 bis 5 Einheiten und die Kinase in einer Menge von 1 bis 10 Einheiten, insbesondere 5 Einheiten oder mehr, verwendet werden. L-Glutaminsäure sollte vorzugsweise in einer Konzentration von 1 bis 50 mM und insbesondere 5 bis 10 mM und ATP und das Kinasesubstrat (beispielsweise Phosphoenolbrenztraubensäure und NADH) in einer Konzentration von nicht weniger als derjenigen des zu bestimmenden Ammoniaks oder ATP eingesetzt werden. Diese Reaktionen werden vorzugsweise bei 20 bis 40°C während 1 bis 20 Minuten durchgeführt.
Die Erfindung wird nachfolgend durch die Beispiele und die beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Die Fig. 1 zeigt eine Eichkurve, welche die Beziehung zwischen der Menge an Ammoniak und dem Unterschied des Absorptionsvermögens bei 340 nm bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erläutert. Die Fig. 2 zeigt eine Eichkurve, welche die Beziehung zwischen der Menge an Ammoniak und dem Unterschied im Absorptionsvermögen bei 500 nm bei Anwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens zeigt. Fig. 3 zeigt eine Eichkurve, welche die Beziehung zwischen der Menge an ATP und dem Unterschied des Absorptionsvermögens bei 340 nm bei dem in Beispiel 3 angewendeten Verfahren erläutert. Fig. 4 zeigt die Veränderungen der Absorption bei 340 nm im Verlaufe der Reaktionszeit (Minuten), wenn Ammoniak unter Verwendung der erfindungsgemäßen Glutaminsynthetase (Kurve A) sowie unter Einsatz von herkömmlicher Glutamatdehydrogenase (Kurve B) bestimmt wird.
Beispiel 1
Bestimmung von Ammoniak (Pyruvatkinase/Lactatdehydrogenase- Reaktionssystem)
Zu 3,0 ml der vorstehenden Mischung werden 0,1 ml einer Ammoniumchloridlösung (1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM und 5 mM Konzentration) gegeben. Jede der erhaltenen Lösungen wird bei 37°C 5 Minuten stehengelassen. Wie aus Fig. 1 hervorgeht, wird eine gute lineare Beziehung zwischen der Menge an zugesetztem Ammoniumchlorid und der Abnahme des Absorptionsvermögens bei 340 nm festgestellt.
Beispiel 2
Bestimmung von Ammoniak (Pyruvatkinase/Pyruvatoxidase/Peroxidase- Reaktionssystem)
Zu 3,0 ml der vorstehenden Mischung werden 0,1 ml Ammoniumchloridlösung (Konzentration 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM und 5 mM) gegeben. Jede der erhaltenen Lösungen wird bei 37°C 5 Minuten stehengelassen. Wie aus Fig. 2 hervorgeht, wird eine gute lineare Beziehung zwischen der Menge an zugesetztem Ammoniumchlorid und der Zunahme des Absorptionsvermögens bei 500 nm beobachtet.
Beispiel 3
Bestimmung von ATP
Zu 3,0 ml der vorstehenden Mischung werden 0,1 ml ATP-Lösung (Konzentration 0,25 mM, 0,50 mM, 0,75 mM und 1,0 mM) gegeben und jede der erhaltenen Lösungen wird bei 37°C stehengelassen. Der Unterschied des Absoptionsvermögens bei 340 nm wird 3 Minuten und 5 Minuten später gemessen. Wie aus Fig. 3 hervorgeht, wird eine gute lineare Beziehung zwischen der Menge an zugesetztem ATP und dem Unterschied des Absorptionsvermögens bei 340 nm beobachtet (d. h. Abnahme der Menge an NADH).
Vergleichsbeispiel
Vergleich der Reaktionsgeschwindigkeit der Ammoniakbestimmung, wenn Glutaminsynthetase oder Glutamindehydrogenase verwendet wird:
Ein Test wird durchgeführt zum Vergleich der Reaktionsgeschwindigkeit der Bestimmung von Ammoniak mit niedriger Konzentration unter Verwendung von Glutaminsynthetase gemäß vorliegender Erfindung oder herkömmlicher Glutamatdehydrogenase aus Hefe. Die Zusammensetzung der Reaktantenmischung bei Verwendung von Glutaminsynthetase ist die gleiche, wie diejenige des Beispiels 1, mit der Ausnahme, daß 0,1 ml einer 45 Einheiten/ml-Glutaminsynthetase verwendet werden. Die Zusammensetzung der Glutamatdehydrogenasereaktion ist wie folgt: 1,0 ml 300 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) 0,1 ml 225 mM 2-Ketoglutarsäurelösung, 0,1 ml 6 mM NADPH-Lösung, 0,1 ml 45 Einheiten/ml-Glutamatdehydrogenaselösung und 1,6 ml Wasser. Zu jeweils 3,0 ml einer jeden der vorstehend beschriebenen gemischten Lösungen werden 50 µl Ammoniumchloridlösung (Konzentration 0,05 mM, 1,0 mM und 2,0 mM) gegeben und die erhaltenen Mischungen werden bei 37°C stehengelassen und die Absorption bei 340 nm infolge einer Abnahme an NADH oder NADPH im Verlaufe der Zeit wird gemessen.
Wie aus Fig. 4 hervorgeht, ist bei Verwendung von Glutaminsynthetase (Kurve A) die Reaktion nach ungefähr 3 Minuten bei allen getesteten Ammoniakkonzentrationen beendet. Wird Glutamatdehydrogenase verwendet (Kurve B), dann ist die Reaktion sogar noch nach 6 bis 7 Minuten im Falle von allen Ammoniakkonzentrationen unvollständig.
Wie aus den vorstehenden Ausführungen hervorgeht, vermag das erfindungsgemäße Verfahren in spezifischer Weise Ammoniak oder ATP mit hoher Empfindlichkeit zu bestimmen. Die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzte Glutaminsynthetase kann durch Mikroorganismen auf billige Weise erzeugt werden und hat sich als wirksames Reagens zur Durchführung von klinischen Test erwiesen.

Claims (2)

1. Verfahren zur Bestimmung von Ammoniak (oder ATP) in einer Probelösung, dadurch gekennzeichnet, daß man Glutaminsynthetase auf die Probelösung in Gegenwart von L-Glutaminsäure und ATP (oder Ammoniak) und dann eine Kinase auf das gebildete Kinasesubstrat und ADP einwirken läßt und die Menge des erhaltenen Produkts der Kinasereaktion mißt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Glutaminsynthetase, die Kinase und das Kinasesubstrat gleichzeitig in der Probelösung vorliegen.
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