DE3605908C2

DE3605908C2 -

Info

Publication number: DE3605908C2
Application number: DE3605908A
Authority: DE
Inventors: Masahiro Nobuhara; Toshinori Koshigaya Saitama Jp Kanamori; Kiyoshi Kawaguchi Saitama Jp Yamaguchi; Ei Tokio/Tokyo Jp Mochida
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1985-02-25
Filing date: 1986-02-24
Publication date: 1992-08-27
Also published as: JPH06800B2; JPS61197600A; DE3605908A1

Description

Die Erfindung betrifft das in den Ansprüchen 1 bis 13 angegebene Verfahren zum Reinigen von Interferon -β und das im Anspruch 14 angegebene Verfahren zum Reinigen von Interferon -gamma.

Interferone sind antivirale Substanzen, die von Nagano et al (Compt. Rend. Soc. Biol., Bd. 148, S. 1700, 1954) und Isaacs et al (Proc. Roy. Soc. Ser. B., Bd. 147, S. 258, 1957) entdeckt wurden und über die in neuerer Zeit berichtet wurde, wonach sie in einem weiten Bereich biologische Aktivitäten aufweisen, einschließlich einer Antitumorwirkung (Gressor, I. et al, B.B.A., Bd. 516, S. 231, 1978). Ihre mögliche Anwendung als Arzneimittel hat deshalb an Bedeutung gewonnen.

Interferone werden im allgemeinen aus Zellkulturen oder durch rekombinante DNA-Technologie gewonnen und der Gehalt an in dem Kulturmedium hergestellten Interferon ist im allgemeinen sehr niedrig. Um ein Interferon zu erhalten, welches als Medikament geeignet ist, ist es erforderlich, eine Reinigungsmethode zur Verfügung zu stellen, die es ermöglicht, ein hochgereinigtes Interferon aus einer rohen Interferonlösung zu gewinnen.

Verschiedene Verfahren zum Reinigen von Humaninterferon sind bekannt. Beispielsweise wurde als Reinigungsverfahren für Interferon-α eine Zinkchelat-Säulenchromatografie (Rubinstein, M. et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 76, S. 640, 1979) und eine blaue Sepharose- Säulenchromatografie (Zoon, K.C. et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 76, S. 5601, 1979) beschrieben. Für Interferon-β wurden Aussalzverfahren mittels Ammoniumsulfat, eine Gelchromatografie und eine CM-Sephadex-Säulenchromatografie (Knight, E. Jr., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 73, S. 520, 1976), eine SP-Sephadex-Säulenchromatografie und eine Zinkchelat- Säulenchromatografie (Hosoi, Kazuo et al, JA-OS Nr. 64 799-1980) beschrieben. Zum Reinigen von Interferon-γ wurde eine Chromatografie über porösem Glas, eine Cocanavalin A-Agarose-Säulenchromatografie und eine Methode, bei welcher eine Kombination dieser Methoden angewendet wurde (Yip, Y. K. et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 78, S. 1601, 1981) beschrieben.

Diese verschiedenen bekannten Reinigungsverfahren sind noch nicht befriedigend hinsichtlich des Reinigungsgrades alleine und um Interferon in einer Reinheit zu gewinnen, die für ein Arzneimittel ausreicht, ist es erforderlich, eine Mehrzahl von verschiedenen Reinigungsmethoden in Kombination anzuwenden. Aus diesem Grund ist das schließlich erhaltene Interferon, selbst wenn es hochgereinigt ist, unvermeidlich nur in einer sehr geringen Ausbeute vorhanden.

J. Biol. Chem. 251, S. 5381-5385, 1976 beschreibt das Verhalten von Human-Leucozyten-Interferon (im folgenden abgekürzt als IFN-alpha) und Human-Fibroblasten Interferon (im folgenden abgekürzt als IFN-beta), das in Bezug auf ein Adsorbens, dessen Ligand eine Aminosäure mit einem aromatischen Ring darstellt, unterschiedlich ist. IFN-alpha bindet an ein Dimer einer Aminosäure mit einem aromatischen Ring, geht jedoch kaum eine Bindung mit einem Monomeren einer Aminosäure mit aromatischem Ring ein. Im Unterschied dazu bindet IFN-beta an das Monomer, jedoch kaum an das Dimer.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Reinigen von Interferon-β und -gamma zur Verfügung zu stellen, bei dem man das Interferon in einer hohen Ausbeute gewinnt und wobei man spezielle Adsorptionsmittel verwendet.

Diese Aufgabe wird gelöst, indem ein Verfahren zur Reinigung von Interferon-beta zur Verfügung gestellt wird, welches gekennzeichnet ist durch:

(i) Kontaktieren einer rohen Interferon-β-Lösung mit einem Adsorptionsmittel, das eine organische, hochmolekulargewichtige, wasserunlösliche Matrix umfaßt, die direkt oder durch einen Abstandshalter mit einem Liganden kombiniert ist, wobei der Ligand aus der Gruppe bestehend aus Oligomeren von Aminosäuren, enthaltend einen aromatischen Ring, und Aminosäure-Derivaten, enthaltend einen aromatischen Ring, ausgewählt ist;
(ii) Adsorbieren von Interferon-β auf dem Adsorptionsmittel;
(iii) Eluieren von Interferon-β vom Adsorptionsmittel.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zum Reinigen von Human-Interferon-gamma, gekennzeichnet durch Kontaktieren einer rohen Human-Interferon-gamma-Lösung mit einem Adsorptionsmittel zur Adsorption von Human-Interferon-gamma an dasselbe mit einem Elutionsmittel, wobei das genannte Adsorptionsmittel D-Tyrosyl-L-tryptophan-Affi-Gel 10 darstellt.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird eine rohe Interferonlösung mit einem Adsorptionsmittel unter Adsorption des Interferons auf dem Adsorptionsmittel in Berührung gebracht und anschließend wird das Interferon mit einem Eluiermittel eluiert. Das Adsorptionsmittel umfaßt eine wasserunlösliche Matrix aus einer organischen hochmolekulargewichtigen Substanz, die mit einem Liganden kombiniert ist. Der Ligand enthält mindestens ein Molekül einer Aminosäure mit einem aromatischen Ring oder eines Aminosäurederivats mit einem aromatischen Ring im Molekül und gleichzeitig enthält er eine Aminogruppe oder Carboxylgruppe, die in der Lage ist, direkt mit der vorerwähnten wasserunlöslichen Matrix kombiniert zu werden oder die in der Lage ist, mit einem mit der Matrix kombinierten Abstandshalter zu kombinieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird im allgemeinen wie folgt durchgeführt. Eine rohe Interferonlösung wird mit einem Adsorptionsmittel durch ein Säulenverfahren oder absatzweise unter Absorption des Interferons auf dem Adsorptionsmittel in Berührung gebracht; dann wird das Adsorptionsmittel mit einem geeigneten Puffer gespült und anschließend wird das Interferon mit einem geeigneten Eluiermittel eluiert.

Das erfindungsgemäß verwendete Adsorptionsmittel umfaßt eine wasserunlösliche Matrix aus einer organischen, hochmolekulargewichtigen Substanz mit gewünschtenfalls einem Abstandshalter und einem Liganden.

Als wasserunlösliche Matrix, welche das Adsorptionsmittel bildet, kann man organische, hochmolekulargewichtige Substanzen, wie Agarose, Cellulose, Dextran, Polyacrylamid etc., verwenden. Besonders bevorzugt wird Agarose.

Der erfindungsgemäß verwendete Ligand ist eine Verbindung, bestehend aus Oligomeren von Aminosäuren, enthaltend einen aromatischen Ring und Aminosäurederivate, enthaltend einen aromatischen Ring. Der Ligand ist in der Lage, mit der wasserunlöslichen Matrix oder mit dem Abstandshalter, der mit der Matrix verbunden ist, über eine Aminogruppe oder Carboxylgruppe in dem Liganden zu kombinieren.

Als Aminosäure mit einem aromatischen Ring können nicht nur α-Aminosäuren verwendet, sondern auch andere Aminosäuren, z. B. β-Aminosäuren, γ-Aminosäuren, δ-Aminosäuren etc., wobei α-Aminosäuren im allgemeinen leicht zur Verfügung stehen und deshalb bevorzugt werden. Von den α-Aminosäuren mit einem aromatischen Ring werden insbesondere L-Tryptophan, D-Tryptophan, L-Tyrosin, D-Tyrosin, L-Phenylalanin und D-Phenylalanin bevorzugt. Diese Aminosäuren können als Ligand in Form eines Oligomers, das aus der gleichen Aminosäure oder wenigstens zwei Arten einer Aminosäure aufgebaut ist, verwendet werden. Als Oligomer wird ein Dimer oder Trimer bevorzugt.

Bei diesen Oligomeren von Aminosäuren ist es auch möglich, solche zu verwenden, in welchen die enthaltene freie Carboxylgruppe alkyliert ist, und zwar vorzugsweise methyliert, ethyliert oder propyliert, z. B. ein Derivat des Oligomers der Aminosäuren.

Die als Liganden verwendeten Verbindungen sind kommerziell erhältlich. Die Oligomeren sind kommerziell erhältlich oder man kann sie durch eine Kondensationsreaktion unter Verwendung von Carbodiimid synthetisieren. Als Carbodiimid kann man kommerziell erhältliches N-Ethyl-N′- (3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-hydrochlorid etc. verwenden.

Die als Liganden verwendeten Verbindungen sind nicht auf die vorerwähnten Verbindungen beschränkt und man kann im wesentlichen jede Verbindung verwenden, die ein Oligomer einer Aminosäure mit einem aromatischen Ring oder eines Aminosäurederivats mit einem aromatischen Ring enthält und die gleichzeitig in der Lage ist, durch die Aminogruppe oder die Carboxylgruppe im Molekül direkt mit der wasserunlöslichen Matrix oder indirekt über einen Abstandshalter zu kombinieren.

Das erfindungsgemäß verwendete Adsorptionsmittel ist ein solches, bei dem der Ligand mit der wasserunlöslichen Matrix kombiniert ist und die Mittel zum Kombinieren des Liganden mit der wasserunlöslichen Matrix vorhanden sind, wie oben angegeben, und schließt eine direkte Kombinierungsmethode und eine indirekte Kombinierungsmethode über einen Abstandshalter (spacer) ein.

Bei einem Verfahren zum direkten Kombinieren des Liganden mit der wasserunlöslichen Matrix kann man beispielsweise Agarose als wasserunlösliche Matrix auswählen und die Agarose wird durch Bromcyan aktiviert und der Ligand kann in diese aktivierte Agarose über die in dem Liganden enthaltene Aminogruppe eingeführt werden. Alternativ ist es auch möglich, den Liganden in die Matrix unter Verwendung von Carbodiimid einzuführen, indem man eine Kondensationsreaktion zwischen der Aminogruppe des Liganden und der Carboxylgruppe der Matrix oder der Carboxylgruppe des Liganden und einer Aminogruppe der Matrix durchführt. Als durch Bromcyan aktivierte Agarose kann man beispielsweise bromcyanaktivierte Sepharose 4B verwenden.

Als Verfahren zum Kombinieren des Liganden mit der wasserunlöslichen Matrix über einen Abstandshalter kann man eine Kondensationsreaktion zwischen der Aminogruppe oder Carboxylgruppe in dem Liganden und der aminofunktionellen Gruppe oder carbonylfunktionellen Gruppe in dem Abstandshalter-Molekül verwenden.

Die Länge des Abstandshalter-Moleküls, mittels welchem der Ligand eingeführt wird, ist vorzugsweise derart, daß die Gesamtzahl der Atome in der linearen Kette aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- und/oder Schwefelatomen 2 bis 15 beträgt, wobei eine Kettenlänge von 5 bis 15 Atomen bei dem Abstandshalter besonders bevorzugt wird.

Man kann das Einführen der verschiedenen Abstandshalter in die wasserunlösliche Matrix durch chemische Synthese durchführen, jedoch kann man auch im Handel erhältliche wasserunlösliche Matrizes, die bereits einen Abstandshalter enthalten, verwenden. Beispielsweise kann man folgende Produkte verwenden: N-Hydroxysuccinimidester eines derivatisierten vernetzten Agarosegels, wie Affi-Gel 10

(beide kommerziell erhältlich), aktivierte CH-Sepharose 4B

kommerziell erhältlich; solche mit einer freien Carboxylgruppe oder Aminogruppe am Ende, wie Affi-Gel 202 (ξ-OCH₂CONH(CH₂)₂NHCO(CH₂)₂COOH) Affi-Gel 102 (ξ-OCH₂CONH(CH₂)₂NH₂) (beide kommerziell erhältlich), AH-Sepharose 4B (ξ-NH-(CH₂)₆-COOH) (beide kommerziell erhältlich.

Die Menge des in die wasserunlösliche Matrix oder die wasserunlösliche Matrix, die mit dem Abstandshalter kombiniert ist, einzuführenden Liganden beträgt vorzugsweise 1 bis 10 µmol pro ml der wasserunlöslichen Matrix im Falle einer bromcyanaktivierten wasserunlöslichen Matrix, z. B. bei bromcyanaktivierter Sepharose 4B, wobei 2 bis 4 µmol/ml besonders bevorzugt werden. Wird der Ligand durch eine Kondensationsrekation unter Verwendung von Carbodiimid eingeführt, dann bevorzugt man im allgemeinen 5 bis 20 µmol/ml der wasserunlöslichen Matrix, wobei dies jedoch je nach der Art der wasserunlöslichen Matrix und dem Abstandshalter variieren kann.

Wird der Ligand in einen N-Hydroxysuccinimidester eines derivatisierten, vernetzten Agarosegels eingeführt, dann werden 5 bis 15 µmol/ml der wasserunlöslichen Matrix bevorzugt.

Eine spezielle Methode zum Einführen des Liganden in die wasserunlösliche Matrix, und zwar entweder direkt oder über den Abstandshalter, wird im allgemeinen wie folgt durchgeführt: die direkte Einführung erfolgt, indem man die wasserunlösliche Matrix, die mit Bromcyan aktiviert wurde, und den Liganden in einen Carbonatpuffer oder Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 8 bis 10 bei Raumtemperatur 1 bis 4 Stunden oder bei 4°C über Nacht rührt. Das Einführen des Liganden durch die Kondensationsreaktion unter Verwendung von Carbodiimid wird durchgeführt, indem man über Nacht die Umsetzung in destilliertem Wasser durchführt und wobei man den pH-Wert von 4,5 bis 6 einstellt.

Die Einführung des Liganden über einen Abstandshalter, z. B. wenn der Ligand in einem N-Hydroxysuccinimidesterderivat eingeführt wird, erfolgt, indem man die Matrix und den Liganden bei einem pH-Wert von 5 bis 10 bei Raumtemperatur während 1 bis 4 Stunden oder bei 4°C über Nacht umsetzt. Wie bereits erwähnt, besteht das erfindungsgemäße Verfahren zum Reinigen von Interferon darin, daß man ein Adsorptionsmittel verwendet, bei dem eine wasserunlösliche Matrix aus einer organischen hochmolekulargewichtigen Substanz direkt mit einem Liganden kombiniert ist oder indirekt mit dem Liganden über einen geeigneten Abstandshalter kombiniert ist, wobei man es besonders bevorzugt, ein solches Adsorptionsmittel zu verwenden, bei welchem die wasserunlösliche Matrix und der Ligand über den Abstandshalter verbunden sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Reinigen von Interferon umfaßt das Kontaktieren einer rohen Interferonlösung mit dem wie oben angegeben hergestellten Adsorptionsmittel unter Adsorption des Interferons auf dem Adsorptionsmittel und anschließendes Eluieren des adsorbierten Interferons mit einem Eluiermittel. Die jeweiligen Schritte können beispielsweise wie folgt durchgeführt werden:
Der pH-Wert beim Kontaktieren des Adsorptionsmittels mit der Interferon enthaltenden Lösung (rohe Interferonlösung) beträgt vorzugsweise 4 bis 9; beispielsweise kann man als Lösungsmittel einen 0,01 M Phosphatpuffer bei dem pH-Wert 7 verwenden. Die Ionenstärke der rohen Interferonlösung braucht zu dieser Zeit nicht besonders beschränkt zu sein und wenn beispielsweise die Ionenstärke mit Natriumchlorid eingestellt wird, kann das Interferon auch dann, wenn die Endkonzentration 0,14 M beträgt, auf dem Adsorptionsmittel adsorbiert werden. Wird die Ionenstärke weiter erhöht, z. B. wenn man Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 3 M zugibt, dann kann das Interferon immer noch ausreichend auf dem Adsorptionsmittel adsorbiert werden. Der Kontakt zwischen dem Adsorptionsmittel und der rohen Interferonlösung kann entweder absatzweise erfolgen oder unter Verwendung einer Säule, wobei man die Säulenmethode bevorzugt, weil die Reinigungseffizienz größer ist.

Das Adsorptionsmittel mit dem darauf adsorbierten Interferon wird dann vorzugsweise mit einer ausreichenden Menge eines Puffers, z. B. einen 0,01 M Phosphatpuffer mit dem pH-Wert 7, enthaltend 0,14 M Natriumchlorid, gespült, bevor man das Interferon eluiert, um dadurch nicht-adsorbierte mit vorhandene Proteine etc. zu entfernen.

Anschließend wird die Eluierung des Interferons von dem Adsorptionsmittel, auf dem das Interferon adsorbiert ist, durchgeführt unter Verwendung eines Puffers mit dem pH-Wert 4 bis 8, enthaltend 30 bis 80% (W/V) eines flüssigen mehrwertigen Alkohols, wie Ethylenglykol oder Propylenglykol.

Interferone, die man nach dem erfindungsgemäßen Verfahren reinigen kann, sind hauptsächlich Human-Interferon-β und Human-Interferon-γ. Das zu reinigende Interferon-β ist nicht auf das Human-Interferon-β beschränkt, sondern schließt auch Interferon-β ein, das von anderen Säugern stammt. Beispielsweise kann man Mäuse-Interferon nach dem erfindungsgemäßen Verfahren reinigen. Ebenso ist es möglich, nicht nur solche Interferone, die durch Zellkulturen gebildet wurden, zu reinigen, sondern auch Interferone, die unter Anwendung der Rekombinant-DNA-Technologie gewonnen wurden, z. B. Human-Interferone, die durch Escherichia coli, Hefen oder Säugetierzellen, enthaltend Human-Interferongene, erzeugt wurden.

Da das beim erfindungsgemäßen Reinigungsverfahren verwendete Adsorptionsmittel Interferon adsorbieren kann, welches keine Zucker enthält und durch E. coli produziert wurde, nimmt man an, daß die Stellen in dem Interferon-Molekül, welche sich mit dem Adsorptionsmittelträger verbinden, keine Zuckerreste, sondern die Peptidreste sind. Man kann infolgedessen annehmen, daß das erfindungsgemäß verwendete Adsorptionsmittel nicht nur für natürliche Interferone geeignet ist, sondern auch für Interferone, in denen die Aminosäuresequenz etwas modifiziert ist, oder für Interferone, in welchen der Zuckerrest verändert wurde.

Man kann somit das erfindungsgemäß verwendete Adsorptionsmittel nicht nur für die Reinigung von rohen Interferonlösungen verwenden, sondern auch, um ein nach anderen Methoden teilgereinigtes Interferon weiter zu reinigen. Schließlich ist es auch möglich, daß man durch eine Kombination von den verschiedenen erfindungsgemäß verwendeten Adsorptionsmitteln vollständig mitvorhandene Proteine, ausgenommen Interferone, entfernt.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Versuchsbeispielen und Beispielen näher beschrieben. Die in den Versuchsbeispielen und Beispielen angegebenen Aktivitäten wurden durch die CPE (Cytophatischer Effekt)-Methode unter Verwendung von FK-Zellen und Sindvis-Virus gemessen. Die Aktivität von Human-Interferon-j wird ausgedrückt, basierend auf dem internationalen Standardprodukt von Human-Interferon-α (GO23-901-527) und die Aktivität von Human-Interferon-β wird ausgedrückt, basierend auf dem internationalen Standardprodukt von Human-Interferon-β (GO23-902-527).

Versuchsbeispiel 1

40 ml Affi-Gel 15 wurden mit 4 l kaltem destillierten Wasser gewaschen und dann weiter mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6) gewaschen und in dem gleichen Puffer bis zu einem Volumen von 40 ml suspendiert. Diese Suspension wurde in 10 ml-Anteile aufgeteilt und 10 ml von wäßrigen Lösungen von D-Phenylalanyl-D-phenylalanin, eingestellt auf 1 mM, 5 mM, 20 mM bzw. 40 mM, wurden zu den jeweiligen Anteilen zugegeben und 18 Stunden bei 4°C gerührt, wobei man Adsorptionsmittel erhielt, die mit unterschiedlichen Mengen von D-Phenylalanyl-D-phenylalanin als Liganden kombiniert waren. Die Menge des an den Träger gebundenen Liganden wurde berechnet, indem man den nicht-absorbierten Liganden von der Gesamtmenge des für die Kombinationsreaktion verwendeten Liganden subtrahierte und wobei man die Werte erhielt, indem man die Absorption der Lösung nach der Ligandenkombinationsreaktion und die Waschwässer maß. Die jeweils in der vorher erwähnten Weise hergestellten Adsorptionsmittel wurden mit einem 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7), enthaltend 0,14 M Natriumchlorid, gewaschen und jeweils in Säulen mit einem Durchmesser von 1,5 cm gepackt. Anschließend wurden 500 ml einer rohen Interferon-β-Lösung, hergestellt von normalen humanen Fibroblast-MRC-5-Zellen nach der Methode von Vilcek et al (Antimicrob. Ag. Chemother., Bd. 2, S. 476, 1972) (spezifische Aktivität 6,3 × 10⁴ Einheiten/mg, Gesamt-Interferonaktivität 7,2 × 10⁶ Einheiten) durch den jeweiligen Säulen laufen gelassen. Anschließend wurden die Säulen in denen das Interferon adsorbiert war, mit dem vorgenannten Puffer mit einem pH-Wert von 7 gespült und dann wurde der vorher erwähnte 0,01 M Phosphatpuffer, enthaltend 50% (W/V) Ethylenglykol, zum Eluieren des adsorbierten Interferons durch die Säulen laufen gelassen.

Die Ergebnisse der Reinigung, unter Verwendung der jeweiligen Adsorptionsmittel mit unterschiedlichen Mengen an Liganden, werden in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Versuchsbeispiel 2 kein Beispiel der Erfindung

Um den Einfluß der Länge des Abstandshalters in dem Adsorptionsmittel auf den Grad der Reinigung und die Wiedergewinnung von Interferon zu untersuchen, wurden Adsorptionsmittel mit unterschiedlich langen Abstandshaltern hergestellt.

Ein Adsorptionsmittel, welches keinen Abstandshalter enthielt, wurde wie folgt hergestellt: Im Handel erhältliche, bromcyanaktivierte Sepharose 4B wurde mit einer 1 mM Salzsäurelösung angequollen und mit der gleichen Lösung gewaschen. Der Ligand (L-Tryptophyl-L-tryptophanmethylester), gelöst in einem Kupplungspuffer aus 0,1 M Carbonatpuffer (pH 8,3), enthaltend 0,5 M Natriumchlorid, wurde in einer solchen Menge zugegeben, daß 10 µmol/ml der Matrix vorlagen. Nach dem Rühren über Nacht bei 4°C wurden die nicht-umgesetzten Teile mit Glycin blockiert und das so erhaltene Adsorptionsmittel war für die weitere Verwendung in dem Versuch fertig.

Ein Adsorptionsmittel mit einem Abstandshalter von 6 Kohlenstoffatomen Länge wurde hergestellt, indem man den Liganden an im Handel erhältliche CH-Sepharose 4B durch eine Kondensationsreaktion unter Verwendung von Carbodiimid kombinierte. Hierzu wurde ein trockenes Pulver von CH-Sepharose 4B in 0,5 M Natriumchloridlösung angequollen und dann weiter mit der gleichen Lösung gewaschen. Der Ligand wurde in destilliertem Wasser gelöst und dann wurde der pH-Wert auf 4,5 eingestellt, unter Erhalt einer 20 mM-Lösung des Liganden. 20 ml dieser Ligand-Lösung wurden mit 20 ml der zuvor erwähnten, gewaschenen CH-Sepharose 4B vermischt und weiterhin wurden 5 ml einer wäßrigen 0,2 M Carbodiimidlösung, eingestellt auf pH 4,5, unmittelbar darauf zugegeben und unter Rühren bei Raumtemperatur über Nacht vermischt.

Die Adsorptionsmittel mit Abstandshaltern von 10 bzw. 15 Atomen Länge wurden hergestellt, indem man den Liganden in Affi-Gel 10 bzw. Affi-Gel 15 enthaltend ein N-Hydroxysuccinimidderivat, (beide kommerziell erhältlich) einführte. 30 ml des jeweiligen Harzes wurden mit kaltem destillierten Wasser gewaschen und dann mit einem kalten Kupplungspuffer aus 0,05 M Phosphatpuffer mit dem pH-Wert 7 für Affi-Gel 10 oder einen 0,05 M Phosphatpuffer mit dem pH-Wert 6 für Affi-Gel 15, gewaschen. 20 ml der jeweiligen Matrix nach dem Waschen wurden mit 20 ml einer 20 mM-Ligandenlösung, die getrennt unter Verwendung des kalten Kupplungspuffers hergestellt worden waren, vermischt und bei 4°C über Nacht gerührt.

10 ml des jeweils so hergestellten Adsorptionsmittels wurden in eine Säule mit einem Durchmesser von 1,5 cm gepackt und mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,5), enthaltend 0,14 M Natriumchlorid, ins Gleichgewicht gebracht. Nach der Methode von Zoon et al (J. Clin. Microbiol., Bd. 7, S. 44, 1979) wurden 500 ml einer rohen Human-Interferon-α-Lösung, hergestellt mit Namalwa-Zellen (spezifische Aktivität 8,3 × 10⁴ Einheiten/mg, Gesamt-Interferonaktivität 2,4 × 10⁶ Einheiten) durch die jeweiligen Säulen laufen gelassen. Die Säulen wurden dann mit dem vorerwähnten Puffer bei pH 7,5 gespült und das adsorbierte Interferon wurde mit dem vorerwähnten Puffer von pH 7,5, enthaltend 60% (W/V) Propylenglykol, eluiert.

Die Reinigungswirkung von Interferon-α, die mit den jeweiligen Adsorptionsmitteln erzielt wurde, wird in Tabelle 2 gezeigt.

Versuchsbeispiel 3

Affi-Gel 10 wurden mit kaltem destillierten Wasser und einem gekühlten 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7) gewaschen und dann in 10 ml-Anteile aufgeteilt. Jeder Anteil wurde mit verschiedenen L-Aminosäuren, Oligomeren von L-Aminosäuren bzw. deren Methylestern umgesetzt, unter Erhalt von Adsorptionsmitteln mit unterschiedlichen Liganden, wobei die Umsetzung in gleicher Weise erfolgte wie im Versuchsbeispiel 2. Die Menge des jeweils bei der Umsetzung verwendeten Liganden betrug 20 µmol/ml Matrix. 10 ml des so hergestellten Adsorptionsmittels wurden jeweils in Säulen von 1,5 cm Durchmesser gepackt, mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7), enthaltend 1 M Natriumchlorid, ins Gleichgewicht gebracht und 500 ml einer rohen Human-Interferon-β-Lösung, hergestellt aus MRC-5-Zellen und eingestellt auf eine End-Natriumchlorid- Konzentration von 1 M (spezifische Aktivität 8,5 × 10⁴ Einheiten/mg, Gesamt-Interferonaktivität 9,6 × 10⁶ Einheiten) wurden durchlaufen gelassen. Die Säule wurde mit dem vorerwähnten Puffer, enthaltend Natriumchlorid, gespült und dann weiter mit dem gleichen Puffer, enthaltend 3% (W/V) Propylenglykol, gespült und anschließend wurde das adsorbierte Interferon mit einem 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7), enthaltend 1 M Natriumchlorid, und dem 80% (W/V) Propylenglykol zugegeben worden waren, eluiert. Die Wirkung der Reinigung des Interferon-β mit den jeweiligen Adsorptionsmitteln wird in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Versuchsbeispiel 4

D-Tyrosyl-L-tryptophan wurde als Ligand in Affi-Gel 10, in gleicher Weise wie in Versuchsbeispiel 2 beschrieben, unter Erhalt von 10 ml eines Adsorptionsmittels eingeführt. Dieses Adsorptionsmittel wurde in eine Säule mit 1,5 cm Durchmesser gepackt, mit einem 0,02 M Phosphatpuffer (pH 7), enthaltend 0,14 M Natriumchlorid, ins Gleichgewicht gebracht und dann wurden 100 ml einer Human-Interferon-γ-Lösung, die unter Verwendung von humanen peripheren Lymphozyten nach der Methode von Langford (Infect. Immun., Bd. 26, S. 36, 1979) erhalten worden waren (spezifische Aktivität 1,3 × 10⁴ Einheiten/mg, Gesamt-Interferonaktivität 3,1 × 10⁵ Einheiten) durch die Säule laufen gelassen. Die Säule wurde mit dem vorerwähnten Puffer gespült, und dann wurde das adsorbierte Interferon mit dem vorgenannten Puffer, enthaltend 50% Ethylenglykol, eluiert. Die Wiedergewinnung an eluiertem Interferon betrug 66% und die spezifische Aktivität betrug 2,7 × 10⁶ Einheiten/mg.

Versuchsbeispiel 5

CH-Sepharose 4B (kommerziell erhältlich) wurde in einer 0,5 M Natriumchloridlösung angequollen und mit der gleichen Lösung gewaschen. Anschließend wurde durch eine Kondensationsreaktion unter Verwendung von Carbodiimid in gleicher Weise wie in Versuchsbeispiel 2 D-Tyrosin, D-Tyrosinmethylester, D-Tyrosinethylester bzw. D-Tyrosinpropylester in die Matrix als Ligand eingeführt. Die Menge des bei der Kondensationsreaktion eingeführten Liganden betrug 20 µmol/ml der Matrix.

10 ml des jeweils mit dem Liganden versehenen Adsorptionsmittels wurden in eine Säule von 1,5 cm Durchmesser gepackt, mit einem 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7), enthaltend 0,14 M Natriumchlorid, ins Gleichgewicht gebracht und dann wurden 500 ml einer rohen Mäuse-Interferon-Lösung, hergestellt unter Verwendung von L929-Zellen nach der Methode von Kronenberg (Virology, Bd. 76, S. 634, 1977) (spezifische Aktivität 2,2 × 10⁴ Einheiten/mg, Gesamt-Interferonaktivität 1,3 × 10⁶ Einheiten) durch die jeweiligen Säulen laufen gelassen. Anschließend wurde jede der Säulen mit dem vorgenannten Puffer gespült und dann wurde das adsorbierte Interferon mit dem vorgenannten Puffer, enthaltend 50% (W/V) Ethylenglykol, eluiert. Die Reinigungswirkung bei dem Mäuse-Interferon mittels der speziellen Adsorptionsmittel wird in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

Beispiel 1

50 ml Affi-Gel wurden mit kaltem destilliertem Wasser und einer gekühlten 0,05 M Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7) gewaschen und dann mit 50 ml einer D-Tryptophyl-D-tryptophan-Lösung eingestellt auf 20 mM, mit dem vorgenannten Puffer vermischt und bei einem pH-Wert von 7 bei 4°C über Nacht gerührt. Das auf diese Weise gebildete Adsorptionsmittel wurde in eine Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm gepackt und dann mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 8), enthaltend 1 M Natriumchlorid, ins Gleichgewicht gebracht. Zu 2 l einer rohen Human-Interferon-β-Lösung, hergestellt unter Verwendung von E. coli nach der Methode von Taniguchi et al (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Bd. 77, S. 5320, 1980) (spezifische Aktivität 4,8 × 10⁴ Einheiten/mg, Gesamt-Interferonaktivität 3,3 × 10⁷ Einheiten) wurde Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 1 M gegeben und diese Lösung wurde durch die Säule laufen gelassen. Die Säule wurde kontinuierlich mit dem vorgenannten Puffer mit einem pH-Wert von 8 und dem vorgenannten Puffer mit einem pH-Wert von 8, enthaltend 10% (W/V) Propylenglykol, gespült und das adsorbierte Interferon wurde mit einem 0,01 M Phosphatpuffer, enthaltend 60% (W/V) Propylenglykol und 1 M Natriumchlorid, eluiert. Die Rückgewinnung von eluiertem Interferon betrug 70% und die spezifische Aktivität betrug 5,1 × 10⁷ Einheiten/mg.

Beispiel 2

50 ml Affi-Gel 10 wurden mit kaltem destillierten Wasser und einem gekühlten 0,05 M Phosphatpuffer (pH 7) gewaschen und dann mit 50 ml einer L-Phenylalanyl-L-phenylalaninmethylester-Lösung, eingestellt auf 20 mM mit dem vorgenannten Puffer, vermischt und bei 4°C und einem pH-Wert von 7 über Nacht gerührt. Das so erhaltene Adsorptionsmittel wurde in eine Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm Durchmesser gepackt und mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7), enthaltend 1 M Natriumchlorid, ins Gleichgewicht gebracht. Zu 2,5 l einer rohen Human-Interferon-β-Lösung, hergestellt aus MRC-5-Zellen (spezifische Aktivität 8,0 × 10⁴ Einheiten/mg, Gesamt-Interferonaktivität 4,2 × 10⁷ Einheiten) wurde Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 1 M gegeben und diese Lösung wurde durch die Säule laufen gelassen. Das Adsorptionsmittel wurde mit dem vorerwähnten, Natriumchlorid enthaltenden Puffer, und dann mit der gleichen Lösung, enthaltend weiterhin 3% (W/V) Propylenglykol, gespült und das adsorbierte Interferon wurde mit einem 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7), enthaltend 80% (W/V) Propylenglykol und 1 M Natriumchlorid, eluiert. Die Rückgewinnung des eluierten Interferons betrug 89% und die spezifische Aktivität 2,3 × 10⁸ Einheiten/mg.

Claims

1. Verfahren zur Reinigung von Interferon-β, gekennzeichnet durch:

(i) Kontaktieren einer rohen Interferon-β-Lösung mit einem Adsorptionsmittel, das eine organische, hochmolekulargewichtige, wasserunlösliche Matrix umfaßt, die direkt oder durch einen Abstandshalter mit einem Liganden kombiniert ist, wobei der Ligand aus der Gruppe bestehend aus Oligomeren von Aminosäuren, enthaltend einen aromatischen Ring, und Aminosäure-Derivaten, enthaltend einen aromatischen Ring, ausgewählt ist;
(ii) Adsorbieren von Interferon-β auf dem Adsorptionsmittel;
[iii) Eluieren von Interferon-β vom Adsorptionsmittel.

2. Reinigungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Oligomer ein Dimer oder ein Trimer darstellt.

3. Reinigungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Aminosäure-Derivat, enthaltend einen aromatischen Ring, eine Aminosäure darstellt, die eine alkylierte Carboxylgruppe enthält.

4. Reinigungsverfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Carboxylgruppe mit einer Methyl-, Ethyl- oder Propylgruppe alkyliert ist.

5. Reinigungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminosäure enthaltend einen aromatischen Ring, eine Aminosäure aus der Gruppe, bestehend aus L-Tryptophan, D-Tryptophan, L-Tyrosin, D-Tyrosin, L-Phenylalanin und D-Phenylalanin, darstellt.

6. Reinigungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Aminosäure-Derivat, enthaltend einen aromatischen Ring, ein Derivat einer Aminosäure aus der Gruppe, bestehend aus L-Tryptophan, D-Tryptophan, L-Tyrosin, D-Tyrosin, L-Phenylalanin und D-Phenylalanin darstellt.

7. Reinigungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Matrix mit Abstandhalter Affi-Gel 10 eingesetzt wird, und daß der Ligand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus L-Tryptophyl-L-tryptophan, L-Phenylalanyl-L-phenylalanin, L-Tyrosyl-L-tyrosin, L-Tryptophyl-L-phenylalanin, L-Tyrosyl-L-tryptophan, D-tyrosyl-D-tryptophan, D-Tyrosyl-L-tryptophan, L-Tryptophyl-L-tryptophan-methylester, L-Phenylalanyl-L-phenylalanin-methylester, n-Tyrosyl-L-phenylalanin-methylester, L-Tryptophyl-L-tryptophyl-L-tryptophan, L-Phenylalanyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanin-methylester und L-Tryptophyl-L-tyrosyl-L-phenylalanin zur Reinigung einer rohen Human-Interferon-β-Lösung.

8. Reinigungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Matrix mit Abstandhalter Affi-Gel 15 eingesetzt wird, und der Ligand D-Phenylalanyl-D-phenylalanin darstellt, umfaßt.

9. Reinigungsverfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die wasserunlösliche Matrix Agarose umfaßt.

10. Reinigungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstandhalter eine lineare Kette von 2 bis 15 Atomen aus der Gruppe, bestehend aus Kohlenstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff- und Schwefelatomen umfaßt.

11. Reinigungsverfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstandhalter eine lineare Kette von 5 bis 15 Atomen umfaßt.

12. Reinigungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Interferon Human-Interferon darstellt.

13. Reinigungsverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Interferon ein modifiziertes Interferon darstellt.

14. Verfahren zum Reinigen von Human-Interferon-gamma, gekennzeichnet durch Kontaktieren einer rohen Human-Interferon-gamma-Lösung mit einem Adsorptionsmittel zur Adsorption von Human-Interferon-gamma an dasselbe und anschließendes Eluieren von Human-Interferon-gamma mit einem Elutionsmittel, wobei das genannte Adsorptionsmittel D-Tyrosyl-L-tryptophan-Affi-Gel 10 darstellt.