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Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vakzine und ein
Serum zur Immunisierung gegen und zur Behandlung von
Erkrankungen mit gramnegativen Bakterien. Insbesondere betrifft
die Erfindung eine Bakterienmutante von Salmonella
enteritidis und ihre Verwendung in einem Kombinationsimpfstoff
zur Immunisierung von Säugetieren und Vögeln gegen
Krankheiten, die durch Endotoxin produzierende gramnegative
Bakterien der taxonomischen Familie der Enterobacteriaceae
verursacht werden. Die Erfindung betrifft auch einen
Immunmodulator mit entgiftetem Endotoxin, der bei der Behandlung
von Tieren und Menschen in Kombination mit anderen
Antigenen von Nutzen ist, und zwei Verfahren zur Herstellung und
Verwendung dieses Modulators.
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Auf dem Gebiet der Tierhaltung werfen endotoxinbedingte
Krankheiten ernste Probleme bezüglich der Gesundheit der
Tiere auf und sind folglich in beachtlichem Ausmaß von
wirtschaftlicher Bedeutung.
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Bei Pferden sind endotoxinbedingte Krankheiten
beispielsweise Lahmheit (d. h. Laminitis), Kolik (d. h.
Bauchbeschwerden in Verbindung mit Überfütterung und anderen belastenden
Phänomenen wie Darmverschluß, Darmischämie,
Enteritis/Diarrhoe aufgrund gramnegativer Bakterien, mangelhafte
Absorption durch den Darm, Transportstörungen, Kreißen,
etc.), septische Arthritis und gramnegative intrauterine
Infektionen. Endotoxinbedingte Krankheiten bei Rindern
umfassen Laminitis sowohl bei Milchkühen als auch bei
Mastvieh, das Syndrom des plötzlichen Todes bei Mastvieh,
Mastitis bei Milchkühen, sowie Dysenterie, Rinderruhr oder
Kolibazilleninfektion und Salmonellen-Diarrhoe bei
Jungkälbern.
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Endotoxinbedingte Krankheiten bei Schweinen umfassen
Kreißen, Dysagalactia (d. h. Versagen der Milchdrüsen aufgrund
einer gramnegativen Endometritis), Darmödem und
Salmonellen-Diarrhoe bei Jungschweinen. Salmonellen-Diarrhoe,
hämorrhagische Septikämie, Infektion der Alveolarsäckchen und
Nebenhöhlen. Geflügel-Cholera und andere Pasteurellosen
sind Beispiele für endotoxinbedingte Krankheiten von
Vögeln.
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Die Behandlung endotoxinbedingter bzw. verursachter
Krankheiten erfolgte bisher rückwirkend (d. h. nach Entstehung
der klinischen Erkrankung) und war auf chemotherapeutische
Maßnahmen beschränkt. Vorbeugende Maßnahmen wurden mit
einer solchen Behandlung nicht erreicht. Ein vorheriger
begrenzter, definitiver Impfschutz gegen gramnegative
Septikämie und/oder Endotoxämie wurde nur erreicht mit Hilfe von
(a) individualisierten Vakzinen aus autogenen
Bakterienisolaten, die verschiedene antigene Epitope darstellen
(K-Antigene oder Kohlenhydratseitenketten bzw. O-Antigene) oder
(b) Lebendimpfstoffen aus abgeschwächten oder
deletionsmodifizierten, lebenden Bakterienisolaten.
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Der Hauptnachteil der derzeitigen Verfahren zur Behandlung
von endotoxinbedingten bzw. -verursachten Krankheiten liegt
darin, daß mit solchen Behandlungen erst nach Ausbruch der
klinischen Erkrankung begonnen wird, was häufig dann ist,
wenn die Krankheit bereits ein irreversibles Stadium
erreicht hat. Der frühere Impfschutz gegen gramnegative
Septikämie und/oder Endotoxämie, der für einzelne, aus
autogenen Bakterienisolaten bestehende Vakzine genannt wurde, ist
hinsichtlich des zeitaufwands, der Kosten und der
Herstellung nicht effizient, weil solche Vakzine rückwirkend, d. h.
nach Entstehung der Krankheit hergestellt werden.
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Die Hauptnachteile der polyvalenten Vakzine, die aus
multiplen Bakterienisolaten bestehen, die verschiedene antigene
Epitope (K-Antigene oder Kohlenhydratseitenketten bzw. O-
Antigene) darstellen, liegen darin, daß die
Bakterienisolate, die zu einem bestimmten Zeitpunkt die Krankheit
verursachen, epidemiologischen Verschiebungen und/oder
Verlagerungen der antigenen Epitope unterliegen, was zu einer
Änderung der antigenen Spezifität und somit zu einem
Verlust der Schutzwirkung führt. Die K-Antigene oder
Kohlenhydratseitenketten bzw. O-Antigene sind auch wirksame
Stimulatoren des immunglobulins IgE, das verantwortlich ist für
unerwünschte anaphylaktoide Reaktionen bei vielen
Tierarten, besonders bei Pferden.
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Die Hauptnachteile von Lebendimpfstoffen, die aus
abgeschwächten oder deletionsmodifizierten Bakterienisolaten
bestehen, bestehen darin, daß sie das Potential haben, zum
Elternstamm vom Wildtyp zurückzukehren und somit für
geimpfte Tiere wieder pathogen zu werden.
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Demzufolge besteht seit langem das Bedürfnis nach einer
Vakzine und einem Serum zur Immunisierung gegen und
Behandlung von Krankhaften, die durch gramnegative Bakterien
verursacht werden, und zur Beseitigung der im Stand der
Technik noch bestehenden Mängel. Ein wichtiger Aspekt der
Erfindung besteht darin, diesem Bedürfnis nachzukommen.
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Die Erfindung gibt eine Vakzine an, umfassend einen
Impfstoff zur Immunisierung gegen gramnegative bakterielle
Erkrankungen, umfassend: eine abgetötete Suspension einer
Bakterienmutante der taxonomischen Familie der
Enterobacteriaceae, die keine Kohlenhydratseitenketten (O-Antigen)
besitzt, einen Proteine oder Lipide bindenden Träger mit
einer hohen lipophilen und einer hohen proteinophilen
Affinität zur Sicherstellung einer gleichmäßigen Suspension der
Bestandteile und einer anhaltenden Antigenfreisetzung,
sowie einen Immunmodulator mit Neigung zur Verbreitung von B-
Lymphozyten und vorzugsweise mit einem hohen Anteil an
neutralisierenden und opsonisierenden Antikörpern hoher
Antigenaffinität und -avidität.
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In einem weiteren Aspekt gibt die Erfindung ein Verfahren
an zur Herstellung einer Vakzine zur Immunisierung gegen
Erkrankungen durch gramnegative Bakterien, umfassend die
folgenden Schritte: (1) Kombinieren einer abgetöteten
Suspension einer Bakterienmutante der taxonomischen Familie
der Enterobacteriaceae, die keine Kohlenhydratseitenketten
(O-Antigene) besitzt, mit einem Immunmodulator mit Neigung
zur Verbreitung von B-Lymphozyten und einem hohen Anteil an
neutralisierenden und opsonisierenden Antikörpern hoher
Antigenaffinität und -avidität; und (2) Suspendieren der
Kombination aus Bakterienmutante und Immunmodulator in einem
Proteine und Lipide bindenden Träger mit einer hohen
lipophilen und proteinophilen Affinität zur Sicherstellung
einer gleichmäßigen Suspension der Bestandteile und einer
anhaltenden Antigenfreisetzung.
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Andere Aspekte der Erfindung umfassen die Herstellung eines
Hyperimmunserums, daß aus dem Kombinationsimpfstoff
gewonnen wird, und ein erfahren zur Behandlung von Tieren, die
an einer Erkrankung durch gramnegative Bakterien erkrankt
sind. Die Erfindung sieht auch die Kombination von Mutante
und Träger allein vor.
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Wie bereits angegeben, umfaßt die vorliegende Erfindung
mehrere verschiedene Konzepte, nämlich (1) eine Vakzine
bestehend aus einer Bakterienmutante und einem Proteine und
Lipide bindenden Träger mit einer hohen lipophilen und
proteinophilen Affinität, die eine gleichmäßige Suspension der
Bestandteile bei anhaltender Antikörperfreisetzung
sicherstellt, und vorzugsweise auch einen Immunmodulator umfaßt,
der ein entgiftetes Endotoxin ist; (2) eine
Bakterienmutante, die ein breites Schutzpotential besitzt,
insbesondere eine Bakterienmutante aus der Familie der
Enterobacteriaceae, die keine Kohlenhydratseitenketten (O-
Antigen) besitzt; (3) den obengenannten Immunmodulator mit
einer speziellen Neigung zur Verbreitung von B-Lymphozyten,
und folglich das frühere Auftreten größerer Mengen von
neutralisierenden und opsonisierenden Antikörpern mit hoher
Antigenaffinität und -avidität, sowie das Verfahren zur
Herstellung des Immunmodulators; (4) ein Hyperimmunserum
zur Behandlung von Erkrankungen durch gramnegative
Bakterien sowie ein Verfahren zur Verwendung des Serums.
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Zur Immunisierung wird die Vakzine intramuskulär oder
subkutan in Konzentrationen verabreicht, die mindestens 1 ·
10&sup7; Bakterien und 100 Mikrogramm Immunmodulator enthalten.
Zur Behandlung eines Tieres mit einer durch gramnegative
Bakterien verursachten Krankheit wird das Serum aus einem
geimpften Spender hergestellt und so verabreicht, daß eine
schützende Menge an Antikörpern vorhanden ist.
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Der Vorteil des Kombinationsimpfstoffes besteht darin, daß
er prophylaktischer Natur ist, im Gegensatz zu den
derzeitigen Behandlungsarten, die rückwirkend oder erst nach
Ausbruch der Krankheit begonnen werden. Ein weiterer Vorteil
des Kombinationsimpfstoffes besteht darin, daß immunisierte
Tiere früher und in höherem Maße gegen viele der
endotoxinbedingten Krankheiten geschützt sind, ohne daß sie den den
bestehenden Impfstoffen innewohnenden Risiken ausgesetzt
sind, wie zum Beispiel (a) der Auslösung einer
möglicherweise tödlichen Anaphylaxie; (b) der Entstehung
möglicherweise tödlicher Infektionen durch Umwandlung lebender,
nicht-pathogener Bakterien in pathogene Formen; oder (c)
dem Verlust der Fähigkeit, den Schutz herbeizuführen, weil
sich die Krankheit verursachende Bakterienstämme verändert
haben. Die entgiftete Endotoxinkomponente des
Kombinationsimpfstoffes bewirkt als starker Immunmodulator mit Neigung
zur Verbreitung von B-Lymphozyten nicht nur eine raschere
Ausbreitung dieser Antikörper-Stammzellen, sondern auch ihr
früheres Auftreten im aktivierten funktionellen Zustand,
was daher viel früher nach der Impfung als bei
herkömmlichen Bakterin-Impfstoffen zur Produktion schützender Mengen
von Antikörpern im Kreislauf des Wirts führt. Die Bakterin-
Komponente des Kombinationsimpfstoffes, die aus einer
Mutante besteht, die ein Antigen mit nacktem Kern (2-Keto-3-
desoxyoctonsäure-Lipid A) besitzt und keine der
Kohlenhydratseitenketten (O-Antigene) bzw. K-Antigene besitzt, die
in herkömmlichen Bakterin-Impfstoffen vorhanden sind,
verhindert die Entstehung von O-Antigen-spezifischem
Immunglobulin E (IgE, Reagin) und damit die Auslösung einer
IgE-bedingten Anaphylaxie nach der Impfung. Da das Antigen mit
nacktem Kern im Gegensatz zu den Kohlenhydratseitenketten
(O-Antigen bzw. K-Antigen-Serotypen) vielen gramnegativen
Bakterien gemeinsam ist, erzeugt es Antikörper mit breitem
Kreuzschutz, während es darüberhinaus den Verlust der
Schutzwirkung aufgrund von epidemiologischen Verschiebungen
und Verlagerungen bei den Kohlenhydratseitenketten
(O-Antigene, K-Antigene, Serotypen) im Lauf der Zeit verhindert.
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Vor der Entwicklung des Kombinationsimpfstoffes und des
durch den Kombinationsimpfstoff hervorgebrachten
Hyperimmunserums beinhaltete die medizinische Versorung in erster
Linie die Chemotherapie erst nach Beginn der
endotoxinbedingten Erkrankung. Der Vorteil des Hyperimmunserums
besteht darin, daß es bei dem nichtgeimpften Tier mit einer
klinisch sichtbaren Erkrankung den Krankheitsverlauf
bessern kann, wodurch eine Verkrüppelung und/oder der Tod des
Pferdes oder einer anderen Tierart verhindert wird.
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Das Konzept des breitangelegten Schutzes mit Hilfe eines
Kombinationsimpfstoffes per se und/oder eines durch den
Kombinationsimpfstoff hervorgebrachten Immunserums gegen
Bakteriämien und/oder Endotoxämien, die durch eine Vielzahl
gramnegativer Bakterien verursacht werden und/oder damit
zusammenhängen, stellt für die Tiermedizin auch in
wirtschaftlicher Hinsicht einen Durchbruch dar, indem in
der angewandten Immunologie neue Molekülbegriffe verwendet
werden. Krankheiten, für die durch den
Kombinationsimpfstoff ein Schutz erreicht wird, umfassen jene in Verbindung
mit der durch Endotoxin hervorgerufenen intravaskulären
Koagulation, und insbesondere die durch die gramnegativen
Bakterien Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium,
Salmonella typhosa, Salmonella minnesota, Salmonella
abortus-equi und Escherichia coli verursachten Krankheiten.
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Insbesondere werden die einzelnen Komponenten der
vorliegenden Erfindung wie folgt beschrieben:
MUTANTE
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Die Mutante ist in der Amerikanischen Kultursammlung (=
American Type Culture Collection) als ATCC Nr. 53000
hinterlegt.
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Das zur Herstellung des genetisch modifizierten
Mutantenstammes R-17 verwendete Elternisolat wurde aus einer
aktiven Diarrhoe-Infektion eines Pferdes am Tiermedizinischen
Institut der Universität von Missouri isoliert. Das
ursprüngliche klinische Isolat wurde auf MacConkeys-Agar
isoliert und zeigte bei einer 24-stündigen Inkubation bei 37ºC
eine lactosenegative, glatte, schleimig glänzende Kolonie
von 3,5-4 mm Durchmesser. Eine biochemische Analyse mit
einem API-System (API Laboratory Products, 200 Express St.,
Plainview, New York 11803) in Verbindung mit dem
Profilerkennungssystem (Profile Recognition System) von API und die
Charakterisierung auf herkömmlichen Labornährböden ergab,
daß das ursprüngliche klinische Isolat Salmonella
enteritidis (Serotyp B - typhimurium) war. Dieser Organismus wird
von Ewing und Martin beschrieben. (Ewing, W.H. und W.J.
Martin: Enterobacteriaceae. In: Manual of Clinical
Microbiology, 2. Auflage, Washington, American Society for
Microbiology, 1974).
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Eine spezielle Ausführungsform des Organismus der
vorliegenden Erfindung betrifft einen durch ionisierende
Strahlung hergestellten Deletionsmutantenstamm des Elternisolats
von Salmonella enteritidis (Serotyp B - typhimurium).
Ionisierende Strahlung bewirkt durch energiereiche Penetranz
die Bildung von freien Radikalen, was die
Zytoplasmamoleküle labil macht und zu einzelsträngigen Aufspaltungen in
den Desoxyribonukleinsäuremolekülen führt, was somit eine
hohe Frequenz von Deletionsmutationen bewirkt. Überlebende
Mutanten zeigen im Phänotyp häufig verschiedene Grade der
Unfähigkeit, ein intaktes Lipopolysaccharid zu
synthetisieren. Solche Mutanten sind leicht zu erkennen, da sie
flache, rauhe (R) Kolonien mit kleinem Durchmesser zeigen, im
Gegensatz zu den großen, punktförmigen oder konvexen,
glatten (G) Kolonien, die von dem Elternbakterium gebildet
werden.
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Röntgenmutagenese wurde auf herkömmlichen Gießplatten
erreicht, die mit lebensfähigen Elternbakterien geimpft
waren. Die Platten wurden in Abständen von 5 Sekunden bis zu
höchstens 35 Sekunden mit einer Röntgenröhre mit
Berylliumfenster vom Typ Machelett OEG 60 bestrahlt, die mit maximal
50 kV und 25 mA betrieben wurde, so daß sich eine Dosisrate
von 250 rad/sec ergab. Die bestrahlten Platten wurden 2-4
Stunden auf 4ºC gehalten und dann bei 37ºC im Dunkeln
inkubiert, um eine photoreaktivierung auszuschließen. Nach 24
Stunden wurden die inkubierten Platten auf eine Änderung
der Morphologie der Kolonien hin untersucht. Kolonien mit
einem Durchmesser von 2 mm oder weniger, die eine rauhe (R)
Morphologie zeigten, wurden ausgewählt, mindestens 10 mal
auffeste Nährböden aufgebracht, und mindestens 3 mal durch
intraperitoneale Inokulation von Labormäusen untersucht, um
einen konstant rauhen (R) Phänotyp sicherzustellen. Der
Mutantenstamm R-17 wurde im Vergleich zu dem Stammisolat
durch eine herkömmliche Untersuchung der Wirksamkeit bei
Mäusen mit Hilfe einer in den Magen verabreichten
Inokulation auf seine Avirulenz untersucht. Gereinigtes
Lipopolysaccharid aus dem Mutantenstamm R-17 und das Elternisolat
wurden chemisch analysiert durch Elektrophorese in einem
Gel aus 2% Natriumdodecylsulfat und 10% Polyacrylamid
(Palva, E.T. & P. Helena Makela, 1980, Lipopolysaccharide
Heterogeneity in Salmonella typhimurium, Analyzed by Sodium
Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis,
European Journal of Biochemistry 107 : 137-143) und biologisch
analysiert durch den farberzeugenden Limulus-Lysat-Test
(Webster, C.J. 1980, Principles of a Quantitative Assay for
Bacterial Endotoxins in Blood That Uses Limulus Lysate and
a Chromatogenic Substrate, Journal of Clinical Microbiology
(12(5):644-650), und durch Seroagglutination (Lindberg, A.
A. & L. Le Minor. 1984, Serology of Salmonella. Bd. 15, S.
1-141; in Methods in Microbiology, T. Bergan, Hrsg.,
Academic Press, New York, 1984), und es konnte kein O-Antigen
nachgewiesen werden. Der Mutantenstamm R-17 wurde daher als
Chemotyp I oder II, als Mutante mit nacktem Kern und als
neue Ausführungsform der Erfindung angesehen.
EXTRAKTION VON LIPOPOLYSACCHARID MIT
TRICHLORESSIGSÄURE (BOIVIN-VERFAHREN)
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Lipopolysaccharid (LPS) wird aus mit Aceton getrockneten
Bakterien oder aus nassen Bakterien extrahiert, die in 5
Volumina destilliertem Wasser mit 0,25 N wäßriger
Trichloressigsäure suspendiert sind. Das löslich gemachte LPS (der
Überstand) wird von den restlichen Bakterien (Kügelchen)
durch Zentrifugieren (5000xg, 30 Min., 40ºC) getrennt. Der
pH-Wert des Überstands wird mit ION NaOH auf einen pH-Wert
von 6,8 eingestellt, und LPS wird dann durch Zugabe von 2
Volumina kaltem absolutem Ethylalkohol aus dem Überstand
ausgefällt. Das ausgefällte LPS wird gesammelt und mit
kaltem absolutem Ethanol durch Zentrifugieren (10.000xg, 1
Std., 4ºC) gewaschen (3·), lyophilisiert und bis zum
Gebrauch bei 4ºC gelagert.
HERSTELLUNG DES IMMUNMODULATORS
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Mit Trichloressigsäure extrahiertes Lipopolysaccharid (LPS)
wird in 100 Volumina frisch hergestelltem Pyridin und 90%
Ameisensäure (2 : 1 v/v) gelöst, indem die Temperatur langsam
auf den Siedepunkt angehoben und ungefähr 15 Minuten dort
gehalten wird, oder bis eine sichtbare Klärung eintritt.
Die Entgiftung erfolgt dann durch Zugabe eines gleichen
Volumens destillierten Wassers zu der
LPS-Pyridin-Ameisensäure-Lösung und durch 60-minütiges Rückflußerhitzen. Das
entgiftete LPS wird über Nacht (4ºC) ausgefällt durch
Zugabe von 4 Volumina kaltem absolutem Ethanol, durch
Zentrifugieren (10.000xg, 1 Std., 4ºC) mit kaltem absolutem
Ethanol gewaschen (3·) und dann lyophilisiert. Der
entgiftete LPS-Immunmodulator wurde bei 4ºC gelagert oder in
0,1%igem wäßrigem Triethylamin zur ursprünglichen
Konzentration gelöst, um sofort zur Immunpotenzierung verwendet
werden zu können.
POTENZIERUNG DER IMMUNANTWORT UND
HYBRIDOMVERSCHMELZUNG MIT DEM IMMUNMODULATOR
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Gereinigtes Lipopolysaccharid bewirkt bekanntlich in vitro,
d. h. in gezüchteten Gewebezellen, eine
Lymphozytenblastogenese. Beim Menschen und bei anderen Säugetieren erzeugen
Lymphozyten die Interleukine (IL-1, IL-2), die die
Immunantwort hervorrufen und dadurch über die Metaboliten der
Eicosatetraensäure (d. h. Prostanoide oder Prostaglandine)
die Bildung von Antikörpern bewirken. Es ist auch bekannt,
daß gereinigtes Lipopolysaccharid die Synthese von IL-1 und
Prostacyclin in vivo potenziert. Gereinigtes
Lipopolysaccharid oder in situ vorhandenes Lipopolysaccharid (in
Verbindung mit gramnegativen Bakterien per se) besitzen
jedoch intakte Kohlenhydratseitenketten (O-Antigene), die
toxisch sind, wenn sie in vivo (d. h. in Säugetiere)
eingeführt werden, was zu unerwünschten fiebrigen Reaktionen,
Koagulopathien und gelegentlich tödlicher, disseminierter
intravaskulärer Koagulation über anaphylaktoide Reaktionen
in dem sensibilisierten Wirt führt. Gereinigtes
Lipopolysaccharid ist in Konzentrationen im Bereich von Pikogramm
und wenigen Nanogramm auch schädlich für Säugetiergewebe
oder in vitro gezüchtete Zellkulturen.
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Die Ausführungsformen der Erfindung umfassen: 1) ein neues
Verfahren zur Herstellung eines Immunmodulators, der für
Säugetiere und Gewebezellkulturen ungiftig ist; 2) ein
neues Verfahren, bei dem der Immunmodulator zur
Immunisierung von Säugetieren gegen disperse oder lösliche Antigene
verwendet wird, bei dem raschere und deutlich verstärkte
Antikörperantworten erreicht werden, und bei dem auch die
Erkennung eines breiteren Spektrums antigener Determinanten
(Epitope) und die anschließende Produktion eines breiteren
Bereiches an immunologischen Spezifitäten ermöglicht wird,
und 3) ein neues Verfahren zur Verbesserung der Frequenz
der Hybridisierung zwischen Antikörper synthetisierenden
Plasmacytomzellen und B-Lymphozyten in einer Zellkultur aus
15-30% bis mehr als 85% durch primäre Immunisierung der
Spendertiere mit dispersen oder löslichen Antigenen in
Gegenwart des Immunmodulators.
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Bei gleichzeitiger Verabreichung mit dem Antigen verbessert
der Immunmodulator die primäre Immunantwort von Mäusen der
Klassifizierung C57BL/6J. Die Verbesserung tritt sowohl bei
dispersen Antigenen wie Pseudomonas aeruginosa als auch bei
löslichen Antigenen wie Haemocyanin ein. Tiere, denen
Antigen und Immunmodulator gleichzeitig injiziert wurden,
zeigten 7, 14 und 35 Tage nach der Injektion einen höheren
Antikörpertiter als Tiere, die das Antigen allein erhalten
hatten. Der Immunmodulator verbessert nicht nur den
Antikörpertiter bei der Immunantwort zu einem frühen Zeitpunkt,
sondern, was noch wichtiger ist, scheint einen hohen
Antikörpergehalt des Serums über längere Zeit zu erhalten. Die
Verbesserung der speziellen Antikörperantwort durch den
Immunmodulator wird durch den Injektionsweg nicht wesentlich
beeinflußt, da die Verbesserung festgestellt wird, wenn
Antigen und Immunmodulator intravenös, intraperitoneal oder
subkutan in unvollständigem Freund-Adjuvans injiziert
werden.
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Diese Ergebnisse sind in Tabelle A zusammengefaßt. Bei
diesen Experimenten waren in jeder Gruppe 5 weibliche Tiere.
Die Versuchstiere erhielten Antigen und Immunmodulator (75
ug/Dosis), und die Kontrolltiere erhielten eine gleiche
Menge Antigen und sterile Kochsalzlösung. Die
Serumantikörpertiter wurden durch einen indirekten ELISA-Test
festgestellt.
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Der Immunmodulator zeigt keine Toxizität, wie aus der
Untersuchung seiner Wirkung auf das Wachstum von Zellkulturen
hervorgeht. Wenn SP2/O-Mausmyelomzellen mit Immunmodulator
in Konzentrationen von 100, 10, 1, 0,1 ng pro ml
Nährflüssigkeit kultiviert wurden, erreichten die Kulturen mit
Immunmodulator Zelldichten, die gleich oder etwas größer
waren als die der entsprechenden Kontrollkulturen.
Myelomzellen wurden in Nährmedium RPMI 1640 kultiviert, das mit 10%
fötalem Rinderserum, 2% L-Glutamin, 1% Natriumpyruvat und
Antibiotika versetzt war. Der Immunmodulator wurde in
geeigneten Konzentrationen als sterile, wäßrige Lösung dem
Nährmedium zugesetzt. Die Zelldichten wurden 24, 48, 72 und
96 Stunden nach Zugabe des Immunmodulators und/oder eines
äquivalenten Volumens von sterilem destilliertem Wasser
ermittelt.
TABELLE A Immunisierung von Mäusen der Klassifizierung C57BL/6J mit dispersen oder löslichen Antigenen mit und
ohne Immunmodulator auf verschiedenen Impfwegen.
Antikörpertiter nach der Immunisierung Tiergruppe Antigen Impfweg 7 Tage 14 Tage 35 Tage Immunmodulator Kontrollgruppe in unvollständigem Freund-Adjuvans Hämocyanin intravenös subkutan intraperitoneal * Verdünnung des Serums
Die Vakzine
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Die Vakzine umfaßt eine Bakterienmutante (Bakterin), einen
Immunmodulator (Endotoxid) und einen Proteine und Lipide
bindenden Träger (Adjuvans). Die Vakzine wird intramuskulär
oder subkutan verabreicht in Konzentrationen von 1 · 10&sup7;
Bakterien (vorzugsweise 1 · 10¹&sup0; Bakterien) oder mehr, 100
Mikrogramm oder mehr (vorzugsweise 100 bis 4000 Mikrogramm)
entgiftetem Endotoxin in einem Träger mit lipophiler und
proteinophiler Affinität.
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Das Bakterin besteht vorzugsweise aus einer abgetöteten
Suspension einer Mutante von Salmonella enteritidis, die
keine Kohlenhydratseitenketten besitzt. Die Bakterien
können hergestellt werden durch Inokulation einer sterilen,
angereicherten Nährlösung mit einer Subkultur der Mutante
von Salmonella enteritidis und durch aerobe Inkubation bei
37ºC, um eine größtmögliche Bakterienmasse zu erhalten. Die
Bakterien werden abgetötet durch Zugabe eines bakteriziden
Mittels wie Merthiolat. Es wird geprüft, ob die Bakterien
noch lebensfähig sind, dann werden sie mit steriler,
nichtpyrogener physiologischer Kochsalzlösung gewaschen (4·) und
wieder auf die gewünschte Stammkonzentration gebracht, um
sie den anderen Komponenten der Vakzine beizumischen.
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Das entgiftete Endotoxin wird hergestellt durch Beimischen
von gramnegativem bakteriellem Endotoxin zu einer Pyridin-
Ameisensäure-Lösung (Verhältnis 2 : 1). Das Gemisch aus
Endotoxin, Pyridin und Ameisensäure wird in einem sterilen
Rückflußkühler gründlich vermischt, die Temperatur wird bis
zum Siedepunkt erhöht, und das Gemisch wird unter Rückfluß
erhitzt, um die optimale Methylierung von Endotoxin zu
erreichen. Das methylierte, entgiftete Endotoxin wird dann
aus dem wäßrigen Rückflußgemisch durch Zugabe von Alkohol
ausgefällt, durch Zentrifugieren gesammelt, durch erneute
Suspension in Alkohol und erneutes Zentrifugieren
gewaschen, und schließlich in nichtpyrogenem destilliertem
Wasser bis zur gewünschten Stammkonzentration gelöst, um
den anderen Komponenten der Vakzine beigemischt zu werden.
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Das Adjuvans besteht aus einem Träger mit einer hohen
lipophilen und proteinophilen Affinität, die ausreicht, um den
Proteinanteil des Bakterins und den Lipidanteil des
entgifteten Endotoxins zu absorbieren. Das Adjuvans ist
vorzugsweise ein Adjuvans auf Fettsäurebasis, auf Ölbasis oder auf
Aluminiumbasis (beispielsweise Dialuminiumtrioxid). Die
Trägereigenschaften von Dialuminiumtrioxid wirken durch
Aufrechterhaltung einer gleichmäßigen Suspension und
erlauben eine anhaltende Freisetzung des Bakterins und des
entgifteten Endotoxins, so daß eine größtmögliche Produktion
von Antikörpern sichergestellt ist. Wenn Dialuminiumtrioxid
als Adjuvans mit einer hohen proteinophilen und lipophilen
Affinität verwendet wird, sind ungefähr 1,5 Vol.-% optimal.
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Wenn normale Pferde mit dem
Kombinationsimpfstoffimmunisiert waren, erzeugten sie in ihrer Blutbahn Antikörper in
einer Menge, die ausreichend Schutz bot, wenn sie im Labor
mit Kohlenhydraten überfüttert wurden (d. h. eine
Überfütterung, die nachahmt, was auch in der Natur vorkommt), oder
wenn ihnen bakterielle Endotoxine (d. h. eine künstlich
ausgelöste Krankheit, die auch in der Natur vorkommt)
intravenos injiziert wurden. Wenn normale Rinder mit der Vakzine
immunisiert waren, entwickelten sie ebenfalls Antikörper;
und zeigten keinen Anstieg der Körpertemperatur oder einen
anormalen Anstieg von Zahl oder Art der weißen
Blutkörperchen. Die Vorteile des Kombinationsimpfstoffes sind (a) das
Mutantenbakterium, das keine Komponenten besitzt, die
normalerweise in seiner Zellwand vorhanden sind und zu
unerwünschten anaphylaktoiden Reaktionen führen; (b) ein
Adjuvans oder einen Träger, der eine anhaltende Freisetzung von
Bakterin und/oder entgiftetem Endotoxin und folglich eine
größtmögliche Produktion neutralisierender Antikörper
sicherstellt, und (c) das entgiftete Endotoxin, das selbst
die Bildung der wünschenswerten neutralisierenden
Antikörper gegen intaktes Endotoxin und Bakterien zu einem
früheren Zeitpunkt und in größeren Mengen begünstigt. Der
Kombinationsimpfstoff hat auch die Eigenschaft, einen breiten
Schutz gegen viele durch gramnegative Bakterien ausgelöste
Krankheiten zu bieten, da die Grundstruktur des Antigens
den meisten gramnegativen Bakterien gemeinsam ist; dennoch
fehlen ihm jene in bestehenden Impfstoffen vorhandene
Komponenten, die zu einer unerwünschten Anaphylaxie führen.
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Beobachtungen im Labor deuten darauf hin, daß eine
Übersättigung mit Kohlenhydraten zu erhöhten Säurekonzentrationen
im Darm (d. h. Dickdarm) führt, was wiederum die
normalerweise undurchlässige Darmwand beschädigt und gleichzeitig
die Anzahl der normalerweise im Darminhalt und in der
Darmwand vorhandenen gramnegativen Bakterien reduziert, indem
deren Migration in die Blutbahn (Septikämie) und die
Zerstörung der Säure im Darm per se begünstigt wird. Das
Abtöten dieser Bakterien führt zur Freisetzung von Endotoxin
aus ihren Zellwänden, das wiederum durch die durch die
Säure beschädigte Darmwand in die Blutbahn gelangt. Das
Endotoxin im Blut bewirkt dann die unerwünschten Blutpfropfen
in den kleinen Blutgefäßen (intravaskuläre Koagulation).
Bei Pferden und anderen Huftieren bilden sich diese
unerwünschten Blutpfropfen in den kleinen Blutgefäßen, was
letztendlich zum Absterben des Hufgewebes, zu einer
dauernden Verkrüppelung und/oder zum Tod des Tieres führt.
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Die speziellen Vorteile des Kombinationsimpfstoffes bei
Pferden bestehen darin, das Verkrüppeln und die tödliche
Wirkung von Laminitis oder Kolik zu verhindern, indem
Endotoxin und/oder gramnegative Bakterien neutralisiert werden,
die in die Blutbahn von Pferden gelangen, die
zufälligerweise überfüttert werden, lahmen oder an sonstigem Stress
leiden. Die speziellen Vorteile des Kombinationsimpfstoffes
bei Rindern bestehen ebenfalls darin, die
endotoxinbedingten Krankheiten zu verhindern oder zu reduzieren, indem
Endotoxin und/oder gramnegative Bakterien, die in die
Blutbahn oder in andere Gewebe gelangen, neutralisiert werden.
Das Syndrom des plötzlichen Todes bei Mastvieh,
hervorgerufen durch Endotoxin von gramnegativen Bakterien aus dem
Darm, ist ein klassisches Beispiel für eine solche
Krankheit mit im Augenblick immensen wirtschaftlichen
Auswirkungen im Bereich der Viehwirtschaft.
Wirksamkeit und Sicherheit von Komponenten der Vakzine
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Es wurden ausführliche Tests durchgeführt, um die
Wirksamkeit und Sicherheit der Komponenten der Vakzine
nachzuweisen.
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Es wurde festgestellt, daß die Aufnahme des Immunregulators
Endotoxoid zusammen mit Bakterin im allgemeinen eine
frühere und verbesserte Immunantwort bei geimpften Tieren
herbeiführte. Gruppen von gesunden erwachsenen Pferden und
Ponys wurden intramuskulär mit Bakterin + Endotoxoid oder mit
dem Bakterin allein geimpft. Von den Tieren waren eine
Woche vor Beginn des Versuchs Blutproben genommen worden, und
die Immunprofile zeigten, daß alle normal waren (d. h. kein
Befund einer chronischen Laminitis). Serumproben wurden in
Abständen von 24 Stunden nach der Immunisierung gezogen,
und mit Hilfe des antigenspezifischen
Festphasen-Radioimmuntests wurden die Antikörpertiter ermittelt. Die in Fig.
1 dargestellten Werte zeigen, daß die mit Bakterin +
Endotoxoid geimpften Tiere bereits 3 Tage nach der Impfung
nachweisbare Antikörpertiter entwickelten und nicht erst
nach 7 Tagen, wie die Tiere, die das Bakterin allein
erhalten hatten. Die Untersuchung der Immunantwortkurven in Fig.
1 in der Zeit zwischen dem 3. und dem 14. Tag ergab für die
Gruppen, die Bakterin + Endotoxoid erhalten hatten, eine
steilere Kurve als für die Gruppen, die nur Bakterin
erhalten hatten. Dies deutete darauf hin, daß sich bei den
zuerst genannten Gruppen verstärkt Antikörper bildeten.
Infolgedessen wurde postuliert, daß die Gruppen, die Bakterin
+ Endotoxoid erhalten hatten, früher geschützt waren.
Außerdem ergab sich ein insgesamt höherer Schutz aufgrund der
höheren Konzentrationen von neutralisierenden und/oder
opsonisierenden Antikörpern in ihrer Blutbahn, im Gegensatz
zu den Tieren, die nur das Bakterin erhalten hatten.
-
Endotoxoid (d. h. entgiftetes Endotoxin) wurde Mäusen,
Pferden und Ponys sowie Rindern verabreicht, um die maximale
Endotoxoidmenge zu ermitteln, die ohne Risiko dem Bakterin
als Immunregulator in der Vakzine beigegeben werden konnte.
Eine LD&sub5;&sub0; für Mäuse der Klassifizierung CF-1 wird normal
erweise innerhalb von 72-96 Stunden durch intravenöse
Injektion von 0,3-0,6 mg nativem Endotoxin erreicht.
-
Gruppen von männlichen CF-1-Mäusen (L 5-20 Gramm) wurden in
die seitliche Schwanzvene mit 0,1 ml physiologischer
Kochsalzlösung, 300 ug Endotoxin in 0,1 ml physiologischer
Kochsalzlösung und mit Konzentrationen von jeweils 600 ug,
6000 ug und 12.000 ug Endotoxoid in 0,1 ml physiologischer
Kochsalzlösung geimpft. Die Mäuse wurden in Abständen von
24 Stunden auf eventuelle Schädigungen und Todesfälle
kontrolliert. Todesfälle wurden in der Endotoxingruppe
(positive Kontrollgruppe) nach 48 Stunden festgestellt,
wobei eine maximale Sterblichkeit (56%) nach 72 Stunden
festgestellt wurde (Tabelle 1). Im Vergleich dazu wurde bei der
Gruppe, die die doppelte Menge Endotoxoid (600 ug) erhielt,
keine Sterblichkeit festgestellt; bei der Gruppe, die das
20fache (6000 ug) erhielt, kam es zu einer Sterblichkeit
von nur 17%, während die 40fache Menge Endotoxoid (12.000
ug) eine LD&sub5;&sub3; ergab. Daraus wurde geschlossen, daß das
Endotoxoid mindestens 40 mal weniger giftig ist als sein
natives Endotoxin.
-
Tabelle 1. Vergleich von Endotoxoid und Endotoxin bei CF-1-
Mäusen.
Gruppen von Mäusen, die folgendes erhielten: Konzentration von Überlebensrate Endotoxin Plazebo Konz. Phys. Kochsalzlösung
-
Erwachsenen Pferden und Ponys wurden intramuskulär bis zu 5
mg Endotoxoid geimpft. Die Tiere wurden 4 Tage lang zweimal
täglich auf die Entstehung von Fieber, den Verlust der
peripheren Perfusion, einen erhöhten Puls, den Blutdruck, das
Entstehen von Lethargie und Diarrhoe beobachtet. Keines der
Tiere, die die 2,5 mg Dosis erhalten hatten, zeigte
irgendwelche ungünstigen Symptome. Ein paar von den Tieren, denen
die 5 mg Dosis geimpft worden war, hatten einen
vorübergehenden Temperaturanstieg auf 103-105ºF, einen leicht
erhöhten Puls und einen geringen Verlust der peripheren
Perfusion. Diese Symptome klangen innerhalb von 8-12 Stunden
wieder ab. Bei keinem der Tiere kam es zu Diarrhoe, einer
Dyskrasie des Blutes oder zu anderen irreversiblen
Auswirkungen. Man schloß daraus, daß bis zu 2,5 mg (2500 ug) oder
das 25fache der 100 ug Endotoxoid, die zur Aufnahme als
Immunregulator in die Vakzine vorgeschlagen worden waren,
ohne Risiko bei Pferden und Ponys verwendet werden konnten.
-
Rindern wurden intramuskulär bis zu 1000 ug Endotoxoid
geimpft, und sie wurden 16 Tage lang in Abständen von 2
Tagen auf die Entstehung von Fieber, Leukopenie und/oder
Leukozytose, Anomalien der mononuklearen Zellen
(unterschiedliche Zellzahlen), Erythrozytenanomalien,
Lethargie und Diarrhoe beobachtet. Bei den Rindern wurden
keine unerwünschten Wirkungen festgestellt. Daraus schloß
man, daß bis zu 1000 ug Endotoxoid ohne Risiko als
Immunregulator in die Vakzine für Rinder aufgenommen werden
konnten.
Sicherheit der Vakzine
-
Die Sicherheit bei der Verwendung der Vakzine wurde anhand
der folgenden Kriterien beurteilt: 1) Große Dosen (bis zum
5fachen) bei Labormäusen, Pferden und Rindern gegenüber der
empfohlenen Dosis für herkömmliche Impfpläne; 2) Impfung
von Pferden und Rindern mit einer Mehrfachdosis innerhalb
eines kurzen Zeitraums; 3) Impfweg (d. h. intramuskulär,
subkutan oder interperitoneal); 4) bei Labormäusen als
Mittel einer späteren Qualitätskontrolle; 5) bei Laborpferden
und -ponys, wo mehrere Kriterien untersucht werden konnten;
und 6) bei Feldtests, wo Pferde und Ponys und Rinder in
großen Zahlen und fit einem ubiquitären Gen-Pool auf eine
begrenzte Anzahl von Parametern hin untersucht werden
konnten.
-
Gruppen von erwachsenen, männlichen und weiblichen Mäusen
(20-25 g) wurden 1 ml aliquote Teile der Vakzine oder
Komponenten der Vakzine geimpft. Die Mäuse wurden in bezug auf
Sterblichkeit, Felltextur, Krümmung der Wirbelsäule und
Zusammenkauern, was auf periphere vaskuläre Hypothermie
hindeutet, auf Dehydration, Lethargie, Diarrhoe und
Abszeßbildung für die Dauer von bis zu 96 Stunden beobachtet.
-
Tabelle 2. Impfung von Mäusen mit der Vakzine
-
Gruppe Überlebensrate nach 96 Stunden (%)
-
Vakzine/subkutan 100
-
Vakzine/intramuskulär *100
-
Vakzine/intraperitoneal ** 70
-
Bakterin/subkutan 100
-
Endotoxoid/subkutan 100
-
Träger/subkutan 100
-
Träger/intraperitoneal *** 50
-
Physiologische Kochsalzlösung 100
-
* Mäuse wurden aufgrund ihrer geringen Größe
intramuskulär mit 10-0,1 ml aliquoten Teilen geimpft.
-
** Mäuse starben an schwerer Dehydration aufgrund der
Adsorption von Serumproteinen durch den stark lipo- und
proteinophilen Träger.
-
*** Anschließende intraperitoneale Impfung mit 1 ml
aliquoten Teilen (entspricht der Menge des Trägers in 2 ml
Vakzine).
-
Die Werte in Tabelle 2 geben an, daß subkutan oder
intramuskulär verabreichte 1 ml Dosen der Vakzine für Labormäuse
kein Risiko darstellten. Bei der intraperitonealen Impfung
kam es jedoch zu einer Sterblichkeit von 30% aufgrund des
hohen Verhältnisses von lipo- und proteinophilem Träger zu
Körpermasse (1 : 20) und der anschließenden
Proteindehydration. Man schloß daraus, daß der bei der intraperitonealen
Impfung von Labormäusen festgestellte nachteilige Effekt
irrelevant ist, da die Zielgattung für die Vakzine von
Natur
aus ein größeres Körpergewicht im Verhältnis zum Träger
besitzt, und der empfohlene Impfweg intramuskulär oder
subkutan und nicht so sehr intraperitoneal sein würde.
-
Gesunde, erwachsene Pferde wurden intramuskulär mit 2
aufeinanderfolgenden Dosen der Vakzine in 5facher
Konzentration (5 · 10¹&sup0; Bakterien, 500 ug Endotoxoid) im Abstand von
6 Tagen geimpft. Die Tiere wurden 20 Tage lang täglich auf
Anorexie, Lethargie, Diarrhoe, Dehydration und
Empfindlichkeit, Schwellung und/oder Abszeßbildung an der
Injektionsstelle beobachtet. Der einzige nachteilige Effekt war eine
vorübergehende Empfindlichkeit und Schwellung an der
Injektionsstelle, was aber innerhalb von 48-72 Stunden wieder
zurückging.
-
Rinder mit einem Gewicht von 500-650 lbs. wurden
intramuskulär mit 2 aufeinanderfolgenden Dosen der Vakzine in
4,5facher Konzentration (entspricht 4,5 · 10¹&sup0; Bakterien
und 437 ug Endotoxoid) im Abstand von 18 Tagen geimpft.
Eine Kuh wurde mit einer 11,25fachen Dosis der Vakzine
(entspricht 1,125 · 10¹&sup0; Bakterien und 1 mg Endotoxoid)
geimpft. Alle Tiere wurden zweimal täglich auf Anorexie,
Lethargie, Diarrhoe, Dehydration und Empfindlichkeit,
Schwellung und/oder Abszeßbildung an der Injektionsstelle
untersucht. Bei keinem der Rinder wurden nachteilige
Reaktionen festgestellt.
-
Die obigen Daten zeigen an, daß der Dosisbereich und die
Verabreichungsart, wie sie für Pferde und Rinder empfohlen
waren, kein unerwünschtes Risiko für die Tiere darstellten.
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Gesunden, erwachsenen Pferden wurden intramuskulär 2,5fache
Dosen der Vakzine (entspricht 2,5 · 10¹&sup0; Bakterien und 200
ug Endotoxoid) 9 Tage lang im Abstand von 3 Tagen geimpft;
dann ließ man sie 7 Tage ruhen, und dann wurde der Impfplan
von 3 Dosen in Abständen von 3 Tagen weitere 5 mal
wiederholt.
Die Pferde wurden über einen Zeitraum von 64 Tagen
insgesamt 18 mal geimpft. Die Impfungen wurden nacheinander
abwechselnd vom Hals bis zum Hinterteil verabreicht. Die
Tiere wurden täglich auf Anorexie, Lethargie, Diarrhoe,
Dehydration sowie auf Empfindlichkeit, Schwellung und/oder
Abszeßbildung an den Injektionsstellen untersucht. Die
einzige nachteilige Reaktion war bei einem Tier nach zehn
Impfungen eine örtliche Empfindlichkeit, eine herdförmige
Schwellung und eine Abszeßbildung an zwei
Injektionsstellen. Die Abszesse lösten sich nach Ableitung des Eiters
rasch auf, und der Impfplan wurde fortgesetzt. Die Tiere
zeigten sonst keine weiteren nachteiligen Reaktionen.
-
Kälber mit einem Gewicht zwischen 190 und 650 lbs. wurden
subkutan mit einer 4fachen Dosis der Vakzine geimpft
(entspricht 4 · 10¹&sup0; Bakterien und 400 ug Endotoxoid).
Siebzehn Tage später wurde ein Teil der Kälber
intramuskulär mit einer einfachen Dosis der Vakzine geimpft. Alle
Tiere wurden 120 Tage lang täglich auf Anorexie, Lethargie,
Diarrhoe und Dehydration hin beobachtet. Alle Tiere wurden
15 Tage lang in Abständen von 3 Tagen, dann 120 Tage lang
in Abständen von 30 Tagen auf Gewichtsverlust,
Körpertemperatur und Dyskrasie des Blutes untersucht. Fünf der Kälber
hatten feste, umschriebene Knötchen im subkutanen Gewebe,
die 8-12 Tage nach der ersten subkutanen Injektion (4fache
Dosis) resorbiert waren. Ähnliche Knötchen waren nach der
erneuten, intramuskulär verabreichten Impfung derselben
Kälber mit der einfachen Dosis nicht sichtbar.
-
Eine Herde von Pferden und Ponys wurde intramuskulär mit 2
Dosen der Vakzine (entspricht 1 · 10¹&sup0; Bakterien und 100 ug
Endotoxoid pro kg Körpergewicht) im Abstand von 14 Tagen
geimpft. Die Tiere wurden 20 Tage lang täglich auf
Anorexie, Lethargie, Diarrhoe, Dehydration und Empfindlichkeit,
Schwellung und/oder Abszeßbildung an der Injektionsstelle
untersucht. Bis auf eine leichte, vorübergehende Schwellung
an der Injektionsstelle bei ein paar Tieren wurden keine
unerwünschten Effekte festgestellt.
-
Eine Herde Mastvieh mit einem Gewicht zwischen 550 und 650
lbs. wurde mit 1 Dosis Vakzine (entspricht 1 · 10¹&sup0;
Bakterien und 100 ug Endotoxoid pro kg Körpergewicht) geimpft.
Ein Teil der Rinder wurde intramuskulär geimpft, und der
Rest wurde subkutan geimpft. Die Rinder wurden 50 Tage lang
täglich auf Anorexie, Lethargie, Diarrhoe und Dehydration
sowie auf Empfindlichkeit, Schwellung und/oder
Abszeßbildung an den Injektionsstellen untersucht. An den
Injektionsstellen wurden keine nachteiligen Reaktionen
festgestellt. In bezug auf die Impfung wurden keine offenbaren
systemischen Anomalien festgestellt. Bei keinem der
subkutan geimpften Tiere war eine subkutane Knötchenbildung
festzustellen.
-
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die intramuskuläre
oder subkutane Impfung von Rindern und Pferden oder Ponys
mit der Vakzine in vernünftigen und empfohlenen Dosierungen
für die Tiere weg oder kein Risiko darstellt.
WIRKSAMKEIT DER VAKZINE
-
Gesunde, erwachsene Pferde und Ponies wurden durch
intramuskuläre Impfung mit zwei einfachen Dosen der Vakzine
(entspricht 1 · 10¹&sup0; Bakterien und 100 ug Endotoxoid)
ungefähr im Abstand von zwei Wochen immunisiert. Den Tieren
wurde ungefähr alle zwei Wochen Blut abgenommen, und die
Antikörpertiter wurden durch den Radioimmuntest ermittelt.
Die Immunantwortkurven erreichten normalerweise ungefähr
20-30 Tage nach der ersten Immunisierung oder 10-20 Tage
nach der zweiten oder anamnestischen Immunisierung ein
Maximum. Die Schutzwirkung wurde durch
Kohlenhydratüberfütterung (peroral) oder durch Verabreichung subletaler Dosen
von Endotoxin (intravenös) an geimpfte Tiere zu
verschiedenen
Zeiten nach der zweiten Immunisierung ermittelt.
Siebzig bis achtzig Prozent der nichtgeimpften Pferde oder
Ponys bekam 40 bis 50 Stunden nach der
Kohlenhydratüberfütterung mit einem über einen
Magenschlauch in einer Dosis von 17,6 Gramm pro Kilogramm
Körpergewicht verabreichten Maisstärke-Holzmehl-Schleim akute
Laminitis der Obel-Stärke 3-4. Einhundert Prozent (100%)
der nichtgeimpften Pferde oder Ponys bekam Tachypnoe,
Dyspnoe und Ataxie innerhalb von 2-3 Minuten und setzte 45
Minuten nach der intravenösen Verabreichung von Endotoxin in
einer Dosis von 10 ug pro Kilogramm Körpergewicht
flüssigen, ungeformten Stuhl ab.
-
Tabelle 3. Belastung geimpfter Pferde durch
Kohlenhydratüberfütterung und i.v. verabreichtes Endotoxin
Belastung mit Kombinationsimpfstoff Plazebo (peroral) Endotoxin Gesamt
-
* Anzahl der Tiere, die nach der Exposition Laminitis der
Obel-Stärke 3-4 oder endotoxinbedingte Symptome bekamen.
-
Aus Tabelle 3 geht hervor, daß ungefähr 90% der geimpften
Tiere, verglichen mit 15 bis 25% der nichtgeimpften
Kontrollgruppe (bestehend aus 100 Tieren über 12-14 Jahre),
nach der Belastung durch Kohlenhydratüberfütterung keine
Laminitis der Obel-Stärke 3-4 bekamen, was auf eine
Schutzwirkung von mindestens 65-75% hindeutet. Ein ähnlicher
Vergleich der geimpften und nichtgeimpften Pferde, denen eine
subletale Menge Endotoxin verabreicht worden war, deutet
auf eine Schutzwirkung von mehr als 60% hin. Infolgedessen
wurde angenommen, daß die Impfung normaler, erwachsener
Pferde oder Ponys mit zwei einfachen Dosen der Vakzine bis
zu 90% der Tiere vor Kohlenhydratbedingter Laminitis
schützte, und mehr als 60% vor endotoxinbedingter
Endotoxämie.
-
Eine Gruppe Rinder beiderlei Geschlechts und verschiedenen
Alters wurde subkutan mit einer oder zwei Dosen der Vakzine
geimpft. Den Tieren wurde Blut abgenommen, und 15 Tage lang
in Abständen von 3 Tagen und danach bis zu 120 Tage lang in
Abständen von 30 Tagen wurden Seren gewonnen. Die
Antikörpertiter wurden durch den Radioimmuntest ermittelt. Bei
allen Tieren zeigte sich 20 Tage nach der Impfung eine 2- bis
4fache Erhöhung des Antikörpertiters. Nachweisbare Titer
waren bei ungefähr 70% der Tiere 120 Tage nach der Impfung
vorhanden. Ein Teil der Gruppe bekam 30 Tage nach der
Impfung eine hohe Kolenhydratration, und nach 17 Wochen
zeigten sich keine Anzeichen für Anorexie, Diarrhoe, Lahmheit
oder das Syndrom des plötzlichen Todes.
-
Eine Herde Mastvieh mit einem Gewicht zwischen 550 und 680
lbs. wurde mit einer einfachen Dosis der Vakzine geimpft
und täglich auf Diarrhoe, Lahmheit und plötzlichen Tod
kontrolliert. Während des 11-wöchigen Beobachtungszeitraums
kam es zu keiner Durchfallerkrankung, Lahmheit oder zu
einem Todesfall.
Das Serum
-
Die Entwicklung und therapeutische Verwendung von
Hyperimmunserum basierte auf der Annahme, daß nichtgeimpften
Tieren mit klinisch feststellbaren endotoxinbedingten
Krankheiten nach der Impfung mit dem Kombinationsimpfstoff nicht
die erforderliche Zeit gelassen wird, bis ihr eigenes
Immunsystem schützende Mengen von Antikörpern bildet. Passive
Immunisierung mit bereits bestehenden, durch ein anderes
Tier gebildeten, aufbewahrten Antikörpern (Hyperimmunserum)
stellte ein Mittel zum kurzfristigen Schutz dar, das zu
einer Besserung der endotoxinbedingten Krankheit beitragen
konnte, bis das eigene Immunsystem des Tieres einen
ausreichenden Schutz bot. Eine akute Laminitis-Erkrankung bei
einem nichtgeimpften Pferd, das zufällig in den Futtertrog
tritt und anschließend lahmt, ist ein klassisches Beispiel
von aktueller Bedeutung für die Pferdewirtschaft.
-
Das Hyperimmunserum besteht aus Blutgerinnselserum oder
Plasma oder aus Teilen desselben (Gammaglobulin,
Immunglobulin oder Immunglobulin IgGT), die einen oder mehrere für
den Kernbestandteil (2-Keto-3-desoxyoctonsäure-Lipid A) im
Endotoxin von Bakterien der taxonomischen Familie der
Enterobacteriaceae spezifische(n) Antikörper enthalten, der/die
durch Hyperimmunisierung der Tiere mit dem
Kombinationsimpfstoff gebildet wird/werden.
-
Hyperimmunserum wird hergestellt, indem gesunden
erwachsenen Pferden 6 mal hintereinander je 2,5 ml des
Kombinationsimpfstoffes in Abständen von 3 Tagen und danach 2 mal
hintereinander je 2,5 ml in Abständen von 7 Tagen
intramuskular injiziert werden. Vor der Impfung und in Abständen
von 3 Tagen nach der Impfung werden den Pferden zur
serologischen Analyse Serumproben entnommen. Die Konzentrationen
der antigenspezifischen Immunglobuline (gG, GT, A und M)
werden durch den Radioimmuntest unter Verwendung des 125I-
Proteins A ermittelt. Wenn bei jedem Tier die Immunantwort
sich auf einem hohen Titer eingependelt hat, werden durch
Venenpunktion jeweils 12 Liter Vollblut entnommen. Das
Hyperimmunserum erhält man durch Zentrifugieren nach der
Koagulation (ungefähr 24 Std.), und es wird dann
hitzeaktiviert (56ºC, 30 Min.) und bis zum Gebrauch oder zur
anschließenden Reinigung von Gammaglobulin oder Immunglobulin
bei 4ºC gelagert.
-
Gammaglobulin wird hergestellt durch Ausfällung aus
aliquoten Teilen von Hyperimmunserum mit 50% gesättigtem
Ammoniumsulfat (SAS). Das Präzipitat wird dann wieder in
0,01 M Phosphatpuffer (PB, NaH&sub2;PO&sub4;-Na&sub2;HPO&sub4;, pH 8)
suspendiert und gründlich gegen denselben Puffer dialysiert, um
SAS zu entfernen.
-
Das aus 50 ml aliquoten Teilen von Hyperimmunserum
gewonnene Gammaglobulin wird auf eine Säule (5 · 50 cm) von
Diethylaminoethyl(DEAE)-Cellulose absorbiert, die mit PB
äquilibriert wurde-und einen pH-Wert von 8 besitzt. Die
Säule wird anfänglich mit Äquilibrierungspuffer (PB, pH 8)
aufgeschlossen, um IgG herauszuspülen, und anschließend
wird dem PB ein NaCl-Gradient (0,03 M) zugesetzt, um IgG(T)
zu dissoziieren. Das Eluat wird in aliquoten Teilen von 5
ml mit Hilfe eines gekühlten Fraktionssammlers gesammelt,
und die Elutions-Peaks werden fortlaufend mit einem
Spektralphotometer der Marke Beckman DB-GT bei zwei
Wellenlängen von 360 und 380 nm überwacht. Die Proteinkonzentration
wird mit der Warberg-Christian-Konstanten ermittelt und
nach der Lowry-Methode bestätigt. Die aliquoten Teile von
IgG(T) werden gesammelt, lyophilisiert und bei -40ºC
gelagert, um später zur passiven Immunisierung verwendet zu
werden. Pferde, die im Versuch durch Überfütterung mit
Kohlenhydraten oder durch intravenöse Injektion von
bakteriellen Endotoxinen zum Lahmen gebracht wurden, zeigten bei
Verabreichung von Hyperimmunserum, das aus anderen, mit dem
Kombinationsimpfstoff geimpften Pferden gewonnen wurde,
eine rasche Besserung. In ähnlicher Weise wird der Tod
aufgrund einer intravenösen Injektion von bakteriellen
Endotoxinen bei Labormäusen durch Immunisierung mit
Hyperimmunserum verhindert, das aus Pferden gewonnen wurde, die mit dem
Kombinationsimpfstoff geimpft waren.
-
Gruppen von gesunden, männlichen erwachsenen (20 g) Mäusen
(CF-1) wurden intraperitoneal (IP) mit 1 ml aliquoten
Teilen
aus 100%, 10% oder 0,1% vollem Hyperimmunserum von
Pferden an vier (4) aufeinanderfolgenden Tagen geimpft. Die
Tiere wurden vier Tage lang in Abständen von 12 Stunden auf
Dyspnoe, Rigor, Perfusion an Nase und Schwanz, geschwollene
Augen, Felltextur und Tod beobachtet. Im Zusammenhang mit
den IP-Seruminjektionen wurden keine unerwünschten Effekte
beobachtet.
-
Einem erwachsenen gesunden Pony wurden durch intravenöse
Tropfinfusion über 90 Minuten 700 ml Hyperimmunserum
geimpft, dem 1000 ml mit Lactat angereicherte Ringer-Lösung
beigemischt war. Das Tier wurde 6 ½ Stunden (in Abständen
von 10-15 Minuten) auf eine Änderung der Körpertemperatur,
den Puls und die periphere Perfusion überwacht; außerdem
auf Unwohlsein und/oder Schmerzen. Das Pony machte keine
Anzeichen für Unwohlsein oder Schmerzen. Die
Körpertemperatur und der Puls zeigten ungefähr 60-90 Minuten nach Beginn
der intravenösen Tropfinfusion eine leichte (statistisch
unbedeutende) Erhöhung (100,4º → 101,3ºF; 50 → 56
Herzschläge/Min.)
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Bei einem klinischen Test wurde ein 900 lb. schweres Pferd
mit Komplikationen, die auf einen septischen Schock
zurückzuführen waren, über einen Zeitraum von 10 Stunden
fortlaufend intravenös mit 1200 ml Hyperimmunserum in mit Lactat
angereicherter Ringer-Lösung geimpft. Das Tier hatte keine
unerwünschten Anzeichen für Toxizität, und es zeigte sogar
eine deutliche Besserung.
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Um die Sicherheit der intramuskulären Impfung zu
beurteilen, wurden gesunde, erwachsene Ponys intramuskulär (IM)
mit 0, 10, 20 und 40 ml Hyperimmunserum geimpft. Die Tiere
wurden 30 Min., 1, 2, 4, 8, 16 und 24 Stunden nach der
Impfung auf (1) Urinieren; (2) Diarrhoe; (3) Rigor; (4)
periphere Perfusion; (5) Temperatur; (6) Atmung; (7) Puls; (8)
Leukozytose (oder -penie); und (9) Erythrozytose (oder
-penie)
kontrolliert. Es wurden keine unerwünschten Effekte
beobachtet. Ein diffuses Knötchen war im Hals eines Ponys
zu sehen, dem die 40 ml Dosis intramuskulär verabreicht
worden war. Das Knötchen war aber nach 4 Stunden
zurückgegangen.
-
Gammaglobulin, das den schützenden Antikörper enthält,
wurde aus dem Hyperimmunserum extrahiert, um die
Schutzwirksamkeit auf der Basis von mg Protein zu ermitteln.
Vorimmun- und Hyperimmunserum von einzelnen Pferden, die
mit der Vakzine hyperimmunisiert waren, wurde miteinander
verglichen, indem Untergruppen von CF-1-Mäusen mit
verschiedenen Konzentrationen von Gammaglobulin in geteilten
Dosen an zwei aufeinanderfolgenden Tagen vor der
intravenösen Belastung mit Endotoxin geimpft wurden. Die Daten in
Fig. 2 und 3 vergleichen Vorimmun- und Hyperimmunglobulin
aus zwei getrennten Pferden (Nr. 23 und Nr. 24) mit Hilfe
des Modells der passiven Immunisierung von Mäusen.
Hyperimmunglobulin wurde aus dem Pferd Nr. 23 zu zwei
aufeinanderfolgenden Zeitpunkten nach der Hyperimmunisierung (Nr. 23A,
Nr. 23B) hergesteuert. Der Vergleich der Prozentsätze von
Mäusen, die 96 Stunden nach der Endotoxinbelastung noch
leben und zuvor mit 50 ug oder mehr von Vorimmun- oder
Hyperimmunglobulin Nr. 23 (Nr. 23A und Nr. 23B) passiv
immunisiert worden waren, ergibt eine mindestens 20%ige (für
Nr. 23B) bis 50%ige (für Nr. 23A) Steigerung der
Überlebensrate für jene Untergruppen, die Hyperimmunglobulin
erhalten hatten (Fig. 2). Der Vergleich von Vorimmun Nr. 24
mit Hyperimmun Nr. 24 ergibt auch eine ähnliche
Schutzwirkung, aber in geringerem Maße (Fig. 3). Daraus wurde
geschlossen, daß das Hyperimmunserum Antikörper enthält, die
Mäuse passiv vor einer letalen Endotoxinbelastung schützen
können.
-
Die Wirksamkeit des Hyperimmun-Gammaglobulins wurde
festgestellt durch Belastung (mit Endotoxin oder
Kohlenhydratüberfütterung)
von Untergruppen von Pferden und Ponys nach
intravenöser Impfung mit 5, 15 oder 20 mg
Antikörperprotein/kg Körpergewicht. Alle Tiere erhielten
eine Mischung von Hyperimmun-Gammaglobulin Nr. 23A und Nr.
23B. Die Kombination der zwei Präparate war notwendig, um
die für die Durchführung der Untersuchungen notwendigen
Mengen des bekannten Antikörperproteins sicherzustellen.
Der Schutz war definiert als deutliche Verzögerung und/oder
Besserung der unmittelbaren Veränderung lebenswichtiger
Merkmale und der Entstehung einer Krankheit von höchstens
der Obel-Stärke 2 bei Tieren, die mit subletalen Mengen
Endotoxin und/oder Kohlenhydratüberfütterung belastet waren.
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Tabelle 4. Passive Immunisierung von Pferden mit Vorimmun-
und Hyperimmunserum
Passive Immunisierung mit Belastung mit Hyperimmunglobulin Vorimmunglobulin (perora)l Endotoxin
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Die Prozentzahlen zeigen an, daß nach der Belastung eine
Laminitis der Obel-Stärke 3-4 oder endotoxinbedingte
Symptome entstehen.
-
Da viele mögliche Ausführungsformen der Erfindung möglich
sind, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen, sollen
natürlich alle hier aufgeführten oder in der beiliegenden
Zeichnung gezeigten Einzelheiten als erläuternd und nicht
als eingrenzend verstanden werden.