DE3587603T2 - Aus follikularer eierstockflüssigkeit isoliertes inhibin. - Google Patents
Aus follikularer eierstockflüssigkeit isoliertes inhibin.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Protein, nämlich Inhibin, ein Verfahren zu dessen Gewinnung und Aufreinigung, bestimmte Fragmente und Derivate dieses Proteins, und die Verwendung dieser Substanzen.
- Rein auf Grundlage von Anhaltspunkten und ein wenig Versuchsarbeit wurde bereits 1932 vorgeschlagen, daß die Gonaden einen nichtsteroidartigen Faktor produzieren, der im Stande war, die Sekretion des follikelstimulierenden Hormons (FSH) durch die Hirnanhangdrüse selektiv zu blockieren und der als Inhibin bezeichnet wurde (McCullagh, Science 76, (1932) 19). Seit damals hat die Entwicklung von Radioimmuntests zur Messung von FSH zur Anhäufung von größeren Mengen Beweismaterial geführt, die auf die Existenz von Inhibin schließen lassen, aber erst in den frühen 70er Jahren versuchte man, diese Substanz zu isolieren und zu bestimmen. Seit damals hat eine Reihe von Forschungsgruppen versucht, Inhibin aus verschiedenen gonadischen Ausgangsmaterialien auf zureinigen, wobei widersprüchliche Ergebnisse erhalten wurden (de Jong, Mol. Cell. Endocrinol. 13, (1979) 1). Einige Forscher behaupteten, Inhibin aus menschlichem Samenplasma isoliert und sequenziert zu haben, wobei die Molekulargewichte ihrer Inhibinformen 5 000 bzw. 14 000 Dalton betrugen (Seidah et al., FEBS Letters 167, (1984) 98; Sheth et al., FEBS Letters, 165, (1984) 11). Es wurde jedoch ernsthaft in Frage gestellt, ob diese Substanzen gonadischen Ursprungs waren (Beksac et al., Int. J. Andrology 7, (1984) 389; Lilja und Jeppsson, FEBS Letters 182, (1985) 181). Andere Forschungsgruppen verwendeten in ihren Versuchen zur Isolierung von gonadischem Inhibin Flüssigkeit aus den Hodenkanälchen (Hodennetzflüssigkeit) sowie Ovarialfollikelflüssigkeit. Trotz 12-jähriger Versuchstätigkeit gelang es jedoch nicht, die Substanz rein zu erhalten. Dieser Hintergrund zeigt, daß generell Uneinigkeit über das Wesen, die chemischen Eigenschaften oder der Produktionsort der als Inhibin definierten Substanz herrscht.
- Aufgrund der Eigenschaften von Extrakten aus Rinderfollikelflüssigkeit wurde die Theorie aufgestellt, daß diese eine Substanz, oder Substanzen, "Inhibin", mit bestimmten Funktionen enthält. Es wurde nun solch eine Substanz aus einem gonadischen Ausgangsmaterial isoliert, und diese Substanz erfüllt alle biologischen Kriterien, die typisch für Inhibin sind.
- Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein gereinigtes Protein, nämlich Inhibin, dadurch gekennzeichnet, daß
- (a) sein scheinbares Molekulargewicht mittels SDS-PAGE als 56 000 ± 1 000 bestimmt wurde;
- (b) sich der isoelektrische Punkt in einem Bereich von 6,9-7,3 befindet;
- (c) das Protein spezifisch an Concanavalin A-Sepharose binden kann;
- (d) das Protein aus zwei Untereinheiten besteht, die, wie mittels SDS-PAGE nachgewiesen wurde, nach Reduktion voneinander getrennt werden können und dadurch gekennzeichnet sind, daß:
- (i) ihre scheinbaren Molekulargewichte mittels SDS-PAGE als 44 000 ± 3 000 bzw. 14 000 ± 2 000 bestimmt wurden;
- (ii) sich der isoelektrische Punkt der Untereinheit mit Molekulargewicht 44 000 im Bereich von 6,0-7,0 befindet; und
- (iii) die N-terminalen Aminosäurensequenzen der beiden Untereinheiten wie unten beschrieben sind;
- (e) das Protein das follikelstimulierende Hormon (FSH), jedoch nicht das luteinisierende Hormon (LH), das thyreotrope Hormon oder Prolactin im in vitro Biotestsystem blockieren kann; und
- (f) das Protein mit radioaktivem Jod markiert werden kann.
- Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung von Inhibin aus Ovarialfollikelflüssigkeit von Säugetieren, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
- (a) einen oder mehrere Gelpermeationschromatographieschritte;
- (b) einen oder mehrere Umkehrphasen-Hochdruck- Flüssigkeitschromatographieschritte;
- (c) einen oder mehrere präparative Polyacrylamid-Gel- Elektrophoreseschritte;
- (d) Elution des aufgereinigten Inhibins mittels Elektrophorese.
- Die Erfindung betrifft weiterhin die beiden Untereinheiten als neue Substanzen per se und daher auch eine proteinartige Substanz, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie die Eigenschaften der oben definierten 44 000 oder 14 000 Dalton Untereinheit aufweist.
- Die Erfindung betrifft weiterhin gewisse Fragmente der neuen Inhibin-Substanz und daher auch eine proteinartige Substanz, die die folgenden Eigenschaften eines Fragments des oben definierten Proteins Inhibin aufweist:
- (a) die Substanz enthält, entweder ganz oder teilweise, eine der oben definierten Untereinheiten,
- (b) sie kann als Antigen an Säugetiere verabreicht werden, um Antikörper gegen das Protein Inhibin zu bilden, wodurch der Spiegel des follikelstimulierenden Hormons in den Säugetieren ansteigt.
- Die Erfindung betrifft weiterhin ein Derivat des neuen Inhibins, das als Antigen an Säugetiere verabreicht werden kann, wodurch der Spiegel des follikelstimulierenden Hormons in den Säugetieren ansteigt.
- Die Erfindung betrifft außerdem ein Homologes des neuen Inhibins, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Homologe als Antigen an Säugetiere verabreicht werden kann, um Antikörper zu bilden, wodurch der Spiegel des follikelstimulierenden Hormons in den Säugetieren ansteigt.
- Beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung des Inhibins wird der Gelpermeationschromatographieschritt vorzugsweise so durchgeführt, daß ein Gelpermeationsträger mit hohem Porenvolumen, zum Beispiel Sephacryl S200 oder Sephadex G100 verwendet wird (sowohl bei Sephacryl wie auch bei Sephadex handelt es sich um Warenzeichen der Firma Pharmacia). Bei bevorzugten Elutionsmethoden werden flüchtige Lösungsmittel verwendet, die z. B. Ammoniumacetat, Essigsäure oder ähnliche Verbindungen enthalten, was eine direkte Wiederherstellung der biologischen Aktivität mittels Gefriertrocknung oder Vakuumtrocknung ermöglicht.
- Die Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie wird vorzugsweise mit einem Säulenfüllmaterial durchgeführt, das aus chemisch gebundener N-Alkylkieselsäure mit einer engen Korngrößenverteilung, am besten 5-10 um, durchgeführt. Die verwendeten Elutionsmittel können flüchtig oder nichtflüchtig sein und enthalten ionische Modifikatoren, wie z . B. Trifluoressigsäure (TFA), Ammoniumbicarbonat, Ammoniumacetat oder Natriumphosphat, in einem Gradienten aus einem mischbaren organischen Lösungsmittel wie Methanol, Acetonitril oder Isopropanol, in Wasser. In einer bevorzugten Vorgangsweise wird ein Gradient von 0-50% Acetonitril in 0,1% TFA verwendet. Verschiedene Methoden der präparativen Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) können in der Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) unter Verwendung von PAGE-Gelen mit verschiedenen Porositäten und Vernetzungsgraden durchgeführt werden. Ein bevorzugtes Puffersystem für die Elektrophorese beruht auf der Methode von Laemmli, wie in Nature 227, (1970) 680 beschrieben.
- Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Bildung spezifischer Antikörper gegen das Inhibin, wobei besagte Antikörper die Fähigkeit haben, im in vitro-Biotest die Aktivität des Inhibins zu neutralisieren und in vivo das Gewicht der Gonaden zu erhöhen. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß ein Säugetier mit einer wirksamen Menge des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Proteins Inhibin oder der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Inhibin-Untereinheiten oder der oben beschriebenen erfindungsgemäßen proteinartigen Substanz immunisiert wird, wobei besagte Zubereitung in Kombination mit einem Hilfsstoff vorliegt.
- Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Inhibin-spezifischen monoklonalen Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, daß sie mittels des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Proteins Inhibin oder mittels einer oben beschriebenen erfindungsgemäßen Inhibin-Untereinheit oder mittels der oben beschriebenen erfindungsgemäßen proteinartigen Substanz hergestellt werden.
- Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Durchführung eines Inhibin-Radioimmuntests, das zur Messung von Inhibin in biologischen Proben wie z. B. Plasma, Serum oder Harn verwendet werden kann.
- Die vorliegende Erfindung wird nun ausschließlich beispielhaft anhand der folgenden Beispiele, die keine Beschränkung darstellen, und den beiliegenden Skizzen beschrieben näher erläutert. Es zeigen:
- Abbildung 1 das Elutionsprofil der Inhibinaktivität in Rinder-Ovarialfollikelflüssigkeit (ROFF), die aus Sephacryl 5200 fraktioniert wurde; Abbildung 2 das Elutionsprofil der Inhibinaktivität in ROFF, das auf Sephadex G100 fraktioniert wurde; Abbildung 3 das Elutionsprofil der Inhibinaktivität in ROFF, die mittels Umkehrphasen-Hochdruck- Flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) im Anschluß an Gelchromatographie fraktioniert wurde.
- Abbildung 4 das Gelelektrophoresemuster von vier sequentiellen, mittels präparativer PAGE erhaltenen Fraktionen auf reduziertem und nichtreduziertem SDS- Polyacrylamid-Gel.
- Erläuterung der Abkürzungen:
- ROFF - Rinder-Ovarialfollikelflüssigkeit
- RP-HPLC - Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie
- PAGE - Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
- FSH - follikelstimulierendes Hormon
- LH - luteinisierendes Hormon
- E - Einheiten
- GF - Gelfiltration
- KD - Kilodalton
- TFA - Trifluoressigsäure
- SDS - Natriumdodecylsulfat
- Der Vorgangsweise bei der Aufreinigung liegt die sequentielle Anwendung eines oder mehrerer Gelpermeationsschritte, eines oder mehrere Umkehrphasen-HPLC- Schritte und eines oder mehrerer PAGE-Schritte zugrunde.
- Die Rinderovarien stammten aus in der Nähe befindlichen, Schlachthäusern, und ROFF wurde in einen gekühlten Behälter, der die Proteaseinhibitoren Trasylol (10 E/ml) und Phenylmethylsulfonylfluorid (24 ug/ml) enthielt, abgesaugt. Die ROFF wurde bei -20ºC im tiefgekühlten Zustand aufbewahrt.
- Das Verfahren zur Aufreinigung von Inhibin umfaßte 4 Stufen oder Schritte. In den folgenden Abschnitten finden sich eine Skizze des Verfahrens und eine genaue Darstellung des Aufreinigungsverfahrens.
- Das Aufreinigungsverfahren umfaßt folgende Schritte:
- (A) Gelpermeationschromatographie auf Sephacryl 5200.
- (B) Gelpermeationschromatographie auf Sephadex G100.
- (C) Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie.
- (D) Präparative Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese.
- (E) Elektrophoretische Elution von Proben. Die Aufreinigung von Inhibin wurde nach dem leicht veränderten (Au et al., Endocrinology 112, (1983) 239) Bioassay-Test nach Scott et al. (Endocrinology 107, (1980) 1536) überwacht. Das Verfahren beruht auf der Fähigkeit von Inhibin, in kultivierten Hypophysen-Vorderlappenzellen der Ratte den FSH-, jedoch nicht den LH-Gehalt in den Zellen dosisabhängig zu reduzieren.
- ROFF (50-100 ml) wurde mit 0,05 M Ammoniumacetat pH 7,0 (25-50 ml) verdünnt und zentrifugiert (12 000 g·30 min bei 4ºC). Der Überstand (75-150 ml) wurde auf einer Sephacryl S200-Gelfiltrationssäule (9·90 cm) bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 70-100 ml pro Stunde fraktioniert. Wie aus Abbildung 1 ersichtlich befand sich die Inhibinaktivität in einer Zwischenkornvolumenregion (MG ≥ 90 000) dieser Säule. 90% der Inhibinaktivität wurden wiedergewonnen, wobei die spezifische Aktivität auf das 3- bis 4fache erhöht war.
- Zwischenkornvolumenfraktionen (A, B, C und D, Abb. 1) wurden zusammengegeben, und 25-50% der vereinigten Fraktionen wurden mit Eisessig (chromogenfrei) auf eine Endkonzentration von 4 M Essigsäure angesäuert und bei 4ºC eine Stunde lang aufbewahrt. Die restlichen 50-75% wurden bei -20ºC in tiefgekühltem Zustand aufbewahrt und anschließlich fraktioniert. Der angesäuerte vereinigte Ansatz (ungefähr 120 ml) wurde auf eine Sephadex G100 Gelfiltrationssäule (9·90 cm) aufgetragen, wobei 4 M Essigsäure als Elutionspuffer verwendet wurde und die Durchflußgeschwindigkeit 70-100 ml pro Stunde betrug. Alle Arbeitsgänge mit beiden Gelfiltrationssäulen wurden bei 4ºC durchgeführt. Unter diesen Bedingungen eluierte der Großteil der Inhibinaktivität in einem unteren Molekularbereich (Elutionsvolumen 1760-1880 ml, MG-Bereich 20 000-60 000, Abb. 2), wobei die spezifische Aktivität auf das 10-20fache erhöht war und 45% der Inhibinaktivität in diesem Bereich wiedergewonnen wurden. Bei Verwendung von analytischen Säulen (z. B. 2,5·100 cm) wurden ähnliche Aktivitätsprofile mit höheren spezifischen Aktivitäten (10-50fach) beobachtet.
- Die Säulenfraktionen (Elutionsvolumen ungefähr 1760-1910 ml) aus Schritt B wurden vereinigt und anschließend auf die RP-HPLC-Säule aufgetragen. Bei der Säule handelte es sich um eine Ultrapore RPSC-Säule (Beckman, Berkeley, Kalifornien). Bei der mobilen Phase handelte es sich um einen linearen Gradienten zwischen 0,1% TFA in Wasser und 50% Acetonitrile in 0,1% TFA; die Durchflußgeschwindigkeit betrug 1 ml pro Minute, und das Eluat wurde in 0,5 ml Fraktionen gesammelt. Drei Auftragungsverfahren wurden angewandt: (a) Die Probe wurde gefriergetrocknet, und 1 mg Probe wurde in 4 M Essigsäure so gelöst, daß eine Konzentration von 8-10 mg Trockengewicht/ml erhalten wurde, in ungefähr 100 ul 4 M Essigsäure zentrifugiert und mittels Spritze auf die HPLC-Säule aufgetragen; (b) die gefriergetrocknete Substanz (5-10 mg) wurde in 20 ml 4 M Essigsäure gelöst, zentrifugiert und mittels einer Lösungsmittel-Aufgabeöffnung im HPLC auf die Säule aufgetragen; (c) die nichtgefriergetrocknete Substanz (ungefähr 100 ml) wurde über ein 0,5 um Filter (FH; Millipore Corp) gefiltert und anschließend über ein Lösungsmittel-Aufgabeöffnung bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 2 ml/min auf die Säule aufgetragen.
- Die Inhibinbereiche aus den Bulk-Läufen (b) und (c) wurden nochmals chromatographiert. Jede Fraktion wurde (falls nötig) mit dem Inhalt der entsprechenden Röhrchen aus den Wiederholungsläufen vereinigt, und aliquote Teile wurden für Biotests, Amninosäureanalyse und SDS-PAGE entnommen. Das Acetonitril wurde anschließend von jeder Fraktion durch Abdampfen unter N&sub2; entfernt, und die Probe wurde gefriergetrocknet. Wie aus ABB. 3 ersichtlich, fand sich Inhibinaktivität in einem Bereich des Chromatogramms, der ungefähr 30% Acetonitril entsprach. Die Probenmenge in diesem Versuch betrug 1 mg.
- In den verschiedenen Auftragungsverfahren wurden 40% der Inhibinaktivität wiedergefunden, obwohl die Leistungsfähigkeit der HPLC-Säule deutlich durch die beiden letztgenannten Verfahren beeinflußt wurde. Mit diesem HPLC-Schritt wurde eine 10fache Erhöhung der spezifischen Aktivität erreicht, wobei die spezifische Aktivität insgesamt auf das 160fache gesteigert wurde.
- Die mittels RP-HPLC erhaltenen inhibinhaltigen Fraktionen wurden in nichtreduzierendem Probenpuffer (0,06 M Tris-HCl pH 6,8, 12,5% Glycerin, 1,25% m/v SDS und 0,006% Bromphenolblau) gelöst und auf einem senkrechten modifizierten Polyacrylamid-Gel-Elektrophoreseapparat (Reid und Bieleski, Analytical Biochemistry, 22, (1968) 374) fraktioniert. Die SDS-Polyacrylamid-Gel- Elektrophoreselösungen (Laemmli, Nature 227 (1970) 680) bestanden aus einem Sammelgel (0,125 M Tris-HCl pH 6,8, 0,1% m/v SDS, 5% Acrylamid, 0,13% Bisacrylamid, 0,1% Ammoniumpersulfat) und einen Trenngel (0,38 H Tris-HCl pH 8,8, 0,1% m/v SDS, 7,5% Acrylamid, 0,2% Bisacrylamid, 0,03% Ammoniumpersulfat). Beim Elektrophoresepuffer handelte es sich um 2,5 mM Tris-Glycin-Puffer mit 0,05% (m/v) SDS. Das aufgetragene Protein (500-700 ug) wurde auf die acht Taschen verteilt.
- Die Gele wurden bei ursprünglich 20 mA laufen gelassen, bis die Probe in das Trenngel gewandert war (1,5 Stunden), und der Strom wurde anschließend auf 30 mA für die Laufzeit (4 Stunden) erhöht, bis der Bromphenolblau-Marker das untere Ende des Gels erreicht hatte. Das Gel wurde mit 0,5% Coomassieblau in Essigsäure: Isopropylalkohol: Wasser im Volumenverhältnis von 1 : 3 : 6 gefärbt (15 Minuten) und mit Essigsäure: Methanol: Wasser im Volumenverhältnis 50 : 165 : 785 entfärbt, und der Inhibinbereich (Molekulargewicht ungefähr 56 000), der durch dieses Verfahren sichtbar gemacht wurde, wurde mit Skalpell und Lineal in 2 mm dicke Stücke zerschnitten. Gelstücke oberhalb und unterhalb des Inhibinbereichs wurden ebenfalls entnommen. Die Gelstücke wurden in verschlossenen Röhrchen bei -15 bis -20ºC aufbewahrt und anschließend elektrophoretisch eluiert.
- Abbildung 4 zeigt reduzierte und nichtreduzierte SDS-Gel-Elektrophoresemuster 4 aufeinanderfolgender Fraktionen (A, B, C und D), die mittels präparativer PAGE-Aufreinigung erhalten wurden. Inhibinaktivität wurde hauptsächlich in Fraktion B aufgefunden (scheinbares Molekulargewicht 56 000 ± 1 000, Mittelwert ± Standardabweichung; 5 aufgereinigte Inhibinansätze). Unter reduzierenden Bedingungen wurde Fraktion B reduziert und ergab zwei Hauptbanden mit scheinbaren Molekulargewichten von 44 000 ± 3 000 und 14 000 ± 2 000 (n = 5) (Bahn E). Bei dem Verfahren handelte es sich um das SDS-PAGE-System nach Laemmli (1970). Proteine wurden durch Silberfärbung sichtbar gemacht. Bei den verwendeten Proteinstandards handelte es sich um Rinderserumalbumin (Molekulargewicht 67 000), Ovalbumin (43 000), Kohlensäureanhydrase (29 000), Gänse-Lysozym (21 000) und Hühnereier-Lysozym (14 500). Als Reduktionsmittel wurde 0,1% 2-Mercaptoethanol verwendet.
- Bei dem Verfahren handelte es sich um eine Modifikation des Verfahrens nach Hunkapiller et al., (Methods in Enzymology, 91 (1983) 227). Gelstücke wurden in destilliertem Wasser mit einer Rasierklinge in Würfel geschnitten, in Elutionspuffer (0,1% SDS in 0,05 M NH&sub4;HCO&sub3;) 5 Minuten lang gewaschen und in eine mit Dialysemembranscheiben (Ausschlußgrenze bei einem Molekulargewicht von 6 000-8 000) ausgestattete Elektrophorese- Elutionszelle gelegt. Die Gelstücke wurden mit "Soaking"- Puffer (2% SDS in 0,4 M NH&sub4;HCO&sub3;) übergossen und mit Elutionspuffer (0,1% SDS in 0,05 M NH&sub4;HCO&sub3;) überschichtet. Festes Natriumthioglycolat wurde zum Elutionspuffer auf eine Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben. Vor Beginn des Elektrophorese-Elutionsvorgangs bei 50 V (Gleichstrom) wurden die Gelstücke 3-5 Stunden quellen gelassen. Nach 12-16 Stunden wurde der Elutionspuffer durch Dialysepuffer (0,02% SDS in 0,01 M NH&sub4;HCO&sub3;) ersetzt, und hieran schloß sich eine weitere 20-24-stündige Elektrophorese-Elution bei 80 V (Gleichstrom) an, bis der Farbstoff Coomassieblau und das Protein in das Probensammmelnäpfchen gewandert waren. Die eluierte Probe wurde aus dem Sammelnäpfchen mittels einer 50 ul Hamilton- Spritze mit gebogener Spitze entfernt, in aliquote Teile geteilt und entweder tiefgekühlt oder gefriergetrocknet. Proben der gereinigten Fraktionen wurden für den in vitro-Biotest, die Aminosäureanalyse und Molekulargewichtsbestimmung aufbewahrt, wobei die SDS-PAGE wie bei der Silberfärbemethode durchgeführt wurde.
- Mit auf den oben genannten Verfahren, d. h. einer Kombination von Gelpermeationschromatographie, RP-HPLC und präparativer PAGE, beruhenden Aufreinigungsverfahren wurde Inhibinaktivität als einzelne Proteinbande auf SDS- PAGE (ABB. 4) aufgefunden, wobei das scheinbare Molekulargewicht 56 000 ± 1 000 betrug (5 Ansätze).
- Die gereinigten Inhibinansätze blockieren im in vitro-Biotest FSH, jedoch nicht das luteinisierende Hormon, das thyreotrope Hormon oder Prolactin, was zeigt, daß das gereinigte Produkt spezifisch FSH blockiert. Die Blockierung ist nicht durch unspezifische, toxische Wirkungen bedingt.
- Inhibin wurde wie in Beispiel 1 isoliert, mit dem Unterschied, daß die Fällung durch Änderung des pH der Zwischenkornvolumenfraktion aus Schritt A mit 4 M Essigsäure auf 4,75 und 30-minütiges Zentrifugieren bei 12 000 g und 4ºC erfolgte. Das erhaltene Pellet wurde in 0,05 M Ammoniumacetat, pH 7,0, gelöst. Die Solubilisation des Pellets wurde durch Homogenisierung und Ultraschallbehandlung in einem Puffer bei Raumtemperatur unterstützt. Die Probe wurde mit Eisessig auf eine Konzentration von 4 M Essigsäure gebracht und zentrifugiert, worauf sie zur Durchführung des zweiten Gelpermeationsschritts (Schritt B) auf die Säule aufgetragen wurde. Inklusive pH-Fällung und Ansäuerung des gelösten Pellets wurden insgesamt 34% der Inhibinaktivität wiedergewonnen.
- Die Modifizierung hat den Vorteil, daß das auf die Säule aufgetragene Probenvolumen um 75% verringert wird, was einen höheren Substanzdurchsatz gestattet. Nach Fraktionierung durch Gelfiltration mit 4 M Essigsäure als Elutionspuffer wurde Inhibinaktivität in ähnlichen Säulenfraktionen (Elutionsvolumina 1700-2100 ml) wie denen im Verfahren nach Beispiel 1 wiedergewonnen. Das anschließende Verhalten von Inhibin in den RP-HPLC- und PREP-PAGE-Verfahren wurde durch die verschiedenen in diesem Beispiel geprüften Modifizierungen nicht beeinflußt.
- Analytische SDS-PAGE des Endprodukts unter nichtreduzierenden Bedingungen ergab eine einzelne Bande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 56 000 ± 1 000 (Mittelwert ± Standardabweichung, 5 Ansätze), während unter reduzierenden Bedingungen 2 Hauptbanden mit scheinbaren Molekulargewichten von 44 000 ± 3 000 bzw. 14 000 ± 2 000 (5 Ansätze) beobachtet wurden. Heterogenität wurde beobachtet, und aufgrund von Elektrophoresen der 56 kD-Bande unter nichtreduzierenden Bedingungen und der 44 kD-Bande unter reduzierenden Bedingungen beurteilt. Das scheinbare Molekulargewicht der 56 kD-Substanz bewegte sich zwischen 54 000 und 57 000 und das der 44 kD-Substanz von 42 000 bis 46 000. Bei der 14 kD-Bande wurde eine einzelne Bande beobachtet. Diese Ergebnisse stimmen mit dem Glycoproteincharakter dieses Moleküls überein.
- Die pI-Werte von intaktem Inhibin und der größeren Untereinheit wurden mit dem zweidimensionalen PAGE- System nach O'Farrell, P.H., J. Biol. Chem, 250 (1975), 4007-4021 bestimmt. Intaktes Inhibin wurde durch Silberfärbung nachgewiesen und wies eine einzelne Bande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 56 000 auf, wobei sich jedoch einige Flecken mit pI-Werten im pH-Bereich 6,9-7,3 in unmittelbarer Nähe befanden. Diese Werte deuten auf eine Glycoproteinzubereitung hin. Die Untereinheit mit einem Molekulargewicht von 44 000 wies eine einzelne Bande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 46 000 auf, wobei sich einige Flecken mit pI-Werten im pH-Bereich von 6,0-7,0 auf, was darauf hindeutet, daß es sich bei dieser Untereinheit um ein Glycoprotein handelt.
- Die Tatsache, daß es sich bei Inhibin um ein Glycoprotein handelt, wurde weiterhin folgendermaßen bewiesen:
- (a) Radioaktiv markiertes Inhibin kann an auf Sepharose (Warenzeichen der FA. Pharmacia, Uppsala, Schweden) immobilisiertes Concanavalin A, ein Lectin, binden. In einer Reihe von Versuchen band der Tracer zu 15-17% an das Lectin und wurde nach Elution mit dem Zuckermethyl-α-D-glucopyranosid (Calbiochem, San Diego, USA) freigesetzt.
- (b) Mit Meerrettichperoxidase markiertes Weizenkeimlectin band nach Fraktionierung von Inhibin auf SDS-PAGE und Elektrotransfer des Proteins auf Nitrocellulose an Inhibin. Die Bindung des Lectins wurde über die Intensität der Peroxidase-Farbreaktion verfolgt.
- Eine Bindung des Lectins trat beim intakten 56 kD-Protein und bei der 44 kD-Untereinheit auf.
- Eine aufgereinigte Inhibinpräparation wurde reduziert und carboxymethyliert, und die beiden Untereinheiten mit scheinbaren Molekulargewichten von 44 000 bzw. 14 000 wurden durch PAGE getrennt und aus dem Gel mittels eines wie in Schritt E, Beispiel 1, oben beschriebenen Elektroelutionsverfahrens gewonnen. Das SDS wurde durch Methanolfällung von Inhibin entfernt und die N-terminale Aminosäuresequenz bestimmt.
- Versuche mit den Untereinheiten in kleinen Mengen ergaben die folgenden Sequenzen, wobei einige Werte nicht mit Sicherheit bestimmt werden konnten. Rest 44 kD-Untereinheit xxx = nicht eindeutig yyy = nicht bestimmbar; nicht genug Material in diesen Versuchen vorhanden Asx = Asn oder Asp
- 19 ug wie oben beschrieben gereinigtes Inhibin wurden in 600 ul Dulbecco's Phosphatpuffer pH 7,4 gelöst und mit einem gleichen Volumenteil eines Hilfsstoffes auf Ölbasis (zum Beispiel Marcol 52: Montanide 888 im Verhältnis 9 : 1. Bei Marcol 52 handelt es sich um ein Warenzeichen der Fa. Esso und bei Montanide 888 um ein Warenzeichen von S.E.P.P.I.C., Paris) emulgiert. Jeweils zweihundert ul wurden einem Kaninchen an vier verschiedenen Stellen intramuskulär und 200 ul subkutan injiziert. Nach sechs Wochen wurde dein Tier eine Auffrischung mit 18 ug gereinigtem Inhibin nach der gleichen Injektionsmethode wie oben beschrieben verabreicht. Der Antikörpertiter im Kaninchenserum wurde aufgrund seiner Fähigkeit, an jodiertes Inhibin zu binden (genaueres siehe unten) bzw. seiner Fähigkeit, in vitro Inhibinaktivität zu neutralisieren, beurteilt. Der höchste Titer wurde zwei Wochen nach der Auffrischung (Probennahme in der achten Versuchswoche) beobachtet und sank nach 17-18 Wochen wieder auf das Niveau vor der Iminunisierung ab.
- Während der Immunisierung erhöhte sich das Hodenvolumen des Kaninchens von 3,0 auf 3,5 ml, was zeigte, daß eine Immunisierung gegen Inhibin das Gewicht der Gonaden, erhöhen kann, vermutlich aufgrund einer Neutralisierung von endogenem Inhibin, was den FSH- Spiegel steigen läßt.
- Wie oben beschrieben erhaltenes Kaninchen-Antiserum aus der achten Versuchswoche wurde auf seine Fähigkeit, in vitro Inhibinaktivität zu neutralisieren, geprüft. Als Inhibin-Standard im in vitro-Inhibin-Biotest wurde eine mit Aktivkohle behandelte Präparation von Rinderfollikelflüssigkeit verwendet (Scott et al., Endocrinology, 107, 1980, 1536). Es erwies sich, daß zur Neutralisierung einer Inhibindosis, die im Test eine Maximalantwort aufwies (2 Einheiten), 2 ul Antiserum ausreichten. Im Präimmunisierungsserum fand sich keine solche neutralisierende Aktivität. Ein weiteres Kaninchen wurde anfänglich mit einer weniger reinen Inhibinpräparation (340 ug erhalten nach Aufreinigung mittels RP-HPLC) immunisiert, wobei die Auffrischungsdosis 22 ug reines Inhibin betrug.
- Zur anfänglichen Immunisierungsinjektion wurde komplettes Freundsches Adjuvans verwendet, wobei die Immunisierungsmethode nach Vaitukaitas et al. (Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 33, 1971, 988) angewandt wurde, während das Verfahren bei der Auffrischung wie oben beschrieben war. Antiserum (Versuchswoche 9) aus diesem Tier war ebenfalls in vitro zur Neutralisierung befähigt.
- Gereinigte Inhibinpräparationen wurden entweder durch ein schonendes Chloramin-T-Verfahren oder durch Verwendung von Bolton-Hunter-Reaganz (Bolton und Hunter, Biochem J. 133 (1973) 529) auf eine spezifische Aktivität von 0,5 uCi/ug (1,85·10¹&sup0; Bg/ug) jodiert, wobei diese Aktivität durch eine Selbstverdrängungsmethode im unten beschriebenen Radioimmuntestverfahren bestimmt wurde. SDS-PAGE unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen ergab, daß das jodierte Material das gleiche scheinbare Molekulargewicht aufwies wie das nicht jodierte Molekül. Mit dem jodierten Tracer wurde ein Radioimmuntestverfahren entwickelt, in dem zur Trennung von jodiertem, an den Antikörper gebundenem bzw. nicht gebundenem Hormon eine zweite Antikörperfällung mit Polyethylenglycol durchgeführt wurde (Peterson, M.A. und Swerdloff, R.S.: Clin. Chem. 25 (1979) 1239-1241). Sowohl für gereinigte als auch für nicht fraktionierte ROFF- Präparationen wurden typische Verdrängungskurven erhalten. Die Dosis-Effekt-Kurve für das gereinigte Material wies eine Empfindlichkeit (ED&sub1;&sub0;) von 2 ng/Röhrchen auf, wobei die ED&sub5;&sub0; 25 ng/Röhrchen betrug. Die Dissoziationskonstante der Wechselwirkung zwischen Inhibin und Antikörper betrug 4,5·10&supmin;¹&sup0;M bei 20ºC.
- Es wurde bereits gezeigt, daß Rohextrakte von Rinder-Follikelflüssigkeit eine ovulationshemmende Wirkung ausüben. Die Hemmung kann mittels FSH vollständig aufgehoben werden (L. Cummins, Doktorarbeit, 1983, University of New England (Armidale)).
- Mäusen im 5.-7. Trächtigkeitstag wurden subkutan um 9 h 1,5 ug Inhibin und anschließend 10 IE HCG um 18 h verabreicht. Am folgenden Morgen wurde die Anzahl der Eier in der Ampulla des Eileiters ermittelt. Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, wirkte die Verabreichung von Inhibin in größerem Ausmaß ovulationshemmend. Tabelle 1 Probe Anzahl Tiere Anzahl Eier in Ampulla Kontrolle (nur Lösungsmittel) Gereinigtes Inhibin* * - Reinheitsgrad der Inhibinpräparation 75% gemäß Intensität der Siberfärbung auf SDS-PAGE. Die Verunreinigungen bestehen aus Material mit einem höheren Molekulargewicht (MG 65-70 kD), das im in vitro-Inhibin-Biotest biologisch nicht aktiv ist. Ungefähre Dosis 1,5 ug Protein/Tier. ** - Enthält 20 ug Inhibin/ml gemäß in vitro-Inhibin-Biotest.
- Sowohl gereinigtes Inhibin als auch 100 ul ROFF hatten eine im Vergleich zur Kontrolle signifikante ovulationshemmende Wirkung (p < 0,01 bzw. p < 0,05 im Wilcoxon-Test).
- Ein Kaninchen wurde wie oben in Beispiel 5 beschrieben immunisiert und anschließend wurde noch zweimal eine Auffrischung mit gereinigtem Inhibin verabreicht. Das so erhaltene Antiserum neutralisiert Inhibinaktivität im in vitro-Biotest. Es ist zu erwarten, daß das Antiserum in vivo im Kreislauf befindliches Inhibin neutralisiert, was zu größeren Mengen an im Kreislauf befindlichem FSH führt. Der Anstieg und Abfall des FSH- Spiegels im Kaninchenplasma war in Übereinstimmung mit dem Inhibin-Antikörpertiter im Kaninchenserum. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 Wochen nach Auffrischung Anzahl Serumproben Antikörpertiter* Plasma-FSH in ng/ml * - Reziprokwert der zur Neutralisierung von 1,5 E Inhibin im in vitro-Inhibin-Biotest benötigten Antiserummenge (ul). a i.Vgl.z. c; a i.Vgl.z. b und c; p < 0,05
- Es ist zu erwarten, daß gereinigtes Inhibin im Kreislauf befindliches FSH innerhalb von 4-8 Stunden nach der Verabreichung blockiert, wie im unterstehenden Versuch mit Schaffollikelflüssigkeit zu sehen ist. Inhibin (Rinderfollikelflüssigkeit) wurde über die Jugularvene in den Blutkreislauf von 34 Tage alten männlichen Ratten, die 3 Tage zuvor kastriert worden waren, verabreicht, und die Plasma-FSH-Spiegel wurden 5 Stunden später im FSH-Radioimmuntest bestimmt.
- Mit steigenden Dosen Rinderfollikelflüssigkeit wurde ein signifikantes dosisabhängiges Absinken des FSH- Spiegels beobachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Tabelle 3 Probe Anzahl Tiere Plasma als Prozentsatz des vor der Injektion ermittelten Spiegels Kontrolle (nur Lösungsmittel) * - Enthält 20 ug Inhibin/ml gemäß in vitro-Inhibin-Biotest. a i.Vgl.z. b; b i.Vgl.z. c; c i.Vgl.z. d p ≤ 0,05
- Es wurde gefunden, daß Inhibinaktivität aus Schaffollikelflüssigkeit auf übliche Weise wie ROFF- Inhibin unter Verwendung der oben beschriebenen Reinigungsschritte A, B und C aufgereinigt werden kann. Seine Eigenschaften nach den Schritten D und E ähneln denjenigen von ROFF-Inhibin. Daraus läßt sich nun der Schluß ziehen, daß sich die Aufreingungsschritte A bis E auf andere Säugetierinhibine inklusive Humaninhibin übertragen lassen.
- Da FSH eine wichtige Rolle bei der Stimulierung der Eierstock- und Hodenfunktion spielt, sind die wichtigsten Hauptanwendungsgebiete von gereinigtem Inhibin dessen Fähigkeit, spezifisch FSH-Sekretion zu hemmen, oder dessen Verwendung als Antigen, insofern als Immunisierung gegen Inhibin die Produktion von Antikörpern zur Folge hat, die fähig sind, endogen vorkommendes Inhibin zu neutralisieren, wodurch der FSH-Spiegel angehoben wird. Mittels einer großen Zahl von in vivo-Untersuchungen mit rohen oder teilweise aufgereinigten Extrakten von Gonadengeweben oder -flüssigkeiten wurde versucht, Wirkungsweise und Physiologie von Inhibin zu erforschen. Zu den bei diesen Versuchen dem Inhibin oder Antikörpern gegen Inhibin zugeschriebenen, aber nicht bewiesenen Wirkungen zählen unter anderem:
- 1. Hemmung der Gonadenfunktion (Moudgal et al., 1985 in Gonadal Proteins and Peptides and their Biological Significance (Hrsg. Sairam), World Scientific Publishing, Singapore (im Druck)).
- 2. Erhöhung der Ovulationsrate (Henderson et al., J. Endocrinol. 102, (1984) 305; Cummins et al., Proc. Aust. Soc. Reprod. Biol. 15 (1983) 81).
- 3. Vorverlegung des Pubertätsbeginns (al Obaidi et al., Proc. Aust. Soc. Reprod. Biol. 15 (1983) 80).
- Die bekannten Eigenschaften von Inhibin und FSH deuten auf eine Reihe von möglichen Anwendungszwecken für das gereinigte Inhibin und Antikörper gegen Inhibin gemäß der vorliegenden Erfindung hin:
- (i) Erhöhung der Ovulationsrate: Es ist eine anerkannte Tatsache, daß FSH die Entwicklung von Eiern in Säugetierovarien stimuliert (Ross et al., (1981) in Textbook of Endocrinology, Hrsg. Williams, S. 355) und daß übermäßige Stimulierung der Eierstöcke mit FSH zu Mehrfachovulationen führt (Gemzell, Introduction of Ovulation with human gonadotropins, Recent Prog. Hormone Res. 21 (1965) 179). Es wurde gezeigt, daß Inhibin FSH sowohl in vitro als auch in vivo blockiert und daß Inhibin als Immunogen zur Produktion von neutralisierenden Antikörpern gegen Inhibin verwendet werden kann. Die Immunisierung von Säugetieren, wie z. B. Rindern und Schafen, mit der aufgereinigten Inhibinpräparation und einem geeigneten Adjuvans führt zur Entwicklung von Antikörpern in immunisierten Tieren. Diese Antikörper neutralisieren die tiereigene Inhibinproduktion und beseitigen dadurch die FSH-sekretionsblockierende Wirkung. Die resultierende Steigerung des FSH-Spiegels führt zu einer erhöhten Stimulierung der Follikelentwicklung im Eierstock, wobei es zu einer Erhöhung der Ovulationsrate kommt.
- Durch die Gewinnung von Serum aus gegen Inhibin immunisierten Tieren wird auch ein Antiserum erhalten, das zur passiven Immunisierung anderer Tiere verwendet werden kann. In diesem Verfahren neutralisiert ein als Injektion verabreichtes Inhibinantiserum das tiereigene Inhibin und führt daher zu einer Erhöhung des FSH-Spiegels und zu den ovulationsstimulierenden Folgeerscheinungen. Sowohl passive als auch aktive Immunisierungsverfahren können zur Erhöhung der Ovulationsrate verwendet werden.
- Die Möglichkeit, Inhibin zur aktiven Immunisierung zu Erreichung von Gonadenwachstum zu verwenden, wird durch die Vergrößerung der Hodengröße des während Immunisierung gegen Inhibin untersuchten Kaninchens veranschaulicht (Beispiel 5).
- (ii) Hemmung der Eierstock- und Hodenfunktion: Die anerkannte wichtige Bedeutung von FSH bei der Stimulierung von Follikelentwicklung im Eierstock und Spermenproduktion in den Hoden (Ross et al., (1981) in Textbook of Endocrinology, Hrsg. Williams, S. 355; Bardin und Paulsen, (1981), The Testes, in Textbook of Endocrinology, Hrsg. Williams, S. 293) weist auf die mögliche Rolle hin, die Inhibin bei der Blockierung der Gonadenfunktion spielt. Es ist zu erwarten, daß die Verabreichung von Inhibin zu einer Blockierung der Eierstock- und Hodenfunktion sowie zu einer Fruchtbarkeitsstörung führt. Diese Wirkung von Inhibin kann bei männlichen und weiblichen Vertretern beim Menschen sowie bei Schaf- und Rinderarten Verwendung finden und ist vermutlich auf andere Arten anwendbar.
- (iii) Vorverlegung des Beginns der Fruchtbarkeit: Eine anerkannte Tatsache ist, daß eines der frühesten Ereignisse am Beginn der Pubertät ein Anstieg des FSH-Spiegels ist, der zu einer Stimulierung von Eierstöcken und Hoden führt (Ross et al., (1981) in Textbook of Endocrinology, Hrsg. Williams, S. 355; Bardin und Paulsen, (1981), The Testes, in Textbook of Endocrinology, Hrsg. Williams, S. 293). Es besteht eine Möglichkeit, daß eine Immunisierung von sexuell unreifen Säugetieren gegen Inhibin mittels aktiver oder passiver Methoden zu einem verfrühten Beginn der Pubertät mit der damit verbundenen Stimulierung der Eierstock- und Hodenfunktion führt.
- Die Fortpflanzungsleistung während der Lebensdauer von Haustieren wie z. B. Kühen, Schafen und Schweinen hängt vom Alter bei Pubertätsbeginn, den Zeiträumen zwischen den einzelnen Befruchtungen und der Möglichkeit eines anschließenden Versagens der Eierstöcke mit zunehmendem Alter ab. Eine Immunisierung von Jungtieren vor der Pubertät mit Inhibin, entweder durch aktive oder durch passive Immunisierung, neutralisiert die tiereigene Inhibinproduktion und führt zu einer Erhöhung des FSH-Spiegels. Diese Erhöhung des FSH-Spiegels induziert eine pubertäre Entwicklung vor dem Normal alter durch Stimulierung der Gonaden. Dieses Verfahren kann zur Induktion von Frühreife in männlichen oder weiblichen Säugetieren verwendet werden.
- Unterdrückung der Pubertät: Da FSH als Faktor von entscheidender Bedeutung beim Beginn der Pubertät anerkannt ist, kann die Verabreichung von Inhibin als Mittel zur Unterdrückung der Pubertät in unerwünschten Situationen, z. B. Frühreife bei Menschen, oder zur Verzögerung des Beginns der Pubertät verwendet werden.
- Inhibin läßt sich als Immunogen zur Produktion von Antiseren oder monoklonalen Antikörpern verwenden, die zur Entwicklung von Radioimmuntests oder ELISA-Tests zur Messung von Inhibin und zur Entwicklung von Immunadsorptionssäulen als Hilfsmittel bei der Aufreinigung von Inhibin verwendet werden können.
- (vi) Mit den oben beschriebenen Antiseren wurde ein Radioimmuntestsystem zur Messung von Inhibin entwickelt, das die Messung von Inhibin in biologischen Proben (z. B. Plasma, Serum oder Harn) ermöglicht, was mit dem vorbekannten in vitro- Biotestsytem von Scott et al. (1980) nicht möglich war. Die Inhibinspiegel in Plasma oder Serum sind ein Hinweis auf die Funktion der Sertoli- und Granulosazellen, was zur Diagnose des Fruchtbarkeitszustands verwendet werden kann.
- (vii) Es mag sein, daß die Verabreichung von Inhibin in hohen Dosen die Sekretion von LH hemmt. Die wäre ein weiterer Hinweis darauf, daß Inhibin zur Ovulationshemmung befähigt ist.
- Es versteht sich von selbst, daß die Erfindung in ihren allgemeinen Gesichtspunkten nicht auf die oben angeführten Einzelheiten beschränkt ist.
- Die folgenden Patentansprüche sind so zu verstehen, daß sie sich nicht auf die natürlich in ihrer komplexen natürlichen biologischen Umwelt vorkommenden Materialien erstrecken.
Claims (74)
1. Protein, nämlich Inhibin, dadurch gekennzeichnet,
daß
(a) sein scheinbares Molekulargewicht mittels SDS-PAGE
als 56 000 ± 1 000 bestimmt wurde;
(b) sich der isoelektrische Punkt in einem Bereich von
6,9-7,3 befindet;
(c) das Protein spezifisch an Concanavalin A-Sepharose
binden kann;
(d) das Protein aus zwei Untereinheiten besteht, die,
wie mittels SDS-PAGE nachgewiesen wurde, nach Reduktion
voneinander getrennt werden können und dadurch
gekennzeichnet sind, daß:
(i) ihre scheinbaren Molekulargewichte 44 000 ± 3 000
bzw. 14 000 ± 2 000 betragen;
(ii) sich der isoelektrische Punkt der Untereinheit
mit Molekulargewicht 44 000 im Bereich von
6,0-7,0 befindet; und
(iii) die N-terminalen Aminosäurensequenzen der
beiden Untereinheiten sind:
Rest 44 kD-Untereinheit
(e) das Protein das follikelstimulierende Hormon, jedoch
nicht das luteinisierende Hormon, das thyreotrope Hormon
oder Prolactin im in vitro Biotestsystem blockieren kann;
und
(f) das Protein mit radioaktivem Jod markiert werden
kann.
2. Protein nach Anspruch 1, das einen Reinheitsgrad
von 75% aufweist.
3. Protein nach Anspruch 1 oder 2, gewonnen aus der
Ovarialfollikelflüssigkeit von Säugetieren.
4. Proteinartiges Material, das durch die folgenden
Eigenschaften einer Inhibin-Untereinheit gekennzeichnet
ist:
(a) Sein scheinbares Molekulargewicht beträgt 14 000 ± 2 000 und
(b) seine N-terminale Aminosäuresequenz ist:
Rest
2 Leu
3 Glu
4 -5 Asp
6 Gly
7 Lys
8 Val
9 Asx
10 Ile
11
12 -13 Lys
14 Lys
5. Proteinartiges Material, das durch die folgenden
Eigenschaften einer Inhibin-Untereinheit gekennzeichnet
ist:
(a) Sein scheinbares Molekulargewicht beträgt 44 000 ± 3 000,
(b) sein isoelektrischer Punkt befindet sich im Bereich
von 6,0 bis 7,0,
(c) seine N-terminale Aminosäuresequenz ist:
Rest
2 Ala
3 Val
4 Gly
5 Gly
6 Phe
7 Met
8 Arg
9 Arg
10 Gly
11 Ser
12 Glu
13, Pro
14 Glu
15 Asp
16 Gln
(d) es kann als Antigen an Säugetiere verabreicht
werden, um Antikörper gegen das Protein Inhibin zu
produzieren, wodurch der Spiegel an
follikelstimulierendem Hormon in den Säugetieren angehoben
wird.
6. Proteinartiges Material, das die folgenden
Eigenschaften eines Fragments des Proteins Inhibin
aufweist:
(a) Das Material enthält, entweder ganz oder teilweise,
zumindest eine der in Anspruch 1 definierten
Untereinheiten, und
(b) es kann als Antigen an Säugetiere verabreicht
werden, um Antikörper gegen Inhibin zu produzieren, wodurch
der Spiegel des follikelstimulierenden Hormons in den
Säugetieren ansteigt.
7. Material nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet,
daß das Fragment die Produktion an follikelstimulierendem
Hormon blockieren kann, ohne dabei die Produktion von
luteinisierendem Hormon zu blockieren.
8. Material nach Anspruch 6 oder 7, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich um einen Teil der 44 000 ± 2 000
Untereinheit handelt.
9. Material nach Anspruch 6, 7 oder 8, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich um ein Glycoprotein handelt.
10. Derivat des Proteins Inhibin nach einem der
Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das
Derivat als Antigen an Säugetiere verabreicht werden
kann, um Antikörper gegen Inhibin zu produzieren, wodurch
der Spiegel des follikelstimulierenden Hormons in den
Säugetieren ansteigt.
11. Derivat des Proteins Inhibin nach Anspruch 10,
dadurch gekennzeichnet, daß das Derivat die Produktion
von follikelstimulierendem Hormon blockieren kann, ohne
dabei die Produktion an luteinisierendem Hormon zu
blockieren.
12. Derivat nach Anspruch 10 oder 11, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich um ein Protein handelt.
13. Derivat nach Anspruch 10 oder 11, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich um ein Glycoprotein handelt.
14. Homologes des Proteins Inhibin nach einem der
Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das
Homologe als Antigen an Säugetiere verabreicht werden
kann, um Antikörper gegen Inhibin zu produzieren, wodurch
der Spiegel des follikelstimulierenden Hormons in den
Säugetieren ansteigt.
15. Homologes nach Anspruch 14, dadurch
gekennzeichnet, daß es die Produktion an follikelstimulierendem
Hormon blockieren kann, ohne dabei die Produktion an
luteinisierendem Hormon zu blockieren.
16. Homologes nach Anspruch 14 oder 15, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich um ein Protein handelt.
17. Homologes nach Anspruch 14 oder 15, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich um ein Glycoprotein handelt.
18. Protein, Material, Derivat oder Homologes nach
einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß
es sich um ein Rinder- oder Schafprotein, -material, -derivat
oder -homologes oder um menschliches Protein,
Material, Derivat oder Homologes handelt.
19. Protein, Material, Derivat oder Homologes nach
einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß
es markiert ist.
20. Protein, Material, Derivat oder Homologes nach
Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß es radioaktiv
markiert ist.
21. Methode zur Gewinnung und Aufreinigung von
Inhibin aus einem inhibinhaltigen
Säugetier-Ausgangsmaterial, dadurch gekennzeichnet, daß man:
(a) Das Ausgangsmaterial einem ersten
Gelpermeationschromatographieschritt unterwirft, der ein erstes Eluat
ergibt,
(b) das erste Eluat einen zweiten
Gelpermeationschromatographieschritt unterwirft, der ein zweites Eluat
ergibt,
(c) das zweite Eluat einem Umkehrphasen-Hochdruck-
Flüssigkeitschromatographieschritt unterwirft, der ein
drittes Eluat ergibt,
(d) das dritte Eluat einem präparativen Polyacrylamid-
Gel-Elektrophoreseschritt unterwirft, wodurch eine
einzelne Hauptbande erhalten wird, und
(e) das Material der einzelnen Hauptbande auf die
Fähigkeit, die Produktion an follikelstimulierendem Hormon in
kultivierten Hypophysen-Vorderlappenzellen der Ratte zu
blockieren, ohne deren Produktion an luteinisierendem
Hormon zu hemmen, prüft.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch
gekennzeichnet, daß die spezifische Aktivität des ersten Eluats
mindestens 3mal größer ist als die spezifische Aktivität
des Ausgangsmaterials.
23. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch
gekennzeichnet, daß die spezifische Aktivität des zweiten Eluats
mindestens 10mal größer ist als die spezifische Aktivität
des Ausgangsmaterials.
24. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch
gekennzeichnet, daß die spezifische Aktivität des zweiten Eluats bis
zu 20mal größer ist als die spezifische Aktivität des
Ausgangsmaterials.
25. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch
gekennzeichnet, daß die spezifische Aktivität des zweiten Eluats bis
zu 50mal größer ist als die spezifische Aktivität des
Ausgangsmaterials.
26. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch
gekennzeichnet, daß die spezifische Aktivität des dritten Eluats bis
zu 160mal größer ist als die spezifische Aktivität des
Ausgangsmaterials.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 26,
dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem
Ausgangsmaterial um Follikelflüssigkeit handelt.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich beim Ausgangsmaterial um Rinder- oder
Schaffollikelflüssigkeit oder menschliche
Follikelflüssigkeit handelt.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 28,
dadurch gekennzeichnete daß Sephacryl S200 zur
Durchführung des ersten Gelpermeationschromatographieschritts
verwendet wird.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 29,
dadurch gekennzeichnet, daß das erste Eluat eine
Leervolumenfraktion aus dem
Gelpermeationschromatographieschritt enthält.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 30,
dadurch gekennzeichnet, daß zur Durchführung des zweiten
Gelpermeationschromatographieschritts eine
Gelpermeationsmatrix aus Sephadex G100 in Gegenwart einer
Säure, vorzugsweise 4 M Essigsäure, verwendet wird.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 31,
dadurch gekennzeichnet, daß der zweite
Gelpermeationschromatographieschritt auf einer analytischen Säule
durchgeführt wird.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 32, das
weiterhin dadurch gekennzeichnet ist, daß die
Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit einem
Säulenmaterial au- chemisch gebundener
N-Alkyl-Kieselsäure durchgeführt wird.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 33, das
weiterhin dadurch gekennzeichnet ist, das aus dem
präparativen Polyacrylamid-Gel ein inhibinhaltiges Gelstück
isoliert wird und das im Gelstück enthaltene Inhibin
elektrophoretisch eluiert wird.
35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch
gekennzeichnet, daß die elektrophoretische Elution die
folgenden Schritte umfaßt:
(a) Waschen des Gelstücks mit einem Elutionspuffer;
(b) Quellen des Gelstücks in einem mit einem
Elutionspuffer überschichteten "Soaking"-Puffer,
(c) Initiieren der elektrophoretischen Elution des
Gelstücks,
(d) Ersetzen des Elutionspuffers mit einem
Dialysepuffer,
(e) Fortsetzen der elektrophoretischen Elution des
Gelstücks, bis das Inhibin aus dem Gelstück gewandert
ist, und
(f) Gewinnung des Inhibin.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 35,
dadurch gekennzeichnet, daß der Reinheitsgrad des
gereinigten Inhibin hoch genug ist, um eine einzelne
Hauptbande in der nichtreduzierenden SDS-PAGE zu
erhalten.
37. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern, die
spezifisch für wie in Anspruch 1 definiertes Inhibin
sind, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Säugetier mit
einer wirksamen Menge eines Präparats eines wie in einem
der Ansprüche 1 bis 6 definierten Materials in
Kombination mit einem Adjuvans immunisiert.
38. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch
gekennzeichnet, daß es weiterhin folgende Schritte umfaßt:
(a) Lösen des Inhibin in einem Puffer,
(b) Emulgieren des im Puffer gelösten Inhibin mit einem
Adjuvans, so daß eine Emulsion erhalten wird, und
(c) Injizieren eines Säugetiers mit dieser Emulsion.
39. Verfahren nach Anspruch 37 oder 38, dadurch
gekennzeichnet, daß man weiterhin besagte Antikörper
enthaltendes Antiserum aus dem Säugetier isoliert.
40. Antiserum, dadurch gekennzeichnet, daß es
Antikörper enthält, die spezifisch für wie in Anspruch 1
definiertes Inhibin sind, wobei das Antiserum nach dem
Verfahren eines der Ansprüche 37 bis 39 hergestellt wird.
41. Antiserum nach Anspruch 40, dadurch
gekennzeichnet, daß es Inhibinaktivität in vitro neutralisiert.
42. Verfahren zur Herstellung von monoklonalen
Antikörpern, die spezifisch für Inhibin sind, dadurch
gekennzeichnet, daß die monoklonalen Antikörper mit dem
nach einem der Ansprüche 1 bis 3 definierten Protein oder
mit dem nach einem der Ansprüche 4 bis 6 definierten
proteinartigen Material hergestellt werden.
43. Nach dem Verfahren von Anspruch 42 erhaltene
Antikörper.
44. Monoklonale Antikörper, die an eine
immunologische Determinante von wie in Anspruch 1 definiertem
Inhibin binden.
45. Testverfahren für in einer Probe befindliches
Inhibin, bestehend aus einer Radioimmuntestmethode,
dadurch gekennzeichnet, daß man ein radioaktiv markiertes
Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und einen
Antikörper gegen Inhibin verwendet.
46. Nachweis- und Diagnoseverfahren für
Unfruchtbarkeit in einem Säugetier, dadurch gekennzeichnet, daß man
die in Anspruch 45 definierte Radioimmuntestmethode für
den Inhibintest in einer aus dem Säugetier stammenden
Probe verwendet.
47. Verwendung einer wirksamen Menge eines wie in
Anspruch 40 definierten Antiserums zur Herstellung einer
Zusammensetzung für die Immunisierung eines Säugetiers,
um die Fruchtbarkeit des Säugetiers zu erhöhen.
48. Verwendung des Proteins Inhibin nach einem der
Ansprüche 1 bis 3 in Kombination mit einem geeigneten
Adjuvans zur Herstellung einer Zusammensetzung für die
Immunisierung eines Säugetiers, um die Fruchtbarkeit des
Säugetiers zu erhöhen.
49. Verwendung eines Verfahrens nach Anspruch 37 zur
Herstellung einer Zusammensetzung für die Immunisierung
eines nicht geschlechtsreifen Säugetiers, um die
Geschlechtsreife vorzuverlegen.
50. Verwendung eines nach Anspruch 40 definierten
Antiserums zur Herstellung einer Zusammensetzung, die
einem nicht geschlechtsreifen Säugetier zur Vorverlegung
der Geschlechtsreife des nicht geschlechtsreifen
Säugetiers injiziert wird.
51. Verwendung einer wirksamen Menge des Proteins
Inhibin nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung
einer Zusammensetzung zur Blockierung oder Verzögerung
des Beginns der Geschlechtsreife bei einem Säugetier.
52. Verwendung des Proteins Inhibin nach einem der
Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung einer Zusammensetzung,
die einem Säugetier zur Unterbindung der Gonadenfunktion
injiziert wird.
53. Verwendung des Proteins Inhibin nach einem der
Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung einer Zusammensetzung
zur Verzögerung des Beginns der Pubertät bei einem
Säugetier.
54. Verwendung des Proteins Inhibin nach einem der
Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung einer Zusammensetzung
zur Blockierung des Eisprungs bei einem weiblichen
Säugetier.
55. Verwendung des Proteins Inhibin nach einem der
Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung einer Zusammensetzung
zur Immunisierung eines weiblichen Säugetiers, um die
Ovulationsrate zu erhöhen.
56. Verwendung eines Antiserums nach Anspruch 40 zur
Herstellung einer Zusammensetzung zur Steigerung der
Ovulationsrate bei einem weiblichen Säugetier.
57. Verwendung des Proteins Inhibin nach einem der
Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung einer Zusammensetzung
zur Blockierung der Spermatogenese bei einem männlichen
Säugetier.
58. Zusammensetzung mit empfängnisverhütender Wirkung
bei einem Säugetier, bestehend aus einer wirksamen Menge
des Proteins Inhibin nach einem der Ansprüche 1 bis 3
zusammen mit einem pharmakologisch unbedenklichen Träger
oder Verdünnungsmittel.
59. Verwendung des Proteins Inhibin nach einem der
Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung einer
empfängnisverhütenden Zusammensetzung für Säugetiere.
60. Verwendung eines Antiserums nach Anspruch 40 zur
Herstellung einer Zusammensetzung zur Erhöhung des FSH-
Spiegels in einem Säugetier.
61. Verwendung des Proteins Inhibin nach einem der
Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung einer Zusammensetzung
zur Senkung des FSH-Spiegels in einem Säugetier.
62. Therapeutikum bestehend aus dem Protein Inhibin
nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zusammen mit einem
pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmittel.
63. Therapeutikum bestehend aus dem Protein Inhibin
nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zusammen mit einer
pharmazeutisch unbedenklichen Retardzusammensetzung.
64. Therapeutikum oder Diagnostikum bestehend aus
einem Antiserum nach Anspruch 40 zusammen mit einem
pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmittel.
65. Therapeutikum bestehend aus einem Antiserum nach
Anspruch 40 zusammen mit einer pharmazeutisch
unbedenklichen Retardzusammensetzung.
66. Verfahren zur Isolierung von Klonen, die alle
oder einige mittels rekombinanter DNS-Technik
hergestellten Gene exprimieren, dadurch gekennzeichnet, daß man ein
Antiserum nach Anspruch 40 verwendet.
67. Verfahren zum Nachweis von Inhibin-mRNS in
biologischen Proben, dadurch gekennzeichnet, daß man die
Aminosäuresequenzen des proteinartigen Materials nach
Anspruch 4 oder 5 verwendet.
68. Antiserum nach Anspruch 40 oder 41 oder
Antikörper gegen Inhibin nach Anspruch 43 oder 44, dadurch
gekennzeichnet, daß der Antikörper markiert wurde.
69. Diagnoseverfahren, dadurch gekennzeichnet, daß
man einen markierten Antikörper nach Anspruch 68
verwendet.
70. Inhibin-Radioimmuntest, dadurch gekennzeichnet,
daß man einen radioaktiv markierten Antikörper nach
Anspruch 68 verwendet.
71. Radioimmuntest nach Anspruch 45 oder 70, dadurch
gekennzeichnet, daß man einen zweiten
Antikörperfällungsschritt mit Polyethylenglycol durchführt.
72. ELISA-Test, dadurch gekennzeichnet, daß man das
Protein Inhibin nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in
enzymgekoppelter Form verwendet.
73. ELISA-Test, dadurch gekennzeichnet, daß man einen
Antikörper nach Anspruch 43 oder 44 verwendet, der nach
einer beliebigen vorbekannten Methode mit einem Enzym
gekoppelt wurde.
74. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch
gekennzeichnet, daß man vor dem zweiten
Gelpermeationschromatographieschritt das erste Eluat auf einen pH von 4,75
bringt.
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