DE3587531T2

DE3587531T2 - Automatisches Gerät für Zyklisierungsreaktionen sowie dieses benutzende automatische Analysegerät.

Info

Publication number: DE3587531T2
Application number: DE85303432T
Authority: DE
Inventors: Takahiko Kato; Yoshiyuki Suzuki
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 1984-05-15
Filing date: 1985-05-15
Publication date: 1994-01-13
Anticipated expiration: 2005-05-16
Also published as: JPS6212986B2; EP0171140A3; EP0171140A2; JPS60241884A; EP0171140B1; US4981801A; DE3587531D1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf eine enzymatische Zyklisierungstechnik zum Analysieren einer kleinen oder extrem kleinen Menge einer in einer Probe enthaltenen Substanz, und speziell auf ein automatisches Gerät für enzymatische Zyklisierungsreaktionen, und auf ein automatisches Analysengerät zum automatischen Analysieren einer kleinen oder extrem kleinen Menge einer Substanz in einer Probe mit Hilfe des automatischen Gerätes für enzymatische Zyklisierungsreaktionen.
Beispielsweise wird auf dem Gebiet der Biochemie eine kleine Menge einer in einer Probe enthaltenen Substanz gewöhnlich nachgewiesen mittels: einer Radioisotopenmethode, bei der die zu analysierende Substanz mit einem Radioisotop markiert wird und dann mit einem Szintillationszähler nachgewiesen wird; einer massenspektrometrischen Methode, bei der eine Substanz mit einem stabilen Isotop markiert wird und mit einem Massenspektrometer nachgewiesen wird; und einer immunologischen Methode, bei der eine Substanz unter Verwendung einer Antigen-Antikörper-Reaktion für die markierte Substanz nachgewiesen wird.
Bei der Radioisotopenmethode ist es erforderlich, ein Gerät vorzusehen, das die Sicherheitsnormen für das verwendete Isotop erfüllt, und außerdem muß eine sehr lästige Behandlung von Abfallmaterialien durchgeführt werden, um eine radioaktive Kontamination zu vermeiden. Weiterhin kann der Vorgang von der Radioaktivität abhängig sein. Bei der massenspektrometrischen Methode, bei der das stabile Isotop verwendet wird, sind die Substanzen, die mit den stabilen Isotopen markiert werden können, zahlenmäßig begrenzt, und daher kann nur eine geringe Anzahl von Substanzen getestet werden. Da ein Massenspektrometer verwendet wird, ist es außerdem erforderlich, die markierte Substanz zu verdampfen. Bei der immunologischen Methode gibt es einen Radioimmunotest, bei dem Radioisotopen-Indikatoren verwendet werden, und einen Fluoroimmunotest, bei dem fluoreszierende Indikatoren verwendet werden. Bei diesen Methoden ist es erforderlich, den Antikörper oder das Antigen zu markieren, die an der Antigen-Antikörper- Reaktion beteiligt sind. Bei dem Radioimmunotest treten die gleichen Probleme wie bei der Radioisotopenmethode auf.
Vor kurzem wurde eine enzymatische Zyklisierungsmethode vorgeschlagen, mit der eine sehr kleine Menge einer Substanz in einer Probe analysiert werden kann, ohne die oben erwähnten Probleme der radioaktiven Kontamination, der Begrenzung der Anzahl der Testsubstanzen, usw. zu verursachen. Bei der enzymatischen Zyklisierungsmethode wird eine Substanz in einer vervielfachenden Weise durch Kombination von zwei Enzymreaktionen gemessen. Heutzutage werden die folgenden drei Arten von Zyklisierungsreaktionen als Routinetests durchgeführt: Name Vervielfachendes Substrat (Coenzym) Zyklisierungsreaktions-Enzym Überschüssiges Substrat Vervielfachtes Produkt Maximale Vervielfachungsrate pro Stunde NAD-Zyklisierung Alkoholdehydrogenase Malatdehydrogenase Äthanol Oxalacetat Qcetaldehyd Malat* Glucose-6-P-hydrogenase Glutamatdehydrogenase Glucose-6-P α-Ketoglutarat 6-P-Gluconat* Glutamat Phosphotransacetylase Citratsynthase Acetyl-P Oxalacetat Phosphat Citrat* Die durch * gekennzeichneten Substanzen werden mit einem Indikator zur Reaktion gebracht, und die dann erhaltenen, fluoreszierenden Substanzen, wie beispielsweise NADH und NADPH werden gemessen. 1) Malat + NAD&spplus; Malatdhydrogenase Oxalacetat + NADH + H&spplus; 2) 6-P-Gluconat + NADP&spplus; 6-P-Gluconatdehydrogenase Ribulose-5-P + NADPH + H&spplus; 3) Citrat Aconitase Cis-Aconitat Aconitase Isocitrat, Isocitrat + NADP&spplus; Aconitase Isocitratdehydrogenase α-Ketaglutarat + CO&sub2; + NADPH + K&spplus;
Nachstehend wird das Prinzip der Zyklisierungsreaktion erklärt, wobei auf die typische NAD-Zyklisierung Bezug genommen wird. Bei der NAD-Zyklisierung werden Malat und Acetaldehyd in einer vervielfachenden Weise durch die folgende Reaktion erzeugt: Äthanol Acetaldehyd Alkoholdehydrogenase NAD&spplus; NADH Malatdehydrogenase **←Oxalacetat ** Das Malat wird nach Zugabe eines Indikatorreagens mit einem Fluorometer gemessen.
Zunächst werden zu einem Gemisch aus überschüssigen Mengen Äthanol und Oxalacetat zwei verschiedene Enzyme hinzugegeben, nämlich Alkoholdehydrogenase und Malatdehydrogenase von bestimmter Konzentration, um ein zyklisierendes Gemisch zu bilden. Zu dem so gebildeten zyklisierenden Gemisch wird eine sehr kleine Menge NAD&spplus; (Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid vom Oxydationstyp), das eine Art eines Coenzyms ist, zugegeben.
Dann wird ein NAD&spplus;-Molekül durch die katalytische Wirkung der Alkoholdehydrogenase unter Verwendung des Äthanols als Substrat reduziert, wobei ein Molekül Acetaldehyd und ein Molekül NADH erzeugt werden. Dann wird ein Molekül des so erzeugten NADH durch die katalytische Wirkung der Malatdehydrogenase unter Verwendung des Oxalacetats als Substrat oxydiert, wobei eine Molekül NAD&spplus; und ein Molekül Malat erzeugt werden. Wenn die Zyklusreaktion 1.000 Mal wiederholt wird, werden daher 1.000 Moleküle Acetaldehyd und Malat erzeugt, obwohl die anfängliche Flüssigkeit nur ein Molekül NAD&spplus; enthält.
Zu dem Gemisch, das das gemäß dem vervielfachenden Modus erzeugte Acetaldehyd und Malat enthält, werden eine überschüssige Menge NAD&spplus; und eine bestimmte Menge Malatdehydrogenase zugegeben, um die folgende Indikatorreaktion hervorzurufen: Malat + NAD&spplus; Malatdehydrogenase Oxalacetat + NADH + H&spplus;
Auf diese Weise wird das akkumulierte oder vervielfachte Malat quantitativ in fluoresziernde NADH umgewandelt. Durch Messen der Intensität des von dem erregten NADH ausgesandten Fluoreszenzlichts ist es daher möglich, eine sehr kleine Menge NAD&spplus; in einer Probe mit Hilfe einer Eichkurve zu messen, die die Beziehung zwischen der Intensität des Fluoreszenzlichts und der NAD&spplus;-Konzentration wiedergibt. Bei der NAD-Zyklisierung wird gleichzeitig NADH auf die vervielfachende Weise erzeugt. Daher kann NADH auf die gleiche Weise wie oben erklärt gemessen werden.
Bei der NADP-Zyklisierung und der CoA-Zyklisierung wird die vervielfachende Reaktion auf die gleiche Weise, wie dies oben erklärt wurde, ausgeführt.
Mittels der enzymatischen Zyklisierungsmethode ist es auch möglich, Substanzen zu messen, die in das vervielfachende Substrat, wie beispielsweise NAD&spplus;, NADH, NADP und CoA transferiert werden können. Zum Beispiel kann eine sehr kleine Menge Äthanol, die in einem Blutserum enthalten ist, auf die folgende Weise gemessen werden: Zunächst wird das Äthanol in der Serumprobe in Gegenwart einer überschüssigen Menge NAD&spplus; gemäß der folgenden Transferreaktion quantitativ in NADH transferiert, wobei Alkoholdehydrogenase als Katalysator verwendet wird:
Als nächstes wird die Lösung auf beispielsweise 70ºC erhitzt, wobei der pH-Wert der Lösung auf 11 bis 12 eingestellt wird. Während dieser Behandlung wird das in der Lösung verbliebene NAD&spplus; zerstört. Dann wird die oben erklärte NAD-Zyklisierungsreaktion ausgeführt, wobei die in der Lösung verbliebene NADH als vervielfachendes Substrat verwendet wird. Auf diese Weise kann eine sehr kleine Menge Äthanol nach der enzymatischen Zyklisierungsmethode genau gemessen werden.
Die meisten Substanzen aus lebenden Körpern, oder die meisten Substanzen, die durch Enzymreaktionen in lebenden Körpern erzeugt werden, können bei den Zyklisierungsreaktionen in vervielfachende Substrate transferiert werden, und daher ist die enzymatische Zyklisierungsmethode sehr gut geeignet zum Messen verschiedener Substanzen unter Verwendung der Spezifizitäten verschiedener enzymatischer Reaktionen.
Heutzutage wird die enzymatische Zyklisierungsmethode verwendet, um verschiedene Substanzen zu analysieren, wie zum Beispiel Glycide und ihre intermediären Metaboliten, Aminosäuren und die damit zusammenhängenden Substanzen, einige Arten von Lipiden (Glycid · Phospholipid), und mit Nukleotiden zusammenhängende Substanzen, und um den Enzymtest für verschiedene Arten von mit dem Stoffwechsel zusammenhängenden Enzymen auszuführen. Zum Beispiel ist es bei der Analyse einer bei einer schwangeren Frau extrahierten Amnionflüssigkeit möglich, angeborene Stoffwechselstörungen des Fötus, wie beispielsweise die Krabbe-Krankheit, Galaktosämie, GM1-Gangliosidose und die Fabry-Krankheit zu diagnostizieren.
Wenn, wie oben erklärt wurde, die Transferreaktionen zum Transferieren der zu analysierenden Substanzen in die vervielfachenden Substrate (Coenzym) verwendet werden, kann die enzymatische Zyklisierungsmethode die Messung von extrem kleinen Mengen von Substanzen gemäß dem vervielfachenden Modus ermöglichen. Daher kann die enzymatische Zyklisierungsmethode nicht nur in der Biochemie und der Medizin, sondern auch in der Biologie im weiteren Sinne angewandt werden, einschließlich der Biochemie, der Physiologie und der Zellbiologie, der Pharmakologie, der Agrikulturchemie und der chemischen Analyse. Auf medizinischem Gebiet ist es infolge der extrem kleinen Probenmenge möglich, nicht nur verschiedene Krankheiten des Fötus, sondern auch verschiedene Krankheiten des Neugeborenen und des Säuglings zu diagnostizieren. Außerdem kann die enzymatische Zyklisierungsmethode in der Gerichtsmedizin und der Pathologie verwendet werden. Da bei der Verwendung in der Biologie, der Pharmakologie und der Agrikulturchemie bestimmte Substanzen quantitativ und qualitativ analysiert werden können, ist es möglich, verschiedene Zellen, wie beispielsweise Mikroorganismen, gezüchtete Zellen und lebendes Gewebe nacheinander zu analysieren, und so die Qualität bestimmter Zellen gründlich zu untersuchen. Auf dem Gebiet der analytischen Chemie können in der organischen Chemie extrem kleine Probenmengen genau analysiert werden.
Bisher wurde die oben erklärte enzymatische Zyklisierungsmethode manuell ausgeführt. Dabei wird zunächst eine bestimmte Probenmenge (vervielfachendes Substrat) und eine Teilmenge eines Zyklisierungsreaktions-Enzyms und eine überschüssige Menge eines Substrats in ein Reaktionsgefäß, wie beispielsweise ein Reagenzglas gegeben. Bis eine bestimmte Anzahl von Proben in Reaktionsgefäße gegeben ist, werden die Reaktionsgefäße in einen ersten Thermostaten getaucht, der auf einer Temperatur von beispielsweise -30ºC gehalten wird, bei der die Zyklisierungsreaktion nicht abläuft. Wenn eine bestimmte Anzahl von Proben in die Reaktionsgefäße gegeben ist, werden die Reaktionsgefäße in einen zweiten Thermostaten eingebracht, der auf einer Temperatur von beispielsweise 25ºC gehalten wird, bei der die Zyklisierungsreaktion abläuft. Die Zeiten, zu denen bestimmte Reaktionsgefäße in den zweiten Thermostaten eingebracht werden, werden manuell aufgezeichnet. Wenn eine bestimmte Zyklisierungsreaktions-Dauer für ein Reaktionsgefäß verstrichen ist, wird das betreffende Reaktionsgefäß während zwei oder drei Minuten in einen dritten Thermostaten eingebracht, der auf einer Temperatur von beispielsweise 100ºC gehalten wird, bei der die Zyklisierungsreaktion infolge der Veränderung der Enzyme abgebrochen wird. Dann wird das Reaktionsgefäß in einen vierten Thermostaten eingebracht, der auf einer Temperatur von beispielsweise 38-40ºC gehalten wird, bei der die Indikatorreaktion abläuft und es wird ein Indikatorreagens in das Reaktionsgefäß gegeben. Wenn die Indikatorreaktion während einer vorgegebenen Zeitdauer stattgefunden hat, wird die in dem Reaktionsgefäß enthaltene Flüssigkeit in ein Fluorometer gegeben und durch Strahlung von bestimmter Wellenlänge erregt, damit sie Fluoreszenzlicht aussendet. Dann wird die Intensität des ausgesandten Fluoreszenzlichts gemessen. Dabei ist anzumerken, daß bei der CoA-Zyklisierung nach Ablauf der vorgegebenen Indikatorreaktionsdauer, aber vor der Fluorometrie eine bestimmte Menge Pufferlösung in das Reaktionsgefäß gegeben wird.
Bei der enzymatischen Zyklisierungsmethode sind die Temperatur und die Dauer der Zyklisierungsreaktion wichtige Faktoren, die die Menge einer akkumulierten Substanz, wie beispielsweise Malat bestimmen. Zum Beispiel wird bei der NAD-Zyklisierung im allgemeinen die folgende Beziehung erhalten:
P = kcCt
wobei C die Summe der NAD&spplus; und der NADH-Konzentration, t die Reaktionsdauer, P die Konzentration des akkumulierten Maleats, und kc die Zyklisierungsrate ist. Es ist offensichtlich, daß die Menge Maleat proportional zu der Reaktionsdauer t ist. Außerdem kann die Zyklisierungsrate kc wie folgt ausgedrückt werden:
kc = kakb/kakb
wobei ka ein primärer Reaktionskoeffizient von Alkoholdehydrogenase bezüglich NAD&spplus;, und kb ein primärer Reaktionskoeffizient von Malatdehydrogenase bezüglich NADH ist. Da ka und kb proportional zu der Konzentration von Alkoholdehydrogenase bzw. Malatdehydrogenase sind, ist die Zyklisierungsrate kc ebenfalls proportional zu der Konzentration dieser Enzyme. Wenn jedoch die Enzymkonzentrationen in dem Zyklisierungsgemisch größer werden, läuft die Zyklisierungsreaktion nicht ab, da NAD&spplus; und NADH an die Enzyme gebunden werden. Bei der NAD-Zyklisierung läuft die Zyklisierungsreaktion in einem Temperaturbereich von 4 bis 25ºC ab, bei der NADP-Zyklisierung findet die Zyklisierungsreaktion in einem Temperaturbereich von 4 bis 38ºC statt, und bei der CoA-Zyklisierung wird die Zyklisierungsreaktion in einem Temperaturbereich von 4 bis 30ºC ausgeführt. Die maximalen Vervielfachungsraten pro Stunde von 60.000, 20.000 und 37.500 bei diesen Zyklisierungen werden bei 25ºC, 38ºC bzw. 30ºC erhalten. Wenn jedoch die Zyklisierungsreaktionen während mehr als drei Stunden bei diesen Temperatur ausgeführt werden, geht die Wirksamkeit der Enzyme verloren, wodurch die Vervielfachungsraten allmählich abnehmen. Zum Beispiel ist bei der NAD-Zyklisierung die Vervielfachungsrate pro Stunde bei 4ºC auf 17% der maximalen Vervielfachungsrate bei 25ºC vermindert, aber da die Enzyme bei 4ºC ihre Wirksamkeit nicht verlieren, wenn die Zyklisierungsreaktion während mehr als drei Stunden, beispielsweise während zwanzig Stunden ausgeführt wird, kann die Menge Maleat um den Faktor 200.000 vergrößert werden. Daher sind bei der Zyklisierungsreaktion die Reaktionstemperatur und die Rekationsdauer sehr wichtige Faktoren für die Vergrößerung der Menge der akkumulierten Substanz um einen gewünschten Faktor.
Wie oben erklärt wurde, wird bei der enzymatischen Zyklisierung der Vervielfachungsfaktor der akkumulierten Substanz überwiegend von der Reaktionstemperatur und der Reaktionsdauer bestimmt. Daher ist es erforderlich, bei der-bekannten manuellen Methode die Eintauchzeiten der einzelnen Reaktionsgefäße in den zweiten Thermostaten genau aufzuzeichnen, und nach Ablauf einer bestimmten Reaktionsdauer das Reaktionsgefäß sofort in den auf 100ºC gehaltenen, dritten Thermostaten einzubringen, um die Zyklisierungsreaktion abzubrechen. Dies ist mit viel Arbeit für die Bedienungsperson verbunden und kann unvermeidliche menschliche Fehler mit sich bringen. Daher ist es schwierig, sehr genaue und zuverlässige Analysenergebnisse zu erhalten.
Um die oben erwähnten Nachteile zu vermeiden, erschien es wünschenswert, ein Gerät zu entwickeln, um die enzymatische Zyklisierungsmethode leicht ausführen zu können. Bei einem solchen Gerät ist es erforderlich, die bei verschiedenen Temperaturen in den Reaktionsgefäßen enthaltenen Zyklisierungsreaktions-Flüssigkeiten zu steuern, und außerdem die Reaktionstemperatur und/oder Reaktionsdauer zu variieren, um eine gewünschte Vervielfachungsrate zu erhalten. Es wird angenommen, daß ein herkömmlicher biochemischer Analyzer so verändert wird, daß er die enzymatische Zyklisierung ausführt. Herkömmliche automatische Analyzer, wie diejenigen, die in den Patenten FR-2314491 und DE-1806585 beschrieben sind, weisen nur einen Thermostaten auf, der die Tanks auf einer konstanten, unveränderlichen Temperatur hält, und die Reaktionsgefäße werden mit einer bestimmten Vorschubgeschwindigkeit nacheinander durch den Thermostaten geführt. Wenn nur die Zuführungsgeschwindigkeit variabel gemacht wird und eine Vielzahl von auf verschiedenen Temperaturen gehaltenen Thermostaten vorgesehen wird, könnten sich verschiedene Probleme ergeben, da bei der enzymatischen Zyklisierung die Vervielfachungsrate über einen weiten Bereich variiert werden muß. Aus diesem Grund wurden ein automatisches Gerät für Zyklisierungsreaktionen, das die enzymatische Zyklisierungsmethode auf einfache und zuverlässige Weise automatisch ausführen kann, und ein automatisches Analysengerät, bei dem die enzymatische Zyklisierungsreaktion verwendet wird, bisher nicht vorgeschlagen.
Die vorliegende Erfindung hat zum Ziel, ein automatisches Gerät für Zyklisierungsreaktionen vorzuschlagen, bei dem eine enzymatische Zyklisierungsreaktion auf einfache und genaue Weise automatisch ausgeführt werden kann.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist, ein automatisches Gerät für Zyklisierungsreaktionen vorzuschlagen, bei dem die Verstärkungsrate, das heißt, die Zyklisierungsrate über einen weiten Bereich leicht eingestellt werden kann.
Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist, ein automatisches Analysengerät vorzuschlagen, mit dem eine extrem kleine Menge einer Substanz unter Verwendung der enzymatischen Zyklisierungsreaktion auf eine sehr genaue und zuverlässige Weise gemessen werden kann.
Gemäß der Erfindung weist das automatische Gerät für Zyklisierungsreaktionen auf: einen Drehtisch zur Aufnahme einer Vielzahl (z. B. bis zu mindestens 100) Reaktionsgefäßen längs seines Randes, wobei jedes dieser Gefäße eine bestimmte Menge einer Probe und eines Enzyme umfassenden Zyklisierungsgemischs enthält; einen Reaktionstank, in dem dieser Drehtisch angeordnet ist; eine Pumpe zum Umwälzen einer Thermostatflüssigkeit durch diesen Tank; und eine Vorrichtung zum Steuern der Temperatur der Thermostatflüssigkeit;
dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zum Steuern der Temperatur der Thermostatflüssigkeit und die Pumpe zur Ausführung der folgenden aufeinanderfolgenden Schritte dienen:
(1) Die Thermostatflüssigkeit wird während einer vorgegebenen Zeitdauer auf einer vorgegebenen Temperatur gehalten, wobei dies eine Temperatur ist, bei der die enzymatische Zyklisierungsreaktion nicht abläuft.
(2) Die Flüssigkeit wird rasch auf eine andere vorgegebene Temperatur erwärmt, wobei dies eine Temperatur ist, bei der die interessierende enzymatische Zyklisierungsreaktion abläuft, und diese Temperatur wird während einer weiteren vorgegebenen Zeitdauer aufrechterhalten.
(3) Die Flüssigkeit wird rasch auf eine weitere vorgegebene Temperatur erwärmt, wobei dies eine Temperatur ist, bei der die Zyklisierungsreaktion infolge des Verlustes der Wirksamkeit der Enzyme angehalten wird, und diese Temperatur wird während einer weiteren vorgegebenen Zeitdauer aufrechterhalten.
(4) Die Flüssigkeit wird rasch auf eine vorgegebene Temperatur abgekühlt, die niedriger als die Temperatur ist, bei der die Zyklisierungsreaktion angehalten wird.
Die Erfindung wird nun ausführlich beschrieben, wobei auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen wird, die Folgendes darstellen:
Die Fig. 1 ist eine schematische Ansicht, die eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen automatischen Analysengerätes wiedergibt.
Die Fig. 2 ist eine perspektivische Ansicht, die eine Außenansicht des in der Fig. 1 wiedergegebenen Gerätes veranschaulicht.
Die Fig. 3 ist ein Diagramm, das die Variation der Temperatur während der Analyse wiedergibt.
Die Fig. 4, 5 und 6 sind Flußdiagramme, die die Funktionsweise des in der Fig. 1 wiedergegebenen Gerätes erklären.
Die Fig. 7 ist eine perspektivische Ansicht, die eine andere Ausführungsform des erfindungsgemäßen automatischen Analysengerätes wiedergibt.
Die Fig. 8 ist eine Draufsicht, die eine Reaktionseinheit des in der Fig. 7 dargestellten Gerätes wiedergibt.
Die Fig. 9 ist eine perspektivische Ansicht, die einen Mechanismus zur Beförderung der Reaktionsgefäße wiedergibt.
Die Fig. 10 ist eine perspektivische Ansicht, die die Abgabedüsen wiedergibt.
Die Fig. 11 ist eine schematische Ansicht, die noch eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen automatischen Analysengerätes veranschaulicht.
Die Fig. 1 ist eine schematische Ansicht, die eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen automatischen Analysengerätes wiedergibt. Bei dieser Ausführungsform weist das Gerät nur einen Reaktionstank 1 auf, in dem eine Vielzahl von Reaktionsgefäßen 2 enthalten ist. Ein Thermostatmedium des Reaktionstanks 1 wird so gesteuert, daß es auf verschiedene Temperaturen gebracht wird, um eine Vielzahl von Flüssigkeiten in den Reaktionsgefäßen auf bestimmten Temperaturen zu halten. In dem Reaktionstank 1 ist ein Drehtisch 3 drehbar angeordnet, der hundert herausnehmbare Reaktionsgefäße 2 in Form von Reagenzgläsern aufnehmen kann, die in gleichen Abständen längs des Randes dieses Drehtischs 3 angeordnet sind. Der Drehtisch 3 weist eine obere Scheibe 3-1 und eine untere Scheibe 3-2 auf, die mit einer Antriebswelle eines Motors 4 verbunden sind. In der oberen Scheibe 3-1 sind hundert Löcher angebracht, in die die Reaktionsgefäße eingesetzt werden, bis ihr unteres Ende die untere Scheibe 3-2 berührt. Der Drehwinkel der Antriebswelle des Motors 4 wird von einem Drehgeber 5 gemessen. Aufgrund des gemessenen Drehwinkels wird der Drehtisch 3 schrittweise in der durch einen Pfeil angegebenen Richtung gedreht, und zwar um einen Schrittwinkel, der der Teilung der Löcher in der oberen Scheibe 3-1 entspricht. Der Reaktionstank 1 ist mit einem Thermostatmedium, wie beispielsweise einer Gefrierschutzflüssigkeit gefüllt, die über das Rohrs 6, die Umwälzpumpe 7, das Umschaltventil 8, die Heizeinrichtung 9 oder die Kühleinrichtung 10 durch den Reaktionstank umgewälzt wird. Das Rohr 6 ist von wärmeisolierendem Material umhüllt, und seine Einlaßöffnung 6-1 ist mit einer Seitenwand des Reaktionstanks 1 verbunden, während seine Auslaßöffnung 6-2 mit dem Boden des Reaktionstanks 1 verbunden ist, so daß die thermostatische Flüssigkeit in dem Reaktionstank 1 wirksam umgewälzt wird. In dem Reaktionstank 1 ist ein Temperaturfühler 11 angeordnet, der die Temperatur der Gefrierschutzflüssigkeit mißt. Dabei ist anzumerken, daß die Gefrierschutzflüssigkeit in dem Reaktionstank 1 ein solches Niveau aufweist, daß bei den Reaktionsgefäßen die Bereiche, die eine Flüssigkeit enthalten, genügend weit in die Gefrierschutzflüssigkeit eingetaucht sind.
Neben dem Reaktionstank 1 ist ein Arm 17 angeordnet, der durch einen Mechanismus 15 nach oben und unten bewegt werden kann, und durch einen Drehmechanismus 16 gedreht werden kann. An einem vorderen Ende des Arms 17 sind drei Düsen 18, 19 und 20 befestigt, die in ein Reaktionsgefäß eingeführt werden können, das bis zu einer Flüssigkeitsabgabeposition weiterbewegt wurde.
Bei einer außerhalb des Reaktionstanks 1 gelegenen Position ist ein Waschtank 21 angeordnet. Wenn der Arm 17 bis über den Waschtank 21 gedreht und dann abgesenkt wird, können die Düsen 18 bis 20 in den Waschtank 21 eingetaucht werden. Der Waschtank 21 ist über ein Ventil 22 mit einem Flüssigkeits-Abfalltank 23 verbunden. Ober dem Waschtank 21 sind zwei Düsen 24 und 25 angeordnet, wobei die Düse 24 über eine Pumpe 26 in Verbindung mit einem Waschflüssigkeitstank 27 steht, um eine Waschflüssigkeit in den Waschtank 21 einzuspritzen. Die andere Düse 25 ist mit einer Luftpumpe 28 verbunden, um einen Luftstrahl erzeugen zu können.
Die an dem Arm 17 befestigte Düse 18 steht über das Ventil 31, die Abgabespritze 32 und das Ventil 33 mit einem Indikatorreagenstank 34 in Verbindung. Durch Betätigung der Ventile 31, 32 und eines Spritzenantriebsmechanismus 35 ist es möglich, eine bestimmte Menge eines Indikatorreagens in ein Reaktionsgefäß 2 zu geben. Dabei ist anzumerken, daß eine Rohrleitung, die sich von dem Indikatorreagenstank 34 bis zu der Spitze der Düse 18 erstreckt, immer mit dem Indikatorreagens gefüllt ist. Die Düse 19 ist mit einer Luftpumpe 36 verbunden, um Luft aus der Düsenspitze herausblasen zu können. Die Düse 20 ist über eine Pumpe 37 und ein Fluorometer 38 mit einem Flüssigkeits-Abfalltank 39 verbunden, um nach der Indikatorreaktion eine Reaktionsflüssigkeit von dem Reaktionsgefäß 2 in das Fluorometer 38 zu befördern. Das Fluorometer 38 weist auf: eine Strömungszelle 38-1, in die die Reaktionsflüssigkeit befördert wird, eine Lichtquelle 38-2, ein Filter 38-3, um Licht von einer bestimmten Wellenlänge in die Strömungszelle eindringen zu lassen, ein Filter 38-4, um das Fluoreszenzlicht durchzulassen, und einen photoelektrischen Sensor 38-5, um das Fluoreszenzlicht nachzuweisen.
Bei dieser Ausführungsform sind zur Steuerung des Betriebs der verschiedenen Einheiten ein Hauptcomputer 41 und zwei an den Hauptcomputer 41 angeschlossene Subcomputer 42 und 43 vorgesehen. Unter der Führung durch den Hauptcomputer 41 steuert der Subcomputer 42 die Temperatur des Thermostatmediums, das heißt, der Gefrierschutzflüssigkeit in dem Reaktionstank 1, während der Subcomputer 43 die Drehbewegung des Drehtischs 3 und verschiedene andere, damit zusammenhängende Bewegungen steuert. Dazu wird das Ausgangssignal des Temperatursensors 11 auf den Subcomputer 42 gegeben, und der Subcomputer 42 steuert dann die Umwälzpumpe 7, das Umschaltventil 8, die Heizeinrichtung 9 und die Kühleinrichtung 10. Das Ausgangssignal des Drehgebers 5 wird auf den Subcomputer 43 gegeben, der dann den Motor 4, den Auf- und Abbewegungsmechanismus 15 und den Drehbewegungsmechanismus 16 für den Arm 17, das Ventil 22, die Pumpe 26, die Luftpumpe 28, die Ventile 31, 33, den Spritzenantriebsmechanismus 35, die Luftpumpe 36 und die Pumpe 37 steuert. Das Ausgangssignal des photoelektrischen Sensors 38-5 des Fluorometers 38 wird auf den Hauptcomputer 41 gegeben, der auf der Grundlage des erhaltenen Ausgangssignals bestimmte Berechnungen ausführt, um die Art und die Menge einer zu analysierenden Substanz zu bestimmen. An den Hauptcomputer 41 sind angeschlossen: eine Tastatur 44 zum Eingeben verschiedener Arten von Informationen, ein Diskettenlaufwerk 45 zum Speichern der eingegebenen Informationen, die sich auf den Analysenvorgang beziehen, und zum Lesen der gespeicherten Informationen, ein Drucker 46 zum Ausdrucken der Analysenergebnisse, und ein Monitor 47 zum Wiedergeben der verschiedenen Arten von Informationen, wie beispielsweise die eingegebenen Informationen und die Analysenergebnisse.
Die Fig. 2 ist eine perspektivische Ansicht, die das äußere Aussehen des in der Fig. 1 wiedergegebenen automatischen Analysengerätes veranschaulicht. Ein Hauptgerät 51 weist auf: eine Reaktionseinheit 52, eine Ausdruck- und Wiedergabeeinheit 53, eine Fluorometrie-Einheit 54, eine Steuereinheit 55, und eine Pumpeneinheit 56. Die Reaktionseinheit 52 weist auf: den Reaktionstank 1 und sein Temperatursteuersystem, den Drehtisch 3 und sein Antriebssystem, den Arm 17 und sein Antriebssystem, den Waschtank 21 und den Thermostaten 57, der auf 4ºC eingestellt wird, um zu verhindern, daß sich das in dem Indikatorreagenstank 34 enthaltene Indikatorreagens verändert. Die Temperatur des Thermostaten 57 wird durch die Kühleinrichtung 10 gesteuert, die auch verwendet wird, um die Temperatur des Reaktionstanks 1 zu steuern. Dabei ist anzumerken, daß die Öffnung des Reaktionstanks 1 mit einem abnehmbaren Deckel 58 bedeckt ist, mit Ausnahme eines Bereichs, bei dem die Düsen 18 bis 20 eingeführt werden. In ähnlicher Weise ist der Thermostat 57 mit einem abnehmbaren Deckel 59 bedeckt. Die Ausdruck- und Wiedergabeeinheit 53 weist, wie in der Fig. 1 veranschaulicht, den Drucker 46 und den Monitor 47 auf, und die Fluorometrie-Einheit 54 weist die Pumpe 37 und das Fluorometer 38 auf. Die Steuereinheit 55 weist den Hauptcomputer 41 und die Subcomputer 42, 43, die Tastatur 44, und das Disketten-Laufwerk 45 auf. Die Steuereinheit 55 weist weiterhin eine Starttaste 60 zum Starten des Analysenvorgangs auf. Die Pumpeneinheit 56 weist auf: die Düsenwaschpumpe 26 und die Luftpumpe 28, die Indikatorreagens-Abgabeventile 31, 33 und die Spritze 32, den Spritzenantriebsmechanismus 35, und die Luftpumpe 36, die mit der Düse verbunden ist, um den Inhalt eines Reaktionsgefäßes zu mischen.
Nachstehend wird die Funktionsweise des automatischen Analysengerätes erklärt, wobei die NAD-Zyklisierung als Beispiel gewählt wird.
Zunächst wird die Umwälzpumpe 7 eingeschaltet, und das Umschaltventil 8 zu der Kühleinrichtung 10 hin umgeschaltet. Danach wird die Kühleinrichtung 10 entsprechend dem Ausgangssignal des Temperaturfühlers 11 durch Ein- und Ausschalten so gesteuert, daß das Gefrierschutzmittel auf -30ºC gehalten wird. Dann wird eine bestimmte Anzahl von Reaktionsgefäßen 2 in den Drehtisch 3 eingesetzt, und zwar werden hundert Reaktionsgefäße eingesetzt, von denen jedes 1 ul einer Probe, und 50 ul eines Zyklisierungsgemischs enthält. Dies kann auf die folgende Weise ausgeführt werden: Vor dem Einfüllen der Proben werden 50 ul Zyklisierungsgemisch in alle Reaktionsgefäße gegeben, die durch Eis kalt gehalten werden, und dann werden hundert Proben, die NAD&spplus; enthalten, das von der zu analysierenden Substanz mittels einer Transferreaktion transferiert wurde, in hundert Probenbecher gegeben. Danach wird 1 ul jeder Probe von den Probenbechern nacheinander in die Reaktionsgefäße gegeben, und die Reaktionsgefäße werden der Reihe nach in den Drehtisch 3 eingesetzt.
Wenn die hundert Reaktionsgefäße, von denen jedes eine bestimmte Teilmenge der Probe und Zyklisierungsgemisch enthält, in den Drehtisch 3 eingesetzt sind, wird der Reaktionstank 1 mit dem Deckel 58 bedeckt und die Starttaste 60 gedrückt. Danach wird das Umschaltventil 8 zu der Heizeinrichtung 9 hin umgeschaltet, um die Gefrierschutzflüssigkeit zu erwärmen. Aufgrund des Ausgangssignals des Temperaturfühlers 11 werden das Umschaltventil 8, die Heizeinrichtung 9 und die Kühleinrichtung 10 so gesteuert, daß die Temperatur der Gefrierschutzflüssigkeit während einer Stunde auf 25ºC gehalten wird.
Die Fig. 3 ist ein Diagramm, das die Temperaturvariation des Reaktionstanks 1 wiedergibt. Wenn die Zyklisierungsreaktions-Dauer von einer Stunde abgelaufen ist, bleibt das Umschaltventil 8 zu der Heizeinrichtung 9 hin umgeschaltet, aber die Gefrierschutzflüssigkeit wird rasch erhitzt, wobei die Temperatur des Reaktionstanks 1 durch Steuerung des Ventils 8, der Heizeinrichtung 9 und der Kühleinrichtung 10 entsprechend dem Ausgangssignal des Temperaturfühlers 11 während drei Minuten auf 100ºC gehalten wird. Wenn die Zyklisierungsreaktions-Flüssigkeit bis auf 100ºC erwärmt wird, verlieren die in der Flüssigkeit enthaltenen Enzyme ihre Wirksamkeit, wodurch die Zyklisierungsreaktion abgebrochen wird.
Danach wird die Gefrierschutzflüssigkeit gekühlt, und der Reaktionstank 1 wird auf 38ºC gehalten, wie dies in der Fig. 3 veranschaulicht ist.
Danach wird 1,0 ml Indikatorreagens auf die folgende Weise in die aufeinanderfolgenden Reaktionsgefäße gegeben:
Der Arm 17 wird mittels des Auf- und Abbewegungsmechanismus 15 nach unten bewegt, wobei die Spitzen der Düsen 18 bis 20 in die Flüssigkeit eingetaucht werden, die in einem Reaktionsgefäß enthalten ist, das gerade nach der Abgabeposition weiterbewegt wurde. Dann wird, nachdem das Ventil 31 geschlossen, und das Ventil 33 geöffnet wurde, der Spritzenantriebsmechanismus 35 betätigt, um 1,0 ml des Indikatorreagens in die Spritze 32 einzusaugen. Nachdem dann das Ventil 31 geöffnet, und das Ventil 33 geschlossen wurde, wird der Mechanismus 35 erneut betätigt, um 1,0 ml des Indikatorreagens über die Düse 18 in die in dem Reaktionsgefäß 2 enthaltene Flüssigkeit zu geben. Gleichzeitig wird die Luftpumpe 36 eingeschaltet, um über die Düse 19 Luft in die Flüssigkeit zu blasen, damit die Zyklisierungsreaktionsflüssigkeit und das Indikatorreagens in dem Reaktionsgefäß 2 bewegt oder gemischt werden. Danach wird der Arm 17 durch den Auf- und Abbewegungsmechanismus 15 nach oben bewegt, wobei die Düsen 18 bis 20 aus dem Reaktionsgefäß 2 herausgenommen werden. Danach wird der Drehmechanismus 16 betätigt, um den Arm 17 bis in die Position über dem Waschtank 21 zu schwenken, wo der Arm 17 nach unten bewegt wird, um die Düsen 18 bis 20 in den Waschtank 21 einzutauchen. Dann wird die Pumpe 26 eingeschaltet, um eine bestimmte Menge der in dem Tank 27 enthaltenen Flüssigkeit über die Düse 24 in den Waschtank 21 einzufüllen. Während des Einfüllens der Waschflüssigkeit ist das Ventil 22 geschlossen, so daß die Bereiche der Düsen 18 bis 20, die in dem Reaktionsgefäß in Kontakt mit der Flüssigkeit gebracht wurden, in die in den Waschtank 21 eingefüllte Waschflüssigkeit getaucht werden. Danach wird das Ventil 22 geöffnet, um Waschflüssigkeit in dem Tank 21 in den Flüssigkeits-Abfalltank 23 abfließen zu lassen. Danach wird die Luftpumpe 28 eingeschaltet, um über die Düse 25 Luft gegen die Düsen 18 bis 20 zu blasen, damit eventuelle Waschflüssigkeit, die an den Außenwänden der Düsen 18 bis 20 haftet, entfernt wird. Danach werden die Antriebsmechanismen 15 und 16 betätigt, um den Arm 17 anzuheben und zu drehen, bis die Düsen 18 bis 20 in der Abgabeposition über dem Drehtisch 3 ankommen. Während des obigen Indikatorreagensabgabe-Vorgangs wird der Drehtisch 3 um einen Schritt in der vorgegebenen Richtung weiterbewegt. Bei der Wiederholung des obigen Vorgangs wird 1,0 ml Indikatorreagens in die aufeinanderfolgenden Reaktionsgefäße 2 gegeben. Dabei ist anzumerken, daß während der Abgabe des Indikatorreagens die mit der Düse 20 verbundene Pumpe 37 ausgeschaltet bleibt.
In jedem Reaktionsgefäß 2 läuft die Indikatorreaktion während einer Stunde ab, und dann wird die in den aufeinanderfolgenden Reaktionsgefäßen 2 enthaltene Flüssigkeit nach dem Fluorometer 38 befördert, um die Intensität des Fluoreszenzlichts zu messen. Zu diesem Zweck wird der Arm 17 wie bei der Indikatorreagens-Abgabe bewegt, wobei die Düsen 18 bis 20 zunächst in die Flüssigkeit eines Reaktionsgefäßes 2 eingetaucht werden, das in der Abgabeposition ist. Dann wird die Pumpe 37 eingeschaltet, um eine bestimmte Menge Flüssigkeit (0,3 ml) von der Düse 20 bis in die Strömungszelle 38-1 zu befördern. Danach wird der Arm 17 angehoben, bis in die Waschposition über dem Waschtank 21 gedreht, und abgesenkt. Während dieser Bewegung wird die in die Strömungszelle beförderte Flüssigkeit gemessen, und danach durch Einschalten der Pumpe 37 in den Tank 39 abgeführt. Nun werden die Düsen 18 bis 20 gewaschen, wozu die Pumpen 26 und 28 in der gleichen Weise betätigt werden, wie dies oben erklärt wurde. Während der Dauer der Fluorometrie sind die mit der Düse 18 verbundenen Ventile 31, 33, die Spritze 32 und die mit der Düse 19 verbundene Luftpumpe 36 außer Betrieb. Um eine Verunreinigung zwischen aufeinanderfolgenden Flüssigkeiten in der mit dem Fluorometer 38 verbundenen Rohrleitung zu vermeiden, wird diese Rohrleitung außerdem mit Waschflüssigkeit durchgespült. Dies kann folgendermaßen gemacht werden: Nachdem die Außenwände der Düsen 18 bis 20 gewaschen wurden, und die verbrauchte Waschflüssigkeit in den Flüssigkeits-Abfalltank 23 abgeführt wurde, wird frische Waschflüssigkeit in den Waschtank 21 eingefüllt. Dann wird die Pumpe 37 wieder eingeschaltet, um die Waschflüssigkeit durch die Düse 20 und das Fluorometer 38 strömen zu lassen. Dabei ist anzumerken, daß die mit dem Fluorometer 38 verbundene Rohrleitung durch hindurchströmende Luft gespült werden kann.
Das Ausgangssignal des photoelektrischen Sensors 38-5 wird auf den Hauptcomputer 42 gegeben, und das Analysenergebnis, das durch die auf dem Ausgangssignal basierende Berechnung erhalten wird, wird von dem Drucker 46 ausgedruckt, und ebenfalls auf dem Monitor 47 wiedergegeben.
Nachdem die in allen Reaktionsgefäßen 2 enthaltene Flüssigkeit in dem Fluorometer 38 gemessen wurde, wird der Betrieb des Gerätes beendet. Dabei ist anzumerken, daß der Drehtisch 3 während einer bestimmten Zeitdauer immer intermittierend gedreht werden kann, oder nur während der Indikatorreagensabgabe-Dauer und der Fluorometrie-Dauer intermittierend gedreht werden kann.
Bei dieser Ausführungsform werden die verschiedenen Einheiten durch den Hauptcomputer 41 über die Subcomputer 42 und 43 entsprechend dem in dem Disketten-Laufwerk 45 aufgezeichneten Programm gesteuert. Die Fig. 4, 5 und 6 sind Flußdiagramme, die die durch den Hauptcomputer 41 und die Subcomputer 42 bzw. 43 gesteuerten Vorgänge wiedergeben. Die in den Flußdiagrammen dargestellten Vorgänge sind aufgrund der obigen Erklärung für Fachleute auf diesem Gebiet gut verständlich, und werden daher nicht nochmals erklärt.
Das automatische Analysengerät der vorliegenden Erfindung kann in gleicher Weise für die NADP-Zyklisierung verwendet werden. Wenn das Gerät für die CoA-Zyklisierung verwendet wird, wird an dem Arm 17 eine weitere Düse befestigt, die mit einem Pufferlösungs-Abgabemechanismus verbunden wird, der dem Indikatorreagens-Abgabemechanismus ähnlich ist, und nach dem Ablauf der Indikatorreaktion, aber vor der Fluorometrie, wird eine bestimmte Menge einer Pufferlösung in ein Reaktionsgefäß 2 gegeben. Während der Abgabe der Pufferlösung in das Reaktionsgefäß kann Luft aus der Düse 19 geblasen werden.
Wie oben ausführlich erklärt wurde, können mit dem automatischen Analysengerät der vorliegenden Ausführungsform, bei Verwendung des einfachen, automatischen Zyklisierungsreaktionsgerätes, bei dem die Temperatur der durch den einzigen Reaktionstank 1 umgewälzten Thermostatflüssigkeit durch die Heizeinrichtung 9 und die Kühleinrichtung 10 gesteuert wird, die Flüssigkeiten in allen in den Drehtisch 3 des Reaktionstanks eingesetzten Reaktionsgefäßen 2 während vorgegebenen Zeitdauern gleichzeitig auf gewünschte Temperaturen gebracht werden, und daher kann die enzymatische Zyklisierungsreaktion sehr genau und zuverlässig ausgeführt werden, wobei das Gerät mit geringen Abmessungen verwirklicht werden kann. Dabei ist anzumerken, daß bei der vorliegenden Ausführungsform zwar ein Waschmechanismus zum Reinigen der Düsen 18 bis 20 vorgesehen ist, aber wenn zwischen den aufeinanderfolgenden Flüssigkeiten in den Reaktionsgefäßen keine Verunreinigung erfolgt, kann auf den Waschmechanismus verzichtet werden.
Die Fig. 7 ist eine perspektivische Ansicht, die eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen automatischen chemischen Analyzers wiedergibt. Bei dieser Ausführungsform ist das Gehäuse des Analyzers in eine Reaktionseinheit und eine Prozeßseinheit unterteilt. In der Reaktionseinheit sind fünf Thermostate 71 bis 75, und eine Station 76 angeordnet. Der erste Thermostat 71 wird auf einer Temperatur von -30ºC gehalten, wobei eine Gefrierschutzflüssigkeit als Thermostatmedium verwendet wird. Weiterhin wird der zweite Thermostat 72 auf einer Zyklisierungstemperatur zwischen 4ºC und 38ºC gehalten, und der dritte Thermostat 73 auf einer Temperatur von 100ºC gehalten, bei der die Zyklisierungsreaktion abgebrochen wird. Weiterhin wird der vierte Thermostat 74 auf einer Temperatur von 4ºC gehalten, bei der die Indikatorreaktion nicht abläuft, und der fünfte Thermostat 75 auf einer Temperatur von 38ºC gehalten, bei der die Indikatorreaktion gestartet wird. Bei der Station 76 ist kein Thermostat vorgesehen, weil die Station 76 auf Raumtemperatur gehalten wird. Bei dem vierten Thermostaten 74 ist eine Abgabe- und Rühreinrichtung 77 für die Indikatorreaktionsflüssigkeit angeordnet, und bei der Station 76 ist eine Saugeinrichtung 78 vorgesehen, um die in dem Reaktionsgefäß enthaltene Testflüssigkeit in eine Strömungszelle zu befördern, die in einer Fluorometrie-Einheit angeordnet ist, wie dies in der Fig. 8 veranschaulicht ist. In der Prozeßeinheit sind die Steuereinheit 79, die Pumpeneinheit 80, die Fluorometrie-Einheit 81, und die Druckereinheit 82 angeordnet. Die Bauweise und Funktion dieser Einheiten sind im wesentlichen die gleichen wie bei der oben erwähnten Ausführungsform. Zum Beispiel weist die Pumpeneinheit 80 eine Pumpe auf, die mit einer in der Abgabe- und Rühreinrichtung 77 angeordneten Abgabedüse 83 verbunden ist, und außerdem mit einem Tank 85 für das Indikatorreagens verbunden ist, der in einem auf 4ºC gehaltenen Thermostaten 84 vorgesehen ist.
Wie in den Fig. 8 bis 10 im Detail gezeigt, wird bei dieser Ausführungsform ein Gestell 88, das in Matrixform hundert Reaktionsgefäße 87 aufnehmen kann, der Reihe nach von dem Thermostaten 71 bis zu dem Thermostaten 75 befördert, um die gewünschte Reaktion auszuführen. Danach wird das Gestell nach der Station 76 befördert, und nach der Indikatorreaktion wird die Flüssigkeit in jedem Reaktionsgefäß 87 in die Fluorometrie-Einheit 81 eingesaugt, um die Fluorometrie auszuführen. Zu diesem Zweck sind Haken 89 an dem Gestell 88 befestigt und in den gabelförmigen Arm 90 eingehängt, so daß das Gestell 88 getragen wird. Wie aus der Fig. 9 ersichtlich ist, ist der Arm 90 an einer Welle 93 befestigt, die in Lagern 91 und 92 so angebracht ist, daß sie gedreht und auch in axialer Richtung verschoben werden kann. In der Welle 93 ist ein sich in Wellenrichtung erstreckendes, erstes Getriebeelement 93a, und ein sich in Umfangsrichtung erstreckendes, zweites Getriebeelement 93b verwirklicht. Das erste Getriebelement 93a ist über Zahnräder 95 und 96 mit einem ersten Motor 97 verbunden. Wenn sich der erste Motor 97 dreht, dreht sich daher die Welle 93, und folglich der Arm 90 in Pfeilrichtung. Außerdem ist das zweite Getriebeelement 93b über ein Zahnrad 98 mit einem zweiten Motor 99 verbunden. Daher ist es möglich, die Welle 93, und folglich den Arm 90 nach oben und unten zu bewegen, wenn der zweite Motor 99 in beiden Richtungen gedreht wird.
Unter den in der Fig. 8 wiedergegebenen Bedingungen wird der Arm bei dem ersten Thermostaten 71 positioniert, und dann werden die in das Gestell 88 eingehängten Reaktionsgefäße 87 in die Thermostatflüssigkeit, die eine Temperatur von -30ºC hat, eingetaucht. Wenn nach dem Einfüllen einer bestimmten Proben- und Zyklisierungsflüssigkeits-Menge in alle Reaktionsgefäße 87 die Starttaste gedrückt wird, wird der zweite Motor 99 eingeschaltet, wodurch die Welle 93 nach oben bewegt wird. Dies hat zur Folge, daß die Reaktionsgefäße 87 aus dem ersten Thermostaten 71 herausgenommen werden. Danach wird der zweite Motor 97 eingeschaltet und der Arm 90 bis zu einer Position über dem zweiten Thermostaten 72 gedreht. Danach werden die Reaktionsgefäße 87 in die Thermostatflüssigkeit des zweiten Thermostaten 72 getaucht, und dann wird während einer bestimmten Dauer die automatische Zyklisierungsreaktion ausgeführt.
Nach Beendigung der Zyklisierungsreaktion werden die Motoren 97 und 99 wieder eingeschaltet, um die Reaktionsgefäße 87 in den dritten Thermostaten 73 zu befördern. Da der dritte Thermostat 73 auf ungefähr 100ºC gehalten wird, wird die automatische Zyklisierungsreaktion abgebrochen. Danach werden die Reaktionsgefäße in den vierten Thermostaten 74 befördert, und eine bestimmte Menge Indikatorreagens wird in alle Reaktionsgefäße 87 gegeben.
Die Fig. 10 ist eine perspektivische Ansicht, die eine Ausführungsform der Abgabe- und Rühreinrichtung 77 wiedergibt. Bei dieser Ausführungsform wird ein rechteckiger Rahmen 100 verwendet, dessen eine Seite 100a mit einer Welle 101 verbunden ist, die nach oben und unten bewegt und in beiden Richtungen gedreht werden kann. Für die Auf- und Abbewegung und die Drehbewegung können verschiedene Mechanismen verwendet werden, die jedoch in der Fig. 10 nicht wiedergegeben sind. Auf der Seite 100a des Rahmens 100 ist in Lagern 102a und 102b eine erste Leitspindel 103 angeordnet. Diese erste Leitspindel 103 ist mit einem ersten Motor 104 verbunden. Auf der Seite 100b, die der Seite 100a gegenüberliegt, ist eine zu der ersten Leitspindel parallele Führungsstange 105 befestigt. Außerdem ist ein erster Mutterblock 106 auf der ersten Leitspindel 103 angebracht, und ein Gleitblock 107 auf der Führungsstange 105 verschiebbar angeordnet. Zwischen diesen Blöcken 106 und 107 ist eine Schiene 108, sowie eine zweite Leitspindel 109 angeordnet, wobei diese zweite Leitspindel 109 in den Blöcken 106 und 107 drehbar gelagert ist. An einem Ende der zweiten Leitspindel 109 ist ein Zahnrad 110 befestigt, mit dem über ein Zahnrad 111 ein zweiter Motor 112 verbunden ist. Außerdem ist ein zweiter Mutterblock 113 auf der zweiten Leitspindel 109 angebracht, und die Abgabedüse 83 und die Luftdüse 84 sind an dem Mutterblock 113 befestigt. Wie oben erwähnt wurde, ist die Abgabedüse 83 über die Abgabepumpe (nicht wiedergegeben) mit dem Indikatorreagenstank 85 verbunden, und die Luftdüse 84 mit der Luftpumpe (nicht wiedergegeben) verbunden.
Bei dieser Ausführungsform wird die Abgabe- und Rühreinrichtung 77 zunächst von der Position über dem vierten Thermostaten 74 entfernt, wozu die Welle 101 in ihrer obersten Position gedreht wird. Dann wird der Arm 90 gedreht, um das Gestell 88 bis über den vierten Thermostaten 74 zu befördern. Danach wird der Arm 90 nach unten bewegt, um die Reaktionsgefäße 87 in die Thermostatflüssigkeit einzutauchen. Dann wird die Abgabe- und Rühreinrichtung 77 durch Drehen der Welle 101 genau über dem Gestell 88 positioniert. Wenn dies geschehen ist, werden der erste Motor 104, und der zweite Motor 112 eingeschaltet, um die Düsen 83 und 84 genau über dem vorher festgelegten Reaktionsgefäß 87 zu positionieren. Dann wird die Welle 101 nach unten bewegt, um das Indikatorreagens abzugeben und um zu rühren. Wenn der oben erwähnte Vorgang bei aufeinanderfolgenden Reaktionsgefäßen 87 wiederholt wird, wird die vorgegebene Menge Indikatorreagens in alle Reaktionsgefäße 87 gegeben. Dann wird die Abgabe- und Rühreinrichtung 77 durch Betätigung der Welle 101 aus dem vierten Thermostaten 74 herausgenommen. Danach wird das Gestell 88 in den fünften Thermostaten 75 befördert, wozu der Arm 90 wiederum so gedreht wird, daß die Indikatorreaktion ausgeführt wird. Wenn die vorher festgelegte Indikatorreaktion beendet ist, wird das Gestell 88 nach der Station 76 befördert, wozu wiederum der Arm 90 betätigt wird. Bei der Station 76 ist die Saugeinrichtung 78 vorgesehen. Die Saugeinrichtung 78 ist im wesentlichen wie die Abgabe- und Rühreinrichtung 77 aufgebaut, wobei jedoch die Saugeinrichtung 78 nur eine Saugdüse 115 aufweist. Die Testflüssigkeit in dem Reaktionsgefäß 87 kann durch geeignete Betätigung der Saugeinrichtung 78 in die Strömungszelle der Fluorometrie-Einheit 81 befördert werden.
Bei der in den Fig. 7 bis 10 wiedergegebenen Ausführungsform wird eine Vielzahl von Thermostaten verwendet, von denen jeder auf der vorher festgelegten Temperatur gehalten wird, wobei das Gestell, das eine gewisse Anzahl von Reaktionsgefäßen enthält, zwischen diesen Thermostaten befördert wird. Daher ist es möglich, eine rasche Temperaturänderung bei den in den Reaktionsgefäßen enthaltenen Flüssigkeiten von einer bestimmten Temperatur nach der nächsten auszuführen, wodurch die Meßgenauigkeit verbessert wird. Da die einzelnen Thermostaten immer auf einer bestimmten Temperatur gehalten werden, ist es außerdem möglich, die Steuerung auf einfache Weise auszuführen. Außerdem ist bei der obigen Erklärung ein Waschvorgang der Abgabedüse, der Saugdüse, und der Strömungszelle der Fluorometer-Einheit weggelassen, aber es ist möglich, den Waschvorgang auf die gleiche Weise wie bei der oben erwähnten Ausführungsform auszuführen.
Die Fig. 11 ist eine schematische Ansicht, die noch eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen automatischen chemischen Analyzers wiedergibt. Bei dieser Ausführungsform werden die Probe und das Zyklisierungsgemisch automatisch in das Reaktionsgefäß gegeben, das in dem automatischen chemischen Analyzer angeordnet ist, bei dem die in den Fig. 1 bis 6 wiedergegebene automatische Reaktionseinrichtung verwendet wird. Daher wird bei dieser Ausführungsform ein Probenteller 131 intermittierend in der vorgegebenen Richtung gedreht, und hundert herausnehmbare Probenbecher 132 sind in gleichen Abständen über den Umfang in den Probenteller 131 eingesetzt. Außerdem ist eine Abgabedüse 133 schwenkbar angeordnet zwischen einer vorgegebenen Halteposition (Probeneinsaugposition) des in den Probenteller 131 eingesetzten Probenbechers 132 und einer vorgegebenen Halteposition (Abgabeposition für die Probe und das Zyklisierungsgemisch) eines Reaktionsgefäßes 122, das in einen Drehtisch 123 des Reaktionstanks 121 eingesetzt ist. Die Abgabedüse 133 wird von einem Arm 134 getragen, und der Arm 134 wird durch einen Auf- und Abbewegungsmechanismus 135 nach oben und unten bewegt, und durch einen Drehmechanismus 136 gedreht. Auf diese Weise wird die Abgabedüse 133 in die Probe getaucht, die in dem Probenbecher 132 enthalten ist, der bei der Probeneinsaugposition positioniert ist, und ebenfalls in das Reaktionsgefäß 122 getaucht, das bei der Proben- und Zyklisierungsgemisch-Abgabeposition positioniert ist. Außerdem ist ein Waschtank 137 im Schwenkbereich der Abgabedüse 133 zwischen dem Probenteller 131 und dem Reaktionstank 121 angeordnet, und die Abgabedüse 133 wird so gesteuert, daß sie bei dem Waschtank 137 positioniert wird. Außerdem wird bei dieser Position der Arm 134 nach unten bewegt, so daß die Abgabedüse 133 in den Waschtank 137 eingeführt wird. Der Waschtank 137 ist über ein Ventil 138 mit einem Flüssigkeits-Abfalltank 139 verbunden, und außerdem sind zwei Düsen 140 und 141 im oberen Bereich der Öffnung des Waschtanks 137 angeordnet. Die Düse 140 ist über eine Pumpe 142 mit einem Waschflüssigkeits-Tank 143 verbunden, um die Waschflüssigkeit in den Waschtank 137 zu befördern, und die Düse 141 ist mit einer Luftpumpe 144 verbunden, um Luft in den Waschtank 137 zu blasen. Die Abgabedüse 133 ist über die Proben-Abgabespritze 145, das Ventil 146, die Zyklisierungsgemisch-Abgabespritze 147 und das Ventil 148 mit einem Tank 149 verbunden, der das Zyklisierungsgemisch enthält. Daher können vorgegebene Proben- und Zyklisierungsgemisch-Mengen in das Reaktionsgefäß 122 gegeben werden, wozu die Ventile 146 und 148 und die Abgabespritzen 145 und 147 mit Hilfe der Spritzenantriebsmechanismen 150 und 151 in geeigneter Weise betätigt werden. Außerdem ist der Zyklisierungsgemisch-Tank 149, zwecks Kühlung mit zum Beispiel Eis, in einem Thermostaten 152 untergebracht, und die Leitung zwischen dem Zyklisierungsgemisch-Tank 149 und der Abgabedüse 133 ist mit dem Zyklisierungsgemisch gefüllt.
Nachstehend wird die Funktionsweise dieser Ausführungsform erklärt.
Zunächst wird eine Vielzahl von Probenbechern 132, von denen jeder eine Probe enthält, in den Probenteller 131 eingesetzt, und außerdem werden die Reaktionsgefäße 122, deren Anzahl gleich der Anzahl der Proben ist, in den Drehtisch 123 eingesetzt. Danach wird die Temperatur der Gefrierschutzflüssigkeit in dem Reaktionstank 121 durch Einschalten des Gerätes auf -30ºC gebracht. Wenn dies geschehen ist, werden der Drehtisch 123 und der Probenteller 131 in synchroner Weise intermittierend gedreht, wobei die vorgegebene Probenmenge, zusammen mit der vorgegebenen Zyklisierungsgemisch- Menge aus den aufeinanderfolgenden Probenbechern 132 des Probentellers 131 in aufeinanderfolgende Reaktionsgefäße 122 befördert wird.
Bei dieser Beförderung von Probe und Zyklisierungsgemisch wird zunächst in der Probeneinsaugposition der Arm 134 mittels des Auf- und Abbewegungsmechanismus 135 um eine vorgegebene Strecke nach unten bewegt, so daß die Abgabedüse 133 in die Probe eingetaucht wird, die in dem bei der Probeneinsaugposition positionierten Probenbecher 132 enthalten ist. Wenn dies geschehen ist, wird das Ventil 146 geschlossen und das Ventil 148 geöffnet, so daß 1 ul Probe mittels des Spritzenantriebsmechanismus 150 in die Probenabgabespritze 145 eingesaugt wird, und 50 ul Zyklisierungsgemisch mittels des Spritzenantriebsmechanismus 151 in die Zyklisierungsgemisch- Abgabespritze 147 eingesaugt werden. Danach wird der Arm 134 mittels des Auf- und Abbewegungsmechanismus 135 nach oben bewegt, so daß die Abgabedüse 133 aus dem Probenbecher 132 herausgenommen wird, und dann wird der Arm 134 mittels des Drehmechanismus 136 um einen vorgegebenen Winkel geschwenkt, so daß die Abgabedüse 133 bei der Proben- und Zyklisierungsgemisch-Abgabeposition des Drehtischs 123 positioniert wird. Danach wird der Arm 134 mittels des Auf- und Abbewegungsmechanismus 135 nach unten bewegt, so daß die Abgabedüse 133 in das bei der Abgabeposition positionierte Reaktionsgefäß 122 eingeführt wird. Wenn dies geschehen ist, wird das Ventil 146 geöffnet und das Ventil 148 geschlossen, so daß mittels der Spritzenantriebsmechanismen 150 und 151 eine vorgegebene Proben- und Zyklisierungsgemisch-Menge in das Reaktionsgefäß 122 abgegeben wird. Danach wird der Arm 134 mittels des Auf- und Abbewegungsmechanismus 135 nach oben bewegt, so daß die Abgabedüse 133 aus dem Reaktionsgefäß 122 herausgenommen wird, und dann wird der Arm 134 mittels des Drehmechanismus 136 um einen vorgegebenen Winkel geschwenkt, so daß die Abgabedüse 133 über dem Waschtank 137 positioniert wird. Danach wird der Arm 134 mittels des Auf- und Abbewegungsmechanismus 135 nach unten bewegt, so daß die Abgabedüse 133 in den Waschtank 137 eingeführt wird. Dann wird das Ventil 138 geschlossen, und durch Betätigen der Pumpe 142 wird über die Düse 140 eine vorgegebene Menge Waschflüssigkeit in den Waschtank 137 eingefüllt. Wenn dies geschehen ist, wird mindestens der Bereich der Abgabedüse 133, der in die in dem Probenbecher 132 enthaltene Probe eingetaucht werden soll, in die Waschflüssigkeit eingetaucht, damit er gewaschen wird. Danach wird das Ventil 138 geöffnet, um die in dem Waschtank 137 enthaltene Waschflüssigkeit in den Flüssigkeits-Abfalltank abfließen zu lassen, und außerdem wird durch Betätigen der Luftpumpe 144 Luft aus der Düse 141 geblasen, um die auf der äußeren Oberfläche der Abgabedüse 133 haftende Waschflüssigkeit zu entfernen. Danach wird der Arm 134 mittels des Auf- und Abbewegungsmechanismus 135 und des Drehmechanismus 136 so nach oben bewegt und gedreht, daß die Abgabedüse 133 bei der vorgegebenen Probeneinsaugposition des Probentellers 131 positioniert wird. Wenn der oben erwähnte Vorgang wiederholt wird, kann die vorgegebene Probenmenge aus aufeinanderfolgenden Probenbechern 132 des Probentellers 131, zusammen mit der vorgegebenen Zyklisierungsgemisch-Menge, in aufeinanderfolgende Reaktionsgefäße 122 des Drehtischs 123 befördert werden, ohne dabei eine Verunreinigung zu verursachen.
Sobald alle Proben, deren Anzahl vorher festgelegt wird, zusammen mit Zyklisierungsgemisch, in die Reaktionsgefäße 122 befördert sind, wird die Temperatur der Gefrierschutzflüssigkeit in dem Reaktionstank 121 auf 25ºC angehoben, und dann wird die zu untersuchende Probe einer qualitativen und quantitativen Analyse unterworfen, wozu die gleichen Vorgänge wie in den Fig. 1 bis 6 mittels der an einem Arm 124 befestigten Düsen 125 bis 127 ausgeführt werden.
Bei dieser Ausführungsform können alle Vorgänge von Einfüllen der Probe bis zu der qualitativen und quantitativen Analyse der zu untersuchenden Probe automatisch ausgeführt werden, so daß viel Arbeit gespart wird.
Wie oben erwähnt wurde, ist es gemäß der Erfindung möglich, das automatische Gerät für Zyklisierungsreaktionen zu verwirklichen, mit dem die enzymatische Zyklisierungsmethode auf einfache Weise durchgeführt werden kann, wobei sehr zuverlässige und genaue Analysenergebnisse erhalten werden. Außerdem ist es möglich, den automatischen chemischen Analyzer zu verwirklichen, der mit Hilfe des automatischen Gerätes für Zyklisierungsreaktionen die zu untersuchende Probe nach der enzymatischen Zyklisierungsmethode auf sehr genaue Weise automatisch analysieren kann.

Claims

1. Automatisches Gerät für enzymatische Zyklisierungsreaktionen, das aufweist: einen Drehtisch zur Aufnahme einer Vielzahl (z. B. bis zu mindestens 100) Reaktionsgefäßen längs seines Randes, wobei jedes dieser Gefäße eine bestimmte Menge einer Probe und eines Enzyme umfassenden Zyklisierungsgemischs enthält; einen Reaktionstank, in dem dieser Drehtisch angeordnet ist; eine Pumpe zum Umwälzen einer Thermostatflüssigkeit durch diesen Tank; und eine Vorrichtung zum Steuern der Temperatur der Thermostatflüssigkeit;

dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zum Steuern der Temperatur der Thermostatflüssigkeit und die Pumpe zur Ausführung der folgenden aufeinanderfolgenden Schritte dienen:

(1) Die Thermostatflüssigkeit wird während einer vorgegebenen Zeitdauer auf einer vorgegebenen Temperatur gehalten, wobei dies eine Temperatur ist, bei der die enzymatische Zyklisierungsreaktion nicht abläuft.

(2) Die Flüssigkeit wird rasch auf eine andere vorgegebene Temperatur erwärmt, wobei dies eine Temperatur ist, bei der die interessierende enzymatische Zyklisierungsreaktion abläuft, und diese Temperatur wird während einer weiteren vorgegebenen Zeitdauer aufrechterhalten.

(3) Die Flüssigkeit wird rasch auf eine weitere vorgegebene Temperatur erwärmt, wobei dies eine Temperatur ist, bei der die Zyklisierungsreaktion infolge des Verlustes der Wirksamkeit der Enzyme angehalten wird, und diese Temperatur wird während einer weiteren vorgegebenen Zeitdauer aufrechterhalten.

(4) Die Flüssigkeit wird rasch auf eine vorgegebene Temperatur abgekühlt, die niedriger als die Temperatur ist, bei der die Zyklisierungsreaktion angehalten wird.

2. Automatisches Gerät für enzymatische Zyklisierungsreaktionen, gemäß Anspruch 1, bei dem die Temperatur der Thermostatflüssigkeit überwacht wird, wobei das Ausgangssignal des Temperaturüberwachungsmittels zum Einstellen der Temperatur der Thermostatflüssigkeit mittels des Temperatursteuermittels verwendet wird.

3. Automatisches Gerät für enzymatische Zyklisierungsreaktionen, gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem die Vorrichtung zum Steuern der Temperatur der Thermostatflüssigkeit aufweist: eine Heizeinrichtung, eine Kühleinrichtung, und ein Umschaltventil, um die Thermostatflüssigkeit wahlweise durch die Heizeinrichtung oder die Kühleinrichtung strömen zu lassen, wobei diese Komponenten an einen Computer angeschlossen sind, der so programmiert werden kann, daß die Temperaturänderungen zu den Zeiten, die für die interessierende enzymatische Zyklisierungsreaktion erforderlich sind, verwirklicht werden, und der Computer ebenfalls das Ausgangssignal des Temperaturüberwachungsmittels analysiert und die erforderlichen Einstellungen der Temperatur der Thermostatflüssigkeit bewirkt.

4. Gerät gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem ein Deckel abnehmbar auf dem Reaktionstank angebracht wird.

5. Automatisches Gerät für enzymatische Zyklisierungsreaktionen, gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Gerät weiterhin ein Mittel aufweist, um eine bestimmte Menge Indikatorreagens in die betreffenden Reaktionsgefäße zu geben, nachdem die enzymatische Zyklisierungsreaktion der Flüssigkeiten in den Reaktionsgefäßen angehalten wurde, und ein Mittel aufweist, um das Fluoreszenzlicht zu messen, das von durch die Indikatorreaktion erzeugten Substanzen ausgesandt wird.