DE3546701C2

DE3546701C2 - Diagnostisches Mittel

Info

Publication number: DE3546701C2
Application number: DE3546701A
Authority: DE
Inventors: Udo Dr Med Ehrenfeld
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1985-03-25
Filing date: 1985-03-25
Publication date: 1998-01-15
Anticipated expiration: 2005-03-26

Description

Die Erfindung betrifft ein diagnostisches Mittel für Tumoren, das Jomol bzw. Jomolderivate enthält.

Jomol® und seine Derivate können als Arzneimittel und als diagnostische Mittel verwendet werden. Sie sind insbeson dere als Mittel zur Steigerung der zelligen Abwehr und für die Diagnose und Therapie von malignen Tumoren sowie zur Behandlung von Schwächen der zelligen und humoralen Immunabwehr geeignet. Jomol® kann als Träger für diagno stische und therapeutische Stoffe verwendet werden.

Die Diagnose maligner Tumoren ist trotz intensiver Forschung heute noch schwierig. Es ist fast unmöglich, maligne Tumoren im Frühzustand zu erkennen, und bis heute steht kein Verfahren zur Verfügung, mit dem eine Frühdiagnose durchgeführt werden kann.

U. Ehrenfeld (Krebsgeschehen 5, 132 ff. (1979)) berich tet über die cancertoxische Wirkung eines Gemisches aus Acetaldehyd und Ethanol. Das Gemisch enthält 3 bis 10 g Acetaldehyd pro 1000 g Ethanol. Es zeigte sich jedoch, daß die Wirkung dieses Gemisches bei der Behandlung von soliden malignen Tumoren wie auch von Metastasen nicht ausreichend ist.

In den deutschen Patentanmeldungen P 33 34 751.4, P 33 36 583.0 und P 34 02 312.7 (entsprechend der euro päischen Patentanmeldung 84 110 118.1 und folgender wei terer Patentanmeldungen in ausländischen Staaten: Kanada (463 991), Südafrika (84/7296), Australien (33327/84) Japan (202 859/84), UdSSR (3 798 784.13), Polen (P. 249 725) Rumänien (115 800), Jugoslawien (P-1639/84), Spanien (536 085), Argentinien (297 977), Südkorea (84-5894) DDR (267 559), Dänemark (4553/84), USA (689 728)) wird ein Mittel zur Diagnose und Therapie von bösartigen Tumo ren sowie zur Therapie von Schwächen der zelligen und homoralen Immunabwehr beschrieben, das einen Immunmodu lator in und/oder auf Liposomen oder lipidiert oder einen mit einem radioaktiven Strahler, einem Farbstoff oder einem Cytostatikum markierten Immunmodulator ent hält.

Es besteht jedoch weiterhin Bedarf nach derartigen Mit teln, die möglichst keinerlei Nebenwirkungen zeigen und insbesondere sehr einfach herzustellen sind. Die bekann ten Mittel besitzen weiterhin den Nachteil, daß ihre intravenöse Verabreichung mit gewissen Schwierigkeiten verbunden ist.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mittel und ein Erzeugnis für die Diagnose von Tumoren zur Verfügung zu stel len. Das Mittel soll hochwirksam sein und daher in gerin gerer Konzentration als die bekannten Mittel verabreicht werden können. Das erfindungsgemäße Mittel soll bewir ken, daß der Organismus des Patienten weniger stark be lastet wird, und weiterhin soll seine Verabreichung auf einfache Weise möglich sein.

Das Mittel soll weiterhin intravenös verabreichbar sein und als Träger für radioaktive Strahler, Arzneimittel und Farbstoffe dienen.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß eine Verbindung, die man aus dem Mikroorganismus Rhodococcus rhodochrous gewinnt, die erfindungsgemäße Aufgabe löst, wenn sie zusammen mit einem Gemisch aus einem Alkohol und Aldehyd verwen det wird.

Gegenstand der Erfindung ist ein diagnostisches Mittel, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es einen mikrobiellen Ex trakt, erhalten durch

a) Züchtung von Nocardia opaca = Rhodococcus rhodo chrous (DSM 43 202 bzw. ATCC 21 953) auf einem Nährmedium,
b) Gewinnung der Zellen,
c) Suspendierung der Zellen in einem Puffer und 15 Minuten bis einige Stunden Stehenlassen der Sus pension,
d) Behandlung der Suspension mit einem murolytischen Enzym,
e) Zerstörung der Zellen,
f) Trennung des erhaltenen Materials in Bodensatz und Überstand,
g) Trennung des Überstands an Sephadex-Säulen unter Verwendung von Puffer als Eluierungsmittel,
h) Gewinnung der aktiven Fraktionen, die im UV-Spektrum eine Absorption bei 214 nm zeigen,
i) Umsetzung der aktiven Fraktionen mit Acetaldehyd in einem Molverhältnis von 1 mol aktiver Fraktion (angenommenes mittleres Molekulargewicht 4000) mit 1,8 bis 2,2 mol Acetaldehyd, gegebenenfalls gekoppelt mit einem Molekül, das einen radioaktiven Strahler und/oder einen Farbstoff binden kann,

enthält und es zusammen mit einem Aldehyd der allgemeinen Formel I

RCHO (I)

worin R ein Wasserstoffatom und eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoff atomen bedeutet, wobei der freie Aldehyd auch direkt oder indirekt von Stoffen metabolisch freigesetzt werden kann, und gegebenenfalls einem Alkohol der allgemeinen Formel II

R¹CH₂OH (II)

worin R¹ die oben für R angegebene Bedeutung besitzt, sowie gegebenenfalls üblichen pharmazeutisch annehmbaren Träger stoffen und/oder Verdünnungsmitteln verwendet wird, enthält.

Der mikrobielle Extrakt (Jomol®) ist durch folgende Eigen schaften charakterisiert:

(1) Absorptionsmaximum im UV-Spektrum bei 286,0 nm;
(2) apparente Molekulargewichte bei 4500, 3000 und 900;
(3) starke Hygroskopizität;
(4) elfenbeinfarbige, teils amorphe, teils kristalline Flocken nach Gefriertrocknung, abhängig von dem Restwassergehalt;
(5) pH-Wert von 5,5 (1 ml der Verbindung, gelöst in 1 ml Wasser);
(6) schwach positive, rosa Ninhydrin-Reaktion;
(7) anfärbbar mit Orcin-Reagens;
(8) Proteingehalt 1,4% (Proteintest nach L. Thomas, J. Clin. Chem. Clin. Biochem., Bd. 19, 1981, Seite 203 bis 208, Coomassie Brilliant Blue G 250);
(9) folgende R_f-Werte (Lösungsmittelangabe Volumen: Volumen) R_f = 0,20 (Butanol : Eisessig : Wasser 4 : 1 : 1)
R_f = 0,45 (Benzol : Eisessig : Wasser 2 : 1 : 2)
R_f = 0,685 (Methanol : Eisessig : Wasser 4 : 1 : 1)
keine Wanderung (Chloroform : Methanol 96 : 4)
R_f = 0,54 (Chloroform : Methanol 1 : 1)
(10) Löslichkeit: schlecht löslich in unpolaren Lösungs mitteln, sehr gut löslich in polaren Lösungsmitteln;

(11) nachweisbare Bestandteile:

Substanzen
Verhältnis (Näherung)
Neutralzucker (Glucose, Galactose, Ribose)
() 1
Aminozucker (Glucosamin, Muraminsäure) (nach Hydrolyse)	3,5
Aminosäure (Ala, Glu, DAP) @	(Ala, Glu + DAP 2,5)	4
Lipide	< 1
Phosphor	< 1

(12) Struktur:
Peptidoglycanstruktur, deren Glycangerüst aus 10 bis 80 Disacchariden aus N-Acetylglucosaminyl- N-acetylmuramyl besteht.

Der mikrobielle Extrakt kann mit einem radioaktiven Strahler, einem Farbstoff oder einem Cyto statikum markiert sein, wobei die Markierung unter Ver wendung von Ankopplungsmitteln, wie beispielsweise DTPA, Kryptofix, Uridin, L-Thyronin, L-Tyrosin, erfolgen kann. Als Kopplungsmittel kann man alle solchen Kopplungsmit tel verwenden, die einen radioaktiven Strahler, einen Farbstoff oder ein Cytostatikum tragen oder binden kön nen.

Der Anmelder hat überraschenderweise gefunden, daß ein bestimmter Mikroorganismus des Genus Nocardia opaca, nämlich Rhodococcus rhodochrous eine Verbindung ergibt, die nach Umsetzung mit Acetaldehyd überraschende Eigen schaften als Träger für diagnostische Stoffe aufweist. Der Stamm Rhodococcus rhodochrous wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Gries bachstraße 8, D-3400 Göttingen, am 16. Mai 1972 unter der Nummer DSM 43 202 (= DSM 363 = ATCC 21 953) hinter legt. Der Stamm ist frei verfügbar, und seine Lebensfähig keit wurde am 28. Februar 1985 erneut nachgewiesen.

Jomol® wird gemäß der DE 35 10 795 C2 (bzw. der DE 35 10 795 A) hergestellt.

Bei der Durchführung des Verfahrens zur Herstellung von Jomol® wird ein eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle und Mineralien enthaltendes Kulturmedium verwendet. Die ses Kulturmedium kann auch Antischaummittel und/oder ande re übliche Komponenten enthalten. Beispiele für Kohlen stoffquellen sind Kohlenhydrate, Alkohole, Kohlenwasser stoffe und Kleie. Beispiele für Stickstoffquellen sind Maisquellwasser, Hefeextrakte, Fleischextrakte, Pepton, Fischmehl, Ammoniumsalze, Nitratsalze und Harnstoff. Die Mineralquelle umfaßt anorganische Salze, wie Phosphate, Ma gnesiumsalze, Zinksalze, Calciumsalze, Mangansalze, Molyb dänsalze und Kupfersalze.

Die Zusammensetzung des Kulturmediums kann nach Bedarf geändert werden, und während der Fermentation können diese Kohlenstoff-, Stickstoff- und Mineral quellen zusätzlich zugegeben werden. Zur Herstellung eines Inokulums wird der Mikroorganismus beispielsweise auf DST-Oxoid-Nährboden, oder Traubenzucker-Agar (2%) in Plattentechnik auf drei bis vier Platten fünf bis 8 Tage kultiviert. Man erhält hierbei ein Produkt, das dann als Inokulum zur Herstellung des Materials in technischem Maßstab verwendet werden kann.

Die Züchtung des Mikroorganismus in technischem Maßstab kann beispiels weise in Erlenmeyer-Kolben, die 100 ml normale Nährbouillon enthalten, erfolgen. Die Züchtung erfolgt unter aeroben Bedingungen.

Die Züchtungstemperatur beträgt 20 bis 40°C, und der pH-Wert des Kultur mediums liegt bei 7,2 bis 7,4. Die bevorzugte Temperatur beträgt 30 bis 37°C, und die geeignete Züchtungszeit beträgt normalerweise 2 bis etwa 30 Tage und kann auf geeignete Weise, abhängig von der Auswahl der anderen Kulturbedingungen, geändert werden.

Die Mikroorganismen werden dann geerntet, vorzugsweise durch Abzentrifu gieren. Man kann die Mikroorganismen jedoch auch über Glasfilter abfil trieren. Das Zentrifugieren kann beispielsweise mit 4000 Umdrehungen pro Minute während einer Zeit von 5 bis 10 Minuten in einer Kühlzentrifuge mit einem Rotor von 40 cm Durchmesser erfolgen. Die erhaltenen Mikroorganismen werden üblicherweise gewaschen, beispielsweise mit Wasser oder 0,01 M Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von beispielsweise 7,4. Der Tris-HCl-Puffer enthält vorzugsweise EDTA-Na₂, zum Beispiel 0,1 bis 0,04, vorzugsweise 0,06%. Der Waschvorgang kann einmal oder mehrere Male wiederholt werden.

Die Mikroorganismen werden sodann vorzugsweise nachdem sie wie oben gewaschen wurden, in Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), beispielsweise 0,01 M, der vorzugsweise 0,1 bis 0,05% EDTA-Na₂ und 8 bis 12% vorzugsweise 10%, Glucose enthält, suspendiert.

Zu der erhaltenen Suspension, die gegebenenfalls bebrütet wurde, wird dann ein murolytisches Enzym, vorzugsweise Lysozym und vorzugsweise zur Entfernung der Nucleinsäuren und zur Herabsetzung der Viskosität Desoxyribonuclease zugesetzt. Man verwendet beispielsweise für 5 g Bakterien 100 ml Tris-HCl-Puffer und gibt dann zu dieser Suspension 10 mg Lysozym und 3 mg Desoxyribonuclease.

Die Behandlung mit Glucose und den Fermenten wird während einer Zeit von 30 Minuten bis mehreren Stunden, vorzugsweise während einer Zeit von zwei bis drei Stunden, bei einer Temperatur von 20 bis 40°C, vorzugsweise 30 bis 37°C, durchgeführt.

Anschließend werden die Zellen zerstört. Dies kann mit allen geeigneten Methoden geschehen, beispielsweise Ultraschall. Vorzugsweise wird Ultra schall während einer Minute, verwendet. Die mechanische Zerstörung der Zellen muß nicht durch geführt werden, sie wird jedoch vorzugsweise durchgeführt, weil dadurch die Ausbeute des gewünschten Produkts erhöht wird.

Das erhaltene Material wird danach in Überstand und Bodensatz, vorzugsweise durch Zentrifugieren, getrennt. Das Zentrifugieren kann in einer normalen Zentrifuge durchgeführt werden, bevorzugt wird es jedoch in einer Kühlzen trifuge bei einer Temperatur von 4 bis 6°C bei 4000 Umdrehungen pro Minute 10 bis 15 Minuten lang durchgeführt. Der Bodensatz kann gegebenenfalls einmal oder mehrere Male mit Wasser oder dem oben erwähnten Puffer gewaschen werden, wobei die erhaltenen Waschlösungen mit dem Überstand vereinigt werden. Der Überstand wird gegebenenfalls nach Einengen im Hochvakuum bei tiefen Temperaturen an Sephadex®-G-75-Säulen chromatographiert. Wird auf ein Waschen des erhaltenen Bodensatzes verzichtet, so wird der Überstand direkt der Chromatographie unterworfen, ohne daß er eingeengt wird. Man erhält beispielsweise aus 5 g Bakterien einen Überstand, den man vorzugsweise in fünf gleiche Teile teilt und auf fünf vorbereiteten Sephadex- G-75-Säulen zu je einem Teil gibt. Die Säulen sind 80 cm lang, der Innen durchmesser beträgt 2,5 cm, die Sephadex®-Füllungshöhe beträgt 60 cm. Wird nur eine Säule verwendet, so wird der Teil, der nicht chromatogra phiert wird, bei -25°C eingefroren und bei dieser Temperatur aufbewahrt.

Wenn man bei einer Chromatographie auf einer der Säulen zur Charakteri sierung der JOMOL®-Substanz "Albumin aus Humanserum Markierung" benutzt, tritt der erste Peak der Rohsub stanz mit dem Albumin (MG 69 000) und die Fraktion 2b* mit dem ebenfalls zur Säuleneichung benutzten Vitamin B₁₂ (MG 1 355,4) aus (Fig. 2).

Als Elutionsmittel wird 0,01 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), der 0,06% EDTA-Na₂ enthält, verwendet. Die Flußrate beträgt 100 µl pro Minute (= 2 Tropfen/min), wobei den auch niedrigere oder höhere Flußraten anwenden kann. Die aktive Fraktion, die als Fraktion 2b* bezeichnet wird, wird in einer Zeit von 12 bis 14 Stunden nach Beginn der Gelchromatographie gesammelt. Das Elutionsvolumen beträgt ca. 900 bis 980 ml, die Fraktionierung erfolgt unter UV-Detektion bei 214 nm Das Vorgehen zur Gewinnung der Fraktion 2b* kann vom Abernten der Zellen nach Kultivieren bis zur Säulenfraktionierung auch in Phosphatpuffer, Ammoniumacetatpuffer und anderen erfolgen. Die Verwendung vom Ammoniumacetat puffer ist insbesondere für die Präparate zur Jodierung bevorzugt. Die erhaltenen aktiven Fraktionen werden lyophilisiert und anschließend eine Stunde bei 80°C zur Zerstörung der Abbauenzyme inkubiert. Wenn nicht lyophilisiert wird, werden die verdünnten Lösungen bei -20°C, vorzugsweise -40°C, besonders bevorzugt -80°C, eingefroren und als Lösung aufbewahrt.

Vor dem Lyophilisieren bzw. Einfrieren werden die erhaltenen Lösungen bei aktiven Fraktionen vorzugsweise mit einer 1 M Acetaldehyd(reinst)-wäßrigen Lösung in u.g. M Verhältnis gemischt und 10 Minuten bis 2 Stunden, vorzugs weise z. B. 30 Minuten, bei Raumtemperatur stehengelassen.

Die Umsetzung der Fraktion 2b* mit Acetaldehyd erfolgt im molaren Verhältnis Fraktion 2b*: Acetaldehyd = 1 : 1,8 bis 2, vorzugsweise im Verhältnis von 1 : 2, wobei man für die Fraktion 2b* ein mittleres Molekulargewicht von ca. 4000 annimmt.

Überraschenderweise zeigte sich, daß man bei der Umsetzung der aktiven Fraktion 2b* mit Acetaldehyd eine "Fraktion 2b" erhält, die als JOMOL® bezeichnet wird, überraschende pharmakologische Eigenschaften aufweist und außerdem als Trägersubstanz verwendet werden kann.

Die Ausbeute aus ca. 5 g Bakterien beträgt ca. 50 bis 70 mg JOMOL® in reiner Form.

Das Produkt ist sehr hygroskopisch. Gegebenenfalls kann mit üblichen Methoden eine Wassergehaltsbestimmung des Lyophilisats durchgeführt werden.

Nach dem Trocknen ist die Substanz gelbweiß und flockig, mit etwas Wasser erscheint sie im Augenblick "kristallin", mit etwas mehr Wasser ist sie farblos, glasartig, gelatinös und zieht Fäden wie Haushaltsalleskleber. Bei steriler Lagerung ohne Lichtzutritt unter Stickstoff ist die Substanz bei einer Temperatur unter -25°C stabil. Die Substanz ist unter Lichtzutritt bei Raumtemperatur einige Stunden stabil.

Wie oben erläutert, werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Nocardia- Bakterien verwendet. Nocardien sind grampositive Actinomyceten. Ihr mehr schichtiges Zellwandgrundgerüst weist Einlagerungen von Proteinen und Poly sacchariden auf. Ihm aufgelagert sind Deckschichten, die schwer ablösbar sind.

Die Zellwand enthält als äußere Schicht Lipoproteine und Wachse, als mittlere Schicht Lipopolysaccharide und als innere Schicht lange Polysaccharidketten. Die Antigenität der Schichtbestandteile nimmt von außen nach innen ab.

Das Substrat für die Herstellung ist die innere Schicht mit den langen Peptidoglykanketten. Diese sind im Glykangerüst aus Dissaccharidbausteinen gebildet. Der Disaccharidbaustein besteht aus N-Acetylglucosaminyl-N-acetyl muramyl:

An der Säuregruppe der N-Acetylmuraminsäure (N-Acetylglucosaminlactatether) sind Peptideinheiten über L-Alanin gebunden. Diese Peptideinheiten enthalten Sequenzen von L-Alanin→D-Isoglutamin→meso-α,ε-Diaminopimelinsäure (DAP), wobei die DAP amidiert sein kann. An dieser Stelle kommt selten Uridindiphosphat oder eine andere Aminosäure, häufiger Lysin vor, die ihrerseits substituiert sein kann. Anstelle der Acetylgruppe kann an der Muraminsäure eine Glycolylgruppe vorhanden sein. Außer diesen genannten Einheiten können auch bis 10% Neutralzucker vorhanden sein.

Dem obengenannten Herstellungsprozeß entsprechend wird der Anteil der äußeren Wandschicht der Nocardien verworfen; Lipoproteine, Lipide und Wachse sind also weder im Gesamtpräparat noch im Präparat Fraktion 2b ent halten. Die hergestellten Präparate sind Spaltprodukte von Peptydoglykanen und Peptiden der inneren Wandschicht. Das zur Spaltung eingesetzte Lysozym hydrolysiert die Bindung zwischen N-Acetylglucosamin und N-Acetylmuramin säure des Glykangerüsts. Die Desoxyribonuclease spaltet Nucleinsäuren; sie setzt die Viskosität des Produktes herab. Die Peptidsubstituenten der Peptidoglykane gehen im obengenannten Herstellungsprozeß so weit ihrer interpeptidischen Bindungen verlustig, daß sie wasserlöslich werden und nur noch gering fettlöslich sind. Gleichzeitig verlieren die Enden der Peptido glykanketten ihre Peptidanteile. Durch den Herstellungsvorgang werden die Peptidoglykane weitestgehend von natürlichen Lipiden, mit den sie zusammen in den Zellwänden vorkommen, befreit. Die N-Acetylglucosamingruppen der Peptidoglykane können teilweise desacetyliert sein.

JOMOL® besitzt unerwartete Eigenschaften. JOMOL® selbst findet als Immunmodu lator, Arzneimittel oder Diagnostikum Verwendung. JOMOL® und seine Kopplungs produkte mit bestimmten Kopplungsmitteln eignen sich besonders gut als Trägersubstanzen für radioaktive Verbindungen, Farbstoffe und Arzneimittel. JOMOL®, seine Kopplungsprodukte und die markierten oder beladenen JOMOL® derivate reichern sich überraschenderweise an Krebszellen an und werden von gesunden Zellen kaum oder nur in geringem Umfang gebunden. Wird beispiels weise JOMOL® mit einem radioaktiven Marker markiert und verabreicht, so reichert sich das markierte JOMOL® an den Tumorzellen an, und diese können dadurch mittels Gammakamera-Imaging leicht nachgewiesen werden.

Beispiele für Kopplungsprodukte von JOMOL® sind Produkte, die JOMOL®, daran gekoppelt einen Kronenether, Diethylentriaminpentaessigsäure, Fluorescein isothiocyanat oder Zinn(II)-chlorid enthalten. Derartige Kopplungsprodukte werden allgemein hergestellt, indem man JOMOL® in einem geeigneten polaren Lösungsmittel oder in einer wäßrigen Lösung eines polaren Lösungsmittels löst. Beispielsweise kann man 1 bis 10 mg JOMOL® bis 20 µl eines geeigneten wäßrigen Lösungsmittels lösen. Man kann auch sehr konzentrierte Lösungen von JOMOL® erstellen. Die Lösung erfolgt bei möglichst tiefer Temperatur, wobei jedoch die Temperatur so gewählt werden muß, daß das Lösungsmittel noch nicht kristallisiert. Die mit JOMOL® umzusetzende Substanz wird in einem Verhältnis von 1 Mol JOMOL zu 0,8 bis 1,2 Mol der anzukoppeln den Verbindung umgesetzt, wobei man für das JOMOL® ein mittleres Molekular gewicht von ca. 4000 annimmt. Die Verbindung, die an JOMOL® angekoppelt wird, wird in einem wasserfreien Medium gelöst oder homogen suspendiert. Im Falle von Zinn(II)-chlorid wird eine salzsaure wäßrige Lösung verwendet. Das Reaktionsgemisch wird während einer Zeit von einigen Minuten bis 60 Minuten bei einer Temperatur im Bereich von 15 bis 40°C stehengelassen. Das Produkt kann direkt verwendet werden. Es kann auch durch Chromatographie gereinigt und isoliert werden.

Chromatographie und Reinigung erfolgen auf ähnliche Weise, wie für JOMOL® selbst beschrieben. Es werden Sephadex®-Säulen verwendet, und als Eluierungs mittel werden die oben erwähnten Puffer eingesetzt.

Werden die Kopplungsprodukte selbst direkt als Diagnostikum verwendet, ist es bevorzugt, möglichst reine Lösungen umzusetzen und die erhaltenen Lösungen direkt, gegebenenfalls nach Sterilisation, zu verwenden.

Es wurden folgende Kopplungsprodukte hergestellt:

1. Kopplungsprodukt aus JOMOL® und Diethylentriaminpentaessigsäureanhydrid

Dieses Produkt wird als "JOMOL®-DTPA" oder als "JOMO®-In" bezeichnet. Es eignet sich zur Beladung mit ¹¹¹Indium oder mit ^99mTechnetium, welches mit Zinn(II)-chlorid reduziert wurde. Die mit einem radioaktiven Marker markierten Produkte sind insbesondere für die Diagnostik geeignet.

2. Kopplungsprodukt aus JOMOL® und Zinn(II)-chlorid

Dieses Produkt wird als "JOMOL®-Sn" oder "JOMO®-tech" bezeichnet. JOMOL®-Sn ist insbesondere für die Beladung mit ^99mTechnetium geeignet.
Das markierte Produkt ist für die Diagnose von Tumoren besonders gut geeignet.
Das Produkt wird durch Umsetzung einer JOMOL®-Lösung mit einer salzsauren, wäßrigen Zinn(II)-lösung hergestellt.

3. Kopplungsprodukt aus JOMOL® und Uridin

Dieses Produkt wird als "JOMO®-J/U" bezeichnet und ist zur Markierung mit radioaktivem Jod besonders geeignet. Das markierte Produkt kann zur Diagnose oder Therapie verwendet werden.
Die Herstellung erfolgt durch Umsetzung von JOMOL® und Uridin-2′, 3′-dialdehyd in einem wasserfreien Lösungsmittel.

4. Kopplungsprodukt aus JOMOL® und Fluoresceinisothiocyanat

Das Produkt wird als "JOMO®-Color" bezeichnet. Es eignet sich insbesondere zur Diagnostik und/oder Therapie. Die Produkte 3 und 4 sind besonders gut für die Markierung mit radioaktivem Jod geeignet. Die Produkte werden für die Diagnostik verwendet.

5. Kopplungsprodukt aus JOMOL® und einer Vorstufe von Kryptofix 222

Dieses Produkt wird als "JOMO®-Ce" und auch als "JOMO®-Ra" bezeichnet. Das Produkt wird hergestellt, indem JOMOL® mit einer Vorstufe von Krypto fix 222®, die CE bezeichnet wird, umgesetzt wird. Das CE-Molekül besitzt folgende Struktur:

CE enthält die komplette Amidbindung im Kronenether (im Gegensatz zum Kryptofix 222®).
Die Verbindung ist besonders für die radioaktive Markierung mit Radium geeignet. Es ist eine längere Inkubationszeit mit ²²⁴Ra zu dessen Auf nahme nötig als beim Kryptofix 222®. Die Stabilitätskonstante hinsichtlich der Radiumbindung ist für CE und Kryptofix 222® gleich: lgK = 6,64 (dieser Logarithmus ist für Radium höher als für alle in Frage kommenden anderen Metallionen). Das angebundene Radium kann hinsichtlich seiner Bindung nur durch ein saures Milieu abgelöst werden (im Magen instabil, im übrigen Körper stabil) Ansäuerungen müssen nach der Bindung des Radium an CE unterbleiben.

JOMOL® und seine oben beschriebenen Kopplungsderivate werden als Trägersub stanz für Farbstoffe, Arzneimittel und radioaktive Marker verwendet. Da sich diese Substanzen, wie oben erwähnt, an Krebszellen anreichern, ist es somit möglich, die Krebszellen gezielt nachzuweisen oder gezielt zu behan deln. Es ist dadurch möglich, die Wirkstoffe, wie beispielsweise die radio aktiven Marker, die einerseits zum Nachweis der Krebszellen und anderer seits auch zur Zerstörung der Krebszellen dienen, gezielt an die Krebszellen zu bringen.

Das oben genannte Kopplungsprodukt aus JOMOL® und Fluoresceinisothiocyanat ist ein besonders bevorzugtes erfindungsgemäßes Produkt, da es sowohl für die Diagnose und Therapie als auch zur Markierung mit radioaktivem Jod geeignet ist.

Die Herstellung von markiertem JOMOL® oder der markierten JOMOL®-Derivate, die mit einem Arzneimittel oder einem Farbstoff markiert sind, erfolgt, indem man eine JOMOL®-Lösung, wie oben bei der Herstellung der Kopplungs produkte angegeben, oder indem man eine Lösung oder Suspension der Kopplungs produkte in geeigneter Konzentration mit einer Lösung oder Suspension eines Arzneimittels oder eines Farbstoffes umsetzt. Im allgemeinen werden äqui molare Mengen von JOMOL® und dem Farbstoff in einem polaren Lösungsmittel zusammengebracht. Danach wird eine äquimolare Menge eines Vernetzungsmittels (Glutaraldehyd) in an sich bekannter Weise zugesetzt und zur Kopplung der Komponenten verwendet. Die Reaktionstemperatur beträgt 15 bis 40°C. Anschließend erfolgt eine chromatographische Reinigung.

Die Herstellung der mit einem radioaktiven Marker markierten Produkte er folgt, indem man JOMOL® oder ein Kopplungsprodukt von JOMOL® oder eine Lösung mit einer Salzlösung des radioaktiven Markers umsetzt und das radioaktive Produkt in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Säulenchromato graphie, gewinnt. Die Markierung mit radioaktiven Strahlern ist in der Literatur beschrieben. Beispiele für radioaktive Strahler sind die Strahler, die man üblicherweise auf dem Gebiet der Therapie und der Diagnose von malignen Tumoren verwendet, wie beispielsweise ^99mTechnetium, ¹¹¹Indium, ¹²⁵Jod, ¹³¹Jod und ²²⁴Radium. Die Radioaktivität kann beispielsweise 185 KBq bis 7.4 GBq betragen.

Bei Beladung von JOMOL® einem Radionuclid zeigt der Peak von JOMOL® mit einem apparenten Molekulargewicht von 3000 in einem FPLC-Elutionsmuster die höchste Bindung des Radionuclids. Dasselbe gilt für JOMO®-tech, JOMO®-In und JOMO®-Ra. (Fig. 3) Bei JOMOL®-Sn^99cTc, JOMOL®-DTPA-¹¹¹In und JOMOL®CE-²²⁴Ra wurde nach fünftägiger Lagerung in wäßriger Lösung (0,5 mg/ml bei -20°C) nach der Markierung keine Autoradiolyse festgestellt.

Erfindungsgemäß ist es auch möglich, Gemische aus JOMOL® und seinen mit einem radioaktiven Strahler, einem Farbstoff oder einem Cytostatikum markierten Derivaten zu verwenden.

Gemäß der vorliegenden Erfindung können JOMOL®, seine Kopplungsprodukte und die entsprechend markierten Derivate, wie oben beschrieben, auf Liposomen oder in lipidierter Form verwendet werden. Liposomen sind kugelförmige Gebilde aus einer oder mehreren Lipiddoppelschichten mit einem Innenraum. Derartige Bläschen lassen sich durch mechanische Feinstverteilung von Phospholipiden, wie zum Beispiel Lecithin, in wäßrigen Medien herstellen. Erfindungsgemäß werden Liposomen verwendet, die einzelne unilamellare Bläschen (SUV) sind und vorzugsweise aus Phosphatidylcholin : Phosphatidyl serin : Cholesterol im molaren Verhältnis 8 : 2 : 10 bestehen und durch Sonication hergestellt werden. Die Lipide, aus denen sie hergestellt werden, sind im Handel erhältlich. Die Lipide werden in Ether gelöst, durch Säulenchromatographie gereinigt, unter N₂ mit JOMOL® bzw. seinen Derivaten vermischt, in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), beispielsweise bei pH 7,4 suspendiert und dann beispielsweise 25 Minuten bei +2°C mit einem pulsierenden Sonicator beschallt (sonicated). Die Sonication wird im allgemeinen unter N₂ durchgeführt. Nach der Beschallung (Soni cation) werden die Liposomen auf einer Sepharose®-4-B-Säule chromatographiert und vorzugsweise die Fraktionen der Population mit Radii unter 30 nm benutzt. (C. Huang, Biochemistry 15, 2362 1969).

Diese Liposomen werden dann zur Diagnostik in an sich bekannter Weise mit vorzugsweise ^99mTechnetium am JOMOL® markiert. Um die radioaktive Markierung zu prüfen, wird ein Aliquot der Liposomen auf eine Sepharose®-4-B-Säule gegeben und chromatographiert. Man stellt fest, daß die Präparation eine spezifische Aktivität von 99,2% an JOMOL® gebundener Radioaktivität und 0,8% von freiem Pertechnetat hat. Die Liposomen können mit JOMOL® bzw. seinen Derivaten beschickt sein, die mit einem radioaktiven Tracer, mit einem Farbstoff, einem Cytostatikum oder mit Gemischen dieser Verbindungen be schickt sind. Derartige Liposomen sind insbesondere für die Diagnose ge eignet. Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird JOMOL® oder JOMOL-Derivat, gegebenenfalls - wie oben erläutert - beschickt, in einem Lipid dispergiert. Die Dispersion erfolgt, indem man die Substanzen zu sammenbringt und ebenfalls einer Beschallung unterwirft. Als Lipide kann man Phosphatidylcholin allein oder mit Phosphatidylserin und Cholesterol zusammen, beispielsweise im molaren Verhältnis 8 : 2 : 10, verwenden.

Wie oben erwähnt, ist bekannt, daß ein Gemisch aus Acetaldehyd und Ethanol eine cancerotoxische Wirkung hat. Überraschenderweise wurde jetzt gefunden, daß JOMOL® der seine Derivate eine besonders gute Wirkung entfalten, wenn sie zusammen mit einem Hilfsmittel, welches als "Cocktail" bezeichnet wird, verabreicht werden. Das Hilfsmittel enthält einen Aldehyd der allgemeinen Formel I

RCHO (I)

worin R ein Wasserstoffatom oder eine geradkettige oder verzweigte Kohlen wasserstoffgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, und gegebenen falls einen Alkohol der allgemeinen Formel II

R¹CH₂OH (II)

worin R¹ die für R gegebene Bedeutung besitzt. Das Hilfsmittel enthält gegebenenfalls übliche Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel. Es ist besonders bevorzugt, daß das Hilfsmittel zusätzlich zu dem Aldehyd einen Alkohol enthält. Überraschenderweise zeigte es sich, daß bei gleichzeitiger und bei zeitlich abgestufter Verwendung des Hilfsmittels zusammen mit JOMOL® oder JOMOL®-Derivaten der Wirkungsgrad von JOMOL® bzw. JOMOL®-Derivaten wesent lich verbessert wird. Die Erfindung betrifft somit ein diagnostisches Mittel, welches das oben beschriebene diagnostische Mittel oder Arznei mittel und das oben beschriebene Hilfsmittel enthält.

Das Hilfsmittel in dem erfindungsgemäßen diagnostischen Mittel kann den Aldehyd als solchen in üblichen pharmakologisch verträglichen Trägern und/oder Verdünnungsmitteln enthalten. Besonders bevorzugt ist es, den Aldehyd in wäßriger und/oder alkoholischer Lösung einzusetzen. Erfindungsgemäß ist es dabei besonders bevorzugt, den jeweiligen Aldehyd zusammen mit seinem zugehörigen Alkohol zu verwenden.

Bevorzugte Hilfsmittel setzen direkt oder indirekt frei und/oder enthalten:
Formaldehyd/Methanol, Acetaldehyd/Ethanol, n-Propionaldehyd/n-Propanol, n-Butyraldehyd/n-Butanol, iso-Butyraldehyd/iso-Butanol, n-Valeraldehyd/n-Pen tanol oder Gemische dieser Verbindungen. Das Stoffpaar Acetaldehyd/Etha nol ist in der erforderlichen Konzentration und Menge praktisch ungiftig; man kann es in geeignet hohen Dosen verabreichen. Daraus resultiert die Möglichkeit einer Dauerbehandlung, auch in Kombination mit einer Strahlen behandlung. Das immunbiologische System wird positiv beeinflußt, und eine Kombination mit anderen Medikamenten sowie mit chirurgischen und radio logischen Maßnahmen ist möglich.

Außer dieser Mischung Ethanol/Acetaldehyd sind grundsätzlich auch andere analoge Mischungen der oben genannten Art möglich. Methanol wird im mensch lichen Körper wesentlich langsamer abgebaut als Ethanol, Propanol um den Faktor 2 schneller als Ethanol. Das Mittel kann jeweils nur einen bestimmten ausgewählten. Aldehyd wie auch Aldehydmischungen enthalten. Die Anwendung der Aldehyde ist nicht zwingend mit der Anwesenheit der entsprechenden Alkohole gekoppelt. Auch wäßrige Lösungen der Aldehyde können eingesetzt werden. Anstelle der freien Aldehyde können erfindungsgemäß auch solche Aldehydderivate zum Einsatz kommen, die im Stoffwechsel des mit dem erfin dungsgemäßen pharmazeutischen Mittel Behandelten den freien Aldehyd bilden. Geeignete Aldehydderivate sind beispielsweise die Acetale oder Halbacetale Kondensationsprodukte, die ebenfalls als solche oder in gelöster Form (Wasser oder Alkohole) wie auch in Mischungen mit den Aldehyden und/oder Alkoholen Verwendung finden können. In einer bevorzugten weiteren erfindungs gemäßen Ausführungsform enthält das Hilfsmittel geringe Mengen (weniger als 0,05 Gew.-%) an Peroxiden, wobei insbesondere die hier stofflich verwandten Peroxide in Betracht kommen, insbesondere H₂O₂ und/oder das Aldehydperoxid bzw. Hydroxyhydroperoxid sowie das Peroxid der zugehörigen Carbonsäure. Durch den Gehalt an Peroxiden wird die antitumorale Wirkung noch weiter verbessert.

Die Konzentration des Aldehyds im erfindungsgemäßen Präparat ist einer seits durch dessen Verträglichkeit und andererseits durch die zu verab reichende Dosis bestimmt. Für das Paar Ethanol/Acetaldehyd ist eine Acet aldehydkonzentration im Alkohol unter 2 × 10^-4 Mol/Liter häufig in der Wirkungs weise unbefriedigend langsam. Die Wirkung steigt mit steigender Aldehyd konzentration und ist nach oben hin in der Regel durch möglicherweise ein tretende Unverträglichkeit des Acetaldehyds im Einzelfall begrenzt. In der Praxis bewährt haben sich beispielsweise Ethanol-Aldehyd-Lösungen mit 5 × 10^-2 Mol bis 1 Mol Acetaldehyd pro Liter Ethanol, wobei diese Mischungen in einer Dosis von beispielsweise 10 bis 150 cm³ pro Tag Verwendung finden können. Es ist bevorzugt, daß das Hilfsmittel 10 bis 60 g Aldehyd pro 1000 g Alkohol, besonders bevorzugt 40 g Aldehyd pro 1000 g Alkohol, enthält. Im allgemeinen wird das Hilfsmittel für die Verabreichung mit Wasser verdünnt. Die alkoholische Lösung kann mit Wasser beliebig verdünnt werden. Beispiels weise kann man ein Volumen der alkoholischen Lösung mit 1 bis 10 Volumen, vorzugsweise 2 bis 5 Volumen, Wasser verdünnen.

Das Hilfsmittel wird bevorzugt oral in Form der wäßrigen Lösung verabreicht und vom Patienten getrunken. Das Hilfsmittel kann jedoch auch parenteral verabreicht werden.

In dem erfindungsgemäßen Erzeugnis bzw. Kit können die beiden Bestandteile jeweils auf unterschiedliche Weise kombiniert sein. Das Hilfsmittel kann in einer für die orale Verabreichung und/oder für die parenterale Verabreichung, zum Beispiel durch Infusion, geeignete Form vorliegen. Die Zubereitung von Infusionslösungen ist dem Fachmann geläufig und kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Beispielsweise kann das Hilfsmittel in Form von Trinkam pullen vorliegen oder es kann in Form von Trinkampullen, die mit Wasser verdünnt werden, vorliegen.

Für die Diagnose ist es bevorzugt, zuerst das Hilfsmittel oral als wäßrige Lösung und ca. 20 bis 30 Minuten später das Diagnostikum parenteral, bevor zugt intravenös, zu verabreichen.

JOMOL® und seine Derivate (unter "JOMOL®-Derivaten" werden in der vorliegenden Anmeldung alle Kopplungsprodukte und markierten Produkte verstanden) dringen überraschenderweise leicht durch die Zellwände hindurch, insbesondere durch die Wände von Lungenalveolen, Lymph- und Blutkapillaren, und reichern sich an Krebszellen an, wo sie leicht nachgewiesen werden können. Dadurch werden eine neue Diagnostik und eine neuartige Behandlungsweise von malignen Tumoren ermöglicht, da das mit einem radioaktiven Marker markierte JOMOL® bzw. solche JOMOL®-Derivate unmittelbar zum malignen Tumor gelangen und dort zur Erkennung und Behandlung des Tumors die höchstmögliche Wirkung erbringen. Das erfindungsgemäße Diagnostikmittel kann zur Diagnostik von malignen Tumoren in vivo und vitro verwendet werden. Die malignen Tumoren können außerhalb des Körpers diagnostiziert werden. Beispielsweise kann der Chirurg bei einer Operation malignes Gewebe entfernen und dann das lebende Gewebe außerhalb des Organismus inkubieren, so daß im flachen Anschnitt des Ge webes, zum Beispiel bei Farbmarkierung mit Fluoresceinisothiocyanat im UV-Licht malignes Gewebe aufleuchtet und von dunklem gesundem Gewebe sofort unterschieden werden kann.

Wenn JOMOL® bzw. eines seiner Derivate mit einem radioaktiven Strahler mar kiert ist, erfolgt die Sichtbarmachung der radioaktiven Verteilung unter Verwendung einer externen Gamma-Kamera. Dargestellt werden mit der externen Gamma-Kamera verschiedene Melanosarkome, Plattenepithelkarzinome und Adeno karzinome der weiblichen Brust.

Fluoresceinisothiocyanat oder ^99mTechnetium bleiben an der Krebszellenwand an JOMOL® bzw. dessen Derivat gebunden und sind dort fluoreszenzmikroskopisch bzw. autoradiographisch nachweisbar. Beim Abbilden mit der Gamma-Kamera ist im Modell mit der SD-Ratte an Walker-Carcinosarkom 256 die Anbindungsrate der erfindungsgemäß beanspruchten Substanz unter gleichzeitigem Einsatz der Kombination (Cocktail) aus Ethanol/Acetaldehyd/Wasser 2,5- bis 8 mal höher als am gesunden Gewebe (im Seitenvergleich). Beim Menschen ist das Anbindungs verhältnis höher. Da JOMOL® auf dem Blutwege im Körper verteilt wird und über Nieren, Leber und Lunge in Urin, Galle und abgeatmete Luft ausgeschieden wird, sind bei entsprechender Markierung des JOMOL® bzw. seiner Derivate mit radioaktiven Isotopen bei Darstellung mittels Gamma-Kamera außer Krebs und seinen Metastasen in Weichteilen und Knochen auch Funktions- bzw. Clearance- Untersuchungen bei diesen Passagen durchführbar.

Pharmakologische Untersuchungen 1. Toxizität

JOMOL® und seine Derivate sind praktisch untoxisch. Im Screening nach Robert A. Turner fanden sich für JOMOL®, JOMO®-tech, JOMO®-In und JOMO®-Color bei einer Überdosis der Humantagesdosis vom 4000- bis 5000fachen, d. h. in einer Menge von 2 mg/kg Körpergewicht, an SPF-Mäusen keine Abweichung von Normalbefunden. Die Verträglichkeit erscheint ausgezeichnet, unerwünschte Nebenwirkungen traten nicht auf.

2. Bindung von radioaktiv markierten JOMOL®-Derivaten an-maligne und benigne Zellen in vitro

Um zu zeigen, daß JOMOL® und seine Derivate an Karzinomzellen besonders leicht gebunden werden, wurden Vergleichsversuche durchgeführt. Es wurde das Bindungsverhalten der radioaktiven Komponenten JOMOL®-DTPA-¹¹In, JOMOL®-CE-²²⁴Ra und JOMOL®-Sn-^99mTc an Karzinomzellen und an gesunden, Zellen in vitro geprüft. Als Karzinomzellen wurden embryonale Mäusezellen F9 und als gesunde Zellen Mäusefibroblasten L929 verwendet.

In einem weiteren Versuch wurde gezeigt, daß die Anbindung besonders ausge prägt ist, wenn vor der Verabreichung der radioaktiven Komponenten der er findungsgemäße Cocktail verabreicht wird.

Für die Bewertung der Bindungsergebnisse ist es erheblich, daß das Volumen einer durchschnittlichen gesunden Fibroblastenzelle L929 etwa dreimal so groß ist wie das einer malignen F9-Zelle, die Oberfläche demzufolge zweimal so groß. Zudem ist das Verhältnis der Zellwand- und Adhäsionsmatrix zur Zelle bei den gesunden L929-Zellen deutlich größer als bei den malignen F9-Zellen.

Das Ergebnis der Bindungsexperimente ist in der folgenden Tabelle 1 zu sammengefaßt. Summarisch kann festgestellt werden, daß die embryonalen Mäusekarzinomzellen F9 JOMOL®-DTPA-¹¹¹In, JOMOL®-CE-²²⁴Ra und JOMOL®-Sn-^99mTc um einen Faktor von ca. 30 bis 60 besser binden. Es ist eine tendenzielle Steigerung des Bindungsverhältnisses durch Zusatz des Cocktails aus Alkohol und Acetaldehyd erkennbar.

Tabelle I

Verhältnis der spezifischen Zellmarkierung (cpm/10⁶ ausgesäte Zellen normiert) von embryonalen Mäusekarzinomzellen F9 zu Mäusefibroblasten L929 (F9/L929

3. Bindung des radioaktiv markierten JOMOLS® an malignes Tumorgewebe in vivo a) Bindung an Walker-Carcinosarkom 256 in der Sprague-Dawley-Ratte

Je drei weiblichen Sprague-Dawley-Ratten wurde 4 Tage nach subkutaner Transplantation von Walker-Carcinosarkom 256 0,8 ml einer JOMOL®-DTPA-¹¹¹In- Lösung bzw. einer JOMOL®-Sn-^99mTc-Lösung appliziert. Die erste Lösung enthielt ca. 80 nmol/ml JOMOL®-DTPA-¹¹¹In in einer spezifischen Markierung von ca. 175 GBq/mmol. Die zweite Lösung enthielt ca. 68 nmol/ml. JOMOL®-Sn-^99mTc in einer spezifischen Markierung von ca. 925 GBq/mmol. Allen Tieren wurde 30 Minuten vor i.v. Gabe des markierten JOMOLS® 1 ml Cocktail oral verabreicht (Cocktail: 22,5 ml physiologische Kochsalzlösung, 2,4 ml Ethanol, 0,26 ml Acetaldehyd). Die Tiere wurden 24 Stunden p.a. in Chloralhydrat-Narkose aus dorsaler Sicht szintigraphiert.

Der Tumor war bei allen Tieren deutlich abgrenzbar. Die Tumormarkierung, angegeben als Quotient der spezifischen Anreicherung an Tumor und Muskelge webe ergab sich für JOMOL®-DTPA-¹¹¹In zwischen 4 : 1 bis 8 : 1, für JOMOL®-Sn-^99mTc zwischen 4 : 1 bis 6 : 1. In weiteren Folgeexperimenten wurden recht häufig Bindungsverhältnisse bei 8 : 1, in Einzelfällen bis zu 36 : 1 gefunden.

b) Verteilung von JOMOL®-Sn-^99mTc in der tumortragenden Sprague-Dawley-Ratte

Fünf weibliche Sprague-Dawley-Ratten wurden 4 Tage nach subkutaner Trans plantation von Walker-Carcinosarkom 256 in die rechte Seitenflanke jeweils 0,5 ml einer JOMOL®-Sn-^99mTc-Lösung in die Schwanzvene injiziert. Die Lösung enthielt 25 nmol/ml JOMOL®-Sn-^99mTc in einer spezifischen Markierung von 925 GBq/mmol. 30 Minuten vor Applikation wurde den Tieren 2,5 ml Cocktail oral verabreicht (Cocktail: 22,5 ml physiologische Kochsalzlösung, 2,4 ml Ethanol, 0,26 ml Acetaldehyd). Zwei der Tiere ergaben im Scintigramm ein Anbindungsverhältnis (spezifische Anreicherung im Tumor zu spezifischer Anreicherung im Muskelgewebe) von 6 : 1 bei einem mittleren Tumorgewicht von ca. 1,5 g.

Scintigraphisch konnte der Tumor bereits 30 Minuten nach Applikation abge grenzt werden. Extrapoliert auf die Verhältnisse beim Menschen kann erwartet werden, daß hier eine Tumorscintigraphie bereits 3 Stunden nach Applikation möglich ist. Zur Ermittlung der Verteilung in den Organen wurden die Tiere eine Stunde nach Injektion dekapitiert und weitgehend entblutet. Die in Tabelle II aufgeführten Organe wurden entnommen und gewogen; die enthaltene Radioaktivität, wurde in einem Gamma-Counter gemessen.

Die folgende Tabelle II zeigt die Verteilung der Radioaktivität eine Stunde nach Applikation.

Ein nicht unbeträchtlicher Anteil der Radioaktivität wurde innerhalb einer Stunde renal ausgeschieden; die geschätzte Clearance beträgt 0,5 ml/min.

Tabelle II In-vivo-Verteilung von ^99mTc-JOMOL® in der tumortragenden Ratte eine Stunde nach intrayenöser Applikation, (n=5, Sprague-Dawley, Walker-Carcinosarkom 256)

Organ
% d. Dosis/g
Blut
0,46±0,01
Leber	0,17±0,05
Milz	0,09±0,01
Magen	0,14±0,02
Nieren	3,34±0,29
Herz	0,16±0,02
Lunge	0,24±0,02
Muskel	0,05±0,01
Thymus	0,11±0,04
Femur	0,09±0,02
Tumor	0,32±0,05

c) Am Menschen wurden verschiedene maligne Tumoren dargestellt. Mit Hilfe einer Gamma-Kamera wurden 3 Stunden nach intravenöser Gabe von JOMO®-tech (740 MBq^99mTc) bzw. JOMO®-In (74 bis 111 MBq¹¹¹Indium)) in den meisten Fällen wurde eine halbe Stunde zuvor eine Dosis Cocktail - 24 ml Ethanol, 1 ml Acetaldehyd, 225 ml Wasser - oral verabreicht) die Tumoren abgebildet. Am Ort der Tumorabbildung wurde mit an deren Untersuchungen (zum Beispiel histologisch) der Tumor verifiziert. Das Ver hältnis Tumorareal/Nichttumorareal lag hinsichtlich der durch die Gamma-Kamera detektierten Strahlung über 10 : 1, in der Leber über 8 : 1.

4. Zur diagnostischen Wirkung von JOMO®-Color (JOMOL®-Fluoresceinisothyocyanat) (JOMOL®-Fitc)

Aus Versuchen mit Fitc-markierten Lymphozyten ist bekannt, daß diese in vivo in wenigen Stunden phagozytiert werden. Segmentkernige Leukozyten (Granulozyten) be sitzen proteolytische Enzyme und Lysozym. Das Lysozym dient zur Spaltung von Murein in Bakterien.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß das durch Fitc "verfremdete" Murein bruchstück JOMO® (bei Cocktail-Gabe verstärkt) an Tumorzellen gebunden im Bereich der proteasenveränderten Zellwandmatrix Granulozyteninvasionen auslöst. Wenn Walker-Carcinosarkom 256-Ascites mit JOMOL®-Fitc, Ethanol/Acetaldehyd und p-Hydro xyphenil-ketopropionsäureantagonisten (die durch Konkurrenz an deren Rezeptoren wirken) oder tyrosinanaloge Moleküle und Monoaminooxidasehemmer in Sprague-Dawley- Ratten behandelt wird, so findet man nach 24 Stunden, beispielsweise nach Einsatz von JOMOL®-Fitc, Ethanol/Acetaldehyd und Cotrimoxazol im Punktat des Ascites eine sehr große Zahl von Leukozyten und eine subtotale regressive Veränderung der Ascitestumorzellen. Die Kontrollen zeigen vitale Tumorzellen und spärlich Leuko zyten. Beispiele für die obigen genannten tyrosinanalogen und Tyrosinabbauprodukt antagonisten sind Sulfamethoxazol und Isoniazid mit dem Monoaminooxidasehemmer Tranylcypromin. Dieser Effekt ist wie die selektiv auftretende Fluoresenz der Krebszellwände (fluoreszenz-)mikroskopisch bereits 10 bis 15 Minuten nach i.v.-Appli kation von JOMO®-Color festzustellen.

Ausführungsbeispiele

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung von JOMOL®

Nocardia opaca (ATCC 21 953 DSM 202) werden auf DST-Platten oder Traubenzuckeragar, 2% in Plattentechnik auf drei bis vier Platten 5 bis 8 Tage kultiviert. Nach dem Abernten werden die Bakterien auf ca. 100 ml normale Nährbouillon verimpft und über Nacht bei 30 bis 37°C bebrütet.

Das Ernten der Nocardia-Bakterien erfolgt vorzugsweise durch Abzentrifu gieren, beispielsweise bei 4000 Umdrehungen/Minute, 5 bis 10 Minuten lang in einer Kühlzentrifuge mit einem Rotor von 40 cm Durchmesser. Der erhaltene Bodensatz (ca. 5 g Bakterien) wird in 100 ml beispielsweise 0,01M Tris/HCl-Puffer (pH 7,4), vorzugsweise mit EDTA-Na₂ (0,06%) suspendiert (Waschvorgang), wie oben angegeben, abzentrifugiert und in ca. 100 ml 0,01M Tris/HCl-Puffer von pH 7,4 mit vorzugsweise 0,06% EDTA-Na₂ und mit 10% Glucose suspendiert. Nach ca. 30 Minuten werden 10 mg Lysozym und vorzugsweise zur Herabsetzung der Viskosität 3 mg Desoxy ribonuclease zugesetzt.

Diese Phase mit Glucose und Fermenten dauert 2 Stunden und findet bei 30 bis 37°C statt. Dann kann, wie oben angegeben, abzentrifugiert werden. Der Bodensatz kann in 100 ml 0,01M Tris-HCl-Puffer mit 0,06% EDTA-Na₂ resuspen diert werden und erneut abzentrifugiert und im selben Medium resuspendiert werden. Dieser Waschvorgang kann unterbleiben, aber durch ihn wird mehr Wandmaterial der Bakterien und Nährmedium aus dem abschließend verwendeten Überstand entfernt.

Danach werden die Zellen zerstört. Dies kann mit allen geeigneten Methoden geschehen, bevorzugt wird Ultraschall über 1 Minute.

Danach wird bei 4 bis 6°C in der Kühlzentrifuge (wie oben beschrieben) bei 4000 Upm 10 bis 15 Minuten lang zentrifugiert. Das UV-Spektrum des Über standes ist in Fig. 1 dargestellt.

Der Überstand wird vorzugsweise in fünf Teile geteilt und auf fünf vorbe reitete Sephadex®-G-75-Säulen zu je einem Teil gegeben. Die Säulen sind 80 cm lang, Innendurchmesser 2,5 cm, die Sephadex®-Füllhöhe beträgt 60 cm (UV-Detektion bei 214 nm). Bei Verwendung einer Säule werden die übrigen Portionen bei -25°C bis zur Verwendung eingefroren. Die Fraktion hat ca. 4500 bis 900 Dalton. Sie tritt beim Eluieren zum Beispiel mit 0,01M Tris- HCl-Puffer (pH 7,4), mit 0,06% ETDA-Na₂ bei ca. 900 bis 980 ml durch, bei einer Tropfgeschwindigkeit von etwa 2 Tropfen pro Sekunde (über Nacht) nach ca. 12 Stunden in 1 bis 2 Stunden. Diese Fraktion enthält die aktive Frak tion, d. h., das gewünschte Produkt 2b*. Es folgt eine Lyophilisation. Danach wird vorzugsweise 1 Stunde bei 80°C inkubiert.

Wenn nicht lyophilisiert wird, dann sind die verdünnten Lösungen bei -20°C, besser bei -40°C bzw. -80°C, eingefroren aufzubewahren. JOMOL® wird durch Umsetzung von Fraktion 2b* (angenommenes mittleres Molekulargewicht 4000) mit Acetaldehyd im molaren Verhältnis 2b*: Acetaldehyd wie 1 : 2 erhalten. Danach muß erneut lyophilisiert werden, gegebenenfalls (siehe oben) einge froren werden.

Die Ausbeute für ca. 5 g Bakterien beträgt ca. 50 mg reines Produkt, d. h. JOMOL®. Das Produkt ist sehr hygroskopisch. Es besitzt die folgenden Eigen schaften: Absorptionsmaximum im UV-Spektrum bei 282,5 nm. Die Substanz wurde in Wasser gelöst, Referenz Wasser 1 cm Quarzküvetten; apparente Molekulargewichte bei 4500, 3000 und 900; je nach Restwassergehalt elfenbeinfarbig amorph-kristallin-flockig; pH-Wert von 5,5 (1 mg der Ver bindung, gelöst in 1 ml Wasser); schwach positive, rosa Ninhydrin-Reaktion; anfärbbar mit Orcin Ragens;
Peptidanteil: ca. 50%, bezogen auf amorphe Substanz (Proteintest nach L. Thomas, J. Clin. Chem. Biochem., Bd. 19, 1981, Seite 203-208, Coomassie Brilliant Blue G ₂₅₀R), folgende R_f-Werte (Lösungsmittelangabe Volumen : Volumen)

R_f = 0,20 (Butanol : Eisessig : Wasser 4 : 1 : 1)
R_f = 0,45 (Benzol : Eisessig : Wasser 2 : 1 : 2)
R_f = 0,685 (Methanol : Eisessig : Wasser 4 : 1 : 1)
keine Wanderung (Chloroform : Methanol 96 : 4)
R_f = 0,54 (Chloroform : Methanol 1 : 1)

Löslichkeit: schlecht löslich in unpolaren Lösungsmitteln, sehr gut löslich in polaren Lösungsmitteln; nachweisbare Bestandteile:

Substanzen
Verhältnis (Näherung)
Neutralzucker (Glucose, Galactose, Ribose)
(<) 1
Aminozucker (Glucosamin, Muraminsäure) (nach Hydrolyse)	3,5
Aminosäuren (Ala, Glu, iso-Gln, Gly, Lys, DAP)	4
Lipide	< 1
Phosphor	< 1

Struktur:
Peptidoglycanstruktur, deren Glycangerüst aus 3 bis 17 Disacchariden aus N-Acetylglucosaminyl-N-Acetylmuramyl besteht.

Beispiel 2 Herstellung des Hilfsmittels "Cocktail"

1000 ml Ethanol 96% und 40 g Acetaldehyd puriss. werden gemischt.

Eine Wirkdosis sind 25 ml davon.

Applikationsanleitung:
25 ml des Cocktails werden mit 225 ml Wasser gemischt und oral verabreicht. Die Tagesdosis beträgt 2 bis 3 Wirkdosen, auf ärztliche Anordnung kann höher dosiert werden. Der Cocktail darf bei Verdacht auf Hirnmetastasen nicht verabreicht werden.

Beispiel 3 Herstellungsbeispiel für JOMOL®-Derivate JOMOL®-Sn (wird auch als JOMO®-tech bezeichnet)

a) Allgemeine Arbeitsbedingungen:
Unter Stickstoff bei 0 bis 10°C arbeiten, Lösungen vor Verwendung mit Stickstoff durchblasen, Reaktionsgefäße säuregewaschen verwenden.
b) 20 mg JOMOL® werden in 100 µl 1N HCl gelöst, dann wird die Lösung 10 bis 15 Minuten stehengelassen. Danach wird 1 mg SnCl₂ × 2H₂O (fest) zugegeben und das Reaktionsgemisch ca. 20 Minuten stehengelassen. Es werden 2 ml einer 0,1N HCl, physiologischen Kochsalzlösung (0 bis 1°C) zugegeben.

Nach kräftigem Umschütteln werden je 20 µl der Lösung bei einer Stell flächentemperatur von -10 bis -20°C in vorgekühlte Durchstechflaschen eingefüllt. Die Durchstechflaschen werden sofort zugedeckelt und bis zum Gebrauch gefroren (ca. -20°C) aufbewahrt.

Beispiel 4 Mit ^99mTechnetium beladenes JOMOL®-Sn für die Diagnostik

Zur Markierung mit ^99mTechnetium wird in die gefrorene Durchstechflasche (Beispiel 3) 740 bis 3700 MBq^99mTc in einem Volumen bis zu 5 ml zugegeben (aus einem ^99mMolybdängenerator. Vor zugsweise wird das zweite Eluat des Präparationstages verwendet. Nach 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur (volles Licht vermeiden) ist das Präparat zur i.v.-Injektion für einen diagnostischen Test mit der Gammakamera ver wendbar.

Beispiel 5 Kopplungsprodukt aus JOMOL® und Diethylentriaminpentaessigsäure

Dieses Kopplungsprodukt ist zur Beladung mit ¹¹¹Indium oder mit durch SnCl₂ reduziertem ^99mPertechnetat geeignet.

a) Allgemeine Arbeitsbedingungen:
Die Reaktionsgefäße werden mit Säure gewaschen verwendet, es wird bei 0 bis 10°C unter Stickstoff gearbeitet, die verwendeten Lösungen sind stickstoffdurchblasen
b) 5 mg Diethylentriaminpentaessigsäure-Anhydrid werden in 5 ml absolutem Diethylether suspendiert (diese Suspension wird als S1 bezeichnet).
c) Ca. 200 µg JOMOL® werden in 300 µl Bicarbonatpuffer (0,05M, pH 7,0) in physiologischer Kochsalzlösung gelöst. Unter starkem Rütteln (Mixer, 30 bis 60 Sekunden) werden 25 µl der Suspension S 1 zugegeben und dann wird 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Der Ether dunstet hierbei ab.
Es folgt eine Chromatographie:
FPLC-Chromatographie:
Säule: Superose 12, HR 10/30, Code-Nr. 17-0538-01.
Aufgetragenes Volumen: ca. 300 µl
Laufmittel: physiologische Kochsalzlösung
Flußrate: 1 ml/min
Detektion: λ = 214 nm, HPLC-Pumpe.

In der Produktfraktion liegt JOMOL® vollständig als JOMOL®-DTPA vor. Die Bindung des DTPA an der Aminogruppe des Lysin des JOMOLS® ist stabil, andere Anbindungen hydrolysieren.

Beispiel 6 Markierung von JOMOL® Diethylendiaminpentaessigsäure mit ¹¹¹Indium

Zu ca. 220 µg JOMOL®-Diethylentriaminpentaessigsäure (im folgenden als JOMOL-DTPA bezeichnet) in 3 ml 5 mM Bicarbonatpuffer (pH 7,0) in physio logischer Kochsalzlösung werden ca. 74 MBq ¹¹¹Indium in 0,2 ml 40 mM HCl zugegeben. Nach Umschütteln und 15 Minuten Abwarten bei Raumtemperatur ist die erhaltene Lösung für eine intravenöse Injektion (i.v.) verwendbar. Die Prüfung erfolgt mit der Gammakamera.

Das mit ¹¹¹In markierte JOMOL®-DTPA führt bei FPLC-Chromatographie (214 nm, 0,1M Phosphatpuffer) zu dem in der Fig. 3 gezeigten Elutionsmuster. Im Diagramm ist die Verteilung der Radioaktivität auf drei separierbare Frak tionen angegeben.

Beispiel 7 Markierung von JOMOL®-Diethylendiaminpentaessigsäure mit ^99mTechnetium

Zur Markierung mit ^99mTechnetium wird zu 1 ml JOMOL-DTPA-Lösung (ca. 50 µg, gefroren) 100 µl einer salzsauren (0,1N HCl) 3 mM SnCl₂ × 2H₂O, physiologischen Kochsalzlösung gegeben und 10 Minuten abgewartet. Danach werden 740 bis 1850 MBq ^99mTechnetium in einem Volumen bis zu 5 ml zugegeben (vom zweiten Eluat des Präparationstages). Nach 10 bis 15 Minuten ist das Präparat zur i.v.-Injektion zum Test an der Gammakamera verwendbar.

Beispiel 8 Herstellung von JOMOL®-Kopplungsprodukten a) JOMOL®-Uridin (JOMOL®-J/U)

Die Herstellung erfolgt analog der Anbindung von Diethylentriamin pentaessigsäure, wie in Beispiel 5 beschrieben. Es werden 30 µg Uridin-2′, 3′-dialdehyd in 10 µl getrocknetem Diethylether gelöst. Das erhaltene Produkt wird, wie in Bei spiel 5 beschrieben, chromatographiert.

b) JOMOL®-L-Tyrosin (JOMO-J/Ts)

Die Herstellung des Kopplungsproduktes erfolgt auf gleiche Weise, wie in Beispiel 5 beschrieben, wobei α-Amino-β-[p-hydroxyphenyl]-propion aldehyd in einer Menge von 30 µg in 10 µl absolutem Diethylether ver wendet werden.

c) JOMOL®-L-Thyronin (JOMO-J/Tn)

Die Anbindung von α-Amino-β-[p-hydroxyphenyl[p-hydroxyphenylether)]- proprionaldehyd erfolgt auf gleiche Weise wie in Beispiels beschrieben.

Beispiel 9 Herstellung eines mit Jod markierten Kupplungsproduktes aus JOMOL®-Uridin/ JOMOL®-L-Thyrosin/JOMOL®-L-Thyronin/JOMO®-Color

Das gemäß Beispiel 8a) hergestellte Kopplungsprodukt aus JOMOL und Uridin wird mit einem geeigneten Radionuclid nach dem für Uridin üblichen Verfahren von entsprechenden Laboratorien durchgeführt.

Die gemäß den Beispielen 8b) und 8c) hergestellten Kopplungsprodukte und JOMO®-Color (vgl. Beispiel 12) werden in an sich bekannter Weise mit radioaktivem Jod markiert.

Beispiel 10 JOMOL® gebunden an eine Vorstufe des Kryptofix (JOMO®-Ra bzw. JOMOL®-CE)

Zu 200 µl einer wäßrigen Lösung von 1 mg JOMOL® gibt man 1 ml 0,2M Borat puffer (pH 8,0). Getrennt wird eine Lösung von einer Vorstufe des Kryptofix hergestellt. Die Vorstufe wird als CE bezeichnet.

Kryptofix Vorstufe (=CE); Kryptofix 222 = 4,7,13,16,21,24-Hexaoxo-1,10- diazabicyclo[8.8.8]hexacosan.

Die Lösung hat eine Konzentration von 1 mg pro ml Ethanol. 240 µl der ethanolischen CE-Lösung werden zu der obigen JOMOL®-Lösung zuge geben. Zu dem Reaktionsgemisch gibt man 160 µl Cyanoborhydridlösung (1 mg/ml 0,2M Boratpuffer, pH 8,0). Das Reaktionsgemisch wird 20 Stunden bei 37°C inkubiert und kann dann direkt zur Anbindung von radioaktivem Marker verwendet werden.

Beispiel 11 Markierung von JOMOL®-CE mit radioaktivem Radium

Nach der oben genannten Inkubation wird zum Reaktionsgemisch ²²⁴Radium als ²²⁴RaCl₂-Lösung bis 7.4 MBq gegeben und bei Raumtemperatur ca. 1 Stunde abgewartet. Die erhaltene Lösung wird auf eine Superose^TH-FPLC-Säule gegeben. Als Laufmittel wird 50 mM Kaliumphosphatpuffer von pH 6,8 in physiologischer Kochsalzlösung, 1 ml/min verwendet. Detektion bei 214 nm, und Radioakti vitätsmonitoring. Das Reaktions produkt und freies JOMOL® weisen im wesentlichen das gleiche Spektrum auf. Die fraktionierte Entnahme erlaubt die Abtrennung der niedermolekularen Komponenten des Reaktionsgemisches. Das Produkt wird in 2 Peaks eluiert. Nach Austritt von ca. 80% der aufgetragenen Radioaktivität wird am 2. Peak eine Schulter erkennbar. Die dieser Schulter zuzuordnenden Fraktionen und die nachfolgenden werden verworfen. Diese enthalten unter anderem das Cyanoborhydrid. Da JOMOL®-CE-²²⁴Ra nicht nur an Krebszelloberflächen ange reichert wird, sondern auch, wie das immunstimulierende reine Immunmodulator molekül, in Monozyten, Makrophagen, Mikrophagen und Knochenmarksstammzellen geht, muß vor der Verabreichung von JOMOL®-CE-²²⁴Ra i.v. darauf geachtet werden, daß diese Zellen das Produkt nicht aufnehmen können. Eine Be schränkung der Aufnahme von JOMOL®-CE-²²⁴Ra in immunkompetente und Knochen marksstammzellen ist mit hohen Dosen Cortisol i.v./i.m. in dem dem Fachmann geläufigen Abstand vor der Gabe der Aktivität erforderlich, weitere Maß nahmen sind durch Hinzuziehen eines Immunologen ad hoc zu ergreifen. Bei Unterlassung droht eine Leukämie. Das Medikament sollte hauptsächlich vor oder auch nach Mikroaussaat von Tumorzellen durch Operation eingesetzt werden (nicht bei Non-Hodgkin-Tumoren).

Beispiel 12 JOMOL®-Fluoresceinisothiocyanat (JOMO®-Color) zur Diagnostik und/oder Therapie

Arbeitsbedingungen: Raumtemperatur
Fluoresceinisothiocyanat in gesättigter Lösung in Ethanol 96%
JOMOL® 10 mg in 200 µl H₂O gelöst.

JOMOL® und Fluoresceinisothiocyanat werden im molaren Verhältnis 1 : 5 zusammen gegeben und 30 Sekunden im Ultraschall gemischt. Dann ca. 10 Minuten ab warten und über eine Säule 30 cm × 0,6 cm, Säulenbett 15 cm Sephadex-G-75, Laufmittel physiologische Kochsalzlösung 0,5 ml/min, fraktionieren. Fraktion 2,5 bis 9 ml enthält JOMO®-Color. Die Säule ist vorher mit 2 Läufen mit je 5 mg JOMOL®-Fitc zu aequilibrieren. Die erhaltene Fraktion wird ent weder sofort bei -20°C eingefroren, oder je 300 µg JOMOL®-Fitc proportioniert und lyophilisiert, unter Stickstoff verschlossen und bis zum Gebrauch bei -20°C aufbewahrt.

Beispiele für Kits und ihre Anwendungen 1) JOMO®-tech, Kit zur scintigraphischen Darstellung von malignen Tumoren mit der Gammakamera

Bestandteile:
a) Cocktail (Ethanol 96%, 50 g/Acetaldehyd puriss., 2 g) 2 × 1 Dosis, Schraubdeckelflasche
b) JOMO®-tech (200 µg JOMOL-Sn 20 µg Trockensubstanz, enthaltend JOMOL + 10 µg SnCl₂ × 2H₂O in 0,1N HCl, physiologischer Kochsalzlösung), Durchstechflasche, gefroren bei -20°C.
Anwendungsanweisung:
zu a) Cocktail: (nicht bei Hirnmetastasen)
1 Dosis = 25 ml aus der Schraubdeckelflasche
Cocktail mit 225 ml Wasser verdünnen und oral verab reichen, 30 Minuten warten, dann
zu b) JOMO®-tech: 740 bis 1110 MBq^99mTechnetium in physiologischer Kochsalzlösung (zweites Eluat des Präparationstages aus einem ^99mMolybdängenerator), in einem Volumen bis zu 5 ml, werden in die gefrorene Durchstechflasche (b) gegeben mit einer Spritze, die man darauf stecken läßt. Die Durchstechflasche (b) wird mehrmals umge schüttelt, 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann wird intravenös injiziert.

2) JOMO®-tech lyo, Kit zur scintigraphischen Darstellung von malignen Tumoren mit der Gammakamera

Bestandteile:
a) Cocktail (siehe [1a])
b) JOMO®-tech lyo (1350 µg JOMOL®-Sn 813 µg Trockensubstanz, enthaltend JOMOL®+ 30 µg SnCl₂ × 2H₂O + 8 µg Na-Acetat + 45 µg
Bernsteinsäure + 670 µg Lactose), lyophilisiert, Durchstechflasche gefroren bei -20°C
Anwendungsanweisung:
siehe (1) JOMO®-tech.

3) Smil-N/Tc, Kit zur scintigraphischen Darstellung von malignen Tumoren der Lunge mit der Gammakamera

Bestandteile:
a) Cocktail (siehe [1a])
b) JOMO®-tech (siehe [1b])
c) Liposomen in physiologischer Kochsalzlösung:
physiologische Kochsalzlösung, 5 ml, Durchstechflasche, ent haltend Liposomen, 5 mg, bestehend aus Phosphatidylcholin:
Phosphatidylserin : Cholesterol im molaren Verhältnis 8 : 2 : 10
Anwendungsanweisung:
zu a) Cocktail (siehe [1a])
zu b) JOMO®-tech (siehe [1b]). Anstelle der intravenösen Injektion wird in die Durchstechflasche (c) instilliert.
zu c) Inhalt von (b) und (c) wird zusammengebracht, umgeschüttelt und mit einem geschlossenen Inhalationssystem inhaliert.

4) JOMO®-In, Kit zur scintigraphischen Darstellung von malignen Tumoren mit der Gammakamera

Bestandteile:
a) Cocktail (siehe [1a])
b) JOMO®-In (200 µg JOMOL®, trocken, +20 µg DTPA = 220 µg JOMOL-DTPA in 3 ml physiologischer Kochsalzlösung, 5 mM Na-Bicarbonatpuffer, pH 7,0), Durchstechflasche, gefroren bei -20°C.
Anwendungsanweisung:
zu a) Cocktail (siehe [1a])
zu b) JOMO®-In auftauen und 74 bis 111 MBq ¹¹¹Indium in 0,2 bis 0,3 ml 40 mM HCl zugeben (InCl₃). Nach Umschütteln und 15 Minuten Ab warten bei Raumtemperatur ist die erhaltene Lösung für eine intra venöse Injektion zum Test an der Gammakamera verwendbar.

5) JOMO®-J, markiert mit ¹³¹Jod, Kit zur scintigraphischen Darstellung von malignen Tumoren mit der Gammakamera und zur Therapie

Bestandteile:
a) Cocktail (siehe [1a])
b) JOMO®-J, markiert mit ¹³¹Jod (ca. 250 µg JOMOL 25 µg JOMOL- Trockensubstanz + 37 MBq ¹³¹Jod) in 1 bis 2 ml PBS, 25 mM, 0,05N Essigsäure, Durchstechflasche, gefroren bei -20°C.
Anwendungsanweisung:
zu a) Cocktail (siehe [1a])
zu b) JOMO®-J, markiert mit ¹³¹Jod) auftauen und intravenös injizieren, danach erfolgt der Test an der Gammakamera.

Eine Blockierung der Schilddrüse mit Natiumperchlorat wird empfohlen. Zur Therapie werden auf Anordnung des handelnden Arztes gegebenenfalls höhere Dosen eingesetzt.

6) JOMO®-Ra, markiert mit ²²⁴Radium, Kit zur lokalen Strahlentherapie von Spurenaussaaten von Krebszellen (JOMOL®-Ce-²²⁴Ra für i.v./i.t.)

Bestandteile:
a) Cocktail (siehe [1])
b) JOMOL®-CE-²²⁴Ra (ca. 30 µg JOMOL®-CE-Trockensubstanz, markiert mit 7.4 MBq ²²⁴Radium) in 2 ml PBS, 25 mM, Durchstechflasche, gefroren bei -20°C.
Anwendungsanweisung:
zu a) Cocktail (siehe [1a])
zu b) JOMOL®-CE-²²⁴Ra:
Zwei Stunden vor der Behandlung mit JOMO-Ra 250 mg Cortisol i.v., dann Cocktail oral, dann (b) auftauen und intravenös oder intra tumoral applizieren.

7) JOMO®-Color, Kit zur intraoperativen Farbdiagnostik mit ultraviolettem Licht bei malignen Tumoren

Bestandteile:
a) Cocktail (siehe [1a])
b) JOMOL®-Fluoresceinisothiocyanat im molaren Verhältnis 1 : 5) aus 5 ml physiologischer Kochsalzlösung, lyophilisiert, Durchstech flasche, gefroren bei -20°C.
Anwendungsanweisung:
zu a) Cocktail bei Anwendung zur Therapie (siehe [1a]); bei Anwendung zur intraoperativen Diagnostik werden 5 bis 10 ml des Cocktails zur Herstellung einer Infusionslösung, die 10 bis 30 Minuten vor der i.v.-Gabe von (b) verabreicht wird, benutzt.

Es ist zu beachten, daß Morphin und seine Derivate durch den Cocktail in ihrer Wirkung 30- bis 40fach gesteigert werden.

zu b) JOMOL®-Fluoresceinisothiocyanat wird mit 5 ml H₂O (Ampuwa^⌀) gelöst und intravenös verabreicht.

Zur intraoperativen Diagnostik 10 bis 20 Minuten p.a. von (b) ist eine UV-Leuchte erforderlich (siehe Augenheilkunde, Zahnheilkunde)

8) JOMO®-Lab zur Schnelldiagnostik maligner Tumoren in vitro

Bestandteile:
Lyophilisat in Laborreinheitsgrad, nicht zur Anwendung in vivo. 300 µg Fluoresceinisothiocyanat-JOMOL®, 45 mg NaCl, Schraubdeckelflasche, gefroren bei -20°C.
Anwendungsanweisung:
In die Schraubdeckelflasche werden 5 ml H₂O gegeben, die Gewebsprobe wird dazugegeben, 5 Minuten bei Raumtemperatur abgewartet, die Gewebs probe in physiologischer Kochsalzlösung gewaschen.

Im Anschnitt der Gewebsprobe zeigt sich im ultravioletten Licht mit der Lupe oder im Fluoreszenzmikroskop das Tumorgewebe hell, das gesunde Gewebe dunkel. Der OP-Präparationsrand zeigt durch zellzerstörungsbe dingte Proteasenfreisetzung ebenfalls Fluoreszenz.

Claims

1. Diagnostisches Mittel, dadurch gekenn zeichnet, daß es einen mikrobiellen Extrakt, erhal ten durch

a) Züchtung von Nocardia opaca = Rhodococcus rhodo chrous (DSM 43 202 bzw. ATCC 21 953) auf einem Nährmedium,
b) Gewinnung der Zellen,
c) Suspendierung der Zellen in einem Puffer und 15 Minuten bis einige Stunden Stehenlassen der Sus pension,
d) Behandlung der Suspension mit einem murolytischen Enzym,
e) Zerstörung der Zellen,
f) Trennung des erhaltenen Materials in Bodensatz und Überstand,
g) Trennung des Überstands an Sephadex-Säulen unter Verwendung von Puffer als Eluierungsmittel,
h) Gewinnung der aktiven Fraktionen, die im UV-Spektrum eine Absorption bei 214 nm zeigen,
i) Umsetzung der aktiven Fraktionen mit Acetaldehyd in einem Molverhältnis von 1 mol aktiver Fraktion (angenommenes mittleres Molekulargewicht 4000) mit 1,8 bis 2,2 mol Acetaldehyd, gegebenenfalls gekoppelt mit einem Molekül, das einen radioaktiven Strahler und/oder einen Farbstoff binden kann, enthält und es zusammen mit einem Aldehyd der allgemeinen Formel I RCHO (I)worin R ein Wasserstoffatom und eine geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoff atomen bedeutet, wobei der freie Aldehyd auch direkt oder indirekt von Stoffen metabolisch freigesetzt werden kann, und gegebenenfalls einem Alkohol der allgemeinen Formel IIR¹CH₂OH (II)worin R die oben für R angegebene Bedeutung besitzt, sowie gegebenenfalls üblichen pharmazeutisch annehmbaren Träger stoffen und/oder Verdünnungsmitteln verwendet wird.

2. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß man als Molekül, das einen radioaktiven Strahler und/oder einen Farbstoff binden kann, Diethylentriaminpentaessigsäure oder 4,7,13,16,21,24-Hexa oxo-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosan (Kryptofix 222®) ein setzt.

3. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß man die Zellen in einem Puffer und einem Glucose enthaltenden Medium suspendiert.

4. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß man die Suspension mit einem murolytischen Enzym und mit Desoxyribonuclease behandelt.

5. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß man die Trennung des Über stands an Sephadex-Säulen unter Verwendung eines Puffers, der 0,1 bis 0,05% Dinatrium-Ethylendiamintetraacetat enthält, durchführt.

6. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß man den mikrobiellen Extrakt nach Anspruch 1 durch 5- bis 8tägiges Anzüchten der Bakte rien auf Traubenzucker-Agar-(2%)-Platten unter Verwendung von Nährbouillon als Nährmedium und Durchführung der Züch tung während einer Zeit von 10 bis 20 Stunden bei einer Tem peratur von 30 bis 37°C erhält.

7. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß man den mikrobiellen Extrakt nach der Gewinnung der Zellen ein oder mehrere Male mit Puffer pH 7,4, der gegebenenfalls 0,1 bis 0,05% EDTA-Na₂ ent halten kann, wäscht.

8. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß man als radioaktiven Strahler, der von dem Molekül gebunden werden kann, ^99mTechnetium, ¹¹¹Indium, ¹²⁵Iod, ¹³¹Iod oder ²²⁴Radium einsetzt.

9. Diagnostisches Mittel nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß es den mikrobiellen Extrakt, markiert mit ^99mTechnetium, enthält.