DE3543346A1

DE3543346A1 - Neue nucleosidderivate und verfahren zu ihrer herstellung

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Publication number: DE3543346A1
Application number: DE19853543346
Authority: DE
Inventors: Chung Il Williamsville N.Y. Hong
Original assignee: Boryung Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Boryung Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1984-12-07
Filing date: 1985-12-07
Publication date: 1986-06-12
Anticipated expiration: 2005-12-08
Also published as: KR860005574A; ES549587A0; ES8802363A1; FR2574411A1; ES8706163A1; GB2168350A; DE3543346C2; FR2574411B1; GB2168350B; GB8530115D0; ES557428A0; KR880000093B1

Description

15 Boryung Pharmaceutical Co., Ltd. 66-21 , Wonnam-dong Chongro-ku, Seoul, Korea

20 Neue Nucleosidderivate und Ver

fahren zu ihrer Herstellung

Beschreibung

25 Die vorliegende Erfindung betrifft neue Nucleosidderivate und Verfahren zur Herstellung neuer Nucleosidderivate der allgemeinen Formel I

O CH₂ - O - W

30 I' I

W-C-O-C-H _{0 0}

I Ii H CH₂- O-P-O-P-0

ι ι

0- 0-

l worin

B Adenin, Cytosin, 5-Fluoruracil, 5-Azacytosin, 6-Mercap-

topurin oder 7-Deazaadenin ist,

A und C jeweils Wasserstoffatome oder Hydroxylgruppen sind,

W ein gesättigter oder ungesättigter Alkylrest mit 8 bis 20 Kohlenstoffatomen oder ein 2- oder 3-Alkoxyalkylrest ist, und

W¹ ein gesättigter oder ungesättigter Alkylrest mit 7 bis 19 Kohlenstoffatomen ist
und deren Salze.

Die neuen Nucleosidderivate sind wertvolle Antikrebs- und Antivirusmittel.

In Formel I umfaßt das Phospholipid die L-, D- und DL-Formen eines optischen Isomeren und als Beispiel umfassen die erfindungsgemäßen Nucleoside 9-ß-D-Arabinofuranosyladenin (nachfolgend als ara-A bezeichnet), 1-ß-D-Arabinofuranosylcytosin (nachfolgend als ara-C bezeichnet), 5-Fluor-2'~ deoxyuridin oder ein anderes Nucleosid, welches als Antikrebs- und Antivirusmittel verwendet werden kann.

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verfahren zur Herstellung von verknüpften Verbindungen von 1-0-Alkylphospholipid und Nucleosid.

Die neue Verbindung nach Formel I wurde zuerst vom Erfinder synthetisiert.

Der Erfinder und seine Mitarbeiter [Journal of Medical

Chemistry, 25, 1322 (1982), Biochemical and Biophysical Research Communication 85, 715 (1978)] und andere Forscher [Biochimica et Biophysica Acta 69, 604 (1980)] beschrieben gg die Analogverbindung, 1,2-Diacylglyceronucleosid-Konjugat. Nach diesem Stand der Technik wurden Nucleosid-5'-monophosphoromorpholidat mit 1^-Diacylglycero-S-phosphat um-

gesetzt, um die Analogverbindung zu erhalten. Jedoch besteht der Phospholipidteil gemäß der vorliegenden Erfindung aus 1-0-Alkyl-2-0-acylglycero-3-phosphat und dessen neues Konjugat mit Nucleosid ist im Stand der Technik nicht beschrieben, sondern wurde vielmehr zuerst durch den Erfinder hergestellt.

Nachstehend folgt eine detaillierte Erklärung der vorliegenden Erfindung:

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung neuer Antikrebs- und antiviraler Mittel, welche einmalige Molekularstrukturen und physikochemische Eigenschaften aufweisen.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung neuer und hoch ergiebiger Verfahren zur Herstellung der angegebenen neuen Antikrebs- und Antivirusmittel, welche einmalige Molekularstrukturen und physikochemische

20 Eigenschaften aufweisen.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung einer neuen Klasse von Phospholipid-Konjugaten als Antikrebs- und Antivirusmittel.

Eine zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung einer neuen Klasse von Liponucleotid-Verbindungen, die als ein neues System für die Abgabe von Antikrebs- und Antivirusmitteln an Tumorzellen agieren und die Lipidvehikel (Liposomen) bilden, welche die Hülle der Krebszelle durchdringen über den Prozeß des Lysosomotropismus oder verwandter Membranphänomene.

Die vorliegenden Antikrebsmittel spalten sich nach dem Eindringen in die Tumorzellen in diesen Zellen über spezi-

fische Phospholipid-Enzym-Reaktionen oder über nicht-spezifische Mechanismen in Antikrebs- und Antivirusnucleosid· oder -nucleotid auf. Sofern die Zelle eine spezifische Bindungsstelle für Phospholipid aufweist, wird sie das Ziel einer spezifischen Verbindung. Ferner liefert für ein Nucleosid, welches eine Phosphorylierung für eine wirksame Aktivität benötigt, ein Konjugat eine derartige Funktion und führt zu einem ausgezeichneten therapeutischen Effekt für Nucleosidkinase ohne Resistenzzellen.

Daneben besitzt 1-O-Alkylphospholipid selbst pharmazeutische Wirksamkeit, insbesondere eine die Antikrebs- und Immunoaktivität modulierende Wirksamkeit, und die Kombination von Nucleosid mit 1-0-Alkylphospholipid führt zum Vorteil von additiven oder synergistischen Effekten.

Mit anderen Worten ist es bekannt, daß das 1-O-Alkylphopholipid, T-O-Alkyl-2-lysophospholipid und ihre Derivate, i-O-Alkyl-2-O-methylphosphatidyl-cholin oder -ethanolamin inhibierende und präventive Wirksamkeit für verschiedene tierische Krebsarten und immunomodulierende Wirksamkeit aufweisen [Anticancer Research 1, 135 und 345 (1981); Seminar in Immunopathology, Band 3, 187-203 (1979)]. So^lange die Verbindung in Konjugatform verbleibt, wird die Aminogruppe von ara-C oder ara-A vor einer Deaminierung durch Cytidindeaminase oder Adenosindeaminase geschützt. Da das Konjugat selbst lipophil ist, wirkt es als eine Art Prodrug mit Langzeitwirkung und erreicht die Zielzelle und in der Zelle hydrolisieren die Konjugate zu Phospholipid und Nucleotid. Das Ergebnis ist das gleiche, als würden zwei Medikamente verabfolgt und es können die pharmazeutischen Wirkungen beider erwartet werden, um den therapeutischen Index des Antikrebsmittels zu erhöhen.

Das Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Formel I ist in dem nachfolgend abgebildeten Reaktionsschema schematisch dargestellt. Das Nucleotid (III) wird an das

Morpholidat (VI) oder an P -Nucleosid-5'-P -diphenylpyrophosphat (VII) kondensiert und anschließend umgesetzt mit i-O-Alkyl-2-O-acylglycero-phosphat (VIII), um das Konjugat (I ) über (I,) zu erhalten. (Reaktionsschema Methode A

α. CI

oder Methode B) Der andere Weg besteht in der Kondensation von Phospholipid (VIII) an das Morpholidat (IX) oder

12

P -Glycero-5'-P -diphenylpyrophosphat (X) und anschließender Umsetzung davon mit dem Nucleotid (III), um das Konjugat (I) über (I,) zu erhalten (Reaktionsschema Methode C und Methode D).

Die erfindungsgemäßen Verbindungen und ihre Salze können im Gemisch mit herkömmlichen pharmazeutisch verträglichen organischen und anorganischen Trägersubstanzen verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Formulierungen können in einer der herkömmlichen akzeptablen Formen vorliegen, wie als Emulsion, Suspension, Ampullen, Pulver, Granulat, Kapseln, Tabletten oder in anderen Formen. Sie können auch herkömmliche Füllstoffe, Konservierungsstoffe, Stabilisatoren, Dispergiermittel, Räuchermittel, Puffer und farbgebende Mittel enthalten.

REAKTION S SCHEMA

HO-I' -0 HO	„r (III)
	Cytosin
B -	Adenin

(In, ara-CDP-L-ΡΒΛ)

HO

ΜΗ2 S

CH₂-O-C_lBH₃₇

H, ,Xo-L »

CVII)

CH,-O-(CH₂)_nCH₃

CH₃ (CH₂ )_m-C-° — C — K

CH₂-O-(CH₂)_nCH₃
i

CH₃(CH_z)_m-C-0 — C-H

IX)

Methocfe C

CIL-O-P-OH

'2 ι

C)H

(VIII )

CH₃(CH₂)

CH₂-O-(CH₂)_nCH₃ _n-C-0 — C-H

(Ib₁ ara-CDP-DL-PBA) HO

NH₂

C₁₅H₃₁-b-O-C_H

CH.

O O 0-1-0-I.-0

(Ic, ara-CDP-I)L-PCA)

HO MH,

₁₅K

¹⁵

O"

(X) (Xd, arn-ADP-DL-PCA)

Die nachstehenden Beispiele dienen lediglich der Erläuterung und sollen in keiner Weise den Schutzumfang der Erfindung begrenzen.

5 Beispiel 1

1-ß-D-Arabinofuranosylcytosin-5'-diphosphat-1-O-octadecyl-2-0-palmitoyl-sn-glycerin oder 1-ß-D-Arabinofuranosylcytosin-5 '-diphosphat-ß-palmitoyl-L-butylalkohol (I ,

3.

IQ ara-CDP-L-PBA) (Reaktionsschema Methode A)

1,7 g (2,6 mMol) i-O-Octadecyl-2-O-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphat (VIII, n=17, m=14, L-Isomer) wurde zusammen mit Pyridin zur Trockne eingedampft und sodann mit 1,8 g

I^ (2,6 mMol) ara-CMP-Morpholidat-4-morpholin-N,N'-dicyclohexyl-carboxamidiniumsalz (VI, B=Cytosin) vermischt. Das Gemisch wurde in 150 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und wurde bei Raumtemperatur für 5 Tage unter wasserfreien Bedingungen gerührt. Das Pyridin wurde sodann unter vermindertem Druck entfernt und eine geringe Menge an Pyridin wurde durch gemeinsame Verdampfung mit Toluol entfernt. Der Rückstand wurde in 15 ml wasserfreier Essigsäure und 150 ml Chloroform-CH₃OH-Wasser (2:3:1) (Lösungsmittel CMW) gelöst und die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt und sodann wurden der Lösung 250 ml Chloroform zugesetzt. Die Schicht des organischen Lösungsmittels wurde abgetrennt und unter vermindertem Druck eingeengt und eine geringe Menge an verbleibender Essigsäure wurde durch gemeinsame Verdampfung mit 10 ml Toluol in drei Schritten entfernt. Der Rückstand wurde in 100 ml CMW-Lösungsmittel gelöst und auf einer Cellulosesäule DE-52 (Acetat) (2,5 χ 50 cm, ummantelt, 5°C) adsorbiert, und die Säule wurde sodann mit 0-0,15M NH.OAc Lineargradientenlösungsmittel CMW (jeweils 1500 ml) eluiert. Ein Eluat

gg von 900 bis 1500 ml wurde gesammelt und unter vermindertem Druck eingedampft bei einer Temperatur unterhalb von

30⁰C, bis sich weiße Kristalle bildeten. Das weiße kristalline Pulver (das Ammoniumsalz der angegebenen Verbindung) wurde mit Wasser gewaschen und filtriert. Zur Umwandlung in das Natriumsalz wurde das Pulver in CMW gelöst und sodann auf eine Säule Amberite CG-50 (Na⁺) (2,5 χ 15 cm) gegeben und das Eluat wurde gesammelt und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde aus Chloroform und Aceton umkristallisiert, um die weißfarbene Verbindung in einer Ausbeute von 820 mg (31,2 %) zu erhalten.

1) Schmelzpunkt: 199 bis 202⁰C

2) [α]ρ⁵ = +33,5° (C=O,23, Chloroform-Methanol-Wasser

2:3:1)

3) NMR (90 MHz): Lösungsmittel (CDCl₃-CD₃OD-D₂O, 2:3:1):

δ ppm 0,95 (6, t, 2CH₃), 1,14-1,87 (58, m, 29CH₂), 2,29 (2, t, CH₂-C=O), 3,27-4,42 (11, m, H2¹, H3·, H4', Η5', CH₂-O-CH₂ und CH₂~O), 5,15 (1, m, Glyce

rin CH), 5,94 (1, d, J=7Hz, Cytosin H₅), 6,18 (1, d, J=5Hz, H1), 7,80 (1, d, J=7Hz, Cytosin H_g)

25 4) Elementaranalyse: C₄^Hg₇N₃O.. ₄P₂ · 1 ,5

berechnet:	56	C	51	i	S	H 9,20	e	3	1	N ,92	2	5	P ,77
gefunden:	56		81		9,27	3	,69	5	,87
		B	e		P i

1-ß-D-Arabinofuranosylcytosin-5'-diphosphat-rac-1-0-octadecyl-2-O-palmitoylglycerin (Ib, ara-CDP-DL-PBA)

35 C) Methode A (Reaktionsschema Methode A)

Diese Verbindung wurde hergestellt durch Kondensation

von rac-i-O-Octadecyl^-O-palmitoylglycero-S-phosphat (VIII, n=17, m=14, DL-Gemisch) mit ara-CMP-Morpholidat (VI, B=Cytosin) und anschließend gemäß obiger Beschreibung abgetrennt, um die genannte Verbindung mit einer Ausbeute von 35 % zu erhalten. Die chromatographischen Beweglichkeiten und die NMR-Daten waren mit dem theoretischen Wert konsistent.

(2) Methode B (Reaktionsschema Methode B)

Diese Verbindung kann ebenfalls nach dem unten angegebenen Verfahren hergestellt werden. 323 mg (1 mMol) ara-CMP (III, B=Cytosin) und 371 mg (1 mMol) Tri-noctylamin wurden in 7 ml heißem Methanol gelöst und sodann wurde das Lösungsmittel eingedampft unter vermindertem Druck, und der Rückstand wurde erneut in Ν,Ν-Dimethylformamid (DMF) gelöst und unter vermindertem Druck eingedampft, um jegliche Spur von in dem Rückstand verbliebenen Wasser zu entfernen. Das trockene ara-CMP-Tri-O-octylammoniumsalz, welches so erhalten wurde, wurde in 10 ml Dioxan und 5 ml DMF gelöst und zu dieser Lösung wurden 0,3 ml Diphenylphosphochloridat und 0,45 ml Tri-n-butylamin gegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 bis 3 Stunden unter wasserfreien Bedingungen umgesetzt. Das Lösungsmittel wurde durch Verdampfen unter vermindertem Druck entfernt und anschließend wurden 50 ml Ether zugegeben, zu dem Niederschlag von P -(1-ß-D-Arabinofuranosyl-

2
cytosin-5'-yl)-P -diphenylpyrophosphat (VII, B=Cytosin) und es wurde für 30 bis 60 Minuten bei 0⁰C gehalten, worauf der Ether entfernt wurde. Der Niederschlag wurde in 2 ml Dioxan gelöst und jegliche Spur von Wasser in dem Niederschlag wurde durch Verdampfen unter vermindertem Druck entfernt. 663 mg (1 mMol) rac-1-O-Octadecyl^-O-palmitoylglycero-S-phosphat (VIII, n=17, m=14, DL-Gemisch) wurden über Nacht über P^O getrocknet und danach in 1 ml wasserfreiem Pyri-

din gelöst, und sodann mit einer Lösung von Pyrophosphat (VII), wie oben angegeben, in 0,5 ml Dioxan bei Raumtemperatur für 1 Tag unter wasserfreien Bedingungen. Nach der Umsetzung wurde das Lösungsmittel durch Verdampfen unter vermindertem Druck entfernt und der erhaltene Rückstand wurde mit 25 ml Ether versetzt und die angegebene Verbindung wurde ausgefällt. Der. so erhaltene Niederschlag wurde in 100 ml CMW gelöst und auf einer Cellulosesäule DE-52 (Acetat) 2,5 χ 50 cm, ummantelt, 5⁰C) adsorbiert und sodann eluiert und gemäß obiger Beschreibung raffiniert, um die obigen Verbindungen in einer Ausbeute von 30 % zu erhalten. Die chromatographischen Beweglichkeiten und die NMR-Daten waren mit den theoretischen Werten konsistent.

Beispiel 3

1-ß-D-Arabihofuranosylcytosin-5'-diphosphat-rac-1-0-hexadecyl-2-O-palmitoylglycerin oder 1-ß-D-Arabinofuranosyl-cytosin-5'-diphosphat-ß-palmitoyl-DL-chimylalkohol (Ic, ara-CDP-DL-PCA)

(1) Methode A (Reaktionsschema Methode A)

Prinzipiell wurde diese Verbindung nach dem gleichen Verfahren gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 hergestellt. 4,19 g (6,6 mMol) rac-i-O-Hexadecyl-2-0-palmitoylglycero-3-phosphat. (VIII, n=15, m=14, DL-Gemisch)., welche zusammen mit Pyridin eingedampft worden waren, wurden mit 3,43 g (5 mMol) ara-CMP-Morpholidat (VI, B=Cytosin) in 300 ml wasserfreiem Pyridin bei Raumtemperatur für 5 Tage unter wasserfreien Bedingungen umgesetzt. Das Pyridin wurde unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand wurde gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 behandelt und auf einer Cellulosesäule DE-52 (Acetat) adsorbiert (2,5 χ 50 cm, ummantelt, 5°C) und sodann mit CMW-Lö-

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sungsmittel, welches 0-0,15MNH₄OAc Lineargradienten enthielt, (jeweils 1500 ml) eluiert, der Anteil, welcher die zu erhaltende Verbindung aufwies wurde gesammelt und eingeengt unterhalb einer Temperatur von 30⁰C bei vermindertem Druck, bis weiße Kristalle gebildet wurden. Die so erhaltenen Kristalle wurden durch Behandlung mit einer Amerlite CG-50 (Na )-Säule ins Natriumsalz überführt, um die gewünschte Verbindung in einer Ausbeute von 30 % zu erhalten.
10

1) Schmelzpunkt: 202-205⁰C (Zersetzung)

2) NMR (90 MHz): Lösungsmittel (CDCl₃-CD₃OD-D₂O,

2:3:1): δ ppm 0,87 (6, t, 2CH₃), 1,07-1,78 (54H, m, 27CH₂), 2,35 (2, t, CH₂-C=O), 3,27-

4,35 (11, m, H₂', H₃ ¹, H₄ ¹, H₅ ¹, CH₃-O-CH₂, CH₂-O), 5,15 (1, m, Glycerin CH), 5,92 (1, d, J=7Hz, Cytosin, H₅), 6,14 (1, d, J=5Hz, H₁'), 7,88 (1, d, J=7Hz, Cytosin H₅).

3) Elementaranalyse: C₄₄Hg₁N₃O₁₄P₂Na₂-O^ H₃O

CHNP berechnet: 53,21 8,43 4,23 6,24

gefunden: 53,69 9,27 3,92 5,72

(2) Methode B (Reaktionsschema Methode C)

Dem unter Rückfluß stehenden Gemisch, welches aus 3,17 g (5 mMol) rac-1-0-Hexadecyl-2-0-palmitoylglycero-3-phosphat (VIII, m=15, n=14, DL-Gemisch), 1,7 ml (20 mMol) Morpholin und 50 ml tert.-Butylalkohol bestand, wurde tropfenweise eine Lösung von 4,12 g (20 mMol) N,N¹-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und 75 ml tert.-Butylalkohol zugesetzt und das Gemisch wurde unter Rückflußbedingungen für 2 Stunden umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt und sodann wurden 20 ml Wasser zugesetzt und das erhaltene Gemisch wurde bei Raumtemperatur für

2 Stunden gerührt, um das verbliebene DCC zu zersetzen. Die so gebildeten weißen Kristalle wurden abfiltriert und entfernt und das Filtrat wurde durch Eindampfen unter vermindertem Druck konzentriert und mit Ether extrahiert. Der Extrakt wurde unter vermindertem Druck eingedampft und der erhaltene Rückstand (IX, n=15, m=14, DLC-Gemisch) wurde zusammen mit Toluol zweimal extrahiert, und sodann wurden 2,13 g (6,6 mMol) ara-CMP (III, B=Cytosin) und 4,67 g (13,2 mMol) Trin-octylamin zugesetzt und das Gemisch wurde erneut zusammen mit Pyridin in drei Stufen durch gemeinsames Verdampfen getrocknet und anschließend in 200 ml Pyridin gelöst und gerührt und bei Raumtemperatur für 7 Tage unter wasserfreien Bedingungen umgesetzt. Das Pyridin wurde durch Verdampfen unter vermindertem Druck entfernt und jegliche verbliebene Spur von Pyridin wurde durch gemeinsames Verdampfen mit einer geringen Menge an Toluol völlig entfernt. Der Rückstand wurde in 30 ml Essigsäure und 300 ml CMW-Lösungsmittel gelöst und bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt und sodann wurden 500 ml Chloroform zugesetzt. Die organische Schicht wurde abgetrennt und unter vermindertem Druck eingeengt und jede Spur an verbliebener Essigsäure wurde durch gemeinsames Verdampfen mit 10 ml Toluol in drei Schritten völlig entfernt. Der Rückstand wurde in 100 ml CMW-Lösungsmittel gelöst und wurde in einer DE-52 (Acetat)-Cellulosesäule (2,5 χ 50 cm, ummantelt, 5⁰C) adsorbiert und sodann mit CMW-Lösungsmittel, welches 0-0,15M NH₄OAc Linear-

gradienten enthielt, gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 eluiert, um das gewünschte Produkt mit einer Ausbeute von 30 % zu erhalten. Die chromatographischen Beweglichkeiten und die NMR-Daten waren mit den theoretischen Werten konsistent.

1 Beispiel 4

9-ß-D-Arabinofuranosyladenin-5'-diphosphat-rac-1-O-hexadecyl-2-O-palmitoylglycerin oder 9-ß-D-Arabinofuranosyladenin-5'-diphosphat-ß-palmitoyl-DL-chimylalkohol (Id, ara-ADP-DL-PCA) (Reaktionsschema Methode A)

1,90 g (3 mMol) rac-i-O-Hexadecyl^-O-palmitoylglycero-S-phosphat (VIII, n=15, m=14, DL-Gemisch) wurde durch gemeinsame Verdampfung mit Pyridin in drei Stufen getrocknet, und 2,13 g (3 mMol) ara-AMP-Morpholidat-4-morpholin-N,N'-dicyclohexyl-carboxamidiniumsalz (VI, B=Adenin) wurden in 20 0 ml wasserfreiem Pyridin gelöst und die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 7 Tage unter wasserfreien Bedingungen gerührt. Das Pyridin wurde durch Verdampfen unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde nach demselben Verfahren gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 behandelt, und über einer Säule DE-52 (Acetat) (2,5 χ 50 cm, ummantelt, 5⁰C) adsorbiert und mit CMW-Lösungsmittel, welches 0-0,15M NH.OAc Lineargradienten enthielt, eluiert und sodann durch eine Amberlite CG-50 (Na )-Säule geschickt, um 851 mg (29 %) des Natriumsalzes zu erhalten.

1) NMR (90 MHz): Lösungsmittel (CDCl₃-CD₃OD-D₂O, 2:3:1): δ ppm 0,92 (6, t, 2CH₃), 1,07-1,78 (54H, m, 27CH₂), 2,35 (2, t, CH₂-C=O), 3,27-4,35 (11, m, H₂ ¹, H₃ ¹, H₄ ¹, H₅ ¹, CH₂-O-CH₂; CHz-O)₇ 5,07 (1, m, Glycerin CH), 6,33 (1, d, J=4,5H₂, H₁ ¹), 8,17 (1, s, Adenin H₂), 8,40 (1, s, Adenin Hg).

Experiment 1

Antitumorwirksamkeit gegenüber i.p. inoculierter L 1210 lymphoidleukämischer Mäuse:

DBA/2J-Mäuse (Durchschnittsgewicht 25 g, männlich) erhiel- ' ten i.p. eine Inoculation von 1 χ 10 oder 1x10 L 1210-lymphoidleukämischen Zellen und nach 24 Stunden wurde das Medikament in 0,9 % NaCl gelöst und den Mäusen injiziert, und die Überlebensrate wurde über 45 Tage aufgezeichnet. Der Test wurde in Übereinstimmung mit den United States National Cancer Institute Protocols (Cancer Chemotherapy Reports 3, 1-103, 1972) durchgeführt. Der Behandlungsplan war qd 1, 5, 9 und qd 1-5. Die optimale Dosierung in Tabelle 1 ist die Menge, welche eine maximale Wirksamkeit erzeugt. Ein breiter Bereich an Dosierungsniveaus wurde untersucht. Die Aktivität wurde gemessen durch Vergleich der Steigerung der Lebenserwartung. Dies wurde durchgeführt mittels Vergleichs der durchschnittlichen Lebenser-Wartungen der Testmäuse und der Kontrollgruppen-Mäuse. Tabelle 1 zeigt die therapeutischen Ergebnisse von ara-C und dem entsprechenden Konjugat ara-CDP-DL-PBA (Ib) und ara-CDP-DL-PCA (Ic). Der erste Teil zeigt Ergebnisse von gegenüber ara-C sensitiven L 1210-lymphoidleukämisehen Mäusen. Die nicht behandelten Kontrollmäuse starben 7 oder 8 Tage nach der Inoculation von Tumorzellen. Wenn ara-C mit einer optimalen einmaligen Dosis von 400 mg (1644 μMol)/kg injiziert wurde, so betrug der Anstieg der Lebenserwartung (% ILS) 14 %, und bei der Injektion von 200 mg (822 μΜοΙ) einmal pro Tag für 5 Tage ergab 129 % ILS. Jedoch zeigten die Konjugate ara-CDP-DL-PBA (Ib) und ara-CDP-DL-PCA (Ic) bei einer optimalen einmaligen Dosierung von 400 mg (395 und 407 \iMol)/kg einen exzellenten Wert von ILS von 257 % bzw. 293 %. Wenn die optimale Dosierung 5mal injiziert wurde, so ergab sich noch ein ausgezeichneter ILS von 229 % bzw. 264 %. Der Vergleich der Einzeldosis für ara-C und dem entsprechenden Konjugat liegt außerhalb des Bereiches. In den fünf Dosierungsplänen zeigt das Konjugat die doppelte Wirksamkeit bei einer Dosierung von 1/8 oder 1/10 der ara-C molaren Dosis, die Toxizitäten sind viel geringer. Zwei-

tens zeigen Ergebnisse der therapeutischen Behandlungen von ara-C resistenten L 1210-lymphoidleukämischen Mäusen aufgrund der in geringen Mengen existierenden Deoxycitidinkinase, daß nicht behandelte Kontrollmäuse nach 8 bis Tagen im Anschluß an die Inoculation von Tumorzellen starben. Einzeldosisbehandlungen mit ara-C zeigten fast keine Effekte (ILS, 6 %), und führten nach 5-tägiger Behandlung zu 65 % ILS. Diese Ergebnisse zeigen an, daß ara-C Deoxycytidinkinase enthält, jedoch in geringen Mengen. Jedoch erzeugt das Konjugat von ara-C, d.h. ara-CDP-DL-PBA (Ib) und ara-CDP-DL-PCA (Ic) ein bemerkenswertes therapeutisches Ergebnis und gibt eine große Hoffnung bei der Bekämpfung von Krebs. Bei der- optimalen Dosierung von 400 mg/kg entweder als Einzeldosis oder in Mengen von 80 mg/kg/Tag für 5 Tage, beträgt das Ergebnis einen ILS von 259^->356 %, und von den sechs Mäusen überlebten 1 bis 3 Mäuse mehr als 45 Tage und wurden völlig geheilt. Darüber zeigte sich bei einer Dosierung von 167 mg/kg/Tag für den ersten, fünften und neunten Tag (drei Dosierungen) bei ara-CDP-PBA (Ib) mehr als 290 % ILS, und bei ara-CDP-DL-PGA (Ic) mehr als 374 % ILS, und mehr als drei Mäuse, insbesondere in dem Fall von ara-CDP-DL-PCA sechs Mäuse von sechs Mäusen, überlebten mehr als 4 5 Tage und wurden geheilt. Somit erzielte ein Drittel (1/3) molare Dosis von ara-C eine fünffache Wirksamkeit. Die Tatsache, daß das Konjugat wirksam ist gegenüber Deoxycytidinkinase-Mangel-ara-C resistenten L 1210-lymphoidleukämischen Mäusen, zeigt, daß das Konjugat in die Zellen durch Endocytose oder andere Mechanismen eingeführt wird und durch ein Enzym zu Phosphorlipid und ara-CMP hydrolysiert wird, wodurch die freigesetzte ara-CMP kontinuierlich zu ara-CTP phosphoriert wird. Da die ara-CMP vom Konjugat freigesetzt wird, wird die Deoxycytidinkinase, die für die Phosphorylierung von ara-C benötigt wird, nicht gebraucht.

1 Vorteile

Wie in den obigen Tests gezeigt wurde, weisen diese Konjugate größere Wirksamkeiten auf als die Stanunarzneimittel ara-C, auch bei geringeren Dosierungen, und dies kann andererseits zur Verbesserung des therapeutischen Index der Stammarzneimittel beitragen. Darüber hinaus hat ara-C eine kurze Halblebenszeit, aber das Konjugat hat eine größere und überlegene Wirksamkeit auch in einer Einzeldosierung. Darum können die Konjugate als ein Arzneimittel mit verzögerter Freisetzung verwendet werden. Insbesondere die Tatsache, daß das Konjugat wirksam ist gegenüber ara-C resistenten L 1210-lymphoidleukämischen Mäusen, bedeutet, daß es hydrolysiert und ara-CMP und Phospholipid in cancerogenen Zellen freisetzt, und auf die resistenten Zellen mit einem Mangel an Deoxycytidinkinase eine große Wirkung ausübt. Das Phospholipid ist i-O-Alkyl-2-O-acylglycero-3-phosphat und wird nach biochemischer Umsetzung überführt in i-O-Alkyl-2-lysophosphatidyl-cholin oder -ethanolamin, und da diese Verbindungen selbst Wachstums- und transfer-verzögernde Wirksamkeiten gegenüber Krebszellen aufweisen und eine immunomodulierende Wirksamkeit besitzen, kann erwartet werden, daß sie additive und synergistische Effekte ausüben. Das Konjugat ist nicht einfach ein Prodrug zu ara-C, jedoch wird mehr als ein neues Arzneimittel angesehen. Ferner haben im Vergleich mit anderen lipophilen Prodrugs die vorliegenden Konjugate den Vorteil der Bildung einer transparenten Suspension in Wasser durch Behandlung mit Ultraschall. Es wurde in der Literatur berichtet, daß bei der Behandlung leukämischer Patienten mit ara-C die Erzeugung von Abwehrkräften gegenüber dem Arzneimittel in Bezug steht zu dem relativen Gehalt der Zelle an Deoxycytidinkinase und Cytidindeaminase [Annals of New York Academy of Science 255, 247 (1975)]. Dagegen hat ara-C-Konjugat eine Abwehrkraft gegenüber Cytidindeaminase und hydrolysiert nicht die Aminogruppe. Es ist die Meinung angemessen, daß es einen großen Einfluß bei der Behandlung von Leukämiepatienten besitzt, die gegenüber ara-C resistent sind.

TABELLE I

Antitumoraktivität gegenüber i.p. inoculierten L 1210-lyinphoidleukämischen Mäusen^c

Verbindung	Behandlungs- optimale Dosis	gegen L1210/ara-C^e	1	mg(μΜοΙ)/kg/Tag	Bereich	Uberlebenstage	14	Anzahl der über 45 Tage Überlebenden
gegen L1210/0^d	plan (qd)	ara-C	1 - 5			Mittelwert (T/C) % ILS¹^	129
ara-C			1	400 (1644)	8-10		257	0
	1	ara-CDP-DL-PBA	1 - 5	200 (822)	7-18	8,0/7,0	229	0
ara-CDP-DL-PBA	1 - 5	(Ib)	1,5,9	400 (395)	15 - 29	16,0/7,0	293	0
(Ib)	1		1	100 (99)	18 - 32	25,0/7,0	264	1
ara-CDP-DL-PCA	1 - 5	ara-CDP-DL-PCA	1 - 5	400 (407)	20 - 33	23,0/7,0		0
(ic)	1	(Ic)	1,5,9	80 (81)	21 - 30	27,5/7,0	6	0
1 - 5		1			25,5/7,0	65
ara-CMP und DL-PCA-pg	1 - 5	300 (1233)	9-10		300	0
	60 (247)	14	9,5/9,0	>356^f	0
400 (395)	25 ->45	14,0/9,0	>290^f	2
80 (79)	30 ->45	36,0/9,0	>328^f	3
167 (165)	24 ->45	>41,0/9,0	259	3
400 (407)	11 ->45	>39,0/10,0	>374^f	3
80 (81)	26 ->45	>38,5/9,0	11	1
167 (169)	-	30,5/8,5	56	6
131 und 258 (407 jeweils)	3-10	>45,0/9,5		0
26,2 und 51,4 (81 jeweils)	4-15	10,0/9,0	0
	14,0/9,0

a: Jede Gruppe von sechs DBA/2J-Mäusen (Mittelgewicht 25 g, männlich) erhielt eine i.p. Inoculation von 1 χ 10⁶ L 1210/0-Zellen oder 1 χ 10⁵ L 1210/ara-C-Zellen am Tag Null.

b: Erzeugt maximale Wirksamkeit.

c: Prozentuale Verlängerung der Lebenszeit: (T/C -DxIOO. d: ara-C sensitive L 1210.

e: ara-C resistent L 1210 aufgrund des Mangels an Deoxycytidin.

15 f: 45 Tage.

g: ara-CMP (III, B=Cytosin) und rac-i-O-Hexadecyl-2-O-

palmitoylglycerin-3-phosphat (VIII, n=15, m=14, DL-Gemisch).
20

Claims

10

Boryung Pharmaceutical Co./ Ltd. 66-21, Wonnam-dong Chongro-ku, Seoul, Korea

Neue Nucleosidderivate und Ver

fahren zu ihrer Herstellung

Patentansprüche 1. Nucleosxdkonjugat nach Formel I

30 35

Q CH₂ H 0 - W 0
H 0 - ■ C - 0 - C - Il
P -
I - 0 I
0- 0 - H
P-O-
I CH₂ I
0- "V K

HO C

worin

B Adenin, Cytosin, 5-Fluoruracil, 5-Azacytosin,

6-Mercaptopurin oder 7-Deazaadenin ist, A und C jeweils Wasserstoffatome oder Hydroxylgruppen sind,

W ein gesättigter oder ungesättigter Alkylrest mit 7 bis 19 Kohlenstoffatomen ist und dessen pharmazeutisch verträgliche, nicht-toxische Salze.

2. Verfahren zur Herstellung des Nucleosidkonjugats gemäß Formel I

0 CH₂-O-W
Il I
W-C-O-C-H _Λ ■ B

CH₂ - 0 - P - 0 - P - 0 —. - <^:>

HO C

dadurch gekennzeichnet , daß das Nucleotid der Formel III

O B

Il
■HO-p-o

HO

HO mit dem Morpholidat nach Formel VI

O Il

- P I O-

- 0

(VI)

1 2

oder P -Nucleosid-5'-P -diphenylpyrophosphat der For

mel VII

ο ο _ ) -o-p-o-p-o

(VII)

"VN

HO

kondensiert wird, und sodann mit i-O-Alkyl-2-O-acylglycero-3-phosphat der Formel VIII

O Ii C-O

CH₂- 0 π

— W

CH₂ — 0

P -OH

I
OH

(VIII)

umgesetzt wird, um das Nucleosidkonjugat gemäß Formel

I oder Salze davon zu erhalten, wobei

B Adenin, Cytosin, 5-Fluoruracil, 5-Azacytosin, 6-Mercaptopurin oder 7-Deazaadenin ist,

A und C jeweils Wasserstoffatome oder Hydroxylgruppen sind,

W ein gesättigter oder ungesättigter Alkylrest mit 7 bis 19 Kohlenstoffatomen ist.

1

3. Verfahren zur Herstellung des Nucleosidkonjugats nach Formel I

W -

0 0 - CH₂ - 0 - W 0 - 0
Il 0 P
C* — 1
j H 0
η Il
P - CH₂ - 0 - |l
P - I
0- I
0

(i:

VY HO C

dadurch gekennzeichnet , daß das Phospholipid der Formel VIII

0 CH₂-

W-C-O-C-H

CH₂- 0

- W

0 i

P-OH

I OH

(VIII)

mit dem Phospholipidmorpholidat der Formel IX

w-c-o —

CH₂-
I 0 - W I
C —
I H 0
I₁ CH₂- 0 - Il
P I
0

- N

1

oder P -Glycero-5'-P -diphenylpyrophosphat der For mel X

O CH₂- O - W C-O- C-H

I 0 0

¹ I Il CH₂-O-P-O-P-O-(Z

I i

0- . 0

kondensiert wird und sodann mit dem Nucleotid der Formel III

Ii B

^H0 ~ * ~~ ° ~i/° ! ^(III)

HO L N

VSI

HO

umgesetzt wird, um das NucLeosidkonjugat gemäß For^mel I und Salze davon zu erhalten, wobei B, A, C, W und W die in Anspruch 1 genannte Bedeutung haben.

4. Verbindung nach Anspruch 1, nämlich 1-ß-D-Arabinofuranosylcytosin-5'-diphosphat-i-O-octadecyl-2-O- palmitoyl-sn-glycerin.

5. Verbindung nach Anspruch 1, nämlich 1-ß-D-Arabinofuranosylcytosin-5'-diphosphat-rac-i-O-octadecyl-2-O- palmitoylglycerin.

6. Verbindung nach Anspruch 1, nämlich 1-ß-D-Arabinofuranosylcytosin-5'-diphosphat-rac-i-O-hexadecyl-2-O— palmitoylglycerin.

7. Verbindung nach Anspruch 1, nämlich 9-ß-D-Arabino-

furanosyladenin-5'-diphosphat-rac-1-O-hexadecyl-2-0-palmitoylglycerin.