DE2309329C2 - Verwendung von Äthyleniminlösungen als Inaktivierungsmittel bei der Herstellung von Impfstoffen - Google Patents
Verwendung von Äthyleniminlösungen als Inaktivierungsmittel bei der Herstellung von ImpfstoffenInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von neutralisierten Äthyleniminlösungen zur Inaktivierung von insextiösen Virus- und Bakteriensuspensionen
für die Herstellung von Impfstoffen.
Es ist bekannt, daß man für die Herstellung der
obengenannten pharmazeutischen Präparate Inakiivierungsmethoden bzw. -mittel benötigt, die einerseits die
Infektiosität der zu verwendenden Viren bzw. Bakterien sicher zerstören, andererseitr aber ihre antigenen
Eigenschaften völlig intakt lassen. Um sicher inaktivierte Präparate zu erhalten, muß dieser Vorgang in einer
Reaktion erster Ordnung verlaufen, damit der Zeitpunkt des vollständigen Verlustes der Infektiosität sicher
bestimmt weit'en kann. Dies ist bei vielen gebräuchlichen Inaktivierungsmethoden (Wärme, UV-Licht) bzw.
Inaktivierungsmitteln (Formaldehyd, Wasserstoffsuperoxid, 0-Propiolacton) nicht der Fall. Andere bekannte
Substanzen, die diesen Nachteil nicht besitzen, sind chemisch wenig stabil, wie z. B. die Acylthylenimine
(Deutsche Patentschrift 10 41 648) oder benötigen eine längere Einwirkungszeit und/oder höhere Konzentrationen, wie z. B. das Äthyläthylenimin (DE-OS
19 24 303).
Es wurde gefunden, daß die Verwendung von neutralisierten Äthyleniminlösungen zur Inaktivierung
von infektiösen Virus- und Bakteriensuspensionen für die Herstellung von Impfstoffen, wobei die Äthylenimin- ■)?
lösungen den Suspensionen bis zu einer Endkonzentration an Äthylenimin von 0,01 bis 04% (Vol/Vol)
zugesetzt werden, der Verwendung bekannter Inaktivierungsmittel überlegen ist.
Überraschenderweise zeigt das Äthylenimin nicht die oben erwähnten Nachteile der bisher bekannten
Inaktivierungsmittel, Äthylenimin ist technisch sehr
leicht zugänglich, ist sehr stabil und gut lagerbar und erlaubt in einer Reaktion erster Ordnung eine schnelle
und sichere Inaktivierung von infektiösen Mikroorganismen, ohne dabei deren Antigenität bzw. Immunogenität zu beeinträchtigen. Durch die kurze Reaktionszeit
bei vergleichsweise niedriger Konzentration verläuft die Inaktivierung äußerst schonend für das zu
inaktivierende Material. Die Verwendung des Äthylenimins als Inaktivierungsmittel bei der Herstellung von
immunisierenden Stoffen für pharmazeutische Präparate stellt daher eine Bereicherung der Pharmazie dar.
Äthylenimin wird den zu inaktivierenden Virus- bzw. Bakteriensuspensionen bis zu Endkonzentrationen von
0,01-0,5 (Vol/Vol), zugesetzt. Die Reaktionszeit beträgt je nach Versuchsbedingungen wenige Stunden bis
zwei Tage. Man arbeitet bei Temperaturen zwischen 0
und 450C, vorzugsweise zwischen 20 und 37"C,
Die erfindungsgemäß mit Äthylenimin inaktivierten Virus- und Bakterienstämme können zur Prophylaxe
und Behandlung von Virus- und Bakterieninfektionen sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin
verwendet werden.
Die nach der erfindungsgemäßen Verwendung erhaltenen Virus- oder Bakterienantigene können nach
üblichen Methoden formuliert und als Lösung, Sirup, Emulsion, Suspension, Spray, Salbe, Paste, Creme,
Lotion, Aerosol, Tabletten usw. verabreicht werden.
Die Formulierungen werden in an sich bekannter Weise hergestellt, z.B. durch Verdünnung der erfindungsgemäß inaktivierten Virus- oder Bakterienpräparationen mit geeigneten Lösungsmitteln und/oder
inerten, nichttoxischen, festen, halbfesten oder flüssigen
Trägerstoffen, gegebenenfalls unter Verwendung von Emulgier- und/oder Dispergier-, Sprüh und Treibmitteln
und unter Verwendung von geeigneten Stabilisatoren.
Als solche Lösungsmittel, Trägerstoffen, Emulgier- bzw. Dispergiermittel seien hier genannt:
Wasser, nichttoxische organische Lösungsmitlei bzw.
Verdünnungsmittel wie Paraffine (z. B. Erdölfraktionen), pflanzliche öle (z. B. Erdnuß-/Sesam-Öl), Alkohole (z. B.
Äthylalkohol, Glycerin) Glykole, z. B. Propylenglykol,
Polyäthylenglykol) und Wasser; feste Trägerstoffe, wie
z. B. natürliche Gesteinsmehle (z. B. hochdisperse Kieselsäure, Silikate), Zucker (z. B. Rohr-, Milch- und
Traubenzucker); Aluminiumhydroxid, Polysaccharide (Dextrane, Agar); Emulgiermittel, wie nichtionogene
und anionische Emulgatoren (z. B. Polyoxyäthylen-Fettsäure-Ester, Polyoxyäthylen-Fettalkohol-Äther, Alkylsulfonate und Arylsulfonate); Dispergiermittel (z. B.
Lignin, Sulfitablaugen, Methylcellulose, Stärke und Polyvinylpyrrolidon) und Gleitmittel (z. B. Magnesiumstearat, Talkum, Stearinsäure und Natriumlaurylsulfat).
Aminosäuren, Zucker, Proteine, Polysaccharide, PoIyalkylenglykole. Diese Stabilisatoren können sowohl in
wäßriger Lösung als auch im lyopbilisierten Zustande
zugesetzt werden.
Die erfindungsgemäß inaktivierten Virus- oder Bakterienstämme bzw. die aus diesen erhaltenen
Arzneimittel können in üblicher Weise angewendet werden, z. B. oral, intramuskulär, intraperitoneal. Subkutan, lokal, insbesondere'an allen Schleimhäuten des
menschlichen und tierischen Körpers.
Zu einer Lösung des Maul- und Klauenseuche-(MKS)-Virus, Typ C, pH 8,0, in Form der zentrifugierten
Kulturflüssigkeit einer infizierten Kultur von permanenten Kälberhodenzellen, wurde eine 2%ige (Vol/Vol)
neutralisierte Lösung von Äthylenimin bis zu einer Endkonzentration von 0,03% (Vol/Vol) gegeben. Das
Gemisch wurde unter Rühren bei 37°C gehalten. Nach bestimmten Zeiten wurden davon Proben entnommen.
Die Inaktivierungsreaktion wurde jeweils durch Zugabe von 10 Volumenprozent einer 20%igen Natriumthiosulfatlösung abgestoppt. Die entnommenen Proben wurden dann unverdünnt und in 10er Stufen Verdünnt auf je
10 Gewebekultur-Röhrchen mit primären Kälbernierenzellen in einer Menge vg/i 0,1 ml verimpft. Die dabei
ermittelten Virustiter ergaben mit zunehmender Zeit einen Abfall, der einer Reaktion erster Ordnung
entsprach. Nach 3 Stunden Einwirkungszeit war auch bei der Verimpfung von 0,5 ml keine Infektiosität mehr
nachweisbar.
Die Abbildung zeigt den Verlauf der Inaktivierung von MKS-Virus, Typ C bei 37°C und pH 8,0. Auf der
Ordinate wird der Logarithmus der infektiösen Einheiten, auf der Abszisse die Einwirkungsdauer in Stunden
angegeben. Kurve 1 zeigt den Verlauf der Inaktivierung bei einer Endkonzentration von 0,03% (Vol/Vol).
Eine 4 Stunden so behandelte Viruslösung wurde in einer Menge von 0,1 ml an 20 3 -4Tage alte Babymäuse
intraperitoneal und in einer Menge von 1,5 ml an 5
Meerschweinchen subkutan verimpft: Alle Tiere zeigten keinerlei Krankheitszeichen, 3 Wochen nach der
Impfung konnten im Serum sämtlicher Meerschweinchen neutralisierende Antikörper gegen das unvorbehandelte
infektiöse Ausgangsvirus nachgewiesen werden.
Die derart inaktivierte Viruslösung zeigte eine gleich hohe Komplementbindungsfähigkeit wie die nicht
behandelte, aktive Virusausgangslösung.
Parallel und in direktem Vergleich zti dem im Beispiel
1 beschriebenen Verfahren wurden anstelle von 0,03% (Vol/Vol) Äthylen folgende Substanzen und Konzentrationen
eingesetzt:
a) 0,05% (Vol/Vol)
b) 0,05% (Vol/Vol)
c) 0,05% (Vol/Vol)
d) 0,05% (Vol/Vol)
e) 0.05% (Vol/Vol)
Äthylenimin
(s. Abbildung, Kurve 2)
Athyläthylenimin
(s. Abbildung, Kurve 3)
N-Acetyläthylenimin
(s. Abbildung, Kurve 4)
2,2'-Dimethyläthylenimin
(s. Abbildung, Kurve 5)
Isopropyläthylenimin
(s. Abbildung, Kurve 6).
Die Abbildung zeigt den Verlauf der Inaktivierung. Bei Äthylenimin (Kurve 2) war nach 1,5 Stunden kein
infektionstüchtiges Virus mehr nachzuweisen, bei den übrigen Substanzen war dieser Zustand erst nach 7-8
Stunden bzw. 11 Stunden erreicht.
Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde bei einer Reaktionstemperatur von 220C anstelle von 37° C
wiederholt. Mit fortschreitender Zeit ergab sich ebenfalls ein linearer Abfall der Infektiosität. Nach 16
Stunden war kein infektiöses Virus mehr nachweisbar.
Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung einer MKS-Viruslösung vom Typ Oi
durchgeführt. Nach einer Reaktionszeit von 4 Stunden konnte keine Infektiosität mehr festgestellt werden.
MKS-Viruslösungen vom Typ C und Typ Oi wurden jeweils nach dem im Beispiel 1 beschriebenen Verfahren
5 bzw. 6 Stunden lang inaktiviert. Mit Hilfe des bekannten Polyäthylenglykol-Verfahrens wurden daraus
Viruskonzentrate hergestellt, von welchen jeweils 1 ml an je S empfängliche Ferkel intramuskulär verimpft
wurden. Nachdem sich innerhalb von 10 Tagen keinerlei
Krankheitserscheinungen zeigten, wurden jeweils gleiehe
Teile der inaktivierten Viruskonzentrate mit einem Adjuvans vermischt und 20 Schweinen intramuskulär
injiziert
Die Tiere bildeten alle neutralisierende Antikörper
gegen beide aktive Virus-Typen. 8 Wochen nach der
ίο Vakzination waren alle 10 von 10 Tieren gegenüber der
Infektion mit aktivem MKS-Virus vom Typ C immun, gegenüber Infektion mit aktivem MKS-Virus vom Typ
Oi waren 9 von 10 Tieren immun, ein Tier erkrankte,
jedoch wesentlich milder als die Kontrollen ohne Inaktivierung.
Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde zur Inaktivierung des Virus der infektiösen bovinen
}° Rhinotracbcitis (IBR) — eines Vertreters der Desoxyribonucleinsäure
enthaltenden Virer — anstelle von MKS-Virus, welches Ribonucleinsäure enthält, angewendet.
Auch hier war ein linearer Infektiositätstiterabfall
festzustellen, so daß nach 6 Stunden Reaktionszeit
-5 keine Infektiosität mehr nachzuweisen war. Jeweils 2 ml
einer 6 Stunden behandelten Viruslösung wurden 10 Meerschweinchen intramuskulär injiziert 3 Wochen
nach der Vakzinierung waren im Serum dieser Tiere neutralisierende Antikörper gegen das IBR-Virus
nachweisbar.
Zu einer Bakterien-Suspension von Pasteurella haemolitica mit etwa 10'° Bakterien/ml wurde analog
dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren Äthylenimin bis zu einer Endkonzentration von 0,05% (Vol/Vol)
gegeben. Nach 14 Stunden bei 37° C wurde die Bakterienmasse abzentrifugiert und in steriler, phosphatgepufferter
Kochsalzlösung resuspendiert.
Eine Probe des so erhaltenen Präparates wurde auf 3 verschiedene Bakteriennährlösungen aufgeimpft und
bei S/°C bebrütet. Innerhalb von 6 Tagen konnte kein
Bakterienwachstum festgestellt werden.
Eine weitere Probe davon wurde in 0,1 ml Dosen intraperitoneal 20 Mäusen injiziert. Nach 24 und 48
Stunden zeigten die Tiere keinerlei Krankheitserscheinungen, während von 20 mit derselben, jedoch
unbehandelten Bakterien-Suspension injizierten Tieren 15 innerhalb von 16 Stunden und 5 innerhalb von 24
w Stunden starben.
Eine weitere Probe davon wurde mit demselben Volumen eines Adjuvans vermischt. Mit je 1,5 ml dieser
Vakzine wurden 5 Kaninchen subkutan geimpft. Die Vakzif.ietung wurde nach 14 Tagen wiederholt. Bei
■>"' keinem dieser Tiere zeigte sich eine Bakterämie. Im
Serum dieser Tiere konnte mit Hilfe des Aggluiinationstests
ein Antikörpertiter gegen dasselbe Bakterium festgestellt werden, der sich dann nach der Booster-Impfung
deutlich trhöhte.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
Claims (2)
- Patentansprüche;1, Verwendung von neutralisierten Äthyleniminlösungen zur Inaktivierung von infektiösen Virus- und Bakteriensuspensionen for die Herstellung von Impfstoffen, wobei die Äthyleniminlösungen den Suspensionen bis zu einer Endkonzentration an Äthylenimin von 0,01 bis 0,5% (Vol/Vo!) zugesetzt werden. _ ι ο
- 2. Verwendung von neutralisierten Äthyleniminlösungen nach Anspruch 1 für die Herstellung von Impfstoffen aus IBR-Viren, MKS-Viren oder Pasteurelia haemolytica-Bakterien.
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