DE3485921T2

DE3485921T2 - Plasmide zur transformation von pflanzenzellen.

Info

Publication number: DE3485921T2
Application number: DE8484900783T
Authority: DE
Inventors: Thomas Fraley; Gary Rogers
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1983-01-17
Filing date: 1984-01-16
Publication date: 1993-04-01
Anticipated expiration: 2004-01-17
Also published as: DE3485921D1

Description

Technisches Gebiet

Diese Erfindung liegt auf dem Gebiet der Genmanipulation, Pflanzenbiologie und Bakteriologie.

Technischer Hintergrund

Im letzten Jahrzehnt hat sich die Wissenschaft der Genmanipulation rasch entwickelt. Es ist eine Reihe von Verfahren zum Insertieren eines heterologen Gens in Bakterien bekannt, wodurch die Bakterien zur effizienten Expression der insertierten Gene fähig werden. Derartige Verfahren involvieren gewöhnlich die Verwendung von Plasmiden, die an einer oder mehreren selektionierten Schnittstellen durch Restriktionsendonucleasen gespalten werden können. Typischerweise wird ein interessierendes Gen durch Spalten eines DNA-Stückes erhalten und das resultierende DNA-Fragment wird mit einem Fragment gemischt, das durch Spalten eines Vektors, wie eines Plasmids, erhalten wird. Die verschiedenen DNA-Stränge werden dann unter Bildung eines rekonstituierten Plasmids miteinander verbunden ("verknüpft"); siehe beispielsweise US-Patente 4 237 224 (Cohen und Boyer, 1980), 4 264 731 (Shine, 1981), 4 273 875 (Manis, 1981), 4 322 499 (Baxter et al., 1982) und 4 336 336 (Silhavy et al., 1982).
Eine Reihe anderer Bezugsarbeiten ist verfügbar. Einige dieser Arbeiten beschreiben den natürlichen Prozeß, durch den DNA in mRNA transkribiert und mRNA in Protein translatiert wird, siehe L. Stryer, Biochemistry, 2. Aufl., S. 559 ff. (W.H. Freeman and Co., 1981); A.L. Lehninger, Biochemistry, 2. Aufl., S. 853 ff. (Worth Publ., 1975). Andere Arbeiten beschreiben Verfahren und Produkte von Genmanipulation, siehe z. B. T. Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Labs, 1982); J.K. Setlow und A. Hollaender, Genetic Engineering, Principles and Methods (Plenum Press, 1979). Im folgenden werden alle Literaturstellen in abgekürzter Form zitiert; eine Liste der vollständigen Zitate scheint nach den Beispielen auf.
Der Großteil der derzeit durchgeführten genetische Manipulationsarbeit involviert die Insertion von Genen in verschiedene Arten von Zellen, hauptsächlich Bakterien, wie E. coli, verschiedene andere Mikroorganismen, wie Hefe, und Säugerzellen. Jedoch sind viele der für Genmanipulation von Tierzellen und Mikroorganismen verwendeten Techniken und Substanzen auf Pflanzen involvierende Genmanipulation nicht direkt anwendbar.
Der hier verwendete Ausdruck "Pflanze" bezieht sich auf einen multizellulären differenzierten Organismus, der zur Photosynthese imstande ist, wie Angiospermen und multizelluläre Algen. Dieser Ausdruck schließt Mikroorganismen, wie Bakterien, Hefe und Pilze, nicht ein. Der Ausdruck "Pflanzenzelle" schließt jede Zelle ein, die von einer Pflanze stammt; er schließt nichtdifferenziertes Gewebe, wie Kallus oder Wurzelhalsgallentumor, sowie Pflanzensamen, Ableger, Pollen oder Pflanzenembryos ein.

Ti- und Ri-Plasmide

Das tumorinduzierende (Ti) Plasmid von Agrobacterium tumefaciens wurde zur Verwendung als natürlicher Vektor zum Einschleusen von genetischer Fremdinformation in Pflanzenzellen vorgeschlagen (Hernalsteen et al., 1980, Rorsch und Schilperoort, 1978). Bestimmte Arten von A. tumefaciens können eine Vielzahl von Pflanzenzellen infizieren, wodurch Wurzelhalsgallenkrankheit hervorgerufen wird. Der Infektionsprozeß wird nicht ganz verstanden. Zumindest ein Teil des Ti-Plasmids tritt in die Pflanzenzelle ein. Es erfolgen verschiedene metabolische Änderungen und ein Teil des Ti-Plasmids wird in das Genom der Pflanze insertiert (wahrscheinlich in die Chromosomen). Der Teil des Ti-Plasmids, der in das Pflanzengenom gelangt, wird "transferierte DNA" (T-DNA) bezeichnet. T-DNA wird in der Pflanzen-DNA stabil aufrechterhalten (Chilton et al., 1977; Yadev et al., 1980, Willmitzer et al., 1980; Otten et al., 1981).
Von verschiedenen Laboratorien durchgeführte Forschung führte zu der Charakterisierung verschiedener Strukturgene (d. h. proteincodierender Gene), die sich in T-DNA befinden (Garfinkel et al., 1981; Leemans et al., 1982), sowie anderer DNA-Sequenzen, die verschiedenen anderen Funktionen zu dienen scheinen. Beispielsweise scheinen die beiden als "linke Grenze" und "rechte Grenze" bezeichneten Sequenzen T-DNA zu delinearisieren, und können im Prozeß involviert sein, durch den T-DNA in Pflanzenchromosome transferiert wird (Zambryski et al., 1982).
Eine andere Art von Agrobacterium, A. rhizogenes, trägt ein "wurzel-induzierendes" (Ri) Plasmid, das dem Ti-Plasmid ähnlich ist. Die Infektion einer Pflanzenzelle durch A. rhizogenes bewirkt Haarwurzelkrankheit. Wie das Ti-Plasmid wird ein Segment von DNA, "T-DNA" genannt (von einigen Forschern auch "R-DNA" bezeichnet), in das Pflanzengenom einer infizierten Zelle transferiert.
Es gibt auch Berichte über verschiedene andere Bakterien, die imstande sind, genetische Transformation von Pflanzenzellen zu bewirken, einschließlich A. rubi, und bestimmte Bakterien der Gattung Rhizobia, die mit einem mutagenen Mittel behandelt wurden; Hooykaas et al., auf Seite 156 von Setlow und Hollaender, 1979.
Der hier verwendete Ausdruck "Ti-Plasmid" schließt jedes Plasmid ein, (1) das in einem anderen Mikroorganismus als einem Virus enthalten ist, der imstande ist, genetische Transformation einer oder mehrerer Pflanzenarten oder Pflanzenzellen zu bewirken, und (2) das ein DNA-Segment enthält, das in ein Pflanzengenom insertiert ist. Er schließt Ri-Plasmide ein.
Der hier verwendete Ausdruck "T-DNA" bezieht sich auf ein DNA-Segment in oder von einem Ti-Plasmid, (1) das in das Genom einer oder mehrerer Arten von Pflanzenzellen insertiert wurde, oder (2) das in einem DNA-Segment enthalten ist, das sich zwischen zwei Basensequenzen befindet, die als T-DNA-Grenzen dienen können. Die hier verwendeten Ausdrücke "T-DNA-Grenze" und "Grenze" sind empirisch bestimmt und angewandt; diese Ausdrücke sollen sich auf eine Basensequenz beziehen, die am oder nahe dem Ende eines DNA-Segments aufscheint, das von einem Ti-Plasmid in ein Pflanzengenom transferiert ist.
Trotz des bestehenden Wissens über T-DNA und Ti-Plasmide war vor dieser Erfindung niemand imstande, diese Vektoren zum Einschleusen von Fremdgenen zu verwenden, die in genetisch modifizierten Pflanzen exprimiert werden. Man stieß bei Genmanipulationsversuchen auf eine Reihe von Hindernissen gegen eine derartige Verwendung. Derartige Hindernisse sind:
1) die große Größe (ungefähr 200 000 Basenpaare) und resultierende Kompliziertheit von Ti-Plasmiden schließen die Verwendung von rekombinanten Standard-DNA-Techniken zum genetischen Modifizieren und/oder Insertieren von Fremdgenen in spezifische Stellen in der T-DNA aus. Beispielsweise gibt es in einem Ti-Plasmid keine bekannten einmaligen Restriktionsendonuclease-Schnittstellen (Leemans et al., 1982);
2) die T-DNA, die in Pflanzenzellen insertiert und darin exprimiert wird, enthält Gene, die in der Produktion großer Mengen von Phytohormonen in den transformierten Pflanzenzellen involviert sind (Leemans et al., 1982). Die großen Mengen von Phytohormonen beeinträchtigen den normalen metabolischen und regenerativen Prozeß der Zellen und verhindern die Bildung von phänotypisch normalen Pflanzen aus den Zellen (Braun und Wood, 1976; Yang et al., 1980). Ausnahmen hievon sind seltene Fälle, wo die T-DNA extensiven spontanen Deletionen in planta ausgesetzt war, um jene Gene zu eliminieren, die in der Phytohormonproduktion involviert sind. Es wurde berichtet, daß unter diesen Bedingungen normale Pflanzen bei niedriger Frequenz erhältlich sind (Otten et al., 1981). Jedoch konnten die in der Phytohormonproduktion involvierten T-DNA-Gene vor dieser Erfindung nicht deletiert werden, weil sie bei der Identifizierung und/oder Selektion transformierter Pflanzenzellen sehr wichtig waren (Marton et al., 1979).
Wie oben beschrieben, sind einfache rekombinate DNA-Techniken zum Einschleusen von Fremdgenen in Plasmide auf das große Ti-Plasmid nicht anwendbar. Als Folge wurden verschiedene indirekte Methoden entwickelt, die im nachstehenden diskutiert werden. Die erste angegebene Verwendung des Ti-Plasmids als Vektor war in Modellversuchen, in denen bakterielle Transposone in T- DNA insertiert und anschließend in Pflanzenzellen eingeschleust wurden. Von den bakteriellen Transposonen wurde berichtet, daß sie im Pflanzengenom stabil aufrechterhalten werden (Hernalsteens et al., 1980, Garfinkel et al., 1981). Jedoch wurde in diesen Fällen gefunden, daß die transformierten Tumorgewebe nicht zur Regeneration in normale Pflanzen imstande waren, und es gibt keinen berichteten Beweis für die Expression von bakteriellen Genen in den Pflanzenzellen. Außerdem war, da angenommen wird, daß die Insertion von bakteriellen Transposonen im wesentlichen regellos ist, ein Großteil der Bemühungen dazu erforderlich, die Position der insertierten DNA in diesen Beispielen zu identifizieren und zu lokalisieren.
In späteren Versuchen demonstrierten J. Leemans, H. de Greve et al. (1982) die Expression von Dihydrofolatreduktase, einem charakteristischen Produkt des bakteriellen Tn 7-Transposons, durch Wurzelhalsgallen-Tabakzellen, die durch mutante Ti- Plasmide, die die Tn 7-Transposonsequenz in der T-DNA enthalten, transformiert worden waren. Die Autoren spekulieren, daß es möglich sein sollte, hinter den T-DNA-Promotoren für Opinsynthese die Sequenzen bakterieller Gene zu insertieren, die für Funktionen codieren, die andere Antibiotika inaktivieren. So nehmen sie an, daß es möglich wäre, gute Expression und möglicherweise ausreichende Antibiotikumresistenz zu erzielen, um direkte Selektion der transformierten Pflanzenzellen zu ermöglichen.
Andere Forscher berichteten über die Verwendung von Zwischenvektoren, die sowohl in E. coli als auch in A. tumefaciens replizieren (Matzke und Chilton, 1981; Leemans et al., 1981; Garfinkel et al., 1981). Die Zwischenvektoren enthalten relativ kleine Subfragmente des Ti-Plasmids, die unter Verwendung von rekombinanten Standard-DNA-Techniken manipuliert werden können. Die Subfragmente können durch die Deletion spezifischer Sequenzen oder durch die Insertion von Fremdgenen an spezifischen Stellen modifiziert werden. Die das modifizierte T-DNA-Subfragment enthaltenden Zwischenvektoren werden dann durch Transformation oder Konjugation in A. tumefaciens eingeschleust. Doppelte Rekombination zwischen dem modifizierten T-DNA-Fragment am Zwischenvektor und seinem Wildtyp-Gegenstück am Ti-Plasmid führt zum Ersatz der Wildtyp-Kopie durch das modifizierte Fragment. Zellen, die die rekombinierten Ti-Plasmide enthalten, können unter Verwendung geeigneter Antibiotika selektioniert werden.
Verschiedene Fremd-DNA's wurden an spezifischen Stellen in der T-DNA durch diese Methode insertiert und es wurde berichtet, daß sie in Pflanzenzellen stabil transferiert wurden (Matzke und Chilton, 1981, Leemans et al., 1981, 1982). Jedoch wurde von derartigen Fremdgenen nicht berichtet, daß sie zu Expression in Pflanzenzellen imstande sind. Mögliche Gründe dafür wurden von M.D. Chilton et al. (1981), diskutiert. Beispielsweise wird vermutet, daß die Länge und Sequenz des 5'-nicht-translatierten Teils des Transkripts die Effizienz von Capping, Spleißen, Transport zum Zytoplasma oder Initiierung von Translation beeinträchtigen könnten. Weiterhin wird es im oben beschriebenen Verfahren bevorzugt, daß ein Doppel-Crossover stattfindet, um die Wildtyp-Kopie durch das modifizierte DNA-Fragment zu ersetzen. Ein einziger Crossover führt zur Bildung eines cointegralen Plasmids, das zwei Kopien der T-DNA-Subfragmente enthält. Diese Duplizierung ist in diesen Methoden unerwünscht, weil homologe Rekombination, die in A. tumefaciens-Zellen oder in Pflanzenzellen stattfinden kann, zum Verlust des oder der insertierten Fremgene führen kann.
Ein Hauptnachteil der obigen Methoden ist, daß die Frequenz von doppelter Rekombination recht niedrig ist, etwa 10&supmin;&sup4; bis 10&supmin;&sup9; (Leemans et al., 1981), und daß es ausgedehnter Mühe bedarf, um die seltenen Doppel-Crossover-Rekombinanten zu identifizieren und zu isolieren. Als Folge sind die Anzahl und Arten von Experimenten, die unter Anwendung bestehender Methoden zum genetischen Manipulieren des Ti-Plasmids durchgeführt werden können, sehr beschränkt.
Choudary et al. (1982) berichten unter Anwendung eines ähnlichen Verfahrens über den Transfer des Gens für Phaseolin von Bohnen- auf Sonnenblumenpflanzenzellen, wobei rekombinante Zellen von A. tumefaciens als Vektoren verwendet werden. Über die Transkription des Phaseolin-Gens in den transformierten Sonnenblumenzellen wurde berichtet, doch konnte die Produktion von Phaseolin nicht nachgewiesen werden.
Ein anderer Bericht über die Aussichten der Verwendung der Ti-Plasmide von Agrobacteria als Vektoren für die Genmanipulation von Pflanzen ist jener von Ream und Gordon (1982).
EP-A-0 116 718, bei der es sich um den die vorliegende Anmeldung betreffenden Stand der Technik gemäß Artikel 54(3) EPÜ handelt, beschreibt modifizierte Akzeptor-Ti-Plasmide, die das Einschleusen eines beliebigen (beliebiger) interessanten Gens (Gene), enthalten in einem Zwischenklonierungsvektor, der eine Region von Homologie mit einer entsprechenden Region im Akzeptor-Ti-Plasmid trägt, ermöglichen. Dieses Einschleusen wird in Agrobacterium als Wirt durch einen einzigen Crossover erzielt, der innerhalb der beiden homologen DNA-Segmente stattfindet. Die resultierenden Hybrid-Ti-Plasmide in Agrobacterium können direkt zum Infizieren von Pflanzenzellen verwendet werden, die anschließend für die Expression des Produktes des (der) interessanten Gens (Gene) gesiebt werden können. Es ist möglich, aus den transformierten Pflanzenzellen transformierte fortpflanzungsfähige Pflanzen zu regenerieren.
Jedoch weisen die Hybrid-Ti-Plasmide von EP-A-0 116 718, die durch den einzigen Crossover produziert werden, zwei Kopien von T-DNA-Subfragmenten auf. Diese Duplizierung ist aus dem oben angegebenen Grund unerwünscht.
Es wurde über eine Reihe anderer Methoden zum Insertieren von DNA in Pflanzenzellen berichtet. Eine solche Methode involviert die Verwendung von Lipidvesikeln, auch Liposome genannt, zum Einkapseln eines oder mehrerer DNA-Moleküle. Die Liposomen und ihr DNA-Gehalt können von Pflanzenzellen aufgenommen werden, siehe z. B. Lurquin, 1981. Wenn die insertierte DNA in das Pflanzengenom inkorporiert, repliziert und vererbt werden kann, werden die Pflanzenzellen transformiert.
Andere Techniken involvieren das Inberührungbringen von Pflanzenzellen mit DNA, die entweder mit (a) polykationischen Substanzen, wie Poly-L-ornithin (Davey et al., 1980) oder (b) Calciumphosphat (Krens et al., 1982) in einen Komplex gebracht wird. Unter Anwendung dieser Techniken wird das gesamte Ti- Plasmid oder ein Teil hievon, wie berichtet, in Pflanzenzellen insertiert, was tumorerzeugende Änderung der Pflanzenzellen bewirkt.
Eine andere Methode wurde entwickelt, die die Fusion von Bakterien, die gewünschte Plasmide enthalten, mit Pflanzenzellen involviert. Derartige Methoden involvieren die Überführung der Bakterien in Sphaeroplasten und die Überführung der Pflanzenzellen in Protoplasten. Beide Methoden entfernen unter Verwendung von enzymischem Verdau die Zellwandbarriere von den Bakterienund Pflanzenzellen. Die beiden Zellarten können dann miteinander verschmolzen werden, indem sie chemischen Mitteln, wie einem Polyäthylenglykol, ausgesetzt werden, siehe Hasezawa et al., 1981.
Jedoch leiden alle obigen Techniken unter einem oder mehreren der folgenden Probleme: (i) bisher angegebene Transformationseffizienzen waren sehr niedrig; (ii) nur kleine DNA-Moleküle können in Pflanzenzellen insertiert werden; (iii) nur kleine Mengen von DNA-Molekülen können in Pflanzenzellen insertiert werden und/oder (iv) ein Gen, das in eine Pflanzenzelle insertiert wird, wird von der Pflanzenzelle nicht stabil aufrechterhalten, wenn es nicht in das Genom der Pflanzenzelle inkorporiert wird, d. h. wenn das Gen nicht in ein Chromosom oder Plasmid insertiert wird, das in der Pflanzenzelle repliziert.
Vor dieser Erfindung gab es keine zufriedenstellende Methode für die Schaffung und Identifizierung von genetisch transformierten Pflanzenzellen, die routinemäßig in morphologisch normale Pflanzen regeneriert werden könnten.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf verschiedene Plasmide, die zum Bilden von transformierten Pflanzenzellen verwendbar sind, die zu anschließender Regeneration in differenzierte, morphologisch-normale Pflanzen imstande sind. Diese Erfindung bezieht sich auch auf Mikroorganismen, die derartige Plasmide enthalten, und auf Verfahren zum Schaffen derartiger Plasmide und Mikroorganismen.
Diese Erfindung involviert ein erstes Plasmid, wie pMON120, das im nachstehenden beschriebene bestimmte, gewünschte Merkmale hat. Ein Gen, das imstande ist, in Pflanzenzellen exprimiert zu werden, kann in dieses Plasmid insertiert werden, um ein modifiziertes Plasmid, wie pMON128, zu erhalten. Beispielsweise enthält Plasmid pMON128 ein chimäres Gen, das Neomycinphosphotransferase II (NPT II) exprimiert, ein Enzym, das bestimmte Antibiotika inaktiviert. Das chimäre Gen ist zur Expression in Pflanzenzellen imstande.
Das modifizierte Plasmid wird in einen geeigneten Mikroorganismus, wie Agrobacterium tumefaciens-Zellen, die Ti-Plasmide enthalten, insertiert. In den A. tumefaciens-Zellen rekombinieren sich einige der insertierten Plasmide mit Ti-Plasmiden unter Bildung eines cointegralen Plasmids; dies auf Grund einer Homologieregion zwischen den beiden Plasmiden. Es ist nur ein einziger Crossover erforderlich, um das gewünschte cointegrale Plasmid zu bilden.
Auf Grund der Merkmale des insertierten Plasmids dieser Erfindung enthält das resultierende cointegrale Ti-Plasmid das chimäre Gen und/oder ein anderes insertiertes Gen innerhalb der T-DNA-Region des cointegralen Plasmids. Das oder die insertierten Gene sind von mindestens zwei T-DNA-Grenzen umgeben, wovon mindestens eine durch den Crossover in das Ti-Plasmid insertiert wurde. Durch geeignete Antibiotika werden A. tumefaciens-Zellen, die keine cointegralen Ti-Plasmide mit insertierten Genen aufweisen, getötet.
A. tumefaciens-Zellen mit cointegralen Plasmiden werden mit Pflanzenzellen, wie Protoplasten, von Protoplasten stammenden Zellen, Pflanzenstecklingen oder intakten Pflanzen, unter Bedingungen cokultiviert, die es den cointegralen Ti-Plasmiden oder Teilen hievon ermöglichen, in die Pflanzenzellen zu gelangen. Wenn sie einmal im Inneren der Pflanzenzellen sind, wird ein Teil des Ti-Plasmids, der von den beiden T-DNA-Grenzen umgeben ist, durch natürliche Prozesse in das Pflanzengenom insertiert. Dieses DNA-Segment enthält das chimäre Gen und/oder jedes andere gewünschte Gen oder Gene. Vorzugsweise enthält das Segment von Vektor-DNA, das in das Pflanzengenom insertiert wird, keinerlei Gene, die die Pflanzenzelle zum Regenerieren in eine differenzierte, morphologisch normale Pflanze unfähig machen würden. Die transformierte(n) Pflanzenzelle(n) kann (können) in eine morphologisch normale Pflanze regeneriert werden, die das insertierte Gen zu ihren Abkömmlingen leitet.
Es gibt für durch das Verfahren dieser Erfindung transformierte Pflanzen verschiedene Verwendungen. Beispielsweise kann ein Gen, das für ein Enzym codiert, das ein Herbizid inaktiviert, in eine Pflanze insertiert werden. Dies würde die Pflanze und ihre Abkömmlinge gegen das Herbizid resistent machen. Andererseits kann ein Gen, das für ein gewünschtes Säugerpolypeptid codiert, wie Wachstumshormon, Insulin, Interferon oder Somatostatin, in Pflanzen insertiert werden. Die Pflanzen können gezogen und geerntet werden und das Polypeptid könnte aus dem Pflanzengewebe extrahiert werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein Schaubild, das die Schritte dieser Erfindung unter Verwendung von pMON128 und des NOS-NPT II-Gens als Beispiel zeigt.
Fig. 2 stellt die Bildung von pMON41, eines zum Konstruieren von pMON120 verwendeten Plasmids, dar.
Fig. 3 stellt die Bildung von M-4, einer zum Konstruieren von pMON109 verwendeten, von M13 stammenden DNA dar.
Fig. 4 stellt die Bildung von pMON54, eines zum Konstruieren von pMON109 verwendeten Plasmids, dar.
Fig. 5 stellt die Bildung von pMON109, eines zum Konstruieren von pMON120 verwendeten Plasmids, dar.
Fig. 6 stellt die Bildung von pMON113, eines zum Konstruieren von pMON120 verwendeten Plasmids, dar.
Fig. 7 stellt die Bildung von Plasmid pMON120, eines Zwischenvektors mit drei Restriktionsendonuclease-Schnittstellen, die zum Insertieren eines gewünschten Gens geeignet sind, dar.
Fig. 8 stellt die Bildung von pMON128, eines Zwischenvektors, dar, der durch Insertieren eines chimären NOS-NPT 11 Kanamycin-Resistenzgens in pMON120 erhalten wurde.
Fig. 9 stellt die Cointegration von pMON128 mit einem Wildtyp-Ti-Plasmid durch einen einzigen Crossover dar, wodurch ein cointegrales Plasmid mit mehreren Grenzen gebildet wird.
Fig. 10 zeigt die Cointegration von pMON128 mit einem entwaffneten Ti-Plasmid, wodurch ein nicht-tumorerzeugendes cointegrales Plasmid gebildet wird.
Fig. 11 ist eine Kurve, in der das Wachstum von transformierten Zellen und nicht-transformierten Zellen auf kanamycinhaltigem Medium verglichen ist.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wurde eine Reihe von chimären Genen unter Anwendung der Schritte, die im Schaubild der Fig. 1 zusammengefaßt sind, in Pflanzenzellen insertiert. Wie in Fig. 1 gezeigt, wurden drei Vorplasmide hergestellt. Diese Plasmide wurden wie folgt bezeichnet:
1. pMON41, das eine rechte Grenze von einem Ti-Plasmid vom Nopalintyp und den 5'-Teil eines Nopalinsynthase (NOS)-Gens enthielt. Die Konstruktion des Plasmids pMON41 ist im nachstehenden beschrieben und in Fig. 2 gezeigt.
2. pMON109, das den 3'-Teil eines NOS-Gens und ein Selektionsmarkergen (spc/str) enthielt, das die Selektion von A. tumefaciens-Zellen mit cointegralen Ti-Plasmiden mit chimären Genen ermöglichte. Die Konstruktion des Plasmids pMON109 ist im nachstehenden beschrieben und in den Fig. 3, 4 und 5 gezeigt.
3. pMON113, das eine DNA-Region mit einer Sequenz enthielt, die mit der Sequenz innerhalb des T-DNA-Teiles eines Ti-Plasmids vom Octopintyp identisch ist. Diese Region wurde als die "linke innere Homologie" (LIH)-Region bezeichnet. Die Konstruktion von pMON113 ist im nachstehenden beschrieben und in Fig. 6 gezeigt.
Nach dem Zusammenbau dieser Plasmide wurde jedes Plasmid durch geeignete Endonucleasen verdaut, um ein gewünschtes Fragment zu erhalten. Drei Fragmente (eines von jedem der drei Plasmide) wurden in einer Dreifachligation zusammengebaut, um den Zwischenvektor, Plasmid pMON120, zu erhalten, wie in Fig. 7 gezeigt.
Plasmid pMON120 spielt eine Schlüsselrolle in der Ausführungsform dieser Erfindung, die im nachstehenden im einzelnen beschrieben ist. Dieses Plasmid hat die folgenden Merkmale:
1. pMON120 hat mindestens drei einmalige Restriktionsendonuclease-Schnittstellen (EcoRi, ClaI und HindIII), die das bequeme Insertieren jedes gewünschten Gens ermöglichen.
2. pMON120 repliziert innerhalb normaler E. coli-Zellen. Jedoch repliziert es nicht innerhalb normaler Agrobacterium- Zellen, wenn es nicht mit einem anderen Plasmid, wie einem Ti- Plasmid, cointegriert, das in Agrobacterium-Zellen repliziert.
3. pMON120 trägt ein Markergen, das für ein Enzym codiert, das gegen zwei Antibiotika, Spectinomycin (spc) und Streptomycin (str), Resistenz verleiht. Dieses Gen, als das spc/str-Gen bezeichnet, wird in E. coli und in A. tumefaciens exprimiert, nicht aber in Pflanzenzellen. pMON120 trägt keine Gene, die für Resistenz gegen Ampicillin oder Tetracyclin codieren.
4. pMON120 trägt eine Sequenz, die zu einer Sequenz innerhalb des T-DNA-Teiles eines Ti-Plasmids von A. tumefaciens vom Octopintyp homolog ist. Diese Sequenz wird als die "linke innere Homologie" (LIH)-Region bezeichnet. Diese Homologieregion fördert einen Crossover, wodurch pMON120 oder ein Derivat von pMON120, wie pMON128, mit dem Ti-Plasmid ein Cointegrat bildet, wenn die beiden Plasmide innerhalb der gleichen A. tumefaciens- Zelle existieren. Gemäß Definition wird das "cointegrale" Plasmid durch einen einzigen Crossover gebildet. Es enthält alle DNA-Sequenzen, die vorher entweder im Ti-Plasmid oder in dem von pMON120 stammenden Plasmid existierten.
5. pMON120 trägt eine T-DNA "rechte Grenze" vom Nopalintyp, d. h. eine Sequenz, die imstande ist, als ein Ende (gemäß Konvention als rechte Grenze bezeichnet) einer T-DNA-Sequenz zu wirken, die von einem Ti-Plasmid transferiert und in das Chromosom einer Pflanzenzelle während Transformation der Zelle durch A.
tumefaciens insertiert wird.
6. pMON120 trägt ein Gen (einschließlich eines Promotors), das für die Expression eines Enzyms, Nopalinsynthase (NOS), codiert. Wenn das NOS-Enzym einmal in eine Pflanzenzelle eingeschleust ist, katalysiert es die Produktion von Nopalin, einer Opinart. In den meisten Pflanzenarten sind Opine nicht- schädliche Verbindungen, die sich in niedrigen Mengen ansammeln; die Anwesenheit von Nopalin kann in Pflanzengewebe leicht nachgewiesen werden (Otten und Schilperoort, 1978). Opin-Gene können als nützliche Markergene zum Bestätigen von Transformation dienen, da Opine gewöhnlich in nicht-transformierten Pflanzenzellen nicht existieren. Wenn gewünscht, kann das NOS-Gen in pMON120 durch eine Reihe den Fachleuten auf dem Gebiet bekannter Techniken nicht-funktionell gemacht werden. Beispielsweise existiert eine BamHI-Schnittstelle innerhalb des codierenden Teiles des NOS-Gens; ein Stopcodon oder eine andere geeignete Oligonucleotidsequenz könnte in diese Stelle insertiert werden, um die Translation von NOS zu verhindern.
7. Die relative Lage der verschiedenen Gene, Schnittstellen und anderen Sequenzen in pMON120 ist für die Durchführung dieser Erfindung sehr wichtig. Das gesamte pMON120-Plasmid oder sein modifiziertes Plasmid, wie pMON128, ist im cointegralen Ti- Plasmid enthalten. Jedoch wird nur ein Teil des cointegralen Ti- Plasmids (die modifizierte T-DNA-Region) in das Pflanzengenom insertiert. Daher wird nur ein Teil des von pMON120 stammenden Plasmids in das Pflanzengenom insertiert. Dieser Teil beginnt an der T-DNA-Grenze und erstreckt sich in einer Richtung nur zur Homologieregion. In pMON120 sind der NOS-Zählmarker, der spc/str-Selektionsmarker und die drei Insertionsstellen innerhalb des Teiles von pMON120, der in das Pflanzengenom transferiert würde. Jedoch würden wahrscheinlich die von pBR322 stammende Region nächst der LIH und die PvuI-Schnittstelle nicht in das Pflanzengenom transferiert. Wichtigerweise verhindert diese Anordnung von pMON120 und seiner Derivate den Transfer von mehr als einer Homologieregion in das Pflanzengenom, wie imnachstehenden diskutiert.
8. pMON120 ist etwa 8 Kilobasen lang. Dies ist ausreichend klein, um zu ermöglichen, daß alle Ziele dieser Erfindung erreicht werden. Wenn jedoch gewünscht, kann es durch die Deletion einer oder mehrerer Nucleotidsequenzen, die nicht wesentlich sind, unter Anwendung von den Fachleuten auf dem Gebiet bekannten Methoden etwas kleiner gemacht werden. Eine derartige Reduktion der Größe könnte die Effizienz oder andere Merkmale des Plasmids verbessern, wenn es für diese Erfindung oder für andere Zwecke verwendet wird, wie von Fachleuten auf dem Gebiet bestimmt werden kann.
Es ist klar, daß eine Vielzahl von Zwischenvektoren, die sich von pMON120 in einer oder mehreren Hinsichten unterscheiden, von Fachleuten hergestellt und verwendet werden kann. Beispielsweise könnte der zum Zählen von transformierten Pflanzenzellen verwendete NOS-Marker deletiert oder durch einen anderen Zähl- oder Selektionsmarker ersetzt oder ergänzt werden. Ein derartiges Markergen könnte ein Antibiotikum-Resistenzgen, wie das im nachstehenden beschriebene NOS-NPT II-NOS chimäre Gen, umfassen. Als anderes Beispiel könnte das zum Selektieren von A. tumefaciens-Zellen verwendete spc/str-Markergen mit cointegralen Plasmiden deletiert oder durch einen anderen Zähl- oder Selektionsmarker, der in Agrobacteria exprimiert wird, ersetzt oder ergänzt werden. Als weiteres Beispiel könnte eine Reihe von T-DNA-Grenzen (wie eine "linke" Grenze vom Nopalintyp oder eine linke oder rechte Grenze vom Octopintyp) verwendet werden. Ähnlich könnte mehr als eine Grenze (wie zwei oder mehrere rechte Nopalingrenzen oder eine rechte Nopalingrenze und eine rechte Octopingrenze) in den Zwischenvektor in der gewünschten Orientierung insertiert werden; dies kann die Frequenz der Insertion der T-DNA in das Pflanzengenom erhöhen, wie von Fachleuten bestimmt werden kann. Es ist auch möglich, sowohl linke als auch rechte Grenzen (jeder Art) in einen Zwischenvektor zu insertieren. Es ist auch möglich, die Länge der Homologieregion zu erhöhen; dies wahrscheinlich, um die Frequenz des gewünschten einzigen Crossover zu erhöhen (Leemans et al., 1981). Es ist auch möglich, eine geeignete Homologieregion von jeder Art von gewünschtem Plasmid, wie ein Nopalin- oder Agropin-Ti-Plasmid oder ein Ri-Plasmid, zu selektionieren; derartige Regionen ermöglichen, daß der Zwischenvektor mit jedem gewünschten Plasmid ein Cointegrat bildet.

Verfahren zum Bilden von pMON120

Plasmid pMON120 wurde aus von drei anderen Plasmiden stammenden Fragmenten konstruiert. Diese drei Plasmide wurden pMON41, pMON109 und pMON113 bezeichnet. Die Konstruktion jedes dieser drei Plasmide ist im nachstehenden zusammengefaßt; weitere Information ist in den Beispielen gegeben.
Plasmid pMON41 steuerte eine T-DNA rechte Grenze vom Nopalintyp und den 5'-Teil eines Nopalinsynthase (NOS)S-Gen für pMON120 bei. Es wurde durch die folgende Methode gebildet.
Ein Ti-Plasmid vom Nopalintyp, als pTiT37-Plasmid bezeichnet, kann mit der HindIII-Endonuclease verdaut werden, wobei eine Reihe von Fragmenten erzeugt wird, einschließlich eines 3,4 kb Fragments, das als HindIII-23-Fragment bezeichnet wird. Dieses Fragment enthält das gesamte NOS-Gen und die T-DNArechte Grenze. Die Anmelderin insertierte ein HindIII-23- Fragment in ein Plasmid, pBR327 (Soberon et al., 1980), das mit HindIII verdaut worden war. Das erhaltene Plasmid, als pMON38 bezeichnet, wurde sowohl mit HindIII als auch BamHI verdaut. Dies ergab ein 2,3 kb Fragment, das die rechte Grenze vom Nopalin-Typ und den 5'-Teil eines NOS-Gens (einschließlich die Promotorregion, die 5'-nicht-translatierte Region und einen Teil der Struktursequenz) enthält. Dieses 2,3 kb Fragment wurde in ein pBR327-Plasmid insertiert, das mit HindIII und BamHI verdaut worden war. Das resultierende Plasmid wurde als pMON41 bezeichnet, wie in Fig. 2 gezeigt.
Eine Reihe von Stämmen von A. tumefaciens ist von der American Type Culture Collection (Rockville, MD) öffentlich erhältlich; die Zuordnungsnummern sind in jedem ATCC-Katalog angegeben. Jeder Stamm enthält ein Ti-Plasmid, das wahrscheinlich zur Verwendung in dieser Erfindung geeignet ist, wie von Fachleuten durch Routineversuche bestimmt werden kann.
Plasmid pMON109 steuerte ein spc/str-Selektionsmarkergen und den 3'-Teil eines NOS-Gens für pMON120 bei. Es wurde durch die folgende Methode gebildet.
Plasmid pMON38 (oben beschrieben und in Fig. 2 gezeigt) wurde mit RsaI verdaut, wodurch glatte Enden erhalten wurden, wie gezeigt:
5'-GTAC
CATG
En 1,1 kb-Fragment wurde isoliert und mit BamHI verdaut, wobei Fragmente von 720 bp und 400 bp erhalten wurden, wovon jedes ein glattes Rsa-Ende und ein kohäsives BamHI-Ende hatte. Diese Fragmente wurden an eine doppelsträngige DNA von einem Phagen M13 mp8 angefügt (Messing und Vieira, 1982), der mit SmaI (wodurch glatte Enden erhalten werden) und BamHI verdaut worden war. Die Mischung wurde verknüpft, in Zellen transformiert und für rekombinanten Phagen plattiert. Rekombinante Phagen-DNA's, die das insertierte 720 bp Fragment enthielten, wurden durch die Größe des BamHI-SmI-Inserts identifiziert. Eine dieser Phagen- DNA's wurde als M-4 bezeichnet, wie in Fig. 3 gezeigt. Das 720 bp-Insert enthielt die 3'-nicht-translatierte Region (einschließlich des in den Figuren durch einen dicken Punkt angezeigten Polyadenylierungssignals) des NOS-Gens sowie den 3'-Teil der Struktursequenz des NOS-Gens. Das 720 bp-Insert ist in M-4 von EcoRI- und PstI-Schnittstellen umgeben, die in der M13 mp8- DNA vorhanden waren.
Es ist bekannt, daß ein bakterielles Transposon, als Tn7 bezeichnet, das oberwähnte spc/str-Gen enthält. Das Tn7-Transposon enthält auch ein Gen, das bewirkt, daß die Wirtszelle gegen das Antibiotikum Trimethoprim resistent ist. Die exakte Lage und Orientierung des spc/str-Gens und des Trimethoprim-Resistenzgens in Tn7 sind nicht bekannt. Das Tn7-Transposon kann aus einer Reihe von Zellstämmen erhalten werden, die öffentlich zugänglich sind. Ein Stamm von A. tumefaciens wurde isoliert, in dem das Tn7-Transposon in die HindIII-23-Region eines pTiT37-Plasmids insertiert worden war. Das modifizierte pTiT37-Plasmid wurde als pGV3106 bezeichnet (Hernalsteens et al., 1980).
Plasmid pGV3106 wurde mit HindIII verdaut und die Fragmente wurden in pBR327-Plasmide shotgun-kloniert, die mit HindIII verdaut worden waren. Diese Plasmide wurden in E. coli-Zellen insertiert und Zellen, die (zufolge eines pBR327-Gens) ampicillinresistent und (zufolge eines Tn7-Gens) trimethoprimresistent waren, wurden selektioniert. Das von einer Kolonie erhaltene Plasmid wurde als pMON31 bezeichnet. Dieses Plasmid enthielt ein 6 kb HindIII-Insert. Das Insert enthielt das spc/str-Resistenzgen und das Trimethoprim-Resistenzgen von Tn7 und den 3'-Teil eines NOS-Gens (der vom pTiT37-Plasmid kam).
Plasmid pMON31 wurde in der Größe zweimal reduziert. Die erste Reduktion wurde durch Verdauen des Plasmids mit EcoRI, Verdünnen der Mischung zum Entfernen eines 850 bp Fragments und Wiederverknüpfen des großen Fragments durchgeführt. Das erhaltene Plasmid, als pMON53 bezeichnet, wurde von transformierten Zellen erhalten, die durch ihre Resistenz auf Ampicillin und Streptomycin selektioniert wurden. Resistenz auf Trimethoprim wurde nicht festgestellt.
Plasmid pMON53 wurde in der Größe durch Verdauen des Plasmids mit ClaI, Verdünnen der Mischung zum Entfernen eines 2 kb Fragments und Wiederverknüpfen des großen Fragments weiter reduziert. Das erhaltene 5,2 kb Plasmid wurde als pMON54 bezeichnet, wie in Fig. 4 gezeigt. Dieses Plasmid enthält das spc/str-Gen.
Plasmid pMON54 wurde mit EcoRI und PstI verdaut und ein 4,8 kb Fragment enthaltend das spc/str-Gen wurde isoliert. M-4- DNA wurde mit EcoRI und PstI verdaut und ein 740 bp Fragment enthaltend die NOS 3'-nicht-translatierte Region wurde isoliert. Diese Fragmente wurden miteinander unter Bildung von pMON64 verknüpft. Um den NOS 3'-Teil und das spc/str-Gen auf einem einzigen EcoRI-BamHI-Fragment erhalten zu können, wurde die Orientierung des spc/str-Gens durch Verdauen von pMON64 mit ClaI und Wiederverknüpfen der Mischung umgedreht. Plasmide mit der gewünschten Orientierung wurden durch Spaltung unter Verwendung von EcoRI und BamHI identifiziert. Diese Plasmide wurden als pMON109 bezeichnet, wie in Fig. 5 gezeigt.
Plasmid pMON113 steuerte für pMON120 eine Homologieregion bei, was ermöglicht, daß pMON120 ein cointegrales Plasmid bildet, wenn es in A. tumefaciens zusammen mit einem Ti-Plasmid vorhanden ist. Die Homologieregion wurde von einem Ti-Plasmid vom Octopintyp genommen. Im Ti-Plasmid befindet sie sich nahe der linken T-DNA-Grenze innerhalb des T-DNA-Teiles des Ti- Plasmids. Diese Homologieregion wird als die "linke innere Homologie" (LIH)-Region bezeichnet.
Eine Homologieregion kann von jeder Art von Plasmid abgeleitet werden, das zum Transformieren von Pflanzenzellen imstande ist, wie einem Ti-Plasmid oder einem Ri-Plasmid. Ein Zwischenvektor kann konstruiert werden, der ein cointegrales Plasmid mit jeder Art von Plasmid, von dem die Homologieregion abgeleitet wurde, bilden kann.
Außerdem muß sich die Homologieregion nicht unbedingt innerhalb der T-DNA befinden. Beispielsweise kann es möglich sein, daß eine Homologieregion von einem Segment eines Ti-Plasmids abgeleitet wird, das eine T-DNA-Grenze und eine Sequenz von Basen außerhalb der T-DNA-Region enthält. Tatsächlich könnte es möglich sein, wenn der Zwischenvektor zwei geeignete T-DNA- Grenzen enthält, daß sich die Homologieregion völlig außerhalb der T-DNA-Region befindet.
Die Anmelderin erhielt eine E. coli-Kultur mit einem von pBR stammenden Plasmid enthaltend das Bam-8-Fragment eines Ti- Plasmids vom Octopintyp. Das Bam-8-Fragment, das etwa 7,5 kb ist, enthält die linke Grenze und die LIH-Region des Ti-Plasmids (Willmitzer et al., 1982; DeGreve et al., 1981). Das Bam-8- Fragment wurde in das Plasmid pBR327 insertiert, das mit BamHI verdaut worden war. Das erhaltene Plasmid wurde als pMON90 bezeichnet, wie in Fig. 6 gezeigt.
Plasmid pMON90 wurde mit BglII verdaut und ein 2,6 kb Fragment, das die LIH-Region, aber nicht die linke Grenze enthält, wurde gereinigt. Das 2,6 kb Fragment wurde mit Klenow-Polymerase behandelt, um die kohäsiven Enden in glatte Enden überzuführen, und das Fragment wurde mit HindIII verdaut, um ein 1,6 kb Fragment (das gewünschte Fragment) und ein 1 kb Fragment zu erhalten. Beide Fragmente wurden mit einem pBR322-Plasmid gemischt, das mit PvuIl und HindIII verdaut worden war. Die Mischung wurde verknüpft und in E. coli-Zellen insertiert. Die Zellen wurden auf Ampicillinresistenz selektioniert und auf die Anwesenheit einer SmaL-Stelle gezählt, die am 1,6 kb Fragment, aber nicht am 1 kb Fragment existiert. Eine Kolonie mit dem gewünschten Plasmid wurde identifiziert und das Plasmid von dieser Kolonie wurde als pMON113 bezeichnet, wie durch Fig. 6 gezeigt.
Um pMON120 zusammenzubauen, mußten drei Fragmente isoliert werden. Plasmid pMON41 wurde mit Pvul und BamI verdaut und ein 1,5 kb Fragment enthaltend eine rechte Grenze vom Nopalintyp und den 5'-Teil eines NOS-Gens wurde isoliert. Plasmid pMON109 wurde mit BamHI und EcoRI verdaut und ein 3,4 kb Fragment enthaltend ein spc/str-Gen und den 3'-Teil eines NOS-Gens wurde isoliert. Plasmid pMON113 wurde mit PvuI und EcoRI verdaut und ein 3,1 kb Fragment enthaltend die LIH-Region wurde isoliert.
Die drei Fragmente wurden miteinander gemischt und unter Bildung von pMON120 verknüpft, wie in Fig. 2 gezeigt. Eine Kultur von E. coli enthaltend pMON120 war bei American Type Culture Collection hinterlegt worden. Dieser Kultur war die Nummer 39263 zugeordnet worden.
Es ist klar, daß eine Reihe verschiedener Methoden zum Bilden von pMON120 oder eines ähnlichen Zwischenvektors verwendet werden könnte. Beispielsweise wäre es möglich, anstelle der Dreifachverknüpfung zwei der gewünschten Fragmente in einem Plasmid zusammenzubauen und das dritte Fragment in das Plasmid zu insertieren.

Methode der Verwendung von pMON120

Wie oben erwähnt, hat pMON120 drei einmalige Schnittstellen (EcoRI, ClaI und HindIII), die zur Insertion jedes gewünschten Gens geeignet sind. Diese Schnittstellen befinden sich in dem Teil von pMON120, der in ein Pflanzengenom insertiert wird, so daß das insertierte Gen auch in das Pflanzengenom insertiert wird.
Eine Reihe von chimären Genen, die zum Exprimieren von Bakterien- und Säugerpolypeptiden in Pflanzenzellen imstande sind, wurde von der Anmelderin gebildet. Diese chimären Gene sind im einzelnen in einer separaten Anmeldung mit dem Titel "Chimeric Genes Suitable for Expression in Plant Cells", US -Anmeldung Ser. Nr. 458,414, eingereicht am 17. Jänner 1983, beschrieben.
Diese chimären Gene sind zur Verwendung in dieser Erfindung geeignet. Sie können in pMON120 insertiert werden, um ein modifiziertes Plasmid zu bilden, das, wie im nachstehenden beschrieben, verwendet werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wurde ein chimäres Gen gebildet, das die folgenden DNA-Sequenzen um faßt:
1. eine Promotorregion und eine 5'-nicht-translatierte Region abgeleitet von einem Nopalinsynthase (NOS)-Gen;
2. eine Struktursequenz abgeleitet von einem Neomycinphosphotransferase II (NPT II)-Gen und
3. eine 3'-nicht-translatierte Region abgeleitet von einem NOS-Gen.
Dieses chimäre NOS-NPT II-NOS-Gen wurde auf ein DNA-Fragment mit EcoRI-Enden isoliert. Dieses Fragment wurde in die EcoRI- Schnittstelle von pMON120 insertiert und die erhaltenen Plasmide (mit chimären Geninserts mit entgegengesetzten Orientierungen) wurden als pMON128 und pMON129 bezeichnet, wie in Fig. 8 gezeigt. Plasmid pMON129 hat zwei Kopien des chimären Gens; dies kann ein nützliches Merkmal in bestimmten Arbeitstypen sein. Jedes Plasmid kann zum Transformieren von Pflanzenzellen auf folgende Weise verwendet werden. Eine Kultur von E. coli enthaltend pMON128 wurde bei American Type Culture Collection hinterlegt. Dieser Kultur wurde die Nummer 39264 zugeordnet.
Plasmid pMON128 (oder ein anderes Plasmid, das durch Insertieren eines gewünschten Gens in pMON120 erhalten wurde) wird in einen Mikroorganismus insertiert, der ein Ti-Plasmid vom Octopintyp (oder ein anderes geeignetes Plasmid) enthält. Geeignete Mikroorganismen sind A. tumefaciens und A. rhizogenes, die Tioder Ri-Plasmide tragen. Andere Mikroorganismen, die ebenfalls zur Verwendung in dieser Erfindung verwendbar sein könnten, sind andere Arten von Agrobacterium sowie Bakterien der Ordnung Rhizobia. Das Geeignetsein dieser Zellen oder irgendwelcher anderer Zellen, die derzeit bekannt sind oder später entdeckt oder gebildet werden, zur Verwendung in dieser Erfindung kann von Fachleuten durch Routineversuche bestimmt werden.
Das Plasmid kann in den Mikroorganismus durch jede gewünschte Methode insertiert werden, wie Transformation (d. h. Inberührungbringen von Plasmiden mit Zellen, die zur Erhöhung ihrer DNA-Aufnahme behandelt wurden) oder Konjugation mit Zellen, die das pMON128 oder andere Plasmide enthalten.
Das insertierte Plasmid (wie pMON128) hat eine Region, die zu einer Sequenz innerhalb des Ti-Plasmids homolog ist. Diese "LIH"-Homologieregion ermöglicht einen einzigen Crossover, wodurch sich pMON128 und ein Ti-Plasmid vom Octopintyp unter Bildung eines cointegralen Plasmids miteinander vereinigen; siehe z. B. Stryer, supra, S. 752-754. Gewöhnlich findet dies innerhalb der A. tumefaciens-Zelle statt, nachdem pMON128 in die Zelle insertiert wurde. Andererseits kann das cointegrale Plasmid in einer anderen Zellart oder in vitro gebildet und dann in eine A. tumefaciens-Zelle oder andere Art von Zelle insertiert werden, die das cointegrale Plasmid in Pflanzenzellen transferieren kann.
Das insertierte Plasmid, wie pMONM128, vereinigt sich mit dem Ti-Plasmid auf die in den Fig. 9 oder 10 dargestellt Weise, je nachdem, welche Art von Ti-Plasmid involviert ist.
In Fig. 2 stellt 2 den T-DNA-Teil eines Ti-Plasmids vom Octopintyp dar. 4 stellt das insertierte Plasmid, wie pMON128, dar. Wenn diese beiden Plasmide in der gleichen Zelle gemeinsam existieren, kann ein Crossover erfolgen, der zur Bildung des cointegralen Plasmids 6 führt.
Das cointegrale Plasmid 6 hat eine linke Grenze 8 und zwei rechte Grenzen 10 und 12. Die beiden rechten Grenzen werden hier als die "proximale" rechte Grenze 10 (die der linken Grenze 8 nächste rechte Grenze) und die "distale" rechte Grenze 12 (die rechte Grenze, die von der linken Grenze 8 weiter entfernt ist) bezeichnet. Die proximale rechte Grenze 10 wurde vom Plasmid 4 getragen; die distale rechte Grenze war am Ti-Plasmid 2 vor Cointegration enthalten.
Eine Kultur von A. tumefaciens GC3111 enthaltend ein cointegrales Plasmid, gebildet von pMON128 und Wildtyp Ti- Plasmid pTiB653, wurde bei American Type Culture Center hinterlegt. Dieser Kultur wurde die Nummer 39266 zugeordnet.
Wenn das cointegrale Ti-Plasmid 6, in Fig. 9 gezeigt, in eine Pflanzenzelle insertiert wird, kann eine der beiden DNA- Regionen in das Pflanzengenom eintreten, T-DNA-Region 14 oder T- DNA-Region 16.
Die T-DNA-Region 14 ist durch die linke Grenze 8 und die proximale rechte Grenze 10 begrenzt. Region 14 enthält das chimäre Gen und alle anderen in Plasmid 4 enthaltenen Gene, wie den spc/str-Selektionsmarker und den NOS-Zählmarker. Jedoch enthält die Region 14 keines der T-DNA-Gene, die Wurzelhalsgallenkrankheit verursachen oder sonst den Metabolismus oder die Regenerationsfähigkeit der Pflanzenzelle unterbrechen würden.
Die T-DNA-Region 16 enthält die linke Grenze 8 und beide rechte Grenzen 10 und 12. Dieses Segment von T-DNA enthält das chimäre Gen und sonstige andere im Plasmid 4 enthaltenen Gene Jedoch enthält die T-DNA-Region 16 auch die T-DNA-Gene, von denen angenommen wird, daß sie Wurzelhalsgallenkrankheit verursachen.
Eines der obigen T-DNA-Segmente, Region 14 oder Region 16, könnte in die Pflanzen-DNA transferiert werden. Es wird angenommen, daß dies mit einer Wahrscheinlichkeit von 50:50 für jeden gegebenen T-DNA-Transfer erfolgt. Dies führt wahrscheinlich zu einer Mischung von transformierten Zellen, wovon einige tumorös und einige nicht-tumorös sind. Es ist möglich, nicht-tumoröse Zellen aus der Mischung zu isolieren und zu züchten, wie in den Beispielen beschrieben.
Es wurde auch ein alternativer Versuch entwickelt, der die Notwendigkeit des Isolierens von tumorösen aus nicht-tumorösen Zellen vermeidet. Mehrere Mutantenstämme von A. tumefaciens wurden isoliert, die nicht imstande sind, Wurzelhalsgallenkrankheit zu bewirken. Derartige Stämme werden gewöhnlich als "entwaffnete" Ti-Plasmide bezeichnet. Ein Ti- oder Ri-Plasmid kann durch eine oder mehrere der folgenden Mutationsarten entwaffnet werden:
1. Entfernung oder Inaktivierung einer der Grenzregionen. Ein derartiges entwaffnetes Octopinplasmid, das eine linke Grenze, aber keine rechte Grenze aufweist, wird als pAL4421 bezeichnet; dieses Plasmid ist im A. tumefaciens-Stamm LBA4421 enthalten (Oooms et al., 1982; Garfinkel et al., 1981).
2. Entfernung oder Inaktivierung eines oder mehrerer der "Tumormorphologie"-Gene, als tmr- und tms-Gene bezeichnet, siehe z. B. Leeman et al., 1982.
Verschiedene andere Arten von entwaffneten Ti-Plasmiden können unter Anwendung von den Fachleuten bekannten Verfahren hergestellt werden; siehe Matzke und Chilton, 1981; Leeman et al., 1981; Koekman et al., 1979.
Fig. 10 stellt ein Ti-Plasmid vom Octopintyp mit einer T- DNA-Region 22 dar, das Mutation erfährt, um die tms- und tmr- Gene und die rechte Grenze zu deletieren. Dies führt zu einem entwaffneten Ti-Plasmid mit partieller T-DNA-Region 24. Wenn das Plasmid 26 (wie pMON128) in eine Zelle insertiert wird, die das entwaffnete Ti-Plasmid 24 trägt, erfolgt ein Crossover, der ein cointegrales Ti-Plasmid mit entwaffneter T-DNA-Region 28 bildet. Die LIH-Homologieregion ist in diesem Ti-Plasmid wiederholt, jedoch enthält das entwaffnete Ti-Plasmid keine onkogenen Gene. Andererseits wären, wenn nur die rechte Grenze aus der T-DNA- Region 22 deletiert worden wäre, die tms- und tmr-Gene und das Octopinsynthase (OCS)-Gen im cointegralen entwaffneten Ti- Plasmid enthalten; jedoch befänden sie sich außerhalb der T-DNA- Grenzen.
Das entwaffnete cointegrale Ti-Plasmid wird zum Infizieren von Pflanzenzellen verwendet und die T-DNA-Region 28 tritt in das Pflanzengenom ein, wie durch transformierte DNA 30 gezeigt. Durch entwaffnete T-DNA 28 transformierte Pflanzenzellen weisen normalen Phytohormonmetabolismus und normale Fähigkeit, in differenzierte Pflanzen regeneriert zu werden, auf.
Nach Insertieren von pMON128 in A. tumefaciens-Zellen erfolgt der gewünschte Crossover in einer bestimmten Fraktion der Zellen. Zellen, die cointegrale Plasmide enthalten (egal ob virulent oder entwaffnet) können aus anderen Zellen, in denen der Crossover nicht erfolgte, auffolgende Weise leicht selektioniert werden. Plasmid pMON120 und seine Derivate enthalten ein Markergen (spc/str), das in A. tumefaciens exprimiert wird. Jedoch replizieren diese Plasmide nicht in A. tumefaciens. Daher wird das spc/str-Markergen durch A. tumefaciens nicht repliziert oder stabil vererbt, wenn sich nicht das insertierte Plasmid mit einem anderen Plasmid vereinigt, das in A. tumefaciens replizieren kann. Die wahrscheinlichste derartige Kombination auf Grund der Homologieregion ist das mit dem Ti-Plasmid gebildete Cointegrat. A. tumefaciens-Zellen, die dieses cointegrale Plasmid enthalten, können durch Wachstum der Zellen auf Medium, das entweder spc oder str oder beide enthält, leicht identifiziert und selektioniert werden.
Das in Fig. 10 gezeigte Ti-Plasmid 28 enthält zwei LIH-Regionen. Es ist möglich, daß cointegrale Ti-Plasmide einen nachfolgenden Crossover durchmachen, in dem sich die beiden LIH- Regionen wieder kombinieren. Dieser Fall ist unerwünscht, weil er zu einer Deletion der DNA zwischen den LIH-Regionen, einschließlich des chimären Gens, führen kann. Jedoch führt dies aus zwei Gründen wahrscheinlich nicht zu ernsten Schwierigkeiten. Zunächst tritt dieser Fall voraussichtlich mit relativ geringer Wahrscheinlichkeit, wie etwa 10 : 2, auf. Zweitens wurden das Plasmid pMON120 und seine Derivate so konstruierte daß sich das Selektionsmarkergen (spc/str) in der DNA-Region befindet, die durch den Crossover deletiert würde. Daher dienen die selektiven Bedingungen, die zum Identifizieren und Züchten von Agrobacteria-Zellen enthaltend cointegrale Plasmide verwendet werden, auch zum Töten der Abkömmlinge von Zellen, die einem nachfolgenden Crossover unterliegen, der das chimäre Gen vom Ti-Plasmid eliminiert.
Nur eine der LIH-Regionen im cointegralen Ti-Plasmid wird in das Pflanzengenom insertiert, wie in Fig. 10 gezeigt. Dieses wichtige Merkmal resultiert aus der Konstruktion von pMON120 und es unterscheidet dieses cointegrale Plasmid von bisher gebildeten unerwünschten cointegralen Plasmiden. Die LIli-Region, die außerhalb der T-DNA-Grenzen liegt, wird nicht in das Pflanzengenom insertiert. Dies führt zu mindestens zwei bedeutenden Vorteilen. Zunächst könnte die Anwesenheit von zwei in das Pflanzengenom insertierten LIH-Regionen in Crossover-Fällen resultieren, die zum Verlust der insertierten Gene in den transformierten Pflanzenzellen und ihrer Nachkommenschaft führen würden. Zweitens kann die Anwesenheit von zwei DNA-Homologieregionen Bemühungen, die in das Pflanzengenom insertierte DNA zu analysieren, signifikant erschweren (Matzke und Chilton, 1981).
Nachdem A. tumefaciens-Zellen, die die cointegralen Ti- Plasmide mit den chimären Genen enthalten, identifiziert und isoliert wurden, müssen die cointegralen Plasmide (oder Teile hiervon) in die Pflanzenzellen insertiert werden. Schließlich können Methoden entwickelt werden, um diesen Schritt direkt durchzuführen. In der Zwischenzeit wurde eine Methode entwickelt, die zweckmäßig und mit guten Ergebnissen verwendet werden kann. Diese Methode ist in zwei separaten schwebenden US- Patentanmeldungen mit dem Titel "Transformation of Plant Cells by Extended Bacterial Co-Cultivation", Ser.Nr. 458,413, und "Rapid Culture of Plant Protoplasts", Ser.Nr. 458,412, beide am 17. Jänner 1983 eingereicht, beschrieben. Die in diesen Anmeldungen beschriebene Methode kann kurz wie folgt zusammengefaßt werden.
Die zu transformierenden Pflanzenzellen werden mit Enzymen in Berührung gebracht, die die Zellwände entfernen. Dies wandelt die Pflanzenzellen in Protoplasten um, die von Membranen umgebene lebensfähige Zellen sind. Die Enzyme werden entfernt und die Protoplasten beginnen Zellwandmaterial zu regenerieren. Zu einem geeigneten Zeitpunkt werden die A. tumefaciens-Zellen (die die cointegralen Ti-Plasmide mit chimären Genen enthalten) mit den Pflanzenprotoplasten gemischt. Die Zellen werden während eines Zeitraumes, der die Infektion der Pflanzenzellen durch A. tumefaciens ermöglicht, cokultiviert. Nach einer geeigneten Cokultivierungsperiode werden die A. tumefaciens-Zellen getötet und die Pflanzenzellen werden vermehrt.
Pflanzenzellen, die transformiert wurden (d. h. Zellen, die DNA von den cointegralen Ti-Plasmiden erhielten), und ihre Abkömmlinge können durch eine Reihe von Methoden selektioniert werden, in Abhängigkeit von der Art von Gen(en), die in das Pflanzengenom insertiert wurden. Beispielsweise können bestimmte Gene bewirken, daß verschiedene Antibiotika inaktiviert werden; derartige Gene schließen das von pMON128 getragene chimäre NOS-NPT II-NOS-Gen ein. Derartige Gene können als Selektionsmarker dienen; eine Gruppe von Zellen kann auf Medium gezüchtet werden, das das Antibiotikum enthält, das durch das chimäre Genprodukt inaktiviert wird, und nur jene Zellen, die das Selektionsmarkergen enthalten, überleben.
Eine Reihe von Genen kann als Zählmarker in Pflanzenzellen dienen. Beispielsweise tragen pMON120 und seine modifizierten Plasmide, wie pMON128, ein Nopalinsynthase (NOS)-Gen, das in Pflanzenzellen exprimiert wird. Dieses Gen codiert für ein Enzym, das die Bildung von Nopalin katalysiert. Nopalin ist eine nicht-schädliche Verbindung, die gewöhnlich in niedrigen Mengen in den meisten Pflanzenarten akkumuliert wird; es kann durch elektrophoretische oder chromatographische Methoden leicht nachgewiesen werden.
Wenn eine Pflanze durch ein Gen transformiert wird, das ein Polypeptid bildet, das schwierig nachzuweisen ist, kann die Anwesenheit eines Selektionsmarkergens (wie des chimären NOS-NPT II-NOS-Gens) oder eines Zählmarkergens (wie des NOS-Gens) im Transformationsvektor zur Identifizierung und Isolierung von transformierten Zellen beitragen.
Faktisch kann jedes gewünschte Gen in pMON120 oder andere Plasmide insertiert werden, die so konstruiert sind, daß sie mit Ti- oder ähnlichen Plasmiden Cointegrate bilden. Beispielsweise hat die Anmelderin eine Reihe von chimären Genen geschaffen, die in der obzitierten Anmeldung "Chimeric Genes Suitable for Expression in Plant Cells" diskutiert sind.
Das Geeignetsein eines Gens zur Verwendung in dieser Erfindung kann von Fachleuten durch Routineversuche bestimmt werden. Eine solche Verwendung ist nicht auf chimäre Gene beschränkt; beispielsweise kann diese Erfindung zum Insertieren von multiplen Kopien eines natürlichen Gens in Pflanzenzellen verwendet werden.
Diese Erfindung ist zur Verwendung mit einer Vielzahl von Pflanzen geeignet, wie von Fachleuten durch Routineversuche bestimmt werden kann. Beispielsweise ist diese Erfindung wahrscheinlich zum Transformieren von Zellen von einer beliebigen Pflanzenart verwendbar, die durch Bakterien von der Gattung Agtrobacterium infiziert werden kann. Es wird angenommen, daß faktisch alle dikotyledonen Pflanzen und bestimmte Monokotyledone durch einen oder mehrere Stämme von Agrobacterium infiziert werden können. Außerdem sind Mikroorganismen der Gattung Rhizobia wahrscheinlich zum Tragen von cointegralen Plasmiden dieser Erfindung verwendbar, wie von Fachleuten festgestellt werden kann. Derartige Bakterien könnten für bestimmte Transformationsarten oder Pflanzenarten bevorzugt werden.
Bestimmte Arten von Pflanzenzellen können in vitro gezüchtet und unter Verwendung von den Fachleuten bekannten Techniken in differenzierte Pflanzen regeneriert werden. Derartige Pflanzenarten sind Kartoffeln, Tomaten, Karotten, Luzerne und Sonnenblumen. Die Forschung in in vitro-Pflanzenkulturtechniken schreitet rasch voran und es ist wahrscheinlich, daß Verfahren entwickelt werden, die die Regeneration eines viel weiteren Bereiches von Pflanzen aus in vitro gezüchteten Zellen ermöglichen. Zellen von einer solchen Pflanze mit Regenerationsfähigkeit sind wahrscheinlich durch das oben diskutierte in vitro- Cokultivierungsverfahren transformierbar, wie durch Routineversuche von Fachleuten bestimmt werden kann. Derartige transformierte Pflanzenzellen können unter Anwendung der in den Beispielen beschriebenen Verfahren in differenzierte Pflanzen regeneriert werden.
Das in vitro-Cokultivierungsverfahren bietet bestimmte Vorteile bei der Transformation von Pflanzen, die auf in vitro- Züchtung und Regeneration empfindlich sind. Jedoch ist diese Erfindung nicht auf in vitro-Zellkulturverfahren beschränkt. Beispielsweise wurde eine Reihe von Pflanzenschößlingen und -stecklingen (einschließlich Sojabohnen, Karotten und Sonnenblumen) durch Berührung mit A. tumefaciens-Zellen, die die cointegralen Plasmide dieser Erfindung tragen, transformiert. Es ist auch möglich, faktisch jede Art von Pflanze aus einem Steckling oder Schößling zu regenerieren. Daher kann es möglich sein, Verfahren zum Transformieren von Schößlingen oder Stecklingen unter Verwendung virulenter oder vorzugsweise entwaffneter cointegraler Plasmide dieser Erfindung oder Mischungen hievon und anschließenden Regenerieren der transformierten Schößlinge oder Stecklinge in differenzierte Pflanzen zu entwickeln, die die insertierten Gene zu ihrer Nachkommenschaft leiten.
Wie oben erwähnt, ist es für diese Erfindung nicht wesentlich, daß Cokultivierung zum Transferieren der cointegralen Plasmide dieser Erfindung in Pflanzenzellen verwendet wird. Eine Reihe anderer Verfahren wird zum Insertieren von DNA in Zellen verwendet. Derartige Verfahren schließen Einkapselung von DNA in Liposome, Komplexbildung der DNA mit Chemikalien, wie polykationischen Substanzen oder Calciumphosphat, Fusion von bakteriellen Sphaeroplasten mit Pflanzenprotoplasten, Mikroinjektion von DNA in eine Zelle und Induktion von DNA-Aufnahme durch elektrischen Strom ein. Obwohl derartige Verfahren zum Insertieren von DNA in Pflanzenzellen bisher nicht mit zufriedenstellender Effizienz verwendet wurden, werden sie aktiv untersucht und sie können zum Insertieren von Fremdgenen in Pflanzenzellen verwendbar sein, wobei die Zwischenvektoren und cointegralen Plasmide dieser Erfindung oder davon stammende Plasmide verwendet werden.
Diese Erfindung kann für eine Vielzahl von Zwecken verwendbar sein. Beispielsweise werden bestimmte bakterielle Enzyme, wie 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphorsäuresynthase (EPSP- Synthase), durch bestimmte lierbizide inaktiviert; andere Enzyme, wie Glutathion-S-transferase (GST), inaktivieren bestimmte lierbizide. Es kann möglich sein, chimäre Gene in Pflanzen zu insertieren, die Expression derartiger Enzyme in den Pflanzen verursachen, wodurch bewirkt wird, daß die Pflanzen auf ein oder mehrere Herbizide resistenter werden. Dies würde ermöglichen, daß das Herbizid, das normalerweise die nicht-transformierte tötet, auf ein Feld von transformierten Pflanzen aufgebracht wird. Das Herbizid würde als Unkrautvernichter wirken und die transformierten Pflanzen ungeschädigt lassen.
Andererseits kann es möglich sein, chimäre Gene in Pflanzen zu insertieren, die bewirken, daß die Pflanzen Säugerpolypeptide bilden, wie Insulin, Interferon, Wachstumshormon und dgl. Zu einem geeigneten Zeitpunkt würden die Pflanzen (oder gezüchtetes Pflanzengewebe) geerntet. Unter Anwendung einer Reihe von Verfahren, die den Fachleuten bekannt sind, kann das gewünschte Protein aus dem geernteten Pflanzengewebe extrahiert werden.
Eine andere Verwendung dieser Erfindung besteht darin, Pflanzen mit hohem Gehalt an gewünschten Substanzen, wie Speicherproteinen oder anderen Proteinen, zu schaffen. Beispielsweise könnte eine Pflanze eine oder mehrere Kopien eines Gens enthalten, das für ein gewünschtes Protein codiert. Zusätzliche Kopien dieses Gens können durch diese Erfindung in die Pflanze insertiert werden. Andererseits könnte die Struktursequenz des Gens in ein chimäres Gen unter der Kontrolle eines anderen Promotors insertiert werden, was fruchtbare Transkription der Struktursequenz bewirkt.
Die Verfahren dieser Erfindung können zum Identifizieren, Isolieren und Untersuchen von DNA-Sequenzen verwendet werden, um zu bestimmen, ob sie zum Fördern oder sonstigen Regulieren der Expression von Genen innerhalb von Pflanzenzellen imstande sind. Beispielsweise kann die DNA von jeder Art von Zelle unter Anwendung von partiellem Endonucleaseverdau oder anderer Methoden fragmentiert werden. Die DNA-Fragmente können regellos in Plasmide ähnlich pMON128 insertiert werden. Diese Plasmide weisen, anstatt ein vollständiges chimäres Gen, wie NOS-NPT II-NOS, aufzuweisen, ein partielles chimäres Gen mit einer Schnittstelle für die Insertion von DNA-Fragmenten anstelle eines NOS- Promotors oder eines anderen Promotors auf. Die Plasmide mit insertierter DNA werden dann in A. tumefaciens insertiert, wo sie sich wieder mit den Ti-Plasmiden vereinigen können. Zellen mit cointegralen Plasmiden werden mittels des spc/str- oder anderen Markergens selektioniert. Die cointegralen Plasmide werden dann durch bakterielle Cokultivierung oder auf andere Weise in die Pflanzenzellen insertiert. Die Pflanzenzellen enthalten eine Selektionsmarkerstruktursequenz, wie die NPT II-Struktursequenz, doch wird diese Struktursequenz nicht transkribiert, wenn nicht das insertierte DNA-Fragment als Promotor für die Struktursequenz dient. Die Pflanzenzellen können selektioniert werden, indem sie auf Medium gezüchtet werden, das Kanamycin oder andere geeignete Antibiotika enthält.
Unter Anwendung dieses Verfahrens ist es möglich, die Promotorregionen von Bakterien, Hefe, Pilzen, Algen, anderen Mikroorganismen und Tierzellen zu untersuchen, um festzustellen, ob sie als Genpromotoren in verschiedenen Arten von Pflanzenzellen wirken. Es ist auch möglich, Promotoren von einer Pflanzenart in anderen Arten von Pflanzenzellen zu untersuchen. Durch Anwendung ähnlicher Verfahren und Variieren der Schnittstelle im Ausgangsplasmid ist es möglich, die Leistung jeglicher DNA-Sequenz als 5'-nicht-translatierte Region, 3'-nicht-translatierte Region oder jede andere Art von Regulierungssequenz zu untersuchen.
Der hier verwendete Ausdruck "ein Stück von DNA" schließt Plasmide, Phagen, DNA-Fragmente und Polynucleotide, egal ob natürlich oder synthetisch, ein.
Der hier verwendete Ausdruck "chimäres Stück von DNA" ist auf ein DNA-Stück beschränkt, das mindestens zwei Teile enthält (d. h. zwei Nucleotidsequenzen), die von anderen und bestimmten DNA-Stücken abgleitet wurden. Beispielsweise kann ein chimäres Stück von DNA nicht bloß dadurch gebildet werden, daß ein oder mehrere Teile eines natürlich existierenden Plasmids deletiert werden. Ein chimäres Stück von DNA kann durch eine Reihe von Verfahren gebildet werden, wie Verknüpfen von zwei Fragmenten von verschiedenen Plasmiden miteinander oder durch Synthetisieren eines Polynucleotids, in dem die Basensequenz durch Analyse der Basensequenzen von zwei verschiedenen Plasmiden bestimmt wurde.
Der hier verwendet Ausdruck "ein chimäres Stück von DNA" ist auf DNA beschränkt, die zusammengebaut, synthetisiert oder sonstwie als Resultat menschlicher Anstrengungen produziert wurde, und jedes Stück von DNA, das repliziert oder sonstwie davon abgeleitet wird. "Menschliche Anstrengungen" schließen enzymatische, zelluläre und andere biologische Prozesse ein, wenn derartige Prozesse unter Bedingungen stattfinden, die durch menschliche Anstrengung oder Intervention bewirkt, erhöht oder reguliert werden; dies schließt Plasmide, Phagen und Polynucleotide aus, die einzig und allein durch natürliche Prozesse gebildet werden. Der hier verwendete Ausdruck "abgeleitet von" soll weit ausgelegt werden. Wann immer in einem Anspruch verwendet, soll der Ausdruck "chimär" eine materialle Beschränkung sein.
Wie hier verwendet, schließt "Fremd-DNA jede DNA ein, die in eine bereits existierende Pflanzenzelle insertiert wird. Ein "Fremdgen" ist ein Gen, das in die bereits existierende Pflanzenzelle insertiert wird.
Wie hier verwendet, ist ein "Markergen" ein Gen, das der Wirtszelle ein phänotypisch identifizierbares Merkmal verleiht, das es ermöglicht, transformierte Wirtszellen von nicht-transformierten Zellen zu unterscheiden. Es schließt Screening-, Zähl- und Selektionsmarker ein.
Wie hier verwendet, bezieht sich eine "Homologieregion" auf eine Sequenz von Basen in einem Plasmid, die ausreichende Korrelation mit einer Sequenz von Basen in einem anderen Plasmid aufweist, um zu bewirken, daß Rekombination des Plasmids mit einer statistisch bestimmbaren Frequenz stattfindet. Vorzugsweise sollte eine derartige Rekombination mit einer Frequenz auftreten, die die zweckmäßige Selektion von Zellen mit kombinierten Plasmiden ermöglicht, z. B. größer als 1 pro 106 Zellen. Dieser Ausdruck ist in einer Reihe von Publikationen eingehender beschrieben, z. B. Leemans et al., 1981.
Mit "tumorerzeugenden Genen" sind jene Gene des Ti-Plasmids gemeint, deren Anwesenheit in der transformierten Pflanze zu einer morphologisch anomalen Pflanze führt, d. h. Wurzelhalsgallenbildung induziert.
Die Fachleute auf dem Gebiet kennen zahlreiche Äquivalente zu den hier diskutierten spezifischen Ausführungsformen der Erfindung oder sind imstande, diese unter Anwendung von nicht mehr als Routineversuchen zu finden. Derartige Äquivalente liegen im Umfang dieser Erfindung.

Beispiel 1: Bildung von Plasmid pMON41

Eine Kultur von E. coli, die ein pBR325 Plasmid (Bolivan, 1978) mit dem HindIII-23-Fragment von pTiT37 (Hernalsteens et al., 1980) insertiert an der HindIII-Stelle trägt, wurde von Drs. M. Bevan und M.D. Chilton, Washington University, St. Louis, MO, erhalten. 10 ug des Plasmids von diesem Klon wurden mit 10 Einheiten HindIII (wenn nichts anderes angegeben, wurden alle in diesen Konstruktionen verwendeten Restriktionsendonucleasen von New England Biolabs, Beverly, MA, gekauft und mit Puffern gemäß den Instruktionen der Lieferfirma verwendet) 1 h bei 37ºC verdaut. Das 3,4 kb HindIII-23-Fragment wurde durch Adsorption auf Glaskügelchen (Vogelstein und Gillespie, 1979) nach Trennung von den anderen HindIII-Fragmenten durch Elektrophorese auf einem 0,8 96 Agarosegel gereinigt. Das gereinigte 3,4 kb HindIII-Fragment (1,0 ug) wurde mit 1,0 ug Plasmid pBR327 DNA (Soberon et al., 1980) gemischt, das sowohl mit HindIII (2 Einheiten, 1 h, 37ºC) als auch alkalischer Kälberphosphatase (CAP, 0,2 Einheiten, 1 h, 37ºC) verdaut worden war, mit Phenol deproteinisiert, mit Äthanol ausgefällt und in 10 ul TE (10 mM Tris HCl, pH 8, 1 mM EDTA) wieder suspendiert. 1 Einheit T4 DNA- Ligase (hergestellt durch das Verfahren von Murray et al., 1979) wurde der Fragmentmischung zugesetzt. 1 Einheit wird als die Konzentration definiert, die ausreichend ist, mehr als 90% Zirkularisierung von 1 ug HindIII-linearisiertem pBR327-Plaswmid in 5 min bei 22ºC zu erhalten. Die gemischten Fragmente waren in einem Gesamtvolumen von 15 ul 25 mM Tris-liCl pH 8, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM Dithiothreitol, 200 uM Spermidin-HCl und 0,75 mM ATP (Ligasepuffer) enthalten.
Die Mischung wurde 3 h bei 22ºC inkubiert und dann mit E. coli C600 A56-Zellen gemischt, die für Transformation durch Behandlung mit CaCl&sub2; vorbereitet wurden (Maniatis et al., 1982). Nach einem Zeitraum für Expression der Ampicillinresistenzdeterminante, getragen vom pBR327-Vektor, wurden Zellen auf LB- Festmediumplatten (Miller, 1972) enthaltend Ampicillin bei 200 ug/ml verteilt. Nach Inkubation bei 37ºC während 16 h wurden mehrere hunderte Klone erhalten. Plasmid-Minipreps (Ish-Horowicz und Burke, 1981) wurden an 24 dieser Kolonien durchgeführt und aliquote Mengen der erhaltenen Plasmid-DNA's (0,1 ug) wurden mit HindIII verdaut, um die Anwesenheit des 3,4 kb HindIII-Fragments zu demonstrieren. Ein Plasmid zeigte die erwartete Struktur und wurde pMON38 bezeichnet. pMON38-DNA wurde Triton X-100-Lyse und CsCl-Gradientenverfahren (Davis et al., 1980) hergestellt.
50 ug pMON38-DNA wurden mit HindIII und BamHI (jeweils 50 Einheiten, 2 h, 37ºC) verdaut und das 2,3 kb HindIII-BamHI- Fragment gereinigt, wie oben beschrieben. Das gereinigte Frage ment (1 ug) wurde mit 1 ug des 2,9 kb HindIII-BamHI-Fragments des pBR327-Vektors, gereinigt wie oben beschrieben, gemischt Nach Verknüpfung (T4 DNA-Ligase, 2 Einheiten) und Transformation von E. coli-Zellen, wie oben beschrieben, wurden 50 ampicillinresistente Kolonien erhalten. DNA's von 12 Plasmid-Minipreps wurden mit HindIII und BamHI verdaut, um die Anwesenheit des 2,3 kb Fragments festzustellen. Ein Plasmid der korrekten Struktur wurde gewählt und pMON41 bezeichnet, wie in Fig. 2 gezeigt. Eine Menge dieser DNA wurde hergestellt, wie oben beschrieben.

Beispiel 2: Schaffung von M13 Klon M-4

30 ug Plasmid pMON38 (in Beispiel 1 beschrieben) wurden mit RasI (30 Einheiten, 2 h, 37ºC) verdaut und das 1100 bp RasI- Fragment nach Trennung durch Agarosegelelektrophorese unter Anwendung der im vorhergehenden Beispiel beschriebenen Glaskugelmethode gereinigt. Das gereinigte 1100 bp RasI-RsaI-Fragment (1 ug) wurde mit 2 Einheiten BamHI verdaut und das BamHI durch Erhitzen inaktiviert. Diese DNA wurde mit 0,2 ug Phagen M13mp8RF-DNA gemischt, die vorher mit Smal und BamHI (jeweils 2 Einheiten, 1 h, 37ºC) und 0,2 Einheiten alkalischer Kälberphosphatase (CAP) verdaut worden war. Nach der Verknüpfung mit 100 Einheiten T4 DNA-Ligase und Transformation von E. coli JM101- Zellen, wie im vorhergehenden Beispiel beschrieben, wurden die transformierten Zellen mit Weichagar gemischt und unter Bedingungen plattiert, die die Identifizierung von rekombinantem Phagen ermöglichen (Messing und Vieira, 1982). 12 rekombinanten Phagen produzierende Zellen wurden genommen und RF Plasmid- Minipreps erhalten, wie im vorhergehenden Beispiel beschrieben. Die RF-DNA's wurden mit BamHI und SmaI verdaut, um die Anwesenheit des 720 bp RsaI-BamHI-Fragments zu beweisen. Eine der das korrekte Fragment tragenden rekombinanten RF-DNA's wurde M13 mp8 M-4 bezeichnet. Dieser Vorgang ist in Fig. 3 dargestellt. M-4 RF-DNA wurde unter Anwendung der Verfahren von Ish-Horowicz und Burke, 1981, und Colman et al., 1978, hergestellt.

Beispiel 3: Konstruktion von pMON109

20 ug Plasmid pGV3106 (Hernalsteens et al., 1980, hergestellt nach der Methode von Currier und Nester, 1976) wurden mit HindIII (20 Einheiten, 2 h, 37ºC) verdaut und mit 2 ug HindIIIverdautem pBR327 gemischt. Nach Verknüpfung (T4 DNA-Ligase, 2 Einheiten) und Transformation von E. coli-Zellen, wie oben beschrieben, wurde eine auf Trimethoprim (100 ug/ml) und Ampicillin resistente Kolonie erhalten. Verdauen von Plasmid-DNA aus dieser Zelle zeigte die Anwesenheit eines 6 kb HindIII-Fragments. Dieses Plasmid wurde pMON31 bezeichnet.
Plasmid pMON31 von einem Miniprep (0,5 ug) wurde mit EcoRI (1 Einheit, 1 h, 37ºC) verdaut und die Endonuclease durch Erhitzen (10 min, 70ºC) inaktiviert. Das 8,5 kb Plasmidfragment wurde in einer Verknüpfungsreaktion von 100 ul (T4 DNA-Ligase, 1 Einheit) rezirkularisiert und zum Transformieren von E. coli-Zellen mit Selektion für auf Ampicillin und Streptomycin (25 ug/ml) resistente Kolonien verwendet. Plasmid-Miniprep-DNA's von 6 Klonen wurden mit EcoRI verdaut, um Verlust des 850 bp Fragments festzustellen. Ein Plasmid, dem das 859 bp EcoRI-Fragment fehlt, wurde pMON53 bezeichnet. Dieses Plasmid wurde durch Transformation in E. coli Gm42 dam- Zellen (Bale et al., 1979), wie beschrieben, eingeschleust.
Plasmid pMON53 (0,5 ug) von einem Miniprep, hergestellt aus dam- Zellen, wurde mit ClaI verdaut und in verdünnter Lösung rezirkularisiert, wie oben beschrieben. Nach Transformation von E. coli GM42-Zellen und Selektion auf auf Ampicillin und Spectinomycin (50 ug/ml) resistente Klone wurden 50 Kolonien erhalten. Verdauen von Plasmid-Miniprep-DNA's von 6 Kolonien zeigte, daß allen das 2 kb ClaI-Fragment fehlte. Eines dieser Plasmide wurde pMON54 bezeichnet, wie in Fig. 4 dargestellt. Plasmid-DNA wurde hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Plasmid pMON54-DNA (20 ug) wurde mit EcoRI und PstI (jeweils 20 Einheiten, 2 h, 37ºC) verdaut und das 4,8 kg Fragment aus Agarosegelen unter Verwendung von Na-45 Membran (Schleicher und Schuell, Keene, N.li.) gereinigt.
Das gereinigte 4,8 kb Fragment (0,5 ug) wurde mit 0,3 ug eines 740 bp EcoRI-PstI-Fragments, erhalten von M13mp8 M-4 RF- DNA (beschrieben in Beispiel 2), das unter Verwendung von NA-45- Membran gereinigt wurde, gemischt. Nach Verknüpfung (T4 DNA- Ligase, 2 Einheiten), Transformation von E. coli GM42 dam- Zellen und Selektion auf spectinomycinresistente Zellen wurden 20 Kolonien erhalten. Plasmid-Miniprep-DNA's, hergestellt aus 12 dieser Klone, wurden mit PstI und EcoRI verdaut, um die Anwesenheit des 740 bp Fragments zu zeigen. Ein dieses Fragment tragendes Plasmid wurde pMON64 bezeichnet. Eine Menge dieser Plasmid- DNA wurde hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
DNA (0,5 ug) von pMON64 wurde mit ClaI (1 Einheit, 1 h, 37ºC) verdaut, ClaI wärmeinaktiviert und die Fragmente wurden mit T4 DNA-Ligase (1 Einheit) wieder verbunden. Nach Transformation und Selektion auf spectinomycinresistente Zellen wurden Plasmid-Minipreps von 12 Kolonien gemacht. Die DNA's wurden mit BamHI und EcoRI verdaut, um die Orientierung des 2 kb ClaI- Fragments zu bestimmen. Die Hälfte der Klone enthielt das ClaI- Fragment in der umgekehrten Orientierung derjenigen in pMON64. Eines dieser Plasmide wurde pMON109 bezeichnet, wie in Fig. 5 dargestellt. DNA wurde hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben.

Beispiel 4: Schaffung von Plasmid pMON113

Plasmid pNW31C-8,29C (Thomashow et al., 1980) wurde von Dr. S. Gelvin der Purdue University, West Lafayette, IN, erhalten. Dieses Plasmid trägt das pTiA6 7,5 kb Bam-8-Fragment. Das Bam-8- Fragment wurde unter Verwendung der Na-45-Membran aus 50 ug BamHI-verdautem pNW31C-8,29C gereinigt, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben. Das gereinigte 7,5 kb Bam-Fragment (1,0 u wurde mit 0,5 ug pBR327 Vektor-DNA gemischt, die vorher sowohl mit BamHI (2 Einheiten) als auch 0,2 Einheiten alkalischer Kälberphosphatase (CAP) 1 h bei 37ºC verdaut worden war; die Mischung wurde entproteinisiert und wieder suspendiert, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben. Die gemischten Fragmente wurden mit T4 Ligase (2 Einheiten) behandelt, zum Transformieren von E. coli C600 A-Zellen verwendet und ampicillinresistente Kolonien wurden selektioniert, wie oben beschrieben. Es wurden Minipreps an 12 dieser Klone zum Erhalten von Plasmid-DNA durchgeführt. Die DNA wurde mit BamHI verdaut, um die Anwesenheit der pBR327 Vektor-und 7,5 kb Bam-8-Fragmente zu zeigen. Ein Plasmid, das beide Fragmente zeigte, wurde pMON90 bezeichnet. DNA wurde hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
25 ug pMON90 DNA wurden mit BglII (25 Einheiten, 2 h, 37ºC) verdaut und das 2,6 kb BglII-Fragment unter Verwendung der NA-45-Membran gereinigt. Um glatte Enden zu schaffen, wurde das Fragment (2 ug) in 10 ul 50 mM HaCl, 6,6 mM Tris-HCl pH 8, 6,6 mM MgCl&sub2; und 0,5 mM Dithiothreitol (Klenow-Puffer) wieder suspendiert. Die 4 Desoxynucleosidtriphosphate (dATP, dTTP dCTP und dGTP) wurden auf eine Endkonzentration von 1 mM zugesetzt und 1 Einheit E. coli großes Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I (New England Biolabs, Beverly, MA) wurde zugegeben. Nach Inkubation während 20 min bei 22ºC wurde die Klenow-Polymerase wärmeinaktiviert und 10 Einheiten HindIII wurden zugesetzt. Der HindIII-Verdau wurde 1 h bei 37ºC durchgeführt und dann das Enzym wärmeinaktiviert. Die HindIII-BglII (glatten) -Fragmente (1 ug) wurden zu 0,25 ug des 2,2 k HindIII-PvuII-Fragments von pBR322 (Bolivar et al., 1977) zugesetzt, das durch HindIII- und PvuII-Verdau erzeugt worden war, und dann mit alkalischer Kälberphosphatase behandelt, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben. Nach Verknüpfung unter Verwendung von 100 Einheiten T4 DNA-Ligase, Transformation von E. coli LE392 Zellen und Selektion von ampicillinresistenten Kolonien, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben, wurden 19 Kolonien erhalten. Plasmid-Minipreps wurden von 12 Kolonien hergestellt und mit HindIII verdaut, um die Größe des rekombinanten Plasmids zu bestimmen, und mit SmaI, um zu bestimmen, daß das korrekte Fragment insertiert worden war. Ein Plasmid mit der korrekten Struktur wurde pMON113 bezeichnet, wie in Fig. 6 gezeigt. Plasmid-DNA wurde hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben.

Beispiel 5: Schaffung von Plasmid pMON120

20 ug Plasmid pMON109 (in Beispiel 3 beschrieben) wurden mit EcoRI und BamHI (jeweils 20 Einheiten, 2 h, 37ºC) verdaut und das 3,4 kb BamHI-EcoRI-Fragment unter Verwendung der NA-45 Membran, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben, gereinigt. 20 ug Plasmid pMON41 (in Beispiel 1 beschrieben) wurden mit BamHI und PvuI (jeweils 20 Einheiten, 2 h, 37ºC) verdaut und das 1,5 kb BamHI-PvuI-Fragment unter Verwendung der NA-45 Membran, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben, gereinigt.
20 ug pMON113-DNA (in Beispiel 4 beschrieben) wurden mit PvuI und EcoRI (jeweils 2 Einheiten, 2 h, 37ºC) verdaut und das 3,1 kb PvuI-EcoRI-Fragment unter Verwendung der NA-45 Membran wie oben gereinigt. Um Plasmid pMON120 zusammenzubauen, wurde das 3,1 kb EcoRI-PvuI pMON113-Fragment (1,5 ug) mit 1,5 ug des 3,4 kb EcoRI-BamHI-Fragments von pMON109 gemischt. Nach Behandlung mit T4 Ligase (3 Einheiten) während 16 h bei 10ºC wurde die Ligase durch Erhitzen (10 min, 70ºC) inaktiviert und 5 Einheiten BamHI wurden zugesetzt. Das Verdauen dauerte 30 min bei 37ºC an, zu welcher Zeit die BamHI-Endonuclease durch Erhitzen, wie oben, inaktiviert wurde. Danach wurden 0,75 ug des 1,5 kb PvuI-BamHI- Fragments von pMON41 zusammen mit T4 DNA-Ligase (2 Einheiten) und frischem ATP auf eine Endkonzentration von 0,75 mM zugesetzt. Die Endligasereaktion wurde 4 h bei 22ºC durchgeführt, zu welcher Zeit die Mischung zum Transformieren von E. coli LE 392- Zellen verwendet wurde mit nachfolgender Selektion auf spectinomycinresistente Zellen, wie oben beschrieben. Plasmid-Minipreps von 12 von mehreren tausend Kolonien wurden auf Plasmide mit einer Größe von ungefähr 8 kb geprüft, die einzelne Stellen für BamHI und EcoRI enthalten. Ein Plasmid, das die korrekte Struktur zeigte, wurde pMON120 bezeichnet, das in Fig. 7 mit einer alternativen Konstruktionsmethode gezeigt ist. pMON120-DNA wurde hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Eine Kultur von E. coli enthaltend pMON120 wurde bei American Type Culture Collection hinterlegt. Dieser Kultur wurde die Nummer 39263 zugeordnet.

Beispiel 6: Schaffung der Plasmide pMON128 und pMON129

Plasmid pMON75 (im einzelnen in einer separaten Anmeldung mit dem Titel "Chimeric Genes Suitable for Expression in Plant Cells", oben zitiert) enthält ein chimäres NOS-NPT II-NOS-Gen. Dieses Plasmid (und pMON128, im nachstehenden beschrieben) kann durch EcoRI verdaut werden und ein 1,5 kb Fragment kann gereinigt werden, das das NOS-NPT II-NOS-Gen enthält.
Plasmid pMON120 wurde mit EcoRI verdaut und mit alkalischer Kälberphosphatase behandelt. Nach Phenoldeproteinisierung und Äthanolausfällung wurde die Eco-RI-gespaltene lineare pMON120- DNA mit 0,5 ug des 1,5 kb EcoRI-chimären Genfragments von pMON75 oder 76 gemischt. Die Mischung wurde mit 2 Einheiten T4 DNA- Ligase 1 h bei 22ºC behandelt. Nach Transformation von E. coli- Zellen und Selektion von auf Spectinomycin resistenten Kolonien (50 ug/ml) erschienen mehrere tausend Kolonien. 6 hievon wurden genommen und gezüchtet und Plasmid-Minipreps wurden gemacht. Die Plasmid-DNA's wurden mit EcoRI verdaut, um auf das 1,5 kb chimäre Geninsert zu prüfen, und mit BamHI, um die Orientierung des Inserts zu bestimmen. BamHI-Verdau zeigte, daß in pMON128 das chimäre Gen in der gleichen Richtung transkribiert war wie das intakte Nopalinsynthasegen von pMON120. Eine Kultur von E. coli enthaltend pMON128 wurde bei American Type Culture Collection hinterlegt. Dieser Kultur wurde die Nummer 39264 zugeordnet. Die Orientierung des Inserts in pMON129 war entgegengesetzt jener in pMON128; das Erscheinen eines weiteren 1,5 kb BamHI-Fragments in Verdaus von pMON129 zeigte, daß Plasmid pMON129 eine Tandemduplikation des chimären NOS-NPT II- NOS-Gens trug, wie in Fig. 8 gezeigt.

Beispiel 7: Schaffung von co-integralem Plasmid pMON128::pTIB6S3TraC

Plasmid pMON128 (in Beispiel 6 beschrieben) wurde unter Anwendung eines Triparental-Plattenpaarungsverfahrens wie folgt in chloramphenicolresistentes Agrobacterium tumefaciens Stamm GV3111=C58Cl, der Ti-Plasmid pTiB6S3traC (Leemans et al., 1982) trägt, transferiert. 0,2 ml einer Kultur von pMON128 tragendem E. coli wurden mit 0,2 ml einer Kultur von E. coli Stamm HB101, der ein pRK2013 Plasmid (Ditta et al., 1980) trägt, und 0,2 ml GV3111-Zellen gemischt. Die Zellmischung wurde in Luria- Brühe (LB) gezüchtet, auf einer LB-Platte verteilt und 16 bis 24 h bei 30ºC inkubiert, um Plasmidtransfer und Bildung von cointegralen Plasmiden zu ermöglichen. Die Zellen wurden in 3 ml 10 mM MgSO&sub4; wieder suspendiert und 0,2 ml aliquote Teile wurden dann auf eine LB-Platte enthaltend 25 ug/ml Chloramphenicol und jeweils 100 ug/ml Spectinomycin und Streptomycin aufgetragen. Nach Inkubation während 48 h bei 30ºC wurden ungefähr 10 Kolonien erhalten. Eine Kolonie wurde gewählt und bei 30ºC in Chloramphenicol, Spectinomycin und Streptomycin in den oben angegebenen Konzentrationen enthaltendem LB-Medium gezüchtet.
Eine separate Art von co-integralem Plasmid zur Verwendung in Kontrollversuchen wurde durch Insertieren von pMON120 in A. tumefaciens-Zellen und Selektionieren auf Zellen mit cointegralen Plasmiden unter Verwendung von Spectinomycin und Streptomycin, wie oben beschrieben, hergestellt. Wie pMON120 enthalten diese Plasmide nicht das chimäre NOS-NPT II-NOS-Gen. Beispiel 8: In Pflanzenzellkulturen verwendete Lösung Die folgenden Lösungen wurden von der Anmelderin verwendet: pro Liter Enzymmischung: Cellulysin Macerozym Ampicillin KH&sub2;PO&sub4; KNO&sub3; CaCl&sub2; MgSO&sub4;·7H&sub2;O KI CuSO&sub4;·5H&sub2;O Mannit MS9: MS-Salze (siehe unten) Saccharose B5-Vitamine (siehe unten) Mannit Phytohormone: Benzyladenin (BA) 2,4-D MS-ES: MOS: Speiseplattenmedium: MS-Salze Saccharose B5-Vitamine Mannit Phytohormone: BA Ms2C: MS104: MS11: B5-Vitaminvorrat: Spülflüssigkeit: Chlorphenoxyessigsäure NAA Zeatin Myoinosit Thiamin.HCl Nikotinsäure Pyrodoxin.HCl PVP-40
MS-Salze werden vorgemischt als ein trockenes Pulver von Gibco Laboratories, Grand Island, N.Y., gekauft.

Beispiel 9: Herstellung von Protoplasten

Mitchell-Petunienpflanzen wurden in Zuchtkammern mit 2 oder 3 Reihen Fluoreszenzlampen und zwei Reihen Glühlampen (etwa 5000 Lux) gezogen. Die Temperatur wurde bei 21ºC konstant gehalten und die Beleuchtungen waren 12 h pro Tag eingeschaltet. Die Pflanzen wurden in einer 50/50 Mischung von Vermiculit und Promix BX (Premier Brands Inc., Canada) gezogen. Die Pflanzen wurden einmal am Tag mit Hoagland-Nährlösung bewässert. Von dunkelgrünen Pflanzen mit kompaktem buschigen Wachstum wurde Gewebe genommen. Die Blätter wurden in einer Lösung von 10 % im Handel erhältlicher Bleiche und einer kleinen Menge Detergens oder Tween 20 20 min unter gelegentlichem Bewegen sterilisiert. Die Blätter wurden zwei- oder dreimal mit sterilem destillierten Wasser gespült. Von den Blättern wurden senkrecht zur Hauptrippe dünne Streifen (etwa 1 mm) herausgeschnitten. Die Streifen wurden in einem Verhältnis von etwa 1 g Gewebe zu 10 ml Enzyme in die Enzymmischung gegeben. Die Schalen wurden mit Parafilm verschlossen und im Dunkeln oder unter geringem indirekten Licht unter kontinuierlichem leichten Bewegen (z. B. 40 UpM auf einem doppelt rotierenden Schüttler) inkubiert. Enzyminkubationen wurden im allgemeinen über Nacht etwa 16 bis 20 h lang durchgeführt.
Die Verdaumischung wurde durch ein 68, 74 oder 88 um-Sieb gesiebt, um großes Debris- und Blattmaterial zu entfernen. Das Filtrat wurde 5 min bei 70 bis 100 g geschleudert, um die Protoplasten zu pelletisieren. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet in Spüllösung wieder leicht suspendiert. Diese Suspension wurde in Babcock-Flaschen gegossen. Die Flaschen wurden bis auf 2 oder 3 cm oberhalb der Basis des Halses gefüllt. 1 ml Wachstumsmedium MS9 wurde vorsichtig oben auf die Spülflüssigkeit gegeben.
Die Babcock-Flaschen wurden ins Gleichgewicht gebracht und 10 bis 20 min bei 500 bis 1000 UpM zentrifugiert. Die Protoplasten bildeten ein kompaktes Band im Hals an der Grenzfläche. Das Band wurde mit einer Pipette entfernt, wobei darauf geachtet wurde, keine überschüssige Spülflüssigkeit aufzunehmen. Die Protoplasten wurden in MS9 verdünnt. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Protoplasten mit MS9 gewaschen oder ohne Waschen zum Plattieren verdünnt.
Protoplasten wurden in MS9-Medium bei 5·10&sup4; pro ml suspendiert und in T-75-Kolben mit 6 ml pro Kolben plattiert. Die Kolben wurden auf einer waagrechten Fläche mit schwachem indirekten Licht oder im Dunkeln bei 26 bis 28ºC inkubiert. Am dritten Tag nach der Entfernung der Enzyme vom Blattgewebe wurde MSO (Medium, das kein Mannit enthält) zu jedem Kolben zugesetzt, wobei eine Menge gleich der Hälfte des ursprünglichen Volumens verwendet wurde. Die gleiche Menge MSO wird am Tag 4 wieder zugesetzt. Dies reduziert die Mannitkonzentration auf etwa 0,33 M nach der ersten Verdünnung und etwa 0,25 M nach der zweiten Verdünnung.

Beispiel 10: Cokultivierung mit Bakterien

Am Tag 5 nach Protoplastenisolierung wurden 5 bis 7 Tage alte Tabaksuspensionskulturen (TXD-Zellen) (wenn notwendig) mit MS2C-Medium so weit verdünnt, daß sich 1 ml leicht über die Oberfläche von Agar-Medium in einer 100·15 mm Petrischale verteilen würde [d. h. eine 10 bis 15%ige Suspension (G/V)]. Das Agar-Medium wurde durch Mischen von 0,8% Agar mit MS-ES-Medium, Behandeln der Mischung im Autoklaven und Kühlen der Mischung, bis sie sich in der Platte verfestigt, erhalten. 1 ml der TXD- Suspension wurde über 25 ml Speiseplattenmedium verteilt. Eine 8,5 cm Scheibe Whatman Nr. 1-Filterpapier wurde über die TXD- Speisezellen gelegt und geglättet. Eine 7 cm-Scheibe des gleichen Papiers wurde in die Mitte der größeren gelegt.
Getrennt wurden aliquote Teile einer Kultur von A. tumefaciens-Zellen (in liefeextrakt-Peptonmedium gezüchtet) in die Kolben eingebracht, die die Pflanzenzellen enthielten. Ein Satz von aliquoten Teilen enthielt Zellen mit den cointegralen pMON128::Ti-Plasmiden mit chimären NOS-NPT II-NOS-Genen. Der andere Satz von aliquoten Teilen enthielt Zellen mit den cointegralen pMON120::Ti-Plasmiden, die keine chimären NOS-NPT II-NOS- Gene aufwiesen.
Die Bakterien wurden den Kolben auf eine Dichte von 10&sup8; Zellen/ml zugesetzt. 0,5 ml der Zellmischung wurden in einer dünnen Schicht auf der Oberfläche der 7 cm-Filterpapierscheibe verteilt. Die Platten wurden in Parafilm- oder Kunststoffsäcke eingewickelt und unter direkter Fluoreszenzbeleuchtung inkubiert, nicht mehr als 5 Platten in einem Stapel.
Innerhalb von 7 Tagen waren Kolonien feststellbar. Innerhalb von 14 Tagen wurden die 7 cm-Scheiben mit daran haftenden Kolonien in neues MSO-Agarmedium (ohne Speisezellen) mit einem Gehalt von 500 ug/ml Carbenicillin sowie 50 ug/ml Kanamycinsulfat (Sigma, St. Louis, MO) transferiert. Innerhalb von 2 Wochen konnten auf den Platten, die Pflanzenzellen enthielten, welche mit A. tumefaciens-Stämmen enthaltend das pMON128 cointegrale NOS-NPT II-Plasmid cokultiviert worden waren, stark wachsende grüne Kolonien festgestellt werden. Keine transformierten Kolonien wurden auf Platten festgestellt, die Pflanzenzellen enthielten, welche mit A. tumefaciens-Stämmen enthaltend das cointegrale pMON120-Plasmid cokultiviert worden waren. Die kanamycinresistenten Transformanden sind im kanamycinhaltigen Kulturmedium zum ununterbrochenen Wachstum fähig. Southern- Blotting-Versuche (wie in E.Southern, J.Mol.Biol. , 503 (1975), beschrieben) bestätigten, daß diese Zellen das chimäre NOS-NPT II-Gen enthalten.
Beide Sätze von transformierten Zellen (und ein dritter Satz von Zellen, die auf gleiche Weise durch ein für das Enzym NPT Typ I codierendes chimäres Gen transformiert worden waren) wurden auf Kanamycinresistenz geprüft. Die Ergebnisse sind in Fig. 11 angegeben.

Beispiel 11: Regeneration von transformierten Pflanzen

Die in Beispiel 10 beschriebenen transformierten kanamycinresistenten Kolonien enthielten sowohl tumoröse als auch nichttumoröse Zellen, wie in Fig. 9 und dem sich darauf beziehenden Text beschrieben. Das folgende Verfahren wurde zum Isolieren von nicht-tumorösen transformierten Zellen aus tumorösen transformierten Zellen und zum Regenerieren von differenziertem Pflanzengewebe aus den nicht-tumorösen Zellen verwendet.
Kolonien wurden auf MS104-Agarmedium enthaltend 30 u/ml Kanamycinsulfat und 500 ug/ml Carbenicillin gezüchtet, bis sie einen Durchmesser von etwa 1 cm erreichten. Überwiegend tumoröse Kolonien zeigen einen etwas blasseren Grünton und sind lockerer organisiert als überwiegend nicht-tumoröse Kolonien. Nicht-tumoröse Kolonien wurden aus dem MS104-Medium mit Pinzetten entfernt und auf MS11-Medium enthaltend 30 ug/ml Kanamycin und 500 ug/ml Carbenicillin aufgebracht. Als die Kolonien weiter wuchsen, wurden Kolonien, die blaßgrün aussahen und locker organisiert waren, entfernt und verworfen.
MS11-Medium enthält Zeatin, ein Phytohormon, das in nichttumorösen Kolonien Triebbildung induziert. Es wurden schließlich einige Triebe festgestellt, die aus kanamycinresistenten Kolonien sprossen. Diese Triebe können auf die gewünschte Größe wachsen gelassen, mit einer scharfen Klinge abgeschnitten und in Agarmedium ohne Phytohormone, wie MSO, eingebracht werden, so sie Wurzeln bilden können. Wenn gewünscht, kann das Medium mit Naphthalinessigsäure ergänzt werden, um Wurzelbildung zu bewirken. Die Pflanzen können im Agarmedium auf die gewünschte Größe wachsen gelassen und dann in Erde transferiert werden. Bei geeigneter Kultivierung wachsen solche Pflanzen bis zur Reife und bilden Samen. Die Nachkommenschaft erbt das erlangte Merkmal gemäß den klassischen Mendelschen-Gesetzen.
Literatur:
A. Bale et al, Mut. Res. 59: 157 (1979)
F. Bolivar, Gene 4: 121 (1978)
A. Braun und H. Wood, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 496 (1976)
M. D. Chilton et al, Cell 11: 263 (1977)
M. D. Chilton et al, Stadler Symposia, Band 13, 39-51 (1981), University of Missouri
P. V. Choudary et al, Miami Winter Symposia, Band 19, (1982), Seite 514, Academic Press
A. Colman et al, Eur. J. Biochem 91: 303-310 (1978)
T. Currier und E. Nester, J. Bact. 126: 157 (1976)
M. Davey et al, Plant Sci. Lett. 18: 307 (1980)
R. W. Davis et al, Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring liarbor Laboratory, New York, (1980)
H. De Greve et al, Plasmid 6: 235 (1981)
G. Ditta et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7347 (1980)
D. Garfinkel et al, Cell 27: 143 (1981)
S. Hasezawa et al, Mol. Gen. Genet. 182: 206 (1981)
J. liernalsteens et al, Nature 287: 654 (1980)
D. Ish-Horowicz und J. F. Burke, Nucleic Acids Res. 9: 2989-2998 (1981)
B. Koekman et al, J. Bacteriol. 141: 129 (1979)
F. Krens et al, Nature 296: 72 (1982)
J. Leemans et al, J. Mol. Appl. Genet. 1: 149 (1981)
J. Leemans, H. de Greve et al, Molec. Biology of Plant Tumors, Academic Press (1982), 537-545
J. Leemans et al, The EMBO J. 1: 147 (1982)
A. L. Lehninger, Biochemistry, 2. Aufl., (Worth Publ., 1975)
P. Lurquin, Nucleic Acids. Res. 6: 3773 (1979)
T. Maniatis et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Labs., 1982)
L. Marton et al, Nature 277: 129 (1979)
T. Matzke und M.D. Chilton, J. Mol. Appl. Genet. 1: 39 (1981)
J. Messing et al, Nucleic Acids Res 9: 309 (1981)
J. Messing und J. Vieira, Gene 19: 269-276 (1982)
J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring liarbor Laboratory, N.Y. (1972)
N. Murray et al, J. Mol. Biol. 132: 493 (1979)
G. Ooms et al, Plasmid 7: 15 (1982)
L. Otten und R. Schilperoort, Biochim. Biophys. Acta 527: 497 (1978)
L. Otten, Mol. Gen. Genet. 183: 209 (1981)
L. W. Ream und M. P. Gordon, Science, 218, 854-859, (1982)
R. Roberts, Nucleic Acids Res. 10: r117 (1982)
A. Rorsch und R. Schilperoort, Genetic Engineering, 189, Elsevier/North Holland, N.Y. (1978)
J. K. Setlow und A. Hollaender, Genetic Engineering, Principles and Methods (Plenum Press 1979)
X. Soberon et al, Gene 9: 287 (1980)
L. Stryer, Biochemistry, 2. Aufl. (W. H. Freeman und Co., 1981)
M. Thomashow et al, Cell 19: 729 (1980)
B. Vogelstein und D. Gillespie, Proc. Natl. Acad. Sci.: 615-619 (1979)
L. Willmitzer et al, Nature 287: 359 (1980)
L. Willmitzer et al, The EMBO J 1: 139 (1982)
N. Yadev et al, Nature 287: 1 (1980)
F. Yang et al, Mol. Gen. Genet. 177: 707 (1980)
P. Zambryski et al, J. Mol. Appl. Genet. 1: 361 (1982)

Claims

1. Cointegrales Plasmid zur Verwendung beim Transformieren von Pflanzenzellen und gebildet durch Rekombination durch einen einzigen Crossover

(A) eines chimären Plasmids umfassend ein Gen, das in Pflanzen zum Exprimieren eines codierten Polypeptids wirkt, welches Plasmid in Sequenz umfaßt:

(a) eine zu T-DNA homologe DNA-Region, die sich nahe der linken T-DNA-Grenze eines tumorinduzierenden Plasmids von Agrobacterium befindet und die imstande ist, in vivo Rekombination des chimären Plasmids mit dem tumorinduzierenden Plasmid von < Agrobacterium durch einen einzigen Crossover zu bewirken,

b) ein Gen, umfassend einen in Pflanzenzellen wirkenden Promotor, eine Codierstruktursequenz, die ein in Pflanzenzellen exprimierbares Polypeptid codiert, und eine 3'-nicht-translatierte Region, die ein Polyadenylierungssignal codiert, wobei der Promotor und das Polyadenylierungssignal wirkungsmäßig mit der Codierstruktursequenz verknüpft sind, und

c) eine Agrobacterium-Plasmid-T-DNA-rechte Grenzsequenz, die den Transfer und das Einschleusen von T-DNA in das Genom einer Pflanzenzelle ermöglicht, welches chimäre Plasmid keine pflanzentumorerzeugenden Gene zwischen und einschließend Region (a), Gen (b) und Grenzsequenz (c) enthält, und

(B) eines Ti-Plasmids, das zum Transferieren der T-DNA-Region in das Genom einer Pflanzenzelle imstande ist, derart, daß das cointegrale Plasmid eine T-DNA-Region mit folgenden Elementen in Sequenz aufweist:

(i) eine linke T-DNA-Grenzsequenz,

(ii) das Gen (b) des chimären Plasmids,

(iii) mindestens eine rechte T-DNA-Grenzsequenz,

wobei die T-DNA-Grenzsequenzen den Transfer der T-DNA-Region in das Genom einer Pflanzenzelle ermöglichen und wobei es zwischen und einschließlich linker T-DNA-Grenzsequenz, Gen (b) und rechter T-DNA-Grenzsequenz oder (wenn es mehr als eine rechte T-DNA- Grenzsequenz gibt) zwischen Gen (b) und rechter T-DNA-Grenz- Sequenz, welche der linken T-DNA-Grenzsequenz am nächsten ist, (1) keine Gene gibt, die eine transformierte Pflanzenzelle tumorös oder zur Regeneration in eine morphologisch normale Pflanze unfähig machen würden, und (2) keine Duplizierung von DNA-Sequenzen gibt, welche Duplizierung durch homologe Rekombination in Verlust des Gens (b) resultieren könnte.

2. Plasmid nach Anspruch 1, in dem das Polypeptid als Selektionsmarker in transformierten Pflanzenzellen wirkt.

3. Plasmid nach Anspruch 2, in dem das Polypeptid bewirkt, daß die Pflanzenzellen antibiotikumresistent sind.

4. Plasmid nach Anspruch 3, in dem das Polypeptid Neomycinphosphotransferase ist.

5. Plasmid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in dem das pflanzentumorinduzierende Plasmid ein Wildtyp Ti-Plasmid ist

6. Plasmid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in dem das pflanzentumorinduzierende Plasmid ein entwaffnetes Ti-Plasmid ist, in dem die tumorerzeugenden Gene und die rechte T-DNA- Grenze entfernt wurden.

7. Cointegrales Ti-Plasmid nach Anspruch 1 mit einem ersten Gen, das Expression eines Polypeptids bewirkt, das als Selektionsmarker in Bakterien wirkt, und einer T-DNA-Region, die ein zweites Gen umfaßt, das Expression eines Polypeptids bewirkt, das als Selektionsmarkergen in den transformierten Pflanzenzellen wirkt, und einem dritten Gen, das Expression eines dritten Polypeptids in Pflanzenzellen bewirkt.

8. Plasmid nach Anspruch 7, in dem das dritte Gen als Zählmarkergen wirkt.

9. Plasmid nach Anspruch 8, in dem das dritte Gen ein chimäres Gen ist.

10. Plasmid nach einem der Ansprüche 8 und 9, gebildet durch einen einzigen Crossover zwischen einem chimären Plasmid umfassend ein Gen, das in Pflanzen zum Exprimieren eines Antibiotikumresistenzmarkers wirkt, welches Plasmid in Sequenz umfaßt:

(a) eine zu T-DNA homologe DNA-Region, die sich nahe der linken T-DNA-Grenze eines tumorinduzierenden Plasmids von Agrobacterium befindet und die imstande ist, in vivo Rekombination des chimären Plasmids mit dem tumorinduzierenden Plasmid von Agrobacterium durch einen einzigen Crossover zu bewirken,

b) ein Gen umfassend einen in Pflanzenzellen wirkenden Promotor, eine Codierstruktursequenz, die einen in Pflanzenzellen exprimierbaren Antibiotikumresistenzmarker codiert, und eine 3'-nicht-translatierte Region, die ein Polyadenylierungssignal codiert, wobei der Promotor und das Polyadenylierungssignal wirkungsmäßig mit der Codierstruktursequenz verknüpft sind, und

c) eine Agrobacterium-Plasmid-T-DNA-rechte Grenzsequenz, die den Transfer und das Einschleusen von T-DNA in das Genom einer Pflanzenzelle ermöglicht, welches chimäre Plasmid keine pflanzentumorerzeugenden Gene zwischen und einschließend Region (a), Gen (b) und Grenzsequenz (c) enthält,

und einem pflanzentumorinduzierenden Plasmid von Agrobacterium.

11. Plasmid nach Anspruch 7, in dem das zweite Gen den Pflanzenzellen Antibiotikumresistenz verleiht.

12. Plasmid nach Anspruch 11, in dem das zweite Gen Neomycinphosphotransferase exprimiert.

13. Plasmid nach Anspruch 7, das keine tumorerzeugenden Gene enthält.

14. Mikroorganismus, der ein chimäres Plasmid nach Anspruch 1 enthält.

15. Mikroorganismus, der ein chimäres Plasmid nach Anspruch 7 enthält.

16. Mikroorganismus nach Anspruch 15, der ein chimäres Plasmid nach Anspruch 12 enthält.

17. Kultur von Mikroorganismen von Anspruch 14.

18. Kultur nach Anspruch 17, identifiziert durch ATCC-Nr. 39266.