DE3427477C2

DE3427477C2 -

Info

Publication number: DE3427477C2
Application number: DE3427477A
Authority: DE
Inventors: Takashi Ichikawa Chiba Jp Tsurumizu; Takashi Chofu Tokio/Tokyo Jp Hashimoto
Original assignee: KITASATO KENKYUSHO TOKIO/TOKYO JP
Current assignee: KITASATO KENKYUSHO TOKIO/TOKYO JP
Priority date: 1983-07-25
Filing date: 1984-07-25
Publication date: 1988-11-17
Also published as: DE3427477A1; GB2143829A; AU3088984A; KR890004123B1; JPS6028937A; KR850000982A; JPH0463864B2; GB8418916D0; GB2143829B

Description

Die Erfindung betrifft Mikroorganismenstämme, ferner Antikörper, diese enthaltende pharmazeutische Mittel zur Inhibierung von Zahnkaries und ein Verfahren zur Herstellung dieser Antikörper.

Zahnkaries ist eine Krankheit, die sowohl bei Menschen als auch bei Tieren auftritt. Diese Krankheit wird hauptsächlich auf der Zahnoberfläche durch Karies erzeugende, orale Bazillen induziert. Diese Krankheit führt zu einer fortschreitenden Zerstörung der Zahnstruktur. Von den verschiedenen Karies erzeugenden, oralen Bazillen scheint der Bazillus Streptococcus mutans der wichtigste zu sein. So ist beispielsweise in dem Manual of Determinative Bacteriology, Seite 502 (1974) von Bergy ausgeführt, daß eine Wechselwirkung zwischen Zahnkaries und S. mutans besteht. Es wird die Vermutung ausgesprochen, daß S. mutans ein ähnlicher Organismus ist wie S. salivarious. Obwohl S. mutans bis jetzt noch nicht intensiv untersucht und mit S. salivarious verglichen worden ist, so steht doch fest, daß S. mutans von S. salivarious dadurch klar unterschieden werden kann, daß S. salivarious aus Rohrzucker Fruktose produziert, während S. mutans aus diesem Disaccharid sowohl wasserlösliche als auch unlösliche dextranähnliche Polysaccharide (im folgenden als DPS bezeichnet) produziert. Bekanntlich haften durch S. mutans produzierte unlösliche DPS auf der Zahnoberfläche und führen zu Zahnbelag (Zahnplaque). Der Hauptanteil von S. mutans in der oralen Flora befindet sich in dem Belag und produziert Milchsäure, von der angenommen wird, daß sie die Oberflächenstruktur der Zähne zerstört. Auch andere Karies erzeugende, orale Bazillen produzieren Milchsäure. Jedoch wird die von S. mutans produzierte Milchsäure nicht aus dem Belag freigesetzt, sondern sammelt sich direkt auf der Zahnoberfläche an.

Die S. mutans-Stämme werden nach der von Bratthall et al vorgeschlagenen Klassifizierung in 7 serologische Gruppen (Serotypen) aufgeteilt, die auf Basis der immunologischen Spezifizitäten ihrer Zellwandantigene mit a bis g bezeichnet werden [Bratthall, Odont. Rev. 20 : 141, (1970) and ibid., 20 : 23 (1970) and Perch et al, Acta, Path. Microbiol. Scand. Section B, 82 : 357 (1974)]. Ein weiteres Klassifizierungsschema für S. mutans-Stämme ist von Makoto Sato vorgeschlagen worden. Nach diesem Klassifizierungsschema werden S. mutans-Stämme als Human I- (HI), Human II- (HII) oder Ratten- (R) Typ definiert. Folgendes wird von Sato ausgeführt:

(a) Der Hauptanteil (96,3%) des von menschlichen Wirten isolierten S. mutans ist vom Human I-Typ, der Rest ist vom Human II-Typ,
(b) alle S. mutans-Stämme, die von Ratten abstammen, sind vom Ratten-Typ,
(c) von Mäusen und Meerschweinchen kann kein S. mutans isoliert werden,
(d) alle von Affen und Hamstern isolierten S. mutans-Stämme sind vom Human I-Typ,
(e) Human I, Human II und Ratten-Typen entsprechen jeweils dem c, e und f, d und g und a und b-Serotypen der Klassifizierung nach Bratthall [J. of Dental Health, Vol. 28, No. 2, pages 100-123 (1978) in der japanischen Version].

Es sind bereits immunologische Wege zur Inhibierung der durch S. mutans induzierten Zahnkaries beim Menschen beschrieben worden. So beschreibt die GB-PS 13 75 866 beispielsweise ein Zahnvakzin, das als Antigen mindestens ein Teil der Zelle eines Karies erzeugenden Stammes von S. mutans aufweist, wobei die Charakteristika dieses Stammes dieselben sind, wie die Charakteristika von Streptococcus mutans NCTC 10449, einem gut bekannten repräsentativen Karies erzeugenden Stamm, der in der Mundhöhle des Menschen vorhanden ist. Es ist jedoch noch nicht berichtet worden, daß ein derartiges Vakzin zur wirksamen Inhibierung der durch S. mutans induzierten Zahnkaries beim Menschen eingesetzt worden wäre. Es ist zudem auch berichtet worden, daß die Verabreichung des ganzen, von S. mutans stammenden Zellantigens an Tiere verschiedene ungewünschte Nebenwirkungen, beispielsweise eine Kreuzreaktion mit dem Herzmuskelantigen, allergische Reaktionen und dergleichen, hervorruft.

Die GB-PS 15 05 513 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, der die durch S. mutans induzierte Zahnkaries bei Ratten inhibiert. Bei diesem Verfahren wird eine Kuh mit hitze-inaktivierten S. mutans-Zellen bestimmter Stämme immunisiert, um die entsprechenden Antikörper in dem Körper der Kuh zu produzieren. Anschließend werden die erhaltenen Antikörper aus der Kuhmilch gewonnen. Es wird vorgeschlagen, derartige Antikörper Menschen zu verabreichen, um Zahnkaries auf verschiedene Art und Weise zu inhibieren, ohne dabei die zuvor genannten ungewünschten Nebenwirkungen hervorzurufen. Die in dieser GB-PS 15 05 513 beschriebenen Mittel, die den Antikörper enthalten, sind nicht geeignet, die durch S. mutans induzierte Zahnkaries beim Menschen zu inhibieren, da sie einen hohen Anteil an Antikörper für Stämme vom Human-Typ enthalten.

Das in der GB-PS 15 05 513 beschriebene Verfahren zur Herstellung der Antikörper ist nachstehend näher erläutert:

Kulturen von S. mutans AHT, BHT, 10449 und 6715 der serologischen Gruppen (Serotypen) a, b, c und d wurden in dialysiertem Tryptose-Medium gezüchtet, die Zellen wurden von der Kulturbrühe getrennt. Die Zellen wurden fünfmal mit 0,1 M phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen und in einer ähnlichen Pufferlösung suspendiert. Die Zellen wurden durch Erhitzen auf 60°C für 30 Minuten inaktiviert und resuspendiert, wobei die Endkonzentration von S. mutans AHT, BHT, 10449 und 6715 5 × 10⁸ Zellen/ml betrug. Dieses Präparat wurde zum Immunisieren von Kühen verwendet. Die Milch von Kühen, die aufgrund dieser Immunisierung Antikörper enthielt, wurde gesammelt und getrocknet.

Die Menge der Antikörper in der getrockneten Milch, die S. mutans AHT, BHT, 10449 und 6715 binden können, wurde wie folgt bestimmt:
50 mg getrocknete Milch wurden in 1 ml destilliertem Wasser gelöst. 4 Sätze von Serien 2fach Verdünnungen wurden in Kochsalzlösung durchgeführt. Zu jedem Satz von Verdünnungsröhrchen wurden durch Formalin getötete S. mutans AHT, BHT, 10449 oder 6715 in einer Konzentration von 2 × 10⁸ Zellen/ml gegeben. Durch Bestimmung der Titer für den Agglutinations-Endpunkt der Proben wurden die folgenden Antikörper-Titer erhalten:

Die folgenden Mittel wurden unter Verwendung der oben beschriebenen, getrockneten Milch hergestellt:

(a) Eine Mundspülung, die die getrocknete Milch verdünnt mit Wasser (x 1-5) enthielt,
(b) ein Konfekt ohne Zucker, beispielsweise ein Kaugummi, ein Bonbon oder eine Eiscreme mit einem Gehalt von mehr als 25% an getrockneter Milch, und
(c) Standardreinigungsprodukte, Pulver oder Zahnpasten, die mehr als 25% dieser getrockneten Milch enthielten.

Die getrocknete Milch wurde unter Verwendung junger Ratten getestet. An diesen Ratten wurden eine Karies fördernde Diät verfüttert. Die Ratten wurden ferner mit S. mutans AHT, BHT und 6715 oral infiziert. Die Inhibierung der Zahnkaries wurde bestimmt. S. mutans 10449 wurde in diesem Test nicht verwendet, da in der getrockneten Milch zuvor keine Antikörper für diesen Stamm beobachtet wurden.

Die in der GB-PS 15 05 513 beschriebenen, Antikörper enthaltenden Mittel sind in der Lage, S. mutans 6715 deutlich zu inhibieren. Dieser Stamm gehört zu der Gruppe der Typ-II-Stämme, die in der Mundhöhle des Menschen gefunden werden. Da diese Mittel jedoch keine Antikörper enthalten, die S. mutans NCTC 10449 (Serotyp c, Human I-Typ), der - wie zuvor ausgeführt - ein gut bekannter Karies erzeugender Stamm in der Mundhöhle des Menschen ist, oder irgendeinen anderen Human I-Typ-Stamm inhibieren können, können sie auch nicht als geeignet angesehen werden, um in Antikaries-Mitteln für Menschen eingesetzt zu werden.

Bekanntlich haften orale Streptococci, wie S. mutans auf der Zahnoberfläche oder der Schleimhaut aufgrund der haar-artigen Strukturen (fimbriae) auf der Oberfläche der Zellwand [Gibbons et al, Ann. Rev. Microbiol., 29 : 19-44 (1975)]. Erfindungsgemäß wurde nun gefunden, daß Antigene, die aus den haar-artigen Strukturen von Human-Typ-Stämmen von S. mutans (im folgenden als PLS Antigene bezeichnet) zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden können, welche Human-Typ S. mutans inhibieren können. Aufgrund signifikanter Unterschiede der serologischen Spezifizität wird zwischen zwei PLS Antigenen unterschieden, die im folgenden als PLS Antigen I und PLS Antigen II bezeichnet sind. Das PLS Antigen II kann aus Stämmen vom Serotyp d isoliert werden, während das PLS Antigen I aus den Stämmen irgendeiner der Serotypen c, e, f und g isoliert werden kann.

Gegenstand der Erfindung sind neben den Stämmen Streptococcus mutans FERM-BP 317 und FERM-BP 366 somit Antikörper zur Inhibierung der durch Streptococcus mutans induzierten Zahnkaries beim Menschen, die dadurch erhältlich sind, daß man ein Säugetier mit einem Antigen, das man aus den Fimbrien auf der Zelloberfläche der Stämme S. mutans der Serotypen c, e, f und g isoliert, oder mit einem Antigen, das man aus den Fimbrien auf der Zelloberfläche der Stämme S. mutans des Serotyps d isoliert, oder mit beiden genannten Antigenen immunisiert und die erhaltenen Antikörper von diesen Säugetieren gewinnt.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von Antikörpern zur Inhibierung der durch Streptococcus mutans induzierten Zahnkaries beim Menschen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Säugetier mit einem Antigen, das man aus den Fimbrien auf der Zelloberfläche der Stämme von S. mutans der Serotypen c, e, f und g isoliert, oder mit einem Antigen, das man von den Fimbrien auf der Zelloberfläche von Stämmen von S. mutans des Serotyps d isoliert, oder mit beiden oben genannten Antigenen immunisiert und die erhaltenen Antikörper von dem Säugetier gewinnt.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Mittel zur Inhibierung der durch S. mutans induzierten Zahnkaries beim Menschen, das eine wirksame Menge von mindestens einem der Antikörper zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Excipienten enthält. Diese Antikörper wurden mit Hilfe von mindestens einem PLS Antigen erhalten.

Das PLS Antigen wurde von Streptococcus mutans NCTC 10449 isoliert. Diesen Stamm findet man bekanntlich in der Mundhöhle des Menschen (Serotyp c, Human I-Typ). Der Proteingehalt des Antigens (nach dem Verfahren von Hartree, unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard) und die Kohlenhydrate (nach dem Phenol/Schwefelsäureverfahren unter Verwendung von D-Glukose als Standard), wurden quantitativ bestimmt. Auch das Molekulargewicht wurde durch Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-100 bestimmt, wobei Phosphorylase b, Rinderserumalbumin, Eialbumin, Chymotrypsinogen und dergleichen mit bekannten Molekulargewichten als Standard verwendet wurden. Ähnliche Untersuchungen wurden auch unter Verwendung bestimmter Stämme S. mutans durchgeführt, die gut bekannte Vergleichsstämme darstellen, beispielsweise S. mutans Ingbritt (Serotyp c), OMZ176 (Serotyp d), P4 (Serotyp e), OMZ175 (Serotyp f) und K1R (Serotyp g). Es wurden folgende Ergebnisse erzielt:

(1) Ein PLS Antigen ist ein saures Glycoprotein, das etwa 15-25% Protein (beispielsweise etwa 20%) und etwa 75-85% Kohlenhydrate (beispielsweise etwa 80%) enthält und ein Molekulargewicht von etwa 6 bis 9 × 10⁴ (beispielsweise etwa 75 000) besitzt.
(2) Polyacrylamid-Disk-Elektrophorese der PLS Antigene führt zu einer charakteristischen breiten Bande zur Kathode.
(3) Führt man mit einem PLS-Antigen eine Ultrazentrifugation mit einem Sukrose-Dichtegradienten durch, dann findet man das Antigen in den Fraktionen, die eine Saccharosedichte von etwa 10-13% und ein spezifisches Gewicht von etwa 1,3-1,4 besitzen.
(4) Führt man eine Gelfiltration einer rohen PLS Antigenlösung unter Verwendung von Sepharcyl S-300 oder Sephadex G-100 durch, dann eluiert man zwei Peaks (überwacht durch Messung der Absorption bei 280 nm). Das PLS Antigen gewinnt man aus dem ersten Peak.
(5) Nach der Methode der isoelektrischen Focussierung gemäß Versterberg et al unter Verwendung von 1% des Carrier-Ampholyten (pH 3,5-10,0) erhält man einen pI-Wert für ein PLS Antigen von etwa 3,5.

Zwischen den Fraktionierungsmustern der PLS Antigene, die von allen Human-Typ-Stämmen von S. mutans abstammen, besteht kein signifikanter Unterschied.

Obwohl es gewünschtenfalls möglich ist, Antikörper zur Inhibierung der Human Typ I- und -II-Stämme zu verwenden, welche mit Hilfe des PLS Antigens I oder des PLS Antigens II erhalten wurden, verwendet man vorzugsweise Antikörper, die mit einer Kombination dieser Antigene gezüchtet wurden. Die gemeinsame Verwendung beeinträchtigt weder die Lagerfähigkeit noch die Wirksamkeit der PLS Antigen I-Antikörper und der PLS Antigen II-Antikörper.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Antikörper können, wenn sie oral am Menschen verabreicht werden, das Haften (Infektion) der Human-Typ-Stämme von S. mutans an den Zahnoberflächen inhibieren. Die Inhibierung des Haftens von S. mutans an den Zähnen führt zu einer Koagulation der Zellen der wilden Stämme von S. mutans beispielsweise im Speichel. Die Zellen sterben innerhalb einer verhältnismäßig kurzen Zeit ab. Es ist möglich, die koagulierten Zellen von S. mutans ohne Schwierigkeiten aus der Mundhöhle zu entfernen, beispielsweise durch die Verwendung üblicher Zahnpasten, Gurgelmittel, Putzmittel und dergleichen.

Es wurde gefunden, daß die orale Verabreichung einer wirksamen Menge von Antikörpern, die mit Hilfe mindestens eines PLS Antigens kontinuierlich gezüchtet wurden, beispielsweise während mehreren Wochen, zu einem völligen Verschwinden wilder Stämme von S. mutans aus der Mundhöhle führt.

Das Verfahren zur Herstellung der Antikörper kann man wie folgt durchführen.

Für die erfindungsgemäßen Zwecke können sowohl wilde Stämme als auch Mutanten-Stämme vom Human-Typ S. mutans verwendet werden. Vorteilhafterweise verwendet man einen Stamm, der über ein großes Haftvermögen verfügt. Den gewünschten Stamm kann man beispielsweise dadurch leicht auswählen, daß man untersucht, wie stark der Stamm an einer Röhrchenwand in vitro haftet. In den nachstehend beschriebenen Beispielen und Experimenten wurden zwei Mutanten-Stämme von S. mutans verwendet, d. h. Streptococcus mutans Mutanten-Stamm K-Dp FERM-BP Nr. 317 und S. mutans KH2 FERM-BP Nr. 366. Die Charakteristika dieser Mutanten-Stämme sind im wesentlichen dieselben, wie diejenigen der entsprechenden wilden Stämme, jedoch haften sie besser. Kultur dieser Mutanten-Stämme wurden bei der Hinterlegungsstelle Bikoken hinterlegt (The Fermentation Research Institute of Industrial Science and Technology), und zwar am 5. März 1982 bzw. 23. Juli 1983.

Das Kultivieren kann man auf übliche Weise, vorzugsweise unter anaeroben Bedingungen, durchführen. Gewünschtenfalls ist es jedoch auch möglich, aerobe Kulturen einzusetzen. Es können sowohl synthetische als auch organische Medien verwendet werden. Für die Massenvermehrung verwendet man vorzugsweise flüssige Medien. Somit kultiviert man gewöhnlich bei einer Temperatur von 23-39°C (beispielsweise etwa 37°C) und bei einem pH von etwa 5,6-9,0 (beispielsweise etwa 7) während 24-72 Stunden. Nach Beendigung der Kultivierung trennt man die Zellen von der Kulturbrühe ab, beispielsweise durch Zentrifugieren (8000 upm/5-20 Min.).

Die abgetrennten Zellen suspendiert man in einer geeigneten Lösung, beispielsweise 0,1-1 M Essigsäure und 0,1-1 M phosphatgepufferter 0,1-1 M Natriumchloridlösung (pH 6-8), zu der man gewünschtenfalls ein nicht-ionisches grenzflächenaktives Mittel gibt, beispielsweise Triton X-100 (0,01%-0,001%). Die Zellensuspension behandelt man dann mit Ultraschallwellen (beispielsweise 10-20 KHz/5-20 Min.), um das gewünschte Antigen zu extrahieren. Elektronenmikroskopische Beobachtungen haben gezeigt, daß es möglich ist, das PLS Antigen alleine durch den Einsatz einer hypertonischen Lösung zu extrahieren.

Statt der Behandlung mit Ultraschallwellen kann man auch Ammoniumsulfat zu der Zellsuspension bis zu einer Sättigung von etwa 20-70% (beispielsweise 60%) geben. Anschließend rührt man, um das Ammoniumsulfat zu lösen. Die Mischung läßt man bei niedriger Temperatur (beispielsweise 4°C) 24-48 Stunden stehen, wobei sich ein Präzipitat bildet, daß das gewünschte Antigen enthält. Nach Entfernen der überstehenden Flüssigkeit sammelt man die ausgefallene Fraktion und suspendiert dicht in einer ähnlichen Pufferlösung (pH 6-8) und dialysiert gegen eine ähnliche Pufferlösung bei niedriger Temperatur (beispielsweise 4°C), um Ammoniumsulfat und dialysierbare Verunreinigungen zu entfernen. Die restliche Lösung sammelt man und zentrifugiert (beispielsweise bei 8000 upm/20 Min.) und erhält so eine extrahierte Lösung, die das PLS Antigen enthält.

Die erhaltene extrahierte Lösung, die das gewünschte PLS Antigen enthält, kann man fraktionieren und auf übliche Weise reinigen, beispielsweise durch Säulenchromatographie, nach der Ausfällungsmethode mit isoelektrischer Focussierung, durch fraktionierte Präzipitation unter Verwendung eines kalten Lösungsmittels, beispielsweise Äthanol, durch Aussalzen unter Verwendung von Ammoniumsulfat und dergleichen. Diese Verfahren können alleine oder in Kombination eingesetzt werden. Besonders gute Ergebnisse erzielt man mit der Zentrifugationsmethode mit einem Dichtegradient.

Um eine Denaturierung des PLS Antigens zu vermeiden, führt man die Extraktion, Fraktionierung und Reinigung vorteilhafterweise bei niedriger Temperatur, beispielsweise unterhalb 10°C durch.

Die gereinigte PLS Antigen-Lösung kann man gewünschtenfalls mit einem geeigneten Inaktivierungsmittel, beispielsweise Formalin (0,2-0,02%) behandeln. Anschließend dialysiert man, um das Inaktivierungsmittel auf übliche Weise zu entfernen.

Die gereinigte PLS Antigen-Lösung verdünnt man dann, beispielsweise mit einer 0,5-1 M phosphat-gepufferten 0,5-1 M Natriumchloridlösung (pH 6-8), bis zu einer Protein-N-Konzentration von 10-50 µg/ml. Anschließend gibt man Aluminiumhydroxid bis zu einer Endkonzentration von Aluminium von etwa 100-500 µg/ml zu, um das Antigen zu adsorbieren. Ein antiseptisches Mittel, beispielsweise Thimerosal (0,05-0,1% Gewicht/Volumen), kann man zu der Antigenlösung geben. Auf diese Weise erhält man eine PLS Antigenlösung, die zur Immunisierung eines Säugetieres geeignet ist.

Statt des Aluminiumhydroxids kann man zu der Antigenlösung auch eine gleiche Menge des Freund's complete adjuvant geben. Man immunisiert in üblicher Weise, beispielsweise indem man kleinere Säugetiere, z. B. Mäuse, Ratten und Meerschweinchen, oder größere Säugetiere, z. B. Kaninchen, Ziegen, Schafe, Pferde und Rinder einsetzt. Die PLS Antigen-Dosis kann in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren, beispielsweise dem verwendeten Säugetier, variieren. Jedoch ist es im allgemeinen möglich, die Antigen-Lösung an kleinere Tiere in einer Dosis von 10-500 µg und an größere Säugetiere in einer Dosis von 100-200 µg (einmal täglich, berechnet als Protein N) durch Injektion, beispielsweise unter die Haut des Tierrückens, verabreichen. Die Immunisierung kann man beispielsweise 2-5mal in einem Abstand von 2-5 Wochen durchführen. Gewünschtenfalls kann man die Immunisierung durch orale Verabreichung, beispielsweise einer 5-10fachen Dosis, durchführen. Die Immunisierung kann man beispielsweise 3-12 Tage fortsetzen. So mischt man beispielsweise für Kaninchen eine PLS Antigen-Lösung, die 100-200 µg Protein N enthält, beispielsweise mit einer gleichen Menge des Freund's complete adjuvant und injiziert auf einmal unter die Rückenhaut des Tieres an 2-5 Tagen in einem Abstand von 2-5 Wochen.

Beispielsweise 10-14 Tage nach der letzten Immunisierung sammelt man das Blut der Säugetiere auf übliche Weise, beispielsweise durch Herzpunktion. Das Blut verwendet man zur Herstellung von Plasma, das man gewünschtenfalls weiter reinigen kann, um ein Antiserum zu erhalten. Das erhaltene Plasma oder Antiserum kann man bei niedriger Temperatur für einen längeren Zeitraum aufbewahren und kann man an Menschen ohne weitere Bearbeitung verabreichen.

Gewünschtenfalls kann man ein Säugetier mit einer Kombination der PLS Antigene I und II immunisieren, obwohl man das Säugetier vorzugsweise entweder mit dem PLS Antigen II oder III alleine immunisiert. Das Antigen I kann man von mehr als einem Stamm von S. mutans erhalten, wobei die Stämme dem gleichen Serotyp oder unterschiedlichen Serotypen, ausgewählt aus c, e, f und g, angehören.

Die erfindungsgemäßen Mittel zur Inhibierung der Zahnkaries bei Menschen enthalten als aktiven Bestandteil PLS Antigen I-Antikörper oder PLS Antigen II-Antikörper oder eine Kombination dieser Antikörper. Die Träger oder Excipienten, die in den erfindungsgemäßen Mitteln verwenden werden können, können fest, halbfest oder flüssig sein. Die Mittel sind im allgemeinen feste, halb-feste oder flüssige Mittel, die oral verabreicht werden können. Die Mittel können somit in Form von Pulver, Kapseln, Granulaten, Tabletten, Tropfen, Sirupen, Suspensionen, Emulsionen und dergleichen vorliegen. Beispiele geeigneter fester Träger sind Laktose, Kartoffel- oder lösliche Stärke, Magnesiumstearat, Ton und Kieselgur. Geeignete flüssige Träger sind beispielsweise Wasser, Kochsalzlösung, Glyzerin, Mandelöl, Getränke, die Milchsäure produzierende Bazillen enthalten, und Säfte. Die Mittel können ferner gewünschtenfalls Bindemittel, stabilisierende Mittel, Emulgatoren, Dispergiermittel, antiseptische Mittel, Konservierungsmittel, Essenzen und verschiedene andere, üblicherweise verwendete Additive enthalten. Bevorzugte Beispiele der erfindungsgemäßen Mittel sind Zahnreinigungsmittel, Gurgelmittel, Bonbons, Kaugummi, Eiscremes und dergleichen.

Um eine gegebene Menge der erfindungsgemäßen Antikörper an Menschen zu verabreichen, formuliert man die erfindungsgemäßen Mittel einfach derart, daß sie beispielsweise in Form von Tabletten, Kapseln, Ampullen, Pastillen oder dergleichen vorliegen. Die Menge der in einer derartigen Dosiseinheit vorhandenen Antikörper kann in Abhängigkeit von der Dosierungseinheitsform und der Verabreichungsart variieren. Gemäß einer Ausführungsform enthält eine derartige Dosierungseinheit die erfindungsgemäßen Antikörper in einer solchen Menge, daß damit 1-10 der nachstehend definierten Einheiten der Antikörper einmal täglich verabreicht werden. Verschiedene Tests an Menschen und Hamstern haben gezeigt, daß Stämme von S. mutans aus der Mundhöhle durch beispielsweise kontinuierliche orale Verabreichung über mehrere Wochen der mit Hilfe mindestens eines PLS Antigens erhaltenen Antikörper in einer täglichen Dose von 1-4 Einheiten (wie nachstehend definiert) entfernt werden können.

Über einen längeren Zeitraum, beispielsweise 6-12 Monate, können die erfindungsgemäßen Antikörper kontinuierlich in die Mundhöhle von Hamstern in großen Mengen verabreicht werden. Danach wurden alle Tiere auf Krankheitserreger untersucht und für normal befunden.

In der vorliegenden Beschreibung wird die Einheit des Antikörpertiters ausgedrückt durch den Präzipitationswert, der nach der Doppeldiffusionsmethode unter Bezug auf Goldman et al erhalten wurde [Isolation and Characterization of Glial Filaments from Human Brain, J. Cell. Biol., 78 : 426 (1978)].

In den folgenden Beispielen und Experimenten wurde die Kultivierung bei 37°C unter anaeroben Bedingungen durchgeführt, wobei man im Handel erhältliche Medien bei ihren spezifischen pH's verwendete, soweit nichts Anderes angegeben ist.

Beispiel Herstellung des Streptococcus mutans Mutanten-Stammes K-Dp FERM-BP Nr. 317

Frische, wilde Stämme von S. mutans (Serotyp c) wurden aus der Mundhöhle eines Menschen isoliert und 24 Stunden unter Verwendung von Dott Heuwitt-Brühe kultiviert (20 ml). Nach Beendigung der Kultivierung wurden die Zellen von der Kulturbrühe abzentrifugiert (8000 u.p.m./20 Min.) und dann 3mal mit 100 ml einer 0,75 M phosphat-gepufferten 1 M Natriumchloridlösung (pH 6,8) durch Zentrifugieren (8000 u.p.m./20 Min.) gewaschen. Die Zellen wurden in einer ähnlichen Pufferlösung (20 ml) suspendiert, die 20% Stickstofflost in einer Konzentration von etwa 10⁸ Lebendzelle pro ml enthielt. Die Lösung wurde bei 37°C gehalten, bis mehr als 90% der Zellen getötet worden waren (während etwa 60-90 Minuten). Die nicht getöteten Zellen wurden gesammelt und auf ähnliche Weise wie oben beschrieben unter Verwendung von Dott Heuwitt-Brühe kultiviert. Nach Beendigung der Kultivierung überführt man die Kulturbrühe mit einer Platinöse zu einem TYC Agarplattenmedium [Stoppelaar et al, Archs, Oral Biol., 12 : 1190-1201 (1976)] und kultiviert 24 Stunden. Die Kulturbrühe läßt man bei Raumtemperatur 24 Stunden stehen, um Kolonien auszuwählen, die große Mengen unlösliche DPS produzieren können. Gewünschtenfalls kann man das oben erwähnte Verfahren wiederholen, bis man einen Stamm erhält, der eine besonders hohe Herstellkapazität von unlöslichen DPS besitzt. Der erhaltene Stamm wurde als Streptococcus mutans Mutanten-Stamm K-Dp bezeichnet. Dieser Mutanten-Stamm wurde oral über einen längeren Zeitraum an Hamster verabreicht und unter Verwendung verschiedener bekannter Medien weiterkultiviert, um zu bestätigen, daß dieser Stamm ein außerordentlich hohes Haftvermögen besitzt und daß seine Charakteristika genetisch stabil sind.

Beispiel 2 Herstellung von Streptococcus mutans Stamm KH2 FERM-BP Nr. 366

Frische wilde Stämme von S. mutans (Serotyp d) werden aus der Mundhöhle eines Menschen isoliert und auf ähnliche Weise wie im Beispiel 1 beschrieben behandelt, um einen Mutanten-Stamm mit einem sehr großen Haftvermögen und genetisch stabilen Charakteristika zu erhalten. Der erhaltene Mutanten-Stamm wurde mit Streptococcus mutans Stamm KH2 bezeichnet.

Beispiel 3 Herstellung von Antikörpern unter Verwendung des PLS Antigens I, das aus dem S. mutans Mutanten-Stamm K-Dp isoliert wurde

Streptococcus mutans Mutanten-Stamm K-Dp FERM-BP Nr. 317 kultiviert man unter Verwendung eines Impfmediums (500 ml), das Polypepton (1,7%), Polypepton S (0,3%, Hefeextrakt (0,5%), Kaliumphosphat, dibasisches (0,25%), Natriumchlorid (0,25%) und Glukose (0,25%) enthält und einen pH von 7,0-7,8 besitzt. Nach Beendigung der Kultivierung wird die Kultur in ein Hauptmedium (15 000 ml) überführt, das dieselbe Zusammensetzung besitzt wie das Impfmedium. Man kultiviert 24 Stunden bei denselben Bedingungen. Nach Beendigung der Kultivierung gibt man Ammoniumsulfat zu der Kulturbrühe bis zu einer Sättigung von 33% und löst durch Rühren. Die Mischung läßt man bei Raumtemperatur 24 Stunden stehen, entfernt die überstehende Lösung von der Mischung und zentrifugiert die präzipitierte Fraktion (8000 U.p.M./30 Min.) ab und suspendiert in einer 1 M phosphat-gepufferten 0,1 M Natriumchloridlösung (750 ml; pH 8,0). Die Zellsuspension läßt man 72 Stunden bei 4°C stehen, wobei man langsam mit 1-5 U.p.M. rührt. Die Suspension zentrifugiert man dann (8000 U.p.M./30 Min.), um die Zellen zu entfernen, und gibt Ammoniumsulfat zu der überstehenden Flüssigkeit bis zu einer Sättigung von 60%. Das Ammoniumsulfat löst man unter Rühren, läßt die Mischung 48 Stunden bei 4°C stehen, wobei sich das gewünschte Antigen enthaltende Präzipitat bildet, entfernt die überstehende Flüssigkeit von der Mischung und zentrifugiert die präzipitierte Fraktion (8000 U.p.M./30 Min.). Das gewonnene Material suspendiert man in einer phosphat-gepufferten Natriumchloridlösung (100 ml), die der oben beschriebenen ähnelt, gibt die erhaltene Suspension in ein Cellophanröhrchen, dialysiert mehr als 48 Stunden bei 4°C gegen eine ähnliche Pufferlösung (mehr als 5000 ml), um Ammoniumsulfat und dialysierbare Verunreinigungen zu entfernen. Die restliche Lösung zentrifugiert man (8000 U.p.M./30 Min.) und sammelt die überstehende Flüssigkeit.

Die überstehende Flüssigkeit (300 ml) verdünnt man mit einer ähnlichen phosphat-gepufferten Natriumchloridlösung mit einer Protein N-Konzentration von 100 µg/ml. Die verdünnte Lösung (200 ml) unterwirft man einer Ultrazentrifugation mit einem Saccharose-Dichte-Gradienten Saccharose-Dichte 5-30%; 35 000 U.p.M./18 Stunden) unter Verwendung einer 65P Ultrazentrifuge mit einem Zonenrotor 235T. Das gewünschte Antigen findet man in den Fraktionen mit einer Saccharose-Dichte von etwa 10-13% und einer spezifischen Schwere von 1,31-1,35. Die Menge an Protein-N des gewünschten PLS Antigens beträgt dabei etwa 33-37 µg/ml. Die erhaltene, extrahierte, das gewünschte Antigen enthaltende Lösung gibt man in ein Cellophanröhrchen und konzentriert, um die Menge auf 1/10 durch die Verwendung von Polyvinylpyrrolidon zu reduzieren. Die konzentrierte Lösung verdünnt man dann mit einer 0,75 M phosphat-gepufferten 1 M Natriumchloridlösung (pH 6,2-6,5) bis zu einer Konzentration von Protein N von 50-100 µg/ml. Zu der verdünnten Lösung gibt man dann eine gleiche Menge von Freund's complete adjuvant, um eine Antigen-Lösung zu erhalten, die zum Immunisieren eines Säugetieres verwendet werden kann.

Die erhaltene, aus Haarbestandteilen gewonnene Antigen-Lösung (1,0 ml) injiziert man auf übliche Weise unter die Rückenhaut von Kaninchen mit einem Körpergewicht von etwa 3 kg. Eine ähnliche Immunisierung führt man insgesamt 3mal in einem Abstand von 4 Wochen durch. 4 Wochen nach der letzten Immunisierung tötet man die Tiere durch Herzpunktion und entnimmt den Tieren das Blut, zu dem man Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung von 33% gibt. Zum Lösen des Ammoniumsulfats rührt man das Blut und läßt dann 48 Stunden bei 4°C stehen. Das Präzipitat zentrifugiert man ab (8000 U.p.M./20 Min.), gibt es in ein Cellophanröhrchen und dialysiert bei 4°C gegen gereinigtes Wasser, um das Ammoniumsulfat vollständig zu entfernen. Die verbleibende Lösung sammelt man, konzentriert und gefriergetrocknet, um eine Antikörper enthaltende Lösung (etwa 85 ml) zu erhalten.

Beispiel 4 Herstellung von Antikörpern unter Verwendung des von S. mutans KH2 isolierten PLS Antigens II

Man kultiviert Streptococcus mutans KH2 FERM-P Nr. 366, Serotyp d) wie im Beispiel 3 beschrieben und behandelt in ähnlicher Weise, wobei man eine Antikörper enthaltende Lösung (etwa 85 ml) erhält.

Beispiel 5

Man stellt ein Mundwasser in üblicher Weise unter Verwendung von Glukose (1 g), einer Antikörper enthaltenden Lösung (0,05 ml; PLS Antigen I-Antikörper oder PLS Antigen II-Antikörper oder eine Kombination derartiger Antikörper) und löslicher Stärke (0,05 g) her.

Beispiel 6

Man stellt einen Sirup in üblicher Weise unter Verwendung von Carboxymethylzellulose (CMC-Na; 0,2 g), einer 20%igen Fruktoselösung (20 ml), Ethylparaffin (0,04 g) und einer Antikörper enthaltenden Lösung (0,1 ml; PLS Antigen I-Antikörper oder PLS Antigen II-Antikörper oder eine Kombination derartiger Antikörper) her.

Beispiel 7

Man stellt eine Zahnpasta her, indem man Kalziumhydrogenphosphat (feines Pulver; 60%), Glyzerin (30%), CMC-Na (10%) und Parabens (antiseptisches Mittel; 0,25 g) gut mischt und Antikörper zu der Mischung gibt (PLS Antigen I- oder PLS Antigen II-Antikörper oder eine Kombination derartiger Antikörper), so daß der Antikörper-Titer 2 Einheiten (wie zuvor definiert) pro 50 ml Produkt beträgt.

Beispiel 8

Man stellt einen nicht-karieserzeugenden Trank, der Milchsäure produzierende Bazillen enthält, auf folgende Weise her. Magermilch (2000 ml), die 10% Feststoffe enthält, sterilisiert man 15 Minuten bei 110°C, gibt dann Lactobacillus casei zu und kultiviert 36 Stunden bei 35-37°C. Zu der Kulturbrühe gibt man eine 10%ige Fruktoselösung, um die Konzentration von L. casei auf 10⁸ Lebendzellen/ml einzustellen. Die gegen PLS Antigen I und II gezogenen Antikörper gibt man zu dieser Lösung und stellt die beiden Titer der PLS Antigen I-Antikörper und PLS Antigen II-Antikörper auf 4 Einheiten (wie hier definiert) pro 50 ml des erhaltenen Produkts ein.

In den folgenden Experimenten wurden Mittel eingesetzt, die gleiche Titer an Antikörpern enthielten, welche mit den PLS Antigenen I und II erhalten und nach den in den oben aufgeführten Beispielen beschriebenen Verfahren hergestellt worden waren. Diese Mittel wurden verwendet, um die Inhibierung des Anhaftens Karies erzeugender S. mutans zu untersuchen. Als Testtiere dienten, soweit nichts anderes angegeben ist, weibliche und männliche Hamster. Jede Gruppe bestand aus 5 Tieren.

Experiment 1

21 Tage alte Hamster wurden als Testtiere verwendet. Es wurden 4 Gruppen gebildet, wovon die erste und die zweite Gruppe als Testgruppen und die dritte und vierte Gruppe als Kontrollgruppen dienten. Streptococcus mutans Mutanten-Stamm K-Dp FERM-BP Nr. 317 und Streptococcus mutans KH2 FERM-P Nr. 366 wurden 24 Stunden bei einem pH von 7,5-7,8 getrennt unter Verwendung von Tryptocase Soja Brühe kultiviert. Die Kulturbrühe, die etwa 10⁸ Lebendzellen des K-Dp-Stammes pro ml enthielt, wurde an jedes Tier der ersten und dritten Gruppe oral in einer Dosis von 0,1 ml 5 Tage einmal täglich verabreicht. In ähnlicher Weise wurde der KH2-Stamm an jedes Tier der dritten und vierten Gruppe verabreicht. Es wurde festgestellt, daß die Stämme von S. mutans an den Zähnen sämtlicher Tiere hafteten. Dann wurde eine nach dem Verfahren des Beispiels 7 hergestellte Zahnpasta (0,1 g pro Tier; enthielt gleiche Titer der PLS Antigen I- und PLS Antigen II-Antikörper) auf die Oberfläche der Backenzähne jedes Tier der ersten und zweiten Gruppe mit einer kleinen Bürste kräftig verrieben. Diese Behandlung wurde 14 Tage einmal täglich durchgeführt.

Während des 60tägigen Testzeitraums wurden alle Tiere mit einer Karies erzeugenden Diät (Diet 2000) und deionisiertem Wasser ad libitum gefüttert. Nach unterschiedlichen Zeiträumen wurden Proben von den Oberflächen der Backenzähne jedes Tieres entnommen. Jede Probe wurde 72 Stunden unter Verwendung eines TYC Agarplatten-Mediums (15 ml, pH 7,4; Stoppelaar et al) und eines Mitis-Salivarius Agarplatten-Mediums (15 ml, pH 7,4) kultiviert, um das Haften von S. mutans zu untersuchen.

Es wurde gefunden, daß die S. mutans-Konzentration in der Mundhöhle jedes Tieres der ersten und dritten Gruppe nach Verabreichen der Antikörper graduell abnahm. Die S. mutans-Stämme verschwanden von einem Teil der Tiere nach 2-4 Wochen und von den übrigen Tieren nach 4-7 Wochen. In der oralen Flora jedes Tiers der Kontrollgruppen wurde keine Konzentrationsabnahme von S. mutans beobachtet. Nach Testende wurden alle Tiere durch Injektion von Pentabarbitol anästhisiert. Den Tieren wurde die Maxilla entnommen. Der weiche Teil der Maxilla wurde durch ein 1-2minütiges Behandeln in einem Autoklaven bei 120-125°C entfernt. Die Maxilla wurde mit Wasser gewaschen und getrocknet, um eine Zahnprobe herzustellen. Alle Backenzähne sämtlicher Tiere wurden untersucht, um den Grad der Infektion (Haften) mit S. mutans und das Ausmaß der Induktion von Zahnkaries verglichen mit der Zahl kariöser Zähne zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 zusammengefaßt.

Tabelle 1

Experiment 2

Die Konzentrationsveränderung der Stämme von S. mutans in der Mundhöhle von Menschen aufgrund der Verwendung der in Beispiel 7 beschriebenen Zahnpasta (enthielt gleiche Titer der PLS Antigen I- und PLS Antigen II-Antikörper) wurde untersucht. Als Testpersonen wurden zehn Erwachsene (5 Männer und 5 Frauen) bestimmt. Aus der Mundhöhle jeder Versuchsperson wurde dreimal Zahnbelag (Zahnplaque) entnommen. Die Proben wurden in ähnlicher Weise wie im Experiment 1 beschrieben kultiviert. Zudem wurde die Bildung von Zahnbelag und Zahncysten in der Mundhöhle untersucht. Es wurde dabei so vorgegangen wie beschrieben in: "The guide line of the procedure of smearing fluoride" (herausgegeben von The Japanese Ministry of Welfare and Health). Die Ergebnisse bestätigen, daß bei allen Versuchspersonen Stämme von S. mutans vorhanden waren. Täglich nach dem Frühstück und dem Abendessen wurde die Zahnpasta von allen Testpersonen zum Reinigen ihrer Zähne verwendet. Die Anwendungsart wurde nicht spezifiziert. Mindestens einmal wöchentlich wurde Zahnbelag aus der Mundhöhle jeder Versuchsperson entnommen und in ähnlicher Weise wie oben beschrieben kultiviert, um die Konzentrationsveränderung der Stämme von Streptococcus mutans in der oralen Flora zu bestimmen. Fast alle Stämme von S. mutans waren bei 3 Testpersonen nach etwa 2-3 Wochen und bei den übrigen Versuchspersonen nach etwa 4-6 Wochen verschwunden. Die OHI-Werte aller Versuchspersonen, die unter Verwendung von Erythrosin bestimmt wurden, nahmen während des Testzeitraums signifikant ab.

Experiment 3

Ein nach dem Verfahren des Beispiels 5 hergestelltes Mundwasser, das sowohl PLS Antigen I- als auch PLS Antigen II-Antikörper enthielt, wurde an jede Versuchsperson einer Testgruppe von 20 erwachsenen Frauen verabreicht. Die Konzentrationsänderung von Streptococcus mutans in deren Mundhöhlen wurde bestimmt. 19 Frauen waren Wirte von S. mutans vom Serotyp c, während nur 1 Frau als Wirt von S. mutans vom Serotyp d diente.

Jeden Tag wurde kurz vor dem Schlafengehen ein Mundwasser oral an jede Versuchsperson der Testgruppe verabreicht. Das Mundwasser wurde solange wie möglich in der Mundhöhle gehalten. Zwei Wochen nach Beginn der Verabreichung konnten bei 5 Versuchspersonen der Testgruppe kein S. mutans isoliert werden. Die Konzentration von S. mutans in der oralen Flora der übrigen Versuchspersonen nahm graduell so ab, daß die S. mutans-Konzentration in deren Mundhöhlen etwa 4 Wochen nach Verabreichungsbeginn sehr niedrig war. Die OHI-Werte aller Versuchspersonen nahmen während des Testzeitraums sehr stark ab.

Es wurde gefunden, daß die inhibierende Wirkung, die durch Verabreichung von Mundwassern erzielt wurde, zumindest gleich groß oder stärker war als die Wirkung einer Zahnpasta, da das Mundwasser in der Mundhöhle länger verweilte als die üblichen Zahnputzmittel.

Claims

1. Streptococcus mutans-Stamm K-Dp FERM-BP Nr. 317.

2. Streptococcus mutans-Stamm KH2 FERM-BP Nr. 366.

3. Antikörper zur Inhibierung der durch Streptococcus mutans induzierten Zahnkaries beim Menschen, dadurch erhältlich, daß man ein Säugetier mit einem Antigen, das man aus den Fimbrien auf der Zelloberfläche der Stämme S. mutans der Serotypen c, e, f und g isoliert, oder mit einem Antigen, das man aus den Fimbrien auf der Zelloberfläche der Stämme S. mutans des Serotyps d isoliert, oder mit beiden genannten Antigenen immunisiert und die erhaltenen Antikörper von diesen Säugetieren gewinnt.

4. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern gemäß Anspruch 3 zur Inhibierung der durch Streptococcus mutans induzierten Zahnkaries beim Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Säugetier mit einem Antigen, das man aus den Fimbrien auf der Zelloberfläche der Stämme von S. mutans der Serotypen c, e, f und g isoliert, oder mit einem Antigen, das man von den Fimbrien auf der Zelloberfläche von Stämmen von S. mutans des Serotyps d isoliert, oder mit beiden oben genannten Antigenen immunisiert und die erhaltenen Antikörper von dem Säugetier gewinnt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Antigene saure Glyko-Proteine sind, die etwa 15-25% Proteine und etwa 75-85% Kohlenhydrate enthalten und ein Molekulargewicht von etwa 60 000 bis 90 000 und einem spezifischen Gewicht von etwa 1,3 bis 1,4 besitzen.

6. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mutanten-Stamm von S. mutans verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Mutanten-Stamm um den Streptococcus mutans Mutanten-Stamm K-Dp FERM-BP Nr. 317 handelt.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem genannten Mutanten-Stamm um den Streptococcus mutans Mutanten-Stamm KH2 FERM-BP Nr. 366 handelt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4-8, dadurch gekennzeichnet, daß man das gewünschte Antigen oder die gewünschten Antigene durch Extraktion mit gepufferter hypertonischer Kochsalz- oder Pufferlösung und anschließender Zentrifugierung unter Einhaltung eines Dichtegradienten isoliert.

10. Mittel zur Inhibierung der durch Streptococcus mutans induzierten Zahnkaries beim Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens einen der Antikörper gemäß Anspruch 3 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Excipienten enthält.