KR890004123B1

KR890004123B1 - 스트렙토콕커스 뮤탄스에 의한 유발된 충치억제용 항체의 제조방법

Info

Publication number: KR890004123B1
Application number: KR1019840004419A
Authority: KR
Inventors: 다가시 쭈루미즈; 다가시 하시모도
Original assignee: 기다사노 겐큐쇼; 미즈노에 고오에이
Priority date: 1983-07-25
Filing date: 1984-07-25
Publication date: 1989-10-21
Also published as: GB8418916D0; AU3088984A; GB2143829B; GB2143829A; KR850000982A; JPS6028937A; JPH0463864B2; DE3427477A1; DE3427477C2

Abstract

내용 없음.

Description

스트렙토콕커스 뮤탄스에 의한 유발된 충치억제용 항체의 제조방법

본 발명은 스트렙토콕커스 뮤탄스에 의한 유발된 충치를 예방 또는 억제하기 위한 항체의 제조방법에 관한 것이다.

충치는 구강내의 세균에 의해서 직접적으로 유발되는 치아의 질환이나 각종의 충치원인균 가운데 스트렙토콕커스 뮤탄스가 가장 중요시되고 있다.

예를들면 버지(Bergy)의 참고문헌[Manual of Determinative Bacteriology, 502페이지(1974)]에 S.뮤탄스가 충지와 관계가 있다고 보고하였다. S.뮤탄스는 스트렙토콕커스 사라바리우스(S.salivarious)와 유사한 미생물이다. S.뮤탄스는 자세하게 연구되지도 않았고 또한 S.사라바리우스와 비교된적도 없다라고 기재되어 있다. 그러나 오늘날 일반에게 알려져 있는 것과 같이 S.뮤탄스는 인간 또는 동물의 치아의 표면과 치아의 내부홈에 부착하여 당(sucrose)으로부터 수용성 및 불용성의 텍스트란-유사다당체(이하 "DPS"라고 한다)를 생산하는 것으로 알려져있다. S.뮤탄스에 의해 형성된 불용성 DPS는 치아의 표면에 부착하여 딱딱한 점착성이 있는 플라그(plaque)를 형성한다. 구강내의 S.뮤탄스의 대부분은 플라그 내에 거주하여 치아를 파괴하는 것으로 믿어지는 유산을 생산한다.

S.뮤탄스 이외의 충치원인균도 유산을 생산하나 S.뮤탄스에 의해 생산된 유산은 플라그밖으로 방출되지 않고 치아의 표면위에 농축되어 축적된다. 따라서 현재는 S.뮤탄스가 각종의 충치원인균 가운데에서도 가장 중요시되고 있다.

S.뮤탄스에 의해 유발되는 인간의 충치를 예방하고 또한 억제하기 위한 면역학적 수단은 공지이나 일반적으로 다음의 두가지로 분류할 수가 있다.

(1) 충치 유발능력을 가진 S.뮤탄스의 세포의 전부 또는 일부를 또는 그 균체의 효소를 항원으로 하는 충치 억제용 왁찐, 예시하면 영국특허 1,375,866호는 대표적인 충치원인균으로서 알려진 S.뮤탄스 NCTC 10449호 주와의 동일의 성질을 갖는 균주의 전균체 또는 일부 및/또는 추출물을 항원으로 하는 충치억제용 왁찐을 기재하고 있으나 실시예에 기재된 전부의 왁찐은 전균체를 항원으로 하고 있다. 그러나, 전균체 왁찐을 사용하여 인간의 충치를 효과적으로 억제할 수 있었던 것은 아직 보고된바 없다. 또한 S.뮤탄스의 전균체 왁찐을 동물에 투여하였을때 심근항원과의 교차반응이나 알레르기-성 질환과 같은 여러가지 바람직하지 않은 부작용이 있다고 보고되었다.

(2) S.뮤탄스로부터 유래한 항원으로 포유류를 면역시켜 이 포유류 체내에서 상응하는 항체를 얻고 이 포유류로부터 얻어진 항체를 회수함에 의해 제조된 충치억제용 항체.

본 발명은 이와같은 종류의 항체의 제조방법에 관한 것이다.

이 항체는 상기의 바람직하지 않은 부작용을 인간에 미칠 염려가 없고 또한 항체의 투여방법을 넓은 범위에서 선택할 수 있다는 점에서 보아 충치용 왁찐 보다도 유리하다고 본다. 그러나 이 종류의 항체를 함유하는 공지의 충치억제용 조성물(영국특허 1,505,513호)에는 다음에서의 문제가 있기 때문에 S.뮤탄스에 의해 유발되는 인간의 충치의 억제에 실용화할 수는 없다.

(1) 영국특허에 기재된 항체는 다음의 방법으로 제조된다.

S.뮤탄스 AHT(혈청형 a), BHT(혈청형 b), 10449(혈청형 c) 및 6715(혈청형 d)의 배양물을 하나의 배지로 배양하여 배양액에서 세포를 원심분리하여 0.1M인산염 완충식염수로 세척하고 같은 완충용액으로 세포를 현탁시켜 60℃로 30분 가열함으로서 세포를 불활성화시키고 같은 완충액에 재현탁시킴으로서 S.뮤탄스 AHT, BHT, 10449와 6715의 최종농도 5x10⁸세포/ml의 항원용액을 만들었다. 이렇게 얻은 항원용액은 S.뮤탄스 AHT, BHT, 10449와 6715의 신선한 항원으로 젖소를 면역시키기 위해 사용하였고, 젖소로부터 우유 즉 우유면역 글로불린을 회수하여 건조시킴으로서 건조우유를 얻었다. 이와 같이 하여 얻은 우유면에 글로불린을 마시면 구강내의 S.뮤탄스은 직접적으로 억제되고 더욱 더 우유면역 글로불린은 소화기 및 혈액을 경유하여 타액으로 분비된다. 다음으로 상기의 건조우유를 예시하면,

(가)1-5배의 물과 혼합시켜 목을 축이는 것으로 사용한다든가

(나)무당의 검, 과자, 아이스크림과 같은 식품에 25%이상 첨가하든가 또는

(다)통상의 치분제에 25%이상 첨가하면 충치억제조성물이 얻어진다.

(2)S.뮤탄스에 대한 우유면역 글로불린의 억제활성을 조사하기 위하여 단계적으로 희석(x2)된 식염수에 일정량의 건조우유를 각각 첨가하여 각 항체용액에 포르말린으로 죽인 S.뮤탄스 AHT, BHT, 10449 및 6715 4종의 어느것인가를 넣어 종말점 응집역각을 측정하여 다음과 결과를 얻었다.

사용항원 혈청학적군 항체역가

AHT a 75

BHT b 1024

10449 c <2

6715 d 256

(3)다음에 시험동물로서 쥐를 사용하여 S.뮤탄스의 감염방어시험을 실시하여 충치억제효과를 인정하였다. S.뮤탄스 10449는 이전의 측정에 있어 그러나, 검출할 수 있는 역가를 보여 주지 않기 때문에 동물시험에서 제외되었다. 이상의 상기 특허 기술과 같은 공지기술에는 다음의 문제점이 있어 실용적인 충치 억제용 조성물을 얻을 수 없다고 생각된다.

(1)S.뮤탄스균주의 분류는 부라탈(Bratthal)등이 제안한 분류에 따르고 있다. 즉 부라탈등은 S.뮤탄스의 세포 벽항원의 면역학적 특이성의 관점에서 S.뮤탄스를 "a"에서 "g"가지의 7개의 혈청형으로 분류할 것을 제안했다. [참고, Bratthall et al, Odont, Revy., 20; 141(1970) and ibid., 20:23(1970) ; Perch et al, Acta, Path, Microbiol. Scand. Section b, 82 : 357(1974)]. 그후 일본의 연구자 사또마고또(Sato Makoto)는 S.뮤탄스균주의 세포체항원의 특이성을 혈청학적으로 조사하여 S,뮤탄스를 인간 I(HI), 인간 II(HII) 및 쥐(R)형으로 분류할 수 있다는 것은 제안하여 다음과 같이 보고하였다.

(가)인간으로부터 단리된 대부분(96.3%)의 S.뮤탄스는 인간 I형이었고 나머지 인간 II형이었다.

(나)쥐의 모든 S.뮤탄스는 쥐형이었다.

(다)새앙쥐와 모르모토로부터 S.뮤탄스는 검출되지 않았다.

(라)햄스타-및 원숭이의 모든 S.뮤탄스는 인간 I형이었다.

(마)상기 인간 I. 인간 II 및 쥐형은 각각 부라탈분류에 의하여 "c, e 및 f", "d 및 g", "a 및 b"혈청액에 대응하는 균주이다[참고문헌 일본 구강위생지 28권 2호, 100-123페이지(1978)].

상기 영국특허에 발표된 건조한 우유, 즉 우유면역 글로불린은 인간의 구강내의 S.뮤탄스의 매우 작은 부분에 속하는 S.뮤탄스 6715(인간 II형, 혈청형 d)를 얼마간 억제할 수 있으나, 항체들을 함유하는 건조한 우유는 인간의 구강내의 S.뮤탄스의 대표적인 충치균주로서 잘 알려진 S.뮤탄스의 대표적인 충치균주로서 잘 알려진 S.뮤탄스 NCTC 10449(인간 I형, 혈청형 c)를 억제할 수 없다.

따라서 공지의 항체가 인간이 S.뮤탄스의 적은 부분을 점유하는 S.뮤탄스 6715(인간 II형, 혈청형 d)에 대한 다소의 억제효과를 갖는다하여도 인간의 S.뮤탄스의 대표적 균주에 대하여 활성이 없는 이상 인간의 충치의 억제에 실용화할 수는 없다. (2)S.뮤탄스의 세포부유액을 60℃, 30분간 가열함으로서 불활성화시킨다. 그 결과 세포표면의 선모상구조로부터 얻어진 항원(이하 "선모층항원"이라함)이 실질적으로 변성되어 세포벽항원만을 잔존시킨다. 이점에 대하여는 후에 기술한다.

(3)사또의 보고에서 알 수 있는 바와같이 S.뮤탄스는 동물종에 대해 현저한 특이성을 갖는 세균이다. 그러나 영국 특허는 4개의 다른 혈청형의 균주를 혼합하여 전체적으로 구별없이 처리하고 있다. 더욱더, 각형균주의 최종비율은 불분명하다.

인간형 S.뮤탄스의 억제활성은 쥐로 시험하고 있다. 혈중항체의 역가와 비교하여 우유중의 항체의 역가는 현저하게 낮어진다. 한편 S.뮤탄스와 같은 스트렙토콕커스 속 구강세균이 균체의 세포벽표면상의 선모에 의해 강점막등에 부착하는 것은 공지되어 있다. [참고 Gibbons et al. Ann. Rev. Microbiol., 29 : 19-44(1975)]. 그러나 충치억제의 관점에서 상기 선모층항원(이하 "PlS 항원이라함)과 세포벽내(세포체내)항원과의 항원활성의 차이는 이제까지 거의 해명된 일이 없다.

본 발명은 S.뮤탄스의 선모층항원으로 포유동물을 면역함으로서 동물의 체내에 산출되는 항체를 동물에서 회수하며, 종래의 세포체항원을 사용하는 경우에 비하여 현저하게 높은 부착억제활성을 갖는 항체가 얻을 수 있다는 것 또는 혈청형 c, e, f 및 g형의 S.뮤탄스이 선모층항원(이하 "항원 I"이라함)과 혈청형 d형의 S.뮤탄스의 선모층항원(이하 "항원 II"라함)과는 이제부터 얻을 수 있는 항체의 부착억제능력에 관하여 특이성을 달리하고 있는 착안점에 뒷받침하고 있다.

본 발명의 목적은 항체를 보다 용이하고 효과있게 인간에 투여하기 위하여 본 발명에 의한 항체를 유효성분으로 하고 약리학적으로 허용할 수 있는 담체 및 부형제를 가하여 제조한 충치억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 혈청형 c, e, f 또는 g형의 스트렙토콕커스 뮤탄스 균주의 세포표면상의 선모로부터 단리한 제1항원과 혈청형 d형의 스트렙토콕커스 뮤탄스 균주의 세포표면상의 선모로부터 단리한 제2항원의 두개의 항원중에서 선택한 적어도 하나의 항원으로 포유동물을 면역시키고, 상기 단리는 원하는 항원 변성을 본질적으로 피할 수 있는 온도에서 수행하고 그리고 상기 포유동물로부터 얻어진 항체를 회수함을 특징으로 하는 스트렙토콕커스 뮤탄스에 유발된 충치억제용 항체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 의한 항체는 면역 글로불린이며, 이것을 인간의 구강에 투여하면 구강내의 S.뮤탄스에 직접 작용하고 또한 소화기 및 혈액을 통해 타액에 분비된다.

본 발명의 항체는 대응하는 충치유발성 S.뮤탄스야외주의 균의 표면이나 치아의 내부홈에 부착을 억제하는 작용을 갖으나 응집소는 생산하지 않으며 또한 야외주 자체의 증식과 DPS산 생산능력을 억제치 않는다. 따라서 이들의 야외주는 치면에 부착(감염)하는 대신에 타액중에 응집된다. 이것을 예를들면 통상의 치마제나 구강냉 세척제등에 의해 구강에서 제거하는 것은 용이하다. 인간이나 햄스타를 사용한 시험결과, 본 항체의 유효량을 예를들면 수주간 연속투여하면 구강내에서 S.뮤탄스가 소멸하는 것이 인정되었다.

본 발명에 의한 선모층항원은 S.뮤탄스와 같은 스트렙토콕커스층 구가내세포의 세포벽표층의 선모상의형 특이다당체 항원과 표층단백질 또는 추출믈을 말한다. 본 항원자체는 공지이나 예를들면 상기 영국특허 1,505,513호와 같은 균체를 60℃로 30분간 가열하여 불활성화하면 선모층항원은 실질적으로 파괴되어 세포체항원만이 남게된다. 얻어지는 항체의 부착억제활성은 항원물질이 부착활성에 의존한다. 실용적으로 충치유발능력의 높은 균주의 선모층항원을 채취하여 이것을 사용하여 포유동물을 면역함으로서 부착억제활성의 높은 항체를 얻을 수가 있다. 원하는 균주는 예를들면 시험관벽 부착능력이 높은 균주를 선별함으로서 얻을 수가 있다.

본 발명의 충치억제용항체는 다음 방법으로 제조할 수 있다.

본 발명의 목적을 위해 인간형 S.뮤탄스의 야외주 및 변이주 모두를 사용할 수 있다. 그러나, 높은 점착능력을 갖는 균주를 사용하는 것이 유리하고, 원하는 균주는 시험관벽에 점착하는 능력을 고려하여 즉시 선택할 수 있다. 후기실시예 기재의 변이주인 스트렙토콕커스 뮤탄스 변이주 K-Dp(혈청형 c)와 동 KH2주(혈청형 d)란 통상의 야외주(친주)와 같은 성상을 같지만 현저하게 높은 점착능력을 갖는점이 다르다. 이들은 각기 1982년 3월 5일과 1983년 7울 23일에 FERM-BP 317호 및 FERM-BP 366호로서 미생물공업기술연구소에 기탁되어 있는 균주이다.

또한 상기의 스트렙토콕커스 뮤탄스 K-Dp주는 기탁번호 : KFCC-10109 fhti 1984년 9월 13일자 한국종균협회에 기탁되었고, 그리고 스트렙토콕커스 뮤탄스 KH2는 기탁번호 : KFCC-10108로서 1984년 9월 13일자 한국종균협회에 기탁되었다.

본 발명의 방법에 의하여 얻어지는 항체를 신모층항원의 기초가되는 균주의 혈청형으로 항체 I 및 II로 분리할 수가 있다. 항체 I은 혈청형 c, e, f 및 g의 균주유래항원에서 얻어진것이고 항체 II는혈청형 d의 균주유래의 항원에서 얻어진 것으로 각기 대응하고 혈청형의 야외주 외부작용을 특이하게 억제하는 활성을 갖고 있다는 것을 알았다. 유사한 혈청형의 세포체에서의 항원을 사용하는데서 4종류의 항체 I를 얻을 수가 있다. 이들을 단독 또는 혼합하여 혈청형 c, e, f 및 g형 야외주의 충치유발의 억제에 사용할 수가 있다.

전술한 "사또마고또"씨의 보고에 의하면 인간의 대부분은 c, e, f 또는 g형 S.뮤탄스의 숙주로 d형 S.뮤탄스의 숙주인 사람은 약간이다. 따라서 항체 I만으로서의 거의 대부분의 인간의 구강내의 S.뮤탄스의 혈청형을 조사하기에는 복잡한 조작이 필요하다. 그리고 항체 I, II를 병용하여도 각 항체의 효과에는 변함이 없다. 따라서 실용적으로 항체 I, II를 혼합하여 투여하는 것이 유리하다.

본 발명에 의한 항체는 플라스마 형도 좋고 또한 정제한 항혈청의 형으로서도 좋다. 이것을 동결건조하여 저온으로 정기간 보존하는 것도 알려진 사실이다. 본 항체의 제법을 다음과 같이 예시한다.

본 발명에 의하여 사용되는 균주는 야외주로 좋고 변이주도 좋다. 배양은 통상의 방법에 의하여 실시할 수도 있다. 즉 배양은 호기조건하에도 좋고 혐기조건하에서의 배양도 적합하다. 사용배지는 천연배지도 합성배지도 좋으나 대량생산에는 액체배지가 적합하다. 배지의 pH는 5.6-9.0예를들면 약 7.0으로 배양도는 23-40℃ 예를들면 37℃가 적합하다. 산생성은 빠르고 통상은 48간이내에 배지의 pH는 약 4.2로 저하하고 그후 균은 증식치 않는다. 본 균주의 배양에 스트렙토콕커스 속세균용의 각종 배지를 사용할 수가 있다. 배양종료후, 원심처리와 같은 방법으로 배양액에서 세포체를 분리한다. 이들 세포체는 적당한 방법으로 예를들면 0.1-1M초산, 초산나트륨완충액(pH6.0-7.8), 인산염환충액(0.01-0.75M)기타의 완충액이 있고 또한 이들의 완충액에 비이온계 계면활성제(트리톤 x100미국 롬 앤드 하스사제)와 같은 적당한 계면활성제를 첨가시킨 완충액에 현탁시켜 초음파처리(10-20kHz, 5-20분간정도)하여 선모층을 추출한다. 얻어진 추출물을 예를들면 공지의 칼럼분획동 전정침강법, 냉용매 분힉침강법, 막농축법, 황산암모늄 염석법 또는 당 밀도 구배초원심법의 단독 또는 조합에 의하여 분획정제한다. 정제된 부획을 0.5-1M인산염 완충식염수(pH약 6.2)로 함유 담백질 N 0.05-0.5mg/ml가 되도록 희석하고흡착제로서 수산화알미늄겔을최종알미늄용량 0.2mg/ml가 되도록 항원을 흡착하고 필요하다면 방부제로서 티메로살(thimerosal) 0.01%(w/v)를 첨가하면 면역용 항원용액이 얻어진다.

초음파 처리대신에 선모층 추출액을 60% 포화시키기 위해 황산을 첨가하여 교반용액하고 저온 4℃로 정치하면 선모층이 침강한다. 상등액을 제거하고 0.1M인산염 완충액(pH 8.0, 1M 염화나트륨 포함)으로 진하게 현탁시켜 저온에서 같은 완충용액으로 불순물 및 황산을 제거하고 그다음 투석시킨 용액을 상기와 같은 방법으로 원심분리하여 정제할 수 있다. 항원용액의 최종처리에 있어 수산화 알미늄 대신에 같은량의 프로인트 보조액(Freund adjuvant)을 사용할 수도 있다.

면역동물로서 예를들면 새앙쥐, 쥐, 모르모트, 토끼, 양, 소 말등을 사용할 수가 있다. 용량은 동물에 따라 다르나 통상 작은 동물에서는 항원 1-500ug(단백질로서)큰 동물에는 0.1-1mg을 1회량으로서 2-5주간 간격으로 3-5회 통상의 방법에 의해 면역시킨다. 예를들면 토끼의 경우 항원액(단백질로서 100-200ug/ml)을 같은 양의 프로인트 보조액 혼합한 것을 2-5주 간격으로 3-5회 투여하여 최종면역후 10-14일후에 동물에서 통상의 방법에 의해 채혈하고 면역글로불린을 함유하는 플라스마를 얻는다. 이것을 그대로 사람에 투여할 수도 있고 정제하여 항혈청으로 할 수도 있다.

본 발명에 의한 충치억제용 조성물의 담체는 경구투여에 적합한 고체, 반고체 또는 액체라도 좋으며 분말, 시럽, 캅셀, 입상물, 유액, 현탁액, 드롭프스등의 종류도 좋다. 적당한 부형제의 예를 락토오스, 감자전분, 가용성전분, 스테아린산 마그네슘등이 있고 적당한 액상담체의 예는 식염수, 그리세린, 아몬드유, 유산균음료, 쥬스 등이다.

본 발명에 의한 조성물은 결합제, 안정제, 유화제, 현탁제, 윤활제, 방부제와 같은 통상의 첨가물을 포함시켜도 좋다. 조성물은 치마제, 치마세척제, 캔디, 아이스크림등의 형상도 좋다. 조성물은 치마제, 치마세척제, 캔디, 아이스크림등의 형상도 좋다.

본 발명에 의한 항체의 일정량을 공급하기 위해서는 충치억제용 조성물을 정제, 캡슐앰플, 밧갈(baccal), 트로치와 같은 투여단위로서 형성시킬 수가 있다. 각 투여단위에 포함되는 항체 I또는 II의 량은 예를들면 하루에 1-10단위를 투여할 수 있다. 사람의 투여시험결과 하루에 각 항체 1-4단위를 수주동안 연속 투여함으로서 구강내에서 S.뮤탄스의 균주가 나타나지 않았다. 햄스타에 대한 본항체를 장시간(6-12개월간)대량 연속 투여하여도 아무런 이상이 없다는 것을 병리학적 시험에 의하여 인정됐다. 본 명세서에 있어서 항체의 역가는 이중확산 시험방법에 이해 얻어진 침강치에 의하여 표시했다 [Goldman, J.C. et al, Isolation and characterization of glial filaments from human brain, J.Cell Biol. 78 : 426(1978)]

하기 실시예 및 시험예에서 배양은 다른 특별한 제한이 없다면 협기성조건하에 37℃에서 수행하였고, 시판용배지가 특정 pH에서 사용하였다.

[실시예 1]

스트렙토콕커스 뮤탄스 변이주 K-Dp주(FERM-BP 317)의 제조사람의 구강에서 분리한 신선한 S.뮤탄스 야외주(혈청형 c)를 Dott Heuwitt 육즙(미국 BBL 사제)20ml를 사용하여 37℃로 24시간 배양하고 배양액을 원심처리(8000r.p.m. 20분간)하고 세포체를 분해하여 이것을 0.75M인산염 완충식염수(pH 6.8, 각 100ml)로 3회 원심처리(8000r.p.m 20분간)하여 세척했다. 니트로겐머스타드 0.1%를 함유하는 0.75M 산염 완충식염수(pH 6.8)에 생균수 약 100만/ml가 되도록 세포체를 현탁시켜 생균수의 90%이상의 사멸할때까지 37℃로 유지한다. 나머지 생균을 상기와 같은 육즙에서 배양하고 배양액의 1백금니의 양을 TYC한천평판배지[STOPPELAAR et al ; Archs. Oral Biol., 12. 1199-1201(1967)]를 사용하여 48시간 배양한후 배양물을 24시간 동안 실온에서 정치하고 불용성 텍스트란 다당체의 생산능력의 높은 콜로니를 분리시킨다. 필요하다면 상기의 방법을 반복하여 텍스트란과 같은 다당체 생산능력이 높은 균주를 순화배양한다. 이 방법에 의하여 얻어진 균주의 점착능력이 가장 놀라운 것을 햄스타의 구강내 투여에 의해 믿어졌다. 본 균주를 스트렙토콕커스변이주 K-Dp주로 명명했다.

[실시예 2]

실시예 1기재의 방법에 따라 사람의 구강에서 분리한 혈청형의 야외주에서 점착능력이 높은 스트렙토콕커스 뮤탄스 KH2(FERM-BP 366)을 인공적으로 유도했다.

[실시예 3]

항체 I의 제조

스트렙토콕커스 뮤탄스 변이주 K-Dp주(FERM-BP 317)를 하기조성의 종배양지 500ml와 본 배지 500ml를 사용하여 24시간 배양했다. 폴리펩톤 1.7% 폴리펩톤 S .3% 이스트추출액 0.5%, 인산 칼륨 0.25%, 염화나트륨 0.5%, 포도당 0.25(pH 7.0-7.8)을 함유하는 씨앗배지를 사용하여 배양하고, 배양종료후 배양액에 33%가 되도록 황산암모늄을가하며 교반용해시키고 4℃로 24시간 정치시켰다. 이 액의 상등액을 제거하고 침강물을 원심처리(8000r.p.m./30분간)에 의해 회수되고 이것이 0.1M인산염 완충식염수(750ml ; pH=8.0)에 현탁시키고 4℃로 매분 1-5회전으로 72시간 교반하였다. 완충액을 원심처리(8000r.p.m./30분간)하여 세포체를 제거하고 상등액에 60% 포화가 되도록 황산암모늄을 가하고 교반응해시킨후 4℃로 48시간 정치시킴으로서 선모층을 침강시켰다. 상등액을 제거, 침강부분을 원심분리(8000r.p.m./30분간)하여 회수한 자료를 같은 인산염 완충식염수 100ml에 현탁시켰다. 현탁액을 투석용 셀로판튜브에 넣어 4℃로 48시간 같은 인산염 완충식염수 5000ml이상을 사용하여 항산암모늄이 제거될때까지 투석시킨다. 투석 시킨용액을 원심처리(8000r.p.m./30분간)하여 투석성 불순물을 제거하고 상등액을 회수했다. 상등액(300ml)단백질 N함량 100㎍/ml가 되도록 같은 인산염 완충식염수로 희석하고 희석액 200ml를 당 밀도 구배 초원심분리장치[히다찌 65P초원심기소나프 로라-RP 235 T사용 ; 당밀도 5-30% ; 3500r.p.m/18시간]로 처리한 결과 당밀도 10-13%를 갖는 분획(비중 약 1.31-1.35)에 존재하는 원하는 항원을 발견하였다. 이의 단백질 N량은 약 33-37㎍/ml이었다. 이렇게 얻은 추출액을 세로판쥬브에 넣어 폴리비닐피롤리돈을 사용항 1/10량이 될때까지 4℃로 농축했다. 농축액을 0.75인산염 완충식염수(pH6.2-6.5)로 단백질 N함량 50-100μ/ml가 되도록 희석하고 희석액에 동량의 프로인트 보조액을 가하여 면역용 항원용액으로 사용했다.

이와같은 과정에서 얻은 액을 체중 약 3kg의 토끼의 복부피하에 통상의 방법에 의해 1.0ml투여하여 면역시키고 4주간마다 총 3회 실시하여 최종면역의 4주간후에는 통상의 방법으로 혈액을 회수하고, 황산암모늄을 33%포화가 되도록 교반용해시켜 4℃로 48시간 침강된 부분을 원심처리(8000r.p.m./20분)에 의해 회수하고 셀로판튜브에 넣어 4℃로 정제수중에 황산암모늄이 없어질때까지 투석하고 투석시킨용액을 공지된 방법에 의해 농축동결건조 시키고 항체 I(약 85ml)를 제조하였다.

[실시예 4]

항체 II의 제조

실시예 3의 방법에서 얻은 S.뮤탄스 돌연변이 주(FERM-BP 366 ; 혈청형 d)를 실시예 3기재의 방법에 따라 배양 및 처리를 하여 항체 II(약 85ml)를 얻었다. 실시예 5이하기재의 조성물에 함유되어 있는 항체로서 실시예 3(항체 I) 및 4(항체 II)기재의 항체 1종이상의 사용할 수가 있으나 필요하다면, 결합하여 사용할 수 있다.

[실시예 5]

포도당 1g, 항체 0.05ml, 가용성전분 0.05g을 사용하여 통상의 방법으로 밧갈을 제조하였다.

[실시예 6]

CMC 나트륨 0.2g, 20% 과당액 20ml 에틸파라핀 0.04g 및 항체 0.1ml를 사용하여 통상의 방법에 의해 시럽으로 만들었다.

[실시예 7]

치마제를 다음의 방법으로 만들었다. 인산수소칼륨 미분말 60%, 글리셀린 30% CMC나트륨 10% 및 파라벤(방부제)0.25%를 혼합하여 항체를 가하고 항체의 역가가 전기측정법으로 2단위/5g의 역가로 조정했다.

[실시예 8]

충치억제 유산균음료를 다음의 방법으로 만들었다.

고형분 10%의 스킴밀크액 2000ml를 110℃로 15분간 멸균후 랙토바실루스카세이를 통상의 방법에 의해 이식하고 35℃-37℃로 36시간 배양하고 배양물을 교반하면서 10% 과당액을 가하고 생균수 약 10⁸개/ml가 되도록 조정했다. 혼합액에 각 항체(I, II를 가하고, 각 항체의 역가는 얻어진 생성물 50ml당 4단위로 조절하여 충치억제용 유산균음료를 얻었다.

[시험예]

하기 시험에서 항체 I, II를 사용한 조성물을 사용하여 스트렙토콕커스 뮤탄스 야외주의 점착억제능을 시험했다. 시험동물(고르덴, 햄스타)의 수는 특기하지 않는한 각 군 암컷 또는 숫컷 5마리이다.

[시험예 1]

생후21일된 햄스타를 시험했다. 제1군과 제2군은 시험군으로 제3군과 제4군은 대조군으로 했다. 실시예 1 및 2기재의 스트레프트콕커스 뮤탄스 변이주 K-Dp(FERM-BP 317) 및 스트렙토콕커스 뮤탄스 KH2(FERM-BP 366)주를 각각 Tryptocase Soy 육즙(미국 BBl 사제지정 pH)를 사용하여 37℃로 24시간 배양했다. 얻어진 각 배양액(생균수 약 10⁸개/ml)을 하루에 0.1ml를 사용하여 제1군 및 제3군의 동물에는 K-Dp주(혈청형 c)제2군 및 제4군의 동물에는 KH2주(혈청형 d)를 5일간 연속하여 구강내에 투여하고 정착시켰다. 그후 제1군 및 제2군의 동물의 구치면을 실시예 7기재의 치마제(항제, I, II함유)각개체당 0.1g를 사용하여 적은 치솔로 강하게 닥어 이것을 1일 1회 14일간 계속했다. 그외에 시험기간의 사료는 충치유발사료[Diet 2000, Funabashi Nojo사 제품]를 사용 탈이온수와 같이 섭취하였다. 60일간의 시험기간중 각 개체의 구치면에서 시료를 채취하고 TYC한천평판배지(Stoppelaar et al)(각각 15ml ; pH 7.4) 및 Mitis-Saivarius 한천평판배지(각각 15ml pH7.4미국의 Difco 사제품)를 사용하여 37℃로 72시간 배양함으로서 치면에의 점착을 조사했다. 제1군 및 제2군(시험군)에는 본 발명에 의한 항체투여후 균주의 농도를 감소시키고 일부의 동물에는 약 2-4주간이내에 잔여 동물에는 약 4-7주간이내에 구강내에서 균이 소멸되었다.

대조군(제3, 4군)에서는 구강내의 균농도의 감소는 인정되지 않었다. 각 시험동물을 시험기간종료후 펜타바르비탈을 주입하여 마취시키고 턱을 적출시켜 오토클래이브(120-125℃ 1-2분간)로 처리한후 연조직을 제거하여 물에 잘 씻어서 건조시키고 치아의 표본으로 했다. 각 시험군의 총치아 가운데 충치가 유발된 비율 및 감염을(점착율)및 충치율을 구하여 제1표에 표시했다.

[표 1]

A : 체중증가(평균%)(시험개시전=100%)

B : 감염율%(전함스타수=100%)

C : 충치율%(전구치수=100%)

혈청형 c형 이외의 사람 I형 S.뮤탄스 즉 주지의 표준 균주 P-4(e형)OMZ 175(f형) 및 KIR(g)를 각각 사용하여 상기와 같은 시험을 실시한 결과 본항체 I은 이들의 균주의 점착능력을 c형 균주의 경우와 같이 억제할 수 있다는 것이 믿어졌다.

[시험예 2]

실시예 7기재의 항체 I, II함유 치마제의 튜여에 의한 성인구강으로부터 스트렙토콕커스 뮤탄스 균주농도의 변동을 다음의 방법으로 조사했다. 성인 10명(남자 5명, 여자 5명)에서 각 3회 구강에서 플라그를 채취하여 시험예 1기재의 방법으로 배양했다. 한편 일본의 후생복지성에서 발행된 [우생성 불화물치면도표 실시요령의 규정]에 준하여 플라그 및 치석침착도를 조사한 결과 10명의 구강내에 스트렙토콕커스 뮤탄스(혈청형 c)의 존재를 인정했다. 10명전원이 매일 아침 식사후 하고 저녁식사후에 상기 치마제를 사용하여 임의 수 방법으로 이들 닦었다. 주1회이상, 각인의 치후를 채취하여 전기방법과 같이 배양하고 뮤탄스균수의 변동을 조사한 결과 구강내의 S.뮤탄스는 3명이 약2-3주후 나머지 7명은 4-7주후 거의 검출되지 않었다. 에르트로신으로 염출시킨 OHI치는 전원이 다 투여개시전 보다도 현저하게 낮어졌다.

[시험예 3]

실시예 5 기재의 항체 I, II를 함유한 밧갈의 투여에 의한 성인 구강내의 S.뮤탄스 농도의 변동을 시험예 2 기재의 방법에 준하여 조사했다. 피검자는 성인여자 20명이다. 그 가운제 1명은 혈청형 d형이었다. 각각의 취침시에 밧갈 1개를 매우 투여하여 가능한 장시간 구강내에 보유시켰다. 약 2주간 후 5명의 구강에서 뮤탄스를 검출할 수가 없었다. 나머지 피검자의 구강내 S.뮤탄스의 농도를 차차 줄어 투여 개시후 약 4주간 후에 구강에서 약간의 S.뮤탄스이 검출되었다. 시험개시전의 OHI치는 밧갈의 투여에 따라 현저하게 저하된다. 밧갈을 사용할때 구강내에 있어서, 항체의 체류시간이 치마제의 경우보다 길기 때문에 치마제의 투여와 동등 이상의 이 억제효과를 얻을 수 있다고 인정되었다.

Claims

혈청형 c, e, f 또는 g형의 스트렙토콕커스 뮤탄스 균주의 세포표면상의 선모로부터 단리한 제1항원과 혈청형 d형의 스트렙토콕커스 뮤탄스 균주의 세포표면상의 선모로부터 단리한 제2항원의 두개의 항원중에서 선택한 적어도 하나의 항원으로 포유동물을 면역시키고, 상기 단리는 원하는 항원의 변성을 본질적으로 피할 수 있는 온도에서 수행하고, 그리고 상기 포유동물로부터 얻어진 항체를 회수함을 특징으로 하는 스트렙토콕커스 뮤탄스에 의해 유발된 충치 억제용 항체의 제조방법.
제1항에 있어서, 두항원들이 15-25%단백질과 75-85% 탄수화물로 구성되고, 60,000-90,000의 분자량을 갖고 그리고 1.3-1.4의 비중을 갖는 산성상-단백질임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 균주의 변이주가 스트렙콕커스 뮤탄스 변이주 K-Dp(FERM-BP 317, KFCC-10109)임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 균주의 변이주가 스트렙토콕커스 뮤탄스 변이주 KH-2(FERM-BP 366, KFCC-10108)임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 2항, 3항 또는 4항에 있어서, 원하는 항원 또는 항원들의 단리는 밀도경사원심분리에 의해 수반된 완충고장식염수로 추출하여 수행됨을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 단리는 10℃이하의 온도에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.