7
ι Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein neues, synthetisches Substrat
für die Bestimmung der Peptidase-Aktivität sowie einen
Assay zur Bestimmung der Peptidase. Die Erfindung betrifft
insbesondere Amidv©rbindungen der allgemeinen Formel
R-NH-// \\- OH
10
in der R für L-Leucyl oder y-°L»Glutamyl steht und X
und Y, die gleich oder verschieden sein können, für Halogenatome stehen, sowie die Salze davon.
Die Erfindung betrifft weiterhin einen Assay zur Bestimmung der Enzymaktivitätj, der dadurch gekennzeichnet ist,
daß man eine Amidverbindung der allgemeinen Formel 20
in der R1 für eine L-Leucyl- oder γ-L-Glutamylgruppe
steht, R2, R,, R^9 R5 und Rg für Wasserstoff, Halogen,
Niedrigalkyl-, Niedrigalkoxy-, Amino-, substituierte
Amino-, Hydroxyl-, Carbossyl-= oder Sulfogruppen stehen
und Rc und Rg einen Kohlenstoffring bilden können, oder
ein wasserlösliches Salz davon mit Peptidase behandelt, daß man das auf diese Weise freigesetzte Amin
der allgemeinen Formel
35
in der R2 , R*, R^, Rc und Rg die oben angegebenen Bedeutungen
haben, mit Oxidase behandelt, die Sauerstoff verbraucht und in Gegenwart eines Kupplers der allgemeinen
Formel
R7-
15 *12
in der Ry für eine Wasserstoff-, Amino-, substituierte
Amino- oder Hydroxylgruppe steht, Rg, R0, R10» R11 und
R12 für Wasserstoff-, Halogen-, Niedrigalkyl-, Niedrig-.
alkoxy-, Amino-, substituierte Amino-, Hydroxyl-, Carboxyl-
oder Sulfogruppen stehen und gegebenenfalls R11
und R12 miteinander einen Kohlenstoffring bilden können
oder wobei Ry gegebenenfalls die Bedeutung Wasserstoff
haben kann, wenn mindestens eine der Gruppen Rg, Rg»
R10, R11 und R12 eine Amino-, substituierte Amino- oder
Hydroxylgruppe ist, einen Farbstoff bildet, und daß man hierauf quantitativ erfaßbare Veränderungen mißt.
Die Erfindung betrifft weiterhin einen Assay, der dadurch
gekennzeichnet ist, daß man eine Amidverbindung der allgemeinen Formel
R - NH -// W OH
in der R für eine L-Leucyl- oder γ-L-Glutamylgruppe
steht und X und Y, die gleich oder verschieden sein können,
jeweils für ein Halogenatom stehen, oder ein Salz davon mit Peptidase in einer Probe behandelt, um ein
Anilinderivat der allgemeinen Formel
in der X und Y die oben angegebenen Bedeutungen haben,
freizusetzen, daß man das genannte Anilinderivat oxidiert und daß man quantitativ die erfaßbaren Veränderun
gen mißt.
"Peptidase" ist eine allgemeine Bezeichnung für ein Enzym, das in L-Peptiden auf die Peptidbindung einwirkt
und am N-Terminal abspaltet f um Aminosäuren oder niedri
ge Peptide freizusetzen. So gibt es beispielsweise Aminopeptidasen, wie Leucin-Aminopeptidase (Echte LAP
in der klinischen Chemie) oder Arylamidase (Klinische
LAP in der klinischen Chemie, hierin manchmal auch als AA bezeichnet) (hierin werden Echte LAP und Klinische
LAP als LAP bezeichnet), Cystin-Aminopeptidase, Prolin-Aminopeptidasey
Arginin-Aminopeptidase, Alanin-Amino-
25 peptidase oder y-Glutamyl-Transpeptidase (γ-GTP).
Unter den obengenannten Enzymen sind LAP und γ-GTP in lebenden Geweben und im S©rum weit verteilt. Diese
Enzyme sind bei Krankheitszuständen erhöht und stellen
wichtige Markierungsmittel für die klinische Diagnose und wichtige Subjekte für den Assay der Enzymaktivität
in der klinischen Analyse dar«,
LAP ist ein Enzym, das den Amino-endständigen Rest von L-Peptid mit L-Leucin oder einem verwandten Peptid als
N-ständigen Rest hydrolysiert, um L-Leucin freizusetzen.
LAP ist im lebenden Gewebe und im Serum verteilt. Die LAP-Menge im Serum variiert je nach den Körperbedingungen
und ist bei akuter Hepatitis, beim Kepatora, metästatischem
Hepatom, Hepatozirrhose und Cholangitis erhöht. Die LAP-Aktivität ist daher ein Markierungsmittel
für diese Symptome, und die Bestimmung der LAP-Aktivität ist für die klinische Diagnose dieser Symptome unerläßlich.
γ-GTP ist ein Enzym, das mit dem Stoffwechsel von γ-Glut
amylpeptid in vivo in Beziehung steht und das die Hydrolysereaktion der γ-Glutamylgruppe in γ-Glutamylpeptide
katalysiert und die genannte Gruppe auf andere Aminosäuren oder Peptide überträgt. Dieses Enzym ist
in den Geweben in vivo und im Serum weit verbreitet. γ-GTP im Serum variiert entsprechend den Bedingungen
der Symptome. Der klinische Wert von Serum-y-GTP soll bei cholestatischer Hepatitis, obstruktiver Gelbsucht
und beim primären, metastatischen Hepatom und bei der aktiven, chronischen Hepatitis höher und bei der nichtaktiven,
chronischen Hepatitis niedriger sein. Die Bestimmung der Serum-y-GTP-Aktivität ist für die chronisehe
Hepatitis spezifisch und ist für die klinische Diagnose und pathologische Bestimmung dieser Erkrankungen
geeignet.
Es sind bereits Assays für LAP bekannt. Die meisten sind colorimetrische Assays der freigesetzten Aminverbindungen
für die LAP-Aktivität. Bei dem Assay wird L-Leucyl-n-nitroanilid als synthetisches Substrat verwendet
und die durch die enzymatische Wirkung von LAP
erzeugte Gelbfärbung von p-Nitroanilin wird gemessen.
35
ei a · * *
Bei der colorimetrischen Bestimmung dieser Farbe ist
jedoch in nachteiliger Weise das Farbabsorptionsmaximum überlappt, wozu noch kommt, daß Sertimkomponenten, wie
Bilirubin-Farbstoff, die Bestimmung in nachteiliger Weise beeinträchtigen. Es ist weiterhin ein Verfahren bekannt,
bei dem man das synthetische Substrat L-Leucyl-ßnaphthylamid
verwendet. Dieses Verfahren hat jedoch eine Anzahl von Nachteilen. Der Assay ist nämlich ziemlich
komplex und erfordert ein präzises Arbeiten.
So wird beispielsweise das gebildete ß-Naphthylamin mit 5-Nitro-2-aminomethoxybenzol-diazotat unter Bildung
eines Farbstoffs gekuppelt, oder das so gebildete ß-Naphthylamin wird mit Natriumnitrit diazotiert, um
mit N-(1-Naphthyl)-ethylendiamin zu kuppeln, oder es
wird mit p-Dimethylaminobenzaldehyd oder p-Dimethylamino-zimtaldehyd
kondensiert, um einen Farbstoff zu bilden, der coloriinetrisch bestimmt wird. Die Standardsubstanz
ß-Naphthylamin ist aber toxisch und induziert Blasenkrebs oder -tumor.
Assaymethoden der γ-GTP sind bekannt. Bei den meisten handelt es sich um colorimetrische Assays der freigesetzten
Aminverbindung aus dem synthetischen Substrat durch γ-GTP. So wird beispielsweise bei einem Assay,bei
dem γ-Glutamyl-p-nitroanilid verwendet wird, γ-Glutamylp-nitroanilid
mit γ-GTP behandelt, um gelbgefärbtes p-Nitroanilin freizusetzen, das bei 410 nm colorimetrisch
gemessen wird. Die Absorption bei 410 nm wird aber durch Verbindungen in den Körperflüssigkeiten, insbesondere
Bilirubin, gestört. Um den Effekt des Bilirubin-Farbstoffs
zu vermeiden, sollte der Kontrollassay für die Probe genau und strikt gemessen werden, wodurch Nachteile
hervorgerufen werden«, Weiterhin wird freigesetztes ρ «»Nitroanilin mit ©inem Aldehyd, wie p-Dimethylaminozimtaldehyd
oder p=B±s©thylaminobenzaldehyd, unter BiI-
I ww w
dung einer Färbung kondensiert, welche bei einer roten Färbung mit langer Wellenlänge colorimetrisch bestimmt
wird. Dieser colorimetrische Assay wird durch die Temperatur für die Färbeempfindlichkeit beeinträchtigt und
die Reproduzierbarkeit wird hierdurch gestört. Es ist weiterhin eine Methode bekannt, bei der das gebildete
p-Nitroanilin diazotiert und mit 3,5-Xylenol kondensiert
wird. Die auf diese Weise gebildete, rote Färbung wird gemessen. Dieser Assay ist jedoch ziemlich komplex
und benötigt zahlreiche Reaktionsstufen. Bei einem weiteren Assay wird als synthetisches Substrat γ-L-Glutamyl-ß-naphthylamid
verwendet. Bei dieser Methode wird das durch γ-GTP freigesetzte ß-Naphthylamin in das Diazoniumsalz
umgewandelt und colorimetrisch gemessen oder mit 3-Methyl-2-benzothiazolinon-hydrazon und einem
Oxidationsmittel umgesetzt, um eine Färbung zu bilden, die colorimetrisch gemessen wird. Man kann bei dieser
Methode auch so vorgehen, daß man die Aldehydverbindung des vorgenannten Färbungsmittels damit kondensiert, um
einen colorimetrischen Assay durchzuführen. Bei diesen Methoden bringt die Carcinogenität des ß-Naphthylamins
Probleme mit sich. Weiterhin benötigen diese Assaymethoden eine strikte Kontrolle des komplexen Reaktions-Prozesses,
was zu Nachteilen führt.
Es wurde bereits gefunden, daß eine Amidverbindung der allgemeinen Formel (die im Serum nicht vorkommt)
30 L- Leu - NH -& M- R1
in der R1 für Hydroxyl, Amino oder Di-niedrigalkylamino
steht und R" für Wasserstoff, Niedrigalkyl oder Carboxyl steht, ein ausgezeichnetes, synthetisches Substrat für
LAP ist und eine Aminverbindung durch die Einwirkung von
13
LAP freisetzt. Die genannte Aminverbindung wird durch die Einwirkung von Oxidase, wie Ascorbat-Oxidase oder
Laccase, oxidiert und der Sauerstoff wird unter Bildung von Chromogen verbraucht. Die LAP-Aktivität kann in der
Weise gemessen werden, daß man die Menge des verbrauchten
Sauerstoffs oder des erzeugten Chromogens mißt.
Der unter Verwendung des obigen synthetischen Substrats durchgeführte Assay hat aber Nachteile, da das Absorptionsmaximum
für das Chromogen nicht höher als 550 nm liegt und durch Verunreinigungen in den Körperflüssigkeiten
beeinträchtigt wird. Es ist daher ein Substrat notwendig, das ein Chromogen mit höherem Absorptionsmaximum bildet.
Es wurde gefunden, daß eine Amidverbindung der Formel (1) ein überlegenes, synthetisches Substrat für LAP oder
γ-GTP darstellt. Das auf diese Weise freigesetzte Amin wird mit dem Kuppler der Formel (3) durch die Einwirkung
von Oxidase unter Verbrauch von Sauerstoff und unter Bildung von Chromogen durch oxidative Kondensation
gekuppelt. Das Chromogen hat höhere Absorptionsmaxima bei 550 bis 750 nm und einen stabilen Farbton. Die Absorption
wird durch Verunreinigungen in Körperflüssig-
25 keiten nicht beeinträchtigt.
Es wurde ferner ein neues, synthetisches Substrat mit überlegener Reaktivität für die Bestimmung von LAP oder
γ-GTP der folgenden Formel (4)
R-NH-^ \\- OH (4)
in der R, X und Y die oben angegebenen Bedeutungen haben,
gefunden. Eine Aminverbindung der Formel (5)
in der X und Y die oben angegebenen Bedeutungen haben,
wird aus dem obigen Substrat durch Einwirkung von LAP oder γ-GTP freigesetzt und wird durch ein Oxidationsmittel
oder durch Oxidase oxidiert, um die Enzymaktivität zu erfassen.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Assay zur Be-Stimmung der Enzymaktivität, der dadurch gekennzeichnet
ist, daß man eine Amidverbindung der allgemeinen Formel (D
(1) 20
in der R^ für eine L-Leucyl- oder γ-L-Glutamylgruppe
steht, R2, R,, R^, R5 und Rg für Wasserstoff, Halogen,
Niedrigalkyl-, Niedrigalkoxy-, Amino-, substituierte Amino-, Hydroxyl-, Carboxyl- oder SuIfοgruppen stehen
und Rc und Rg einen Kohlenstoffring bilden können, oder
ein wasserlösliches Salz davon mit Peptidase behandelt, daß man das auf diese Weise freigesetzte Amin der allgemeinen
Formel (2)
(2)
• ·
15
in der R2, R*, R4» R5 ^10 R6 **ie ot>en angegebenen Bedeutungen
haben, mit Oxidase behandelt, die Sauerstoff verbraucht und in Gegenwart eines Kupplers der allgemeinen
Formel (3)
in der FU für eine Wasserstoff-, Amino-, substituierte Amino- oder Hydroxylgruppe steht, Rg, Rq, R-o» rii und
R12 für Wasserstoff-, Halogen-, Niedrigalkyl-, Niedrigalkoxy-,
Amino-, substituierte Amino.-., Hydroxyl-, Carboxyl- oder Sulfogruppen stehen und gegebenenfalls R11
und R^2 miteinander einen Kohlenstoffring bilden können
oder wobei Ry gegebenenfalls die Bedeutung Wasserstoff
haben kann, wenn mindestens eine der Gruppen Rq, Rq, R^q, R^1 und R12 eine Amino-, substituierte Amino- oder
Hydroxylgruppe ist, einen Farbstoff bildet, und daß man hierauf quantitativ erfaßbare Veränderungen mißt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Assay,
der dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Amidverbin-
dung der allgemeinen Formel (4)
25 R-NH-^ V- OH (4)
in der R für eine L-Leucyl-·oder γ-L-Glutamylgruppe
steht und X und Y, die gleich oder verschieden sein können, jeweils für ein Halogenatom stehen, oder ein Salz
davon mit Peptidase in einer Probe behandelt, um ein Anilinderivat der allgemeinen Formel (5)
In der X und Y di@ oben angegebenen Bedeutungen haben,
freizusetzen^ daß man das genannte Anilinderivat oxi-■ diert und -daß man quantitativ di© erfaßbaren Veränderungen
mißt.
10
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist schließlich
- ein neues, synthetisches Substrat für den Assay der
Peptidase-Aktivität der allgemeinen Formel
in der R für eine L-Leucyl- oder γ-L-Glutamylgruppe
steht und X und Y gleich oder verschieden sein können, sowie die Salze davon.
Eine synthetische Substrat-Amidverbindung (1) oder (4) für den LAP- oder γ-GTP-Assay gemäß der Erfindung kann
durch herkömmliche Methoden der Peptidsynthese hergestellt werden, z.B. durch Umsetzung der Carboxylgruppe
von L-Leucin oder der γ-Carboxylgruppe von L-Glutaminsäure
mit dem Amin (2) oder dem Anilinderivat (5).
Bei der obigen Kondensationsreaktion sollten reaktive
Gruppen, die an der Reaktion nicht teilnehmen, z.B. die Aminogruppe des L-Leucins oder die Aminogruppe
und die a-Carboxylgruppe der L-Glutaminsäure, geschützt
werden. Beispiele für geeignete Schutzgruppen für die Aminogruppe sind herkömmliche Schutzgruppen für a-Amino-
ι gruppen, wie die t-Butoxycarbonyl-, t-Amyloxycarbonyl-,
Benzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl- oder
o-Nitrophenylthiogruppe. Die «-Carboxylgruppe der L-Glutaminsäure
wird vorzugsweise durch einen Methylester, Ethylester, t-Buty!ester, Benzylester, p-Nitrobenzylester
oder p-Methoxybenzylester geschützt. Die genannte Schutzgruppe kann vorzugsweise zusammen mit der Schutzgruppe
für die Aminogruppe in einem einstufigen Verfahren zur Entfernung der Schutzgruppe entfernt werden. So
wird beispielsweise die Aminogruppe durch eine Benzyloxycarbonylgruppe geschützt und die a-Carboxylgruppe wird
durch einen Benzylester geschützt.
Beispiele für Amine (2), die bei der Kondensationsreaktion verwendet werden können, sind Verbindungen, die
durch Niedrigalkyl-, Niedrigalkoxy-, Amino-, substituierte Amino-, Hydroxy-, Carbonyl- oder Sulfogruppen substituiert
sind. Beisiele sind die folgenden Verbindungen: o(m- oder p-)-Toluidin, o(m- oder p-)-Ethylanilin, 2,3-(2,4-,
2,5-, 2,6-, 3,4- oder 3,5-)-Xylidin, o(m- oder p-)-Anisidin, 2,5-Dimethoxyanilin, 2,5-Diethoxyanilin,
o(m- oder p-)-Chloranilin, o(m- oder p-)-Bromanilin, o(m- oder p-)-Phenylendiamin, Ν,Ν-Dimethyl-m-phenylendiamin,
N,N-Dimethyl-p-phenylendiamin, N,N-Diethyl-pphenylendiamin,
Ν,Ν-Dipropyl-p-phenylendiamin, o(m- oder p-)-Aminophenol, o(m- oder p-)-Aminobenzoesäure, p-Aminobenzolsulfonsäure,
4-Hydroxy-3,5-dichloranilin, 4-Hydroxy-3,5-dibromanilin, 2(oder 4)-Methyl-o-phenylendiamin,
2-Hydroxy-5-toluidin, 3(oder 4)-Chlor-o-toluidin, 2(oder 4)-Methyl-m-phenylendiamin, 2(oder 4)-Chlor-mphenylendiamin,
4-Methyl-m-aminobenzoesäure, 2(oder 3)-Hydroxy-o-aminobenzoesäure,
4-Hydroxy-m-aminobenzoesäure, 4-Chlor-2-aminophenol, N«Ethyl-N-hydroxyethyl-ppjjßnylendiamin9
4=-Methyl-2-aminophenol, 2-Me^oXy-S-ChIOranilin,
3-Chlor-o-toluidia oder 4-Chlor-o-toluidin. Wei-
tere Beispiele geeigneter Aminverbindungen (2) sind
Naphthylaminverbindungen, wie α-Naphthylamin- oder
1 -Amino -6-naphtholsulfonsäure.
Beispiele für geeignete Anilinderivate (5) sind 3»5-Dibrom-4-hydroxyanilin,
3,5-Dichlor-4-hydroxyanilin und 3-Chlor-5-brom-4-hydroxyanilin.
Die Kondensationsreaktion wird in der Weise durchgeführt,
daß. man die α-Carboxylgruppe des L-Leucins, dessen a-Aminogruppe geschützt worden ist, oder die γ-Carboxylgruppe
von L-Glutaininsäure, bei der die oc-Amino- und
die a-Carboxylgruppe geschützt worden sind, mit einem
Säurehalogenid, Säureanhydrid, Säureazid, Säureimidazolid oder aktivierten Ester, z.B. Cyanomethylester,
p-Nitrophenylester, 2,4-Dinitrophenylester, N-Hydroxysuccinimidester
oder N-Hydroxyphthalimidester, aktiviert und mit dem Amin (2) oder dem Anilinderivat (5) umsetzt.
Man kann auch so vorgehen, daß man das geschützte L-Leucin oder die geschützte L-Glutaminsäure mit dem Amin
(2) oder dem Anilin (5) in Gegenwart eines Kondensationsmittels, z.B. von Carbodiimid, wie Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid
oder Ν,Ν'-Carbonylimidazol, und einem Isoxazoliumsalz,
wie einem Woodward-Reagens, umsetzt.
25 "
Die obige Kondensationsreaktion mit einem inerten, organischen
Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid,
Dimethylsulfoxid, Tetrahydrofuran, Dioxan, Benzol, Chloroform, Dichlormethan oder Dichlorethan, unter
Verwendung von gleichen Mengen der geschützten Aminosäure und des Amins (2) oder des Anilinderivats (5)wird bei
Raumtemperatur oder darunter durchgeführt. Der Reaktionsprozeß kann durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie
(TLC) oder Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) verfolgt werden und nach dem Verschwinden
des Ausgangsmaterials abgebrochen werden.
Das so erhaltene Reaktionsprodukt wird mit oder ohne
Abdestillation des Reaktionslösungsmittels in einem mit Wasser nicht mischbaren, organischen Lösungsmittel,
wie Chloroform, Dichlormethan, Ethylacetat, Butylacetat,
Methylisobuty!keton, Benzol oder Diethylether,
aufgelöst. Die Lösung wird mit saurem Wasser oder alkalischem Wasser gewaschen und das Lösungsmittel zur
Isolierung des Produktes entfernt. Wenn eine weitere Reinigung erforderlich ist, dann wird eine Umkristallisation
aus einem geeigneten Umkristallisations-Lösungsmittel oder eine Reinigung durch Säulenchromatographie
mit Silikagel, aktivem Aluminiumoxid oder adsorbierendem Kunstharz durchgeführt.
Die Entfernung der Schutzgruppe kann durch herkömmliche Methoden der Peptidchemie geschehen. So wird beispielsweise
die t-Butyloxycarbonylgruppe der oc-Aminogruppe
durch 2N HCl in Essigsäure, Trifluoressigsäure oder Ameisensäure entfernt. Die Benzyloxycarbonylgruppe wird
durch katalytische Reduktion unter Verwendung von Palladium/Kohle oder HBr in Essigsäure entfernt. Der
Benzylester der a-Carboxylgruppe der L-Glutaminsäure
wird durch katalytische Reduktion mit Palladium/Kohle . entfernt.
Die so erhaltene Amidverbindung (1) oder Amidverbindung (4) kann isoliert werden, indem man im Falle der Entfernung
der Schutzgruppe durch saure Zersetzung das Reaktionsgemisch neutralisiert oder im Falle der katalytischen
Reduktion den Katalysator entfernt. Es wird ein mit Wasser nicht mischbares, organisches Lösungsmittel,
wie Chloroform, Dichlormethan, Dichlorethan, Ethylacetat, Butylacetat, Methylisobutylketon, Benzol
QdGr Diethylethers zugesetzt und hierauf wird mit saure»
Wasser und alkalischem !fässer gewaschen und das Lösungs-
mittel entfernt. Eine weitere Reinigung kann durch Umkristallisation
in einem geeigneten Lösungsmittel oder durch Säulenchromatographie mit Silikagel, aktivem Aiii"
miniumoxid oder einem adsorbierenden Kunstharz ge-
5 ßchehen.
Die Amidverbindung (1) oder die Amidverbindung (4) kann
gegebenenfalls als Salz hergestellt werden. So können z.B. anorganische Salze, wie das Hydrochlorid, Sulfat,
Nitrat oder Phosphat, oder organische Salze, wie das Formiat, Acetat, Propionat, Malat, Citrat, Tartrat oder
Oxalat, hergestellt werden.
Erfindungsgemäß wird eine Amidverbindung (1) durch
LAP oder γ-GTP in einer Probe hydrolysiert, um das Amin (2) freizusetzen, welches unter der Einwirkung von
Oxidase oxidativ mit dem Kuppler (3) kondensiert wird. Auf diese Weise wird eine chromogene Verbindung (die
nachstehend als "Chromogen" bezeichnet wird) gebildet.
Beispiele für geeignete Kuppler (3) können aromatische Verbindungen sein, die ein Chromogen mit Absorptionsmaxima
bei 550 bis 750 nm bilden und mit dem Amin (2) durch die Einwirkung der Oxidase oxidativ kondensiert
werden können.
Bevorzugte Beispiele sind Phenole, Aminophenole, Aniline und Naphthole. Beispiele für Phenole sind Phenol,
Salicylsäure, m-Hydroxybenzoesäure, p-Hydroxybenzoesäure, 2,6-Dihydroxybenzoesäure, Methylsalicylat,
o(m- oder p-)-Kresol, ο(oder m-)-Ethylphenol, 2,3(2,4-, 2,5-, 3,5- oder 2,6-)-Xylenol, o(m- oder p-)-Hethoxyphenol,
2,6-Dimethoxyphenol, o(m- oder p-)-Chlorphenol, 2,4(oder 2,6-)-Dichlorphenol, o(m- oder p-)-Bromphenol,
2,4(oder 2,6-)-Dibromphenol, 2-Methyl-6-chlorphenol,
35 2-Chlor-5-methylphenol, ο-Carboxymethy!phenol oder
21
2-Hydroxy~4-aniinoethylphenol, Beispiele für Aminophenole
sind 4-Chlor-2-aminophenol, Ν,Ν-Diethyl-m-aminophenol,
4-Methyl-2-aminophenol, 5-Amino-2-hydroxybenzoesäure,
2-Amino-3-hydroxybenzoesäure, o(m- oder p-)-Aminophenol, 2,6-Dichlor-4-aminophenol oder 2,6-Dibrom-4-aminophenol.
Beispiele für Aniline sind Anilin, o(m- oder p-)-Toluidin, N-Methylanilin, N-Ethylanilin, Ν,Ν-Dimethylanilin, N,N-Diethylanilin,
Ν,Ν-Dimethyl-o-toluidin, N,N-Dimethyl-ptoluidin,
Ν,Ν-Diethyl-o-toluidin, Ν,Ν-Diethyl-p-toluidin,
o(oder m-)-Chloranilin, m-Bromanilin, Anthranilsäure,
3-Aminobenzoesäure, p-Dimethylaminobenzoesäiire, 4-Chloro-toluidin,
3-Amino-4-methy!benzoesäure, m-Phenylendiamin,
Ν,Ν-Dimethyl-m-phenylendiamin, 4-Methyl-o-phenylendiamin,
4-Methyl-m-phenylendiamin, 2-Chlor-m-phenylendiamin,
4-Chlor-m-phenylendiamin, 3-Chlor-o-toluidin,
2-Methoxy-5-chloranilin, o-Ethylanilin, 2,5-Diethoxyanilin,
N-Ethyl-N-hydroxyethylanilin oder N-Ethyl-Nr
hydroxyethy1-m-toluidin. Beispiele für Naphthole sind
a-Naphthol, ß-Naphthaol, i-Naphthol-2-carbonsäure,
4"Chlor-1-naphthol, 1-Hydroxy-2-naphthoesäure, 1-Naphthol-2-sulfonsäure,
1-Naphthol-4-sulfonsäuref 1-Naphthol-8-sulfonsäure,
2-Naphthol-6-sulfonsäure, 2-Naphthol-7-sulfonsäure,
2-Naphthol-8-sulfonsäure, 2-Naphthol-3,6-disulfonsäure
oder 2-Naphthol-6,8-disulfonsäure.
Beispiele für Oxidasen sind Oxidasen, die Sauerstoff verbrauchen und die ein Chromogen bilden können, indem das
freigesetzte Amin (2) allein oxidiert wird oder indem das freigesetzte Amin (2) mit dem Kuppler (3) oxidativ
gekuppelt wird. Als Einzelbeispiele können Ascorbat-Oxidase, Laccase, Tyrosinase, Aminophenol-Oxidase, Phenol-Oxidase
oder Polyphenol-Oxidase genannt werden. Bevorzugte Beispiele sind Ascorbat-Oxidase, erhalten aus
Kürbissen, Gurken oder Chaywurzel (Sechium edule) (JA-OS
56-88793), oder Laccase, erhalten aus Japan (urushi,
Japanese lacquer) oder Bacidiomycetes (Coriolus versicolor,
Rhizopus oder Polyporus versicolor) [j.Biochem.,
£0, 264 (1961); Biochim.Biophys.Actas 7£, 204 (1963)j
Ac ta Chem.Scand., 21. f 2367 (1967)].
5 .
Nachstehend werden Ausführungsform des LAP« oder γ-GTP-Assays
unter ¥erwendung der Amidverbindung (i) beschrieben.
Bei dem LAP-Assay wird die Amidverbindung .(1) des synthetischen Substrats für LAPS bei der R. für eine L-Leucylgruppe
steht, oder ein Salz davon mit LAP in der Probe behandelt, um das Amin (2) freizusetzen,,
Die Probe besteht aus 0,01 bis 5 ml einer Serumprobe«
Die Enzymreaktion wird 5 min oder langer bei 37°C durchgeführt.
Der optimale pH-Wert des Enzyms beträgt 6,5 bis 8,0.
Beispiele für geeignete Pufferlösungen sind Phosphat-, Borat-, Barbital-, Carbonat- oder Trishydroxymethylaminoethan-Puffer.
Bei dem γ-GTP-Assay wird die Amidverbindung' (1) des
synthetischen Substrats für γ-GTP, bei der R^ für eine
γ-L-Glutamylgruppe steht, oder ein Salz davon mit
γ-GTP in der Probe behandelt, um das Amin (2) freizusetzen. Es werden 0,01 bis 5 ml der Serumprobe verwendet.
Die Enzymreaktion läuft bei 370C über 5 min oder mehr
ab. Der optimale pH-Wert des Enzyms ist 7,5 bis 9,0. Die enzymatische Reaktion wird in einem Puffer mit einem
pH von 7,5 bis 9,0, der Aminosäure oder Peptid als Akzeptor, wie Glycylglycin, enthält, durchgeführt, um
das Amin (2) zu bestimmen, das sich entsprechend der γ-GTP-Aktivität bildet. Beispiele für geeignete Puffer
sind Phosphat-, Borat-, Barbital-, Carbonat-, Triethanolamin-,
Glycin- oder Trishydroxymethylaminomethan-Puffer.
Die quantitative Bestimmung des Amins (2) kann durch
Behandlung mit Oxidase in Gegenwart des Kupplers (3) erfolgen. Die Farbreaktion ist bei dem optimalen pH-Wert
der Oxidase im allgemeinen bei einem pH-Wert von 6 bis beendigt, wodurch das Chromogen durch oxidative Kondensation
gebildet wird. Beispiele für geeignete Puffer sind Phosphat-, Borat-, Carbonat-, Acetat- oder Trishydroxymethylaminomethan-Puffer.
Die enzymatische Reaktion läuft bei etwa 370C ab. Das durch die oxidative
Kondensation des Amins (2) und des Kupplers (3) gebildete Chromogen hat Absorptionsmaxima bei 550 bis 750 nm, je
nach der Art des Kupplers (3). Im allgemeinen zeigt das Chromogen eine blaue Färbung mit Absorptionsmaxima bei
570 bis 700 nm und mit hoher Empfindlichkeit und Stabilität ohne Temperaturabweichungen. Der Assay wird durch
Verunreinigungen, wie Bilirubin, nicht beeinträchtigt. Vorzugsweise wird er als LAP- oder γ-GTP-Assay ausgestaltet.
Erfindungsgemäß kann eine enzymatische Reaktion auf die
Amidverbindung (1) durch LAP oder γ-GTP oder eine enzymatische, oxidative Kondensationsreaktion durch das
Amin (2) und den Kuppler (3) gleichzeitig ablaufen. In diesem Falle sollte der optimale pH-Wert für LAP oder
γ-GTP und die Oxidase gemeinsam sein, wie es beispielsweise bei einem pH von 7,0 der Fall ist. Die Pufferlösung
kann wie vorstehend beschrieben ausgewählt werden .
V* ν* ν» ι w »^ —■
Die quantitative Bestimmung des so gebildeten Chromogens
kann vorzugsweise colorimetrisch bei der spezifischen Absorptionswellenlänge des Chromogens erfolgen. Die Bestimmung
der spezifischen Absorptionswellenlänge kann in der Weise durchgeführt werden, daß man herkömmlicherweise
das Absorptionsspektrum des Chromogens mißt. Im allgemeinen erfolgt die Bestimmung bei 550 bis 770 nm.
Die LAP- oder γ-GTP-Aktivität in einer Probe kann in der
Weise gemessen werden, daß man die Menge des verbrauchten Sauerstoffs ermittelt, was vorzugsweise mittels einer
Sauerstoffelektrode geschieht. Weiterhin kann die Oxidase durch bekannte Immobilisierungstecliniken immobilisiert
werden. Das immobilisierte Enzym wird mit der Elektrode unter Ausbildung einer Enzymelektrode kombiniert.
Mit dieser Enzymelektrode kann ein rascher, einfacher und wiederholbarer Assay durchgeführt werden,
wobei die Elektrode auch in ein automatisches Assaysystem eingearbeitet werden kann. Die Messung durch
elektrochemische Veränderungen auf der Sauerstoffelektrode kann Ersparnisse hinsichtlich der Mengen des
teuren Enzyms mit sich bringen. Die LAP- oder γ-GTP- .
Aktivität kann durch Umwandlung der aufgezeichneten oder angezeichneten Menge der elektrochemischen Veranderung,
die durch die Elektrode gemessen wird, bestimmt werden.
Wie vorstehend erläutert, stellt die vorliegende Erfindung einen einfachen Assay in jeder Reaktiorisstufe zur·
Verfügung, der einen exakten und raschen LAP- oder γ-GTP-Assay darstellt. Das gebildete Chromogen hat
Absorptionsmaxima bei 550 bis 750 nm, die durch Verunreinigungen in den Proben nicht beeinträchtigt werden
können.
Nachstehend werden Ausführungsformen des Peptidase-Assays
unter Verwendung der Amidverbindung (4) beschrieben.
Die Amidverbindung (4) oder ein Salz davon wird mit der
Peptidase in der Probe, insbesondere LAP oder γ-GTP, behandelt, um das Anilinderivat (5) freizusetzen. Das
Anilinderivat wird durch die Einwirkung eines Oxidations mittels oder der Oxidase in das Chromogen umgewandelt
und die gefärbte Verbindung colorimetrisch gemessen oder es wird die Menge an verbrauchtem Sauerstoff durch die
Oxidase gemessen.
Eine oxidative Färbung ist vorzugsweise ein colorimetrischer Assay des Chromogens, das durch oxidative Kondensation
des Kupplers (3) und des Anilinderivats (5) gebildet worden ist. Beispiele für geeignete Kuppler sind
aromatische Verbindungen, die ein Chromogen bilden, das oxidativ mit dem Anilinderivat (5) kondensiert wird.
Bevorzugte Kuppler sind Verbindungen der Phenol-, Aminophenol-, Anilin- oder Nap hthol-Reihe der obengenannten
Kuppler (3).
Die oxidative Kondensation wird bei einem pH-Wert von 4 bis 12 zur Vervollständigung der Farbreaktion durchgeführt.
Puffer oder wäßrige, alkalische Lösungen zur Kontrolle des pH-Wertes sind Carbonat-, Phosphat- oder
Borat-Puffer oder Alkalihydroxidlösungen. Die Kondensation
läuft in Anwesenheit des Oxidationsmittels oder der Oxidase, die das Anilinderivat (5) mit dem Kuppler (3)
oxidativ kondensieren kann, ab. Beispiele für Oxidations mittel sind Oxidationsmittel der Halogenreihe, wie Perjodat,
Chloramin T oder Unterchlorigesäure, Oxidationsmittel
der Peroxidreihe, wie Persulfat oder Hydroperoxid, oder Cyanoferri-Komplexe, wobei ein bevorzugtes
Beispiel Natriummetaperjodat darstellt. Bevorzugte Beispiele für Oxidase sind Laccase, Ascorbat-Oxidase oder
Tyrosinase. Die Oxidation durch die Oxidase kann in det*
gleichen Weise wie: diejenige der Amidverbindung (1)
5 durchgeführt werden.
Das auf diese Weise durch oxidative Kondensation des
Anilinderivats (5) und des Kupplers (3) gebildete Chromogen hat eine maximale Absorptionswellenlänge ungefähr
bei 550 bis 770 nm, ;Je nach der Art des Kupplers. Es ist
ein im allgemeinen gefärbter Farbstoff mit 570 bis 680 nm. Die genannte Farbstoffbildung ist hochempfindlich
und stabil, ohne daß Beeinträchtigungen durch die Temperatur und Verunreinigungen der Probe, z.B. BiIirübin,
in Betracht kommen. Daher werden keine positiven Fehler bewirkt und der Assay wird als Peptidase-Assay,
wie für LAP oder y-GTP, bevorzugt.
Ein weiterer, colorimetrischer Assay des Anilinderivats
(5) ist die colorimetrische Bestimmung der Färbung, die
durch Behandlung des Pentacyanoferri-Komplexes mit Peroxid
erzeugt worden ist. Beispiele für geeignete Peroxide sind Natriumperjodat, Kaliumperjodat, Kaliumpermanganat
oder Hydroperoxid; Hydroperoxid wird bevorzugt. Ein stabiles Ferri-Komplexreagens kann in der Weise erhalten
werden, daß man den vorgenannten Cyanoferri-Komplex mit Bicarbonat, wie Natriumbicarbonat, Lithiumbicarbonat
oder Kaliumbicarbonat, und niedermolekularem Dextran vermischt. Das genannte Komplexgemisch ist als
gefriergetrocknetes Pulver stabil und wird als Reagens für einen Reagenssatz für den colorimetrischen Assay
bevorzugt.
Der colorimetrische Assay unter Verwendung des Cyanoferri· Komplexes wird bei einem sauren pH, vorzugsweise bei pH
3 bis 7 und am meisten bevorzugt pH 4 bis 5,5, durchgeführt.
Zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes wird ein herkömmlicher Puffer verwendet. Beispiele für geeignete
Puffer sind 0,01 bis 1 M und vorzugsweise 0,05 bis
5 0,4 M Lactat-, Citrat- oder Oxalat-Puffer.
Das Chromogen, das durch Reaktion des Cyanoferri-Komplexes und des Anilinderivats (5) gebildet wird, hat
eine maximale Absorption ungefähr bei 700 nm mit einem
stabilen Ton. Es ist für die Bestimmung von Peptidase, wie LAP oder γ-GTP, geeignet.
Weiterhin kann eine Bestimmung der Peptidase, z.B.von
LAP oder γ-GTP, durch colorimetrische Bestimmung des Chromogens, das durch Reaktion von Natriumpentacyanoamminoferriat
Na2[Fe(CN)^H2O] und freigesetztem Anilinderivat
(5) gebildet worden ist, durchgeführt werden. Weiterhin kann der Peptidase-Assay colorimetrisch durch
herkömmliche,chemische, colorimetrische Assaymethoden
durchgeführt werden, z.B. durch eine Colorimetrie des aromatischen Amins, wie eine Diazo-Kupplungsmethode,
oder eine Colorimetrie der Schiffsehen Base, die durch
Umsetzung mit der Verbindung der Aldehydreihe gebildet worden ist.
Nachstehend wird der LAP-Assay unter Verwendung der Amidverbindung
(4) näher erläutert.
Das synthetische Substrat für LAP,nämlich das L-Leucyl-3,5-dihalogeno-4-hydroxyanilid,
wird enzymatisch mit LAP in der Probe umgesetzt, um das Anilinderivat (5),
d.h. 3,5-Dihalogeno-4-hydroxyanilin, freizusetzen. Es werden 0,01 bis 5 ml Serum als Probeflüssigkeit verwendet»
und die enzymatische Reaktion wird bei 370C während
5 min durchgeführt. Der optimale pH-Wert der Reak-
tion ist 6,5 Mb 8,0;, und. er wird mit einer Pufferlösung,
z.B. einem Phosphat-, Barbltal-, Borat- oder Trishydroxyaminometh&pr-Puffer,
aufrechterhalten,,
Das so gebildet© Anilind@rivat (5) kann durch colorimetrische
Bestimmung des gebildeten Chromogens durch oxidative Kondensation mit dem Oxidationsmittel, wie
Natriummetaperjodat, in Gegenwart des Kupplers bestimmt
werden. Alternativ kann es colorimetrisch bestimmt werden, indem man ein Farbreagens verwendet 9 das durch
Oxidation von Pentacyanoaiaminoferroat mit einem Oxidationsmittel,
wie Hydroperoxid, gebildet worden ist«, Der colorimetrische Assay kann weiterhin in der Weise durchgeführt
werden, daß man mit Oxidase behandelt, um Sauerstoff
zu verbrauchen und Chromogen freizusetzen, und daß man den verbrauchten Sauerstoff oder das gebildete
Chromogen bestimmt.
Nachstehend werden Ausführungsformen des γ-GTP-Assays
unter Verwendung der Amidverbindung (4) beschrieben.
Das synthetische Substrat für γ-GTP, nämlich γ-L-Glutamyl-3,5-dihalogeno-4-hydroxyanilid,
wird enzymatisch mit γ-GTP in der Probe umgesetzt, um das Anilinderivat
(5) von S-Dihalogeno-^-hydroxyanilin freizusetzen. Die
Probe besteht aus 0,01 bis 5 ml Serumflüssigkeit.
Die enzymatische Reaktion von y-GTP wird 5 min bei 370C
bei einem optimalen pH-Wert von 7,5 bis 9,0 durchgeführt. Die Reaktion kann in einem Puffer mit einem pH
von 7,5 bis 9,0, der Aminosäure oder ein Peptid als Akzeptor, wie Glycylglycin, enthält, durchgeführt werden,
und das Anilinderivat (5), das entsprechend der γ-GTP-Aktivität gebildet worden ist, wird bestimmt.
: : : ·: Γ··:· Γ:.//· 3331538
Beispiele für geeignete Pufferlösungen sind Phosphat-, Barbital-, Borat-, Carbonat-, Triethanolamin-» GIycin-
oder Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer.
Die Bestimmung des Anilinderivats (5) kann in der gleichen Weise wie im Falle der Bestimmung von LAP erfolgen.
Wie oben erläutert, ist der erfindungsgemäße Assay, bei dem die synthetische Substrat-Amidverbindung (4) verwendet
wird, in jeder Reaktionsstufe einfach und somit kann . die Peptidase, wie LAP oder γ-GTP, rasch und genau bestimmt
werden. Da weiterhin das gebildete Chromogen eine maximale Absorption bei 550 bis 750 mn hat, können Beeinträchtigungen
durch Verunreinigungen in der Probeflüssigkeit vermieden werden, und es wird eine genaue
Assaymethode für die Peptidase zur Verfügung gestellt.
Der erfindungsgemäße Assay wird weiterhin mit einer
milden, enzymatischen Reaktionsstufe durchgeführt. Wei-
2Ό terhin kann die LAP oder γ-GTP enzymatisch mit einer
einfachen, einstufigen Reaktion bestimmt werden. Die Methode kann leicht für automatische Systeme angepaßt
werden und es ist eine Assaygeschwindigkeit möglich, die bei herkömmlichen, chemischen Assaymethoden unmög-
25 lieh war.
Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
Leu L-Leucyl
30 γ-GIu γ-L-Glutamyl
BOC t-Butyloxycarbonyl
OSu N-Hydroxysuccinimidester
AcOH Essigsäure
BuOH Butanol.
l Beispiel 1 L-Leucyl-3s5-dichlor-4-hyaroxyanilidOHC1
25 ml einer Lösung von 3928 g (10 mM) BOC~Leu-OSu in
Dioxan wurde, tropfenweise unter Rühren zu 1„78 g (10 mM)
2,6-Dichlor-4»aminophenol und 0,92 g (15 mM) Natriumbicarbonatj,
gelöst in 25 ml Wasser» bei 0 bis 5°C gegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt
und Dicxan im Vakuum bei einer Temperatur unterhalb 30 C
!0 abdestilliert» Der in 200 ml Ethylacetat aufgelöste
Rückstand wurde dreimal mit jeweils 50 ml gesättigter Natriumbicarbonatiösungj Wasserp 1N HCl und gesättigter
NaGl-Lösung gewaschen. Die Ethylacetatschicht wurde
mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum
!5 eingeengt, wodurch 2,96 g BOC-L-Leucyl-S^-dichlor^-
hydroxyanilid erhalten wurden. Das in 15 ml 2N HCl gelöste Produkt wurde bei Raumtemperatur gerührt und
durch Zugabe von 100 ml trockenem Diethylether kristallisiert. Es wurde zweimal mit trockenem Ether dekantiert.
Die Kristalle wurden im Vakuum getrocknet, wodurch L-Leucyl-3»5-dichlor-4-hydroxyanilid.HCl erhalten
wurde.
Ausbeute: 1,89 g (83,656)
Molekularformel: C12H16N2O2Cl2-HCl
25 Fp.: 127 bis 133°C (Zers.) TLC: Rf = 0,63 [BuOH-AcOH-Wasser (4:1:1)]
IR-Spektrum (KBr): Fig. 1.
Beispi.el 2 30 L-Leucyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid.HCl
70 ml einer Lösung von 6,01 g (18,3 mM) BOC-Leu-OSu in
Dioxan wurde tropfenweise bei 0 bis 5°C in 4,90 g (18,8 mM) 2,6-Dibrom-4-aminophenol und 1,68 g (20 mM)
Natriumbicarbonat, gelöst in 20 ml Wasser, gegeben. Das
Geraisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt
und Dioxan bei einer Temperatur unterhalb 300C abdestilliert.
Der Rückstand wurde in 400 ml Ethylacetat gelöst und dreimal mit jeweils 100 ml gesättigter, wäßriger
Natriumbicarbonatlösung, Wasser, 1N HCl und gesättigter
NaCl-Lösung gewaschen. Die Ethylacetatschicht wurde mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und im
Vakuum eingeengt, wodurch 5,8 g BOC-L-Leucyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid
erhalten wurden. Das Produkt wurde in 3,0 ml 2N HCl gelöst und 2 h bei Raumtemperatur gerührt.
Sodann wurde trockener Ether zugesetzt, um das Produkt L-Leucyl-3»5-dibrom-4-hydroxyanilid.HCl auszukristallisieren.
Ausbeute: 2,50 g (49,7%)
15 Molekularformel: ci2Hi6N2°2Br2 (^16»5ZO
TLC. (Silikagel): Rf = 0,65 [n-BuOH:AcOH:¥asser(4:1:1)]
Fp.: 131 bis 134°C (Zers.)
IR-Spektrum (KBr): Fig. 2.
20 Beispiel 5
y-L-Glutamyl-3,5-dichlor-4-hydroxyanilid
5,16 g (20 mM) Ν,Ν-Phthaloyl-L-glutaminsäureanhydrid
und 3,56 g (20 mM) 4-Amino-2,6-dichlorphenol, gelöst in 50 ml Dioxan, wurden 2 h bei 60°C gerührt. Dioxan
wurde im Vakuum abdestilliert und 1,5 ml Hydrazinhydrat in 50 ml Methanol wurden zugesetzt. Das Ganze
wurde dann 2 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Methanol wurde im Vakuum abdestilliert, der Rückstand
mit Wasser versetzt und der pH durch Zugabe von 0,5N HCl auf 3 eingestellt, wodurch 3»96 g γ-L-Glutamyl-3,5-dichlor-4-hydroxyanilid
ausfallen. Ausbeute: 3,96 g (72,990
Molekularformel: C11H12N2O
\/ V
1 Fp.s 214 bis 217°C (Zers.)
TLC (Silikagel): Rf = 0s49 [BuOH-AcOH-H2O (4s1:i)]
IR-Spektrum (KBr): Fig, 3O
5 Beispiel 4
y-L-Glutamyl-3,5-dibrom~4~hydroxyanilid
2,18 g (8,4 mM) Ν,Ν-Phthaloyl-L-glutaminsäureanhydrid
und 2,26 g (8,4 mM) 4-Amino-2g6-dichlorphenol9 gelöst
in 20 ml Dioxan, mirden 1,5h bei 60°C gerührt« Dioxan
wurde im Vakuum abaestilliert9 0,7 ml Hydraüinhydrat
in 20 ml Methanol wurden zu dem Rückstand zugesetzt und das Ganze wurde 2 Tag® bei Raumtemperatur stehengelassen.
Methanol wurde im Vakuum abdestilliert, der Rückstand
mit Wasser versetzt und dar pH durch Zugabe von 0,5N HCl auf 3 eingestellt. Man erhielt 2 »13 g ausgefälltes
Y-L-Glutamyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid. Ausbeute: 2,13 g (64,0%)
Molekularformel: C11H12N2O^Br2
20 Fp.: 191 bis 1940C (Zers.) TLC (Silikagel): Rf = 0,53 [BuOH-AcOH-H2O (4:1:1)]
IR-Spektrum (KBr): Fig. 4.
Beispiel 5
LAP-Assay unter Verwendung von L-Leucyl-4-N,N-diethylaminoanilid,
1-Naphthol-2-sulfonsäure und Laccase
Es wurde eine Substratlösung, enthaltend 0,1 M Phosphatpuffer-Lösung
(pH 7,0) von L-Leucyl-4-N,N-diethylaminoanilid.2HCl (2 mM) und als Kuppler Kalium-1-naphthol-2-sulfonat
(0,5 mM), hergestellt. 100 /ul (330 E) Laccaselösung, erhalten aus Poryporus versicolor
und Serum (LAP: 879 G-R Einheiten/ml, 50/ul), wurden
zu 2,0 ml der Substratlösung zugegeben und das Gemisch wurde bei 370C unter Bildung eines Farbstoffs in-
ι · ■ · ι
kubiert. (Das Absorptionsspektrum des Farbstoffs ist in Fig. 5 dargestellt; das Absorptionsmaximum liegt bei
655 nm.) Bei der Reaktion wurde die Absorption bei .655 nm des gebildeten Farbstoffs zu jedem Zeitpunkt
kontinuierlich gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt.
Fig. 7 zeigt die Ergebnisse, die unter Verwendung von Serum mit 414 G-R Einheiten/ml erhalten wurden.
Wie in den Fig. 6 und 7 gezeigt ist, kann die Serum-LAP-Aktivität
durch den erfindungsgemäßen Assay exakt gemessen werden. Im Gegensatz zu den bekannten, chemischen,
colorimetrischen Verfahren wird das Reaktionsgemisch gleichzeitig mit dem Beginn der LAP-Einwirkung
gefärbt, wodurch die Geschwindigkeit des Assay gesteigert werden kann.
Beispiel 6
LAP-Assay unter Verwendung von L-Leucyl-4-N,N-diethylaminoanilid,
Phenol und Laccase
Es wurde ein Substrat hergestellt, das L-Leucyl-4-N,N-diethylanilid.2HCl
(2 raM) und als Kupper Phenol (1 mM) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) enthielt. 100 /ul
(330 E) Laccaselösung und 50/ul Serum (LAP: 879 G-R Einheiten/ml) wurden zu 2 ml der Substratlösung gegeben
und das Gemisch wurde bei 370C inkubiert, um einen Farbstoff
zu bilden. Bei der Reaktion wurde die Farbe (maximale Absorption bei 670 nm), die zu jedem Zeitpunkt
der Reaktion gebildet worden war, kontinuierlich bei 670 nm gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in
Fig. 8 dargestellt.
Wie in Fig. 8 gezeigt wird, ist der erfindungsgemäße
Assay ein einfacher und exakter Assay zur Bestimmung von LAP. Das Reaktionsgemisch wurde gleichzeitig mit
dem Beginn der LAP-Einwirkung gefärbt, wodurch die Ge-
5 schwindigkeit des Assays erhöht werden kann.
•Die Absorptionskurve des durch den obigen Prozeß gebildeten
Farbstoffs bei jeder Wellenlänge ist in Fig.9 gezeigt, wobei die maximale Absorption bei 670 nm stattfindet.
Beispiel 7
LAP-Assay unter Verwendung von L-Leucyl-4-N,N-diethylaminoanilid,
Kuppler (2,3-Dimethylphenol, 2,4-Dimethylphenol,
2,5-Dimethylphenol und 2,6-Dimethy!phenol) und
Laccase
In Beispiel 5 wurde das 1-Naphthol-2-sulfonat durch 2,3-Dimethylphenol, 2,4-Dimethylphenol, 2,5-Dimethylphenol
oder 2,6-Dimethylphenol ersetzt, wodurch eine
Substratlösung hergestellt wurde, die L-Leucyl-4-N,N-diethylaminoanilid.2HCl
(2 mM) und Kuppler (0,5 mM) in
0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) enthielt. 100/ul (330 E)
laccaselösung und 50/ul Serum (LAP:879 G-R E/ml) wurden
zu 2 ml der Substratlösung gegeben und das Gemisch wurde bei 370C inkubiert. Nach 10 min wurde die Absorption,
des gebildeten Farbstoffs bei seiner maximalen Absorptionswellenlänge gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse
sind in Tabelle 1 zusammengestellt.
35
Tabelle 1
Kuppler |
Maximale Ab
sorption· nm |
Optische Dichte |
2,3-Diraethylphenol
2,4- «
2,5- "
2,6- " |
630
630
650
630 |
0,168
0,187
0,231
0,193 |
Beispiel 8 |
|
|
LAP-Assay unter Verwendung von L-Leucyl-4-N,N-diethyl
aminoanilin, Kuppler (i-Naphthol-2-sulfonat, Phenol,
2,3-Dimethylphenol, 2,4-Dimethylphenol, 2,5-DimethyI-phenol
oder 2,6-Dimethylphenol) und Ascorbat-Oxidase
Es wurde eine Substratlösung hergestellt, die L-Leucyl-4-N,N-diethylaminoanilin.2HCl
(2 mM) und Kuppler (Kallum-i-naphthol-2-sulfonat, Phenol, 2,3-Dimethylphenol,
2,4-Dimethylphenol, 2,5-Dimethylphenol oder
2,6-Dimethylphenol) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0)
20 enthielt. Ascorbat-Oxidase, erhalten aus 100/ul
(130 E) Chaywurzel(Sechium edule)-Lösung und 50/Ul
Serum (LAP: 879 G-R E/ml), wurde zugegeben und bei 370C
inkubiert. Nach 10 min wurde die Absorption des gebildeten Farbstoffs bei seiner maximalen Absorptionswellen·
länge gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.
:„: .:. \.: ::: ;..:\.: ooo iooo
36
1
Tabelle 2
Kuppler Maximale Ab- Optische Dichte
sorption,, nm (OD)
1-Naphthol-2-sulfonat 655 0,411
5 Phenol 670 0,347
2,3-Dimethylphenol 630 t 0,356
2.4- « 630 0,267
2.5- " 650 0,222
2.6- » 630 0,427 10 " ~~
Beispiel 9
LAP-Assay unter Verwendung von L-Leucyl-4-N,N-dimethyl-
aminoanilid, 1-Naphthol-2-sulfonat und Laccase
In Beispiel 5 wurde das L-Leucyl^-NjN-diethylaminoanilid.2HCl
durch L-Leucyl-4-N,N-dimethylaminoanilid.2HCl ersetzt und Serum (LAP: 879 G-R E/ml) wurde zugesetzt.
Ansonsten wurde gemäß Beispiel 5 verfahren.
Die maximale Absorption des gebildeten Farbstoffs lag bei 650 nm. Das Absorptionsverhältnis zu jedem Zeitpunkt
der Reaktion wurde bei 650 nm gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 10 zusammengestellt.
Wie in Fig. 10 gezeigt wird, kann die LAP-Aktivität durch das erfindungsgemäße Verfahren bestimmt werden.
B e 1 s pi e 1 10
LAP-Assay unter Verwendung von L-Leucyl-4-N,N-dimethylaminoanilid,
Phenol und Laccase
In Beispiel 6 wurde das L-Leucyl-4-N,N-diethylaminoanilid.2HCl
durch L-Leucyl^-NjN-dimethylaminoanilid.2HCl
ersetzt und ansonsten wurde gemäß Beispiel 6 verfahren. Die maximale Absorptionswellenlänge des ge-
bildeten Farbstoffs war bei 655 mn. Das Absorptionsverhältnis
zu jedem Zeitpunkt der Reaktion ist in Fig. angegeben. Wie in Fig. 11 gezeigt wird, ist der erfindungsgemäße
LAP-Assay ausgezeichnet.
Beispiel 11
LAP-Assay unter Verwendung von L-Leucyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid,
1-Naphthol-2-sulfonat und Ascorbat-Oxidase
Es wurde eine Substratlösung hergestellt, die L-Leucyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid.HCl
(2 mM) und Kalium-1-naphthol-2-sulfonat
(0,5 mM) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) enthielt. 20/ul einer Lösung, enthaltend
Ascorbat-Oxidase (130 E) und Arylamidase (Boehringer, 1000 G-R E/ml), wurden zu 2 ml der Substratlösung gegeben
und das Gemisch wurde bei 370C inkubiert. Zu jedem
Zeitpunkt der Reaktion wurde die Absorption des gebildeten Farbstoffs bei 630 nm gemessen. Die erhaltenen
Ergebnisse sind in Fig. 12 dargestellt. Aus Fig. 12 wird
20 ersichtlich, daß der erfindungsgemäße Assay
einen ausgezeichneten LAP-Assay darstellt und daß die
Durchführung eines Hochgeschwindigkeits-Assays ermöglicht wird aufgrund der gleichzeitigen Färbung beim Beginn
der LAP-Reaktion. Die Absorptionskurve des Farb-
25 Stoffs ist in Fig. 13 gezeigt.
Beispiel 12
LAP-Assay unter Verwendung von L-Leucyl-3»5-dibrom-4-hydroxyanilid,
i-Naphthol-2-sulfonat, Ascorbat-Oxidase
oder Laccase
1,0 ml einer gemäß Beispiel 11 hergestellten Substratlösung
wurde in eine Reaktionszelle (Innenvolumen = 1 ml), die mit einer Sauerstoffelektrode versehen und
auf 37°C vorgewärmt worden war, gegeben. 100/ul einer
Lösung, enthaltend Ascorbat-Oxidase (350 E) und Arylamidase
(1000 G-R E/ml), wurden zugesetzt und das Gemisch wurde bei 37°C inkubiert«, Die Menge an verbrauehtem
Sauerstoff zu jedem Zeitpunkt wurde durch die Sauerstoffelektrode
gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 14 aufgeführt. Die Ergebnisse zeigen, daß der
Asssay vorteilhafterweise unter Verwendung der Sauerstoff elektrode durchgeführt werden kann.
Beim gleichen Versuch wurde die Ascorbat-Oxidase durch Laccase (250 E) ersetzt. Auch hier wurden ausgezeich-?
nete Ergebnisse erhalten8 wie aus Figo 15 ersichtlich
ist.
15 Beispiel 15
LAP-Assay unter Verwendung von L-Leucyl-3,5~dibrom-4-hydroxyanilid,
Kuppler (Phenol, 2,5-Dimethy!phenol) und Laccase
In Beispiel 11 wurde 1-Naphthol-2-sulfonat durch Phenol
oder 2,5-Dimethylphenol (0,5 mM) zur Herstellung einer
Substratlösung ersetzt. 20/ul einer Lösung, enthaltend
Laccase (330 E) und Arylamidase (1000 G-R E/ml) ,wurden
zu 2 ml der Substratlösung zugesetzt und das Gemisch wurde 10 min bei 37°C inkubiert. Das Absorptionsverhältnis
des gebildeten Farbstoffs wurde bei der maximalen Absorptionswellenlänge gemessen. Die erhaltenen
Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt.
30 Tabelle 3
Kuppler Maximale Absorp- Optische
tionswellenlänge, Dichte (mn) (OD)
Phenol 610 0,160
2,5-Dimethylphenol 585 0,452
l Beispiel 14
LAP-Assay unter Verwendung von L-Leucyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid,
Phenol und Tyrosinase
Es wurde eine Substratlösung hergestellt, die L-Leucyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid.HCl
(2,5 mM) und Phenol (0,5mM) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) enthielt.
100/Ul (300 E) Tyrosinaselösung und Arylamidase (1000 G-R E/ml), 20/Ul) wurden in 2 ml der Substrat-ο
lösung gegeben und das Gemisch wurde 10 min bei 37 C inkubiert. Das Absorptionsverhältnis des gebildeten
Farbstoffs wurde bei der maximalen Absorptionswellenlänge von 610 nm gemessen (ODg1Q ~ °»158). Die LAP
kann mit guten Ergebnissen bestimmt werden. = .
Beispiel 15
LAP-Assay unter Verwendung von L-Leucyl-2-methyl-4-aminoanilid, 1-Naphthol-2-sulfonat und Laccase
Es wurde eine Substratlösung hergestellt, die L-Leucyl-2-methyl-4-aminoanilid.2HCl
(2 mM) und Kalium-1-naphthol-2-sulf onat (0,5 mM) in Phosphatpuffer (pH 7,0) enthielt.
100/Ul (330 E) Laccaselösung und 50yul Arylamidaselösung
(1000 G-R E/ml) wurden zu 2 ml der Substratlösung gegeben und das Gemisch wurde 30 min bei 37°C inkubiert.
Das Absorptionsverhältnis des gebildeten Farbstoffs j wurde bei der maximalen Absorptionswellenlänge von
565 nm gemessen (01Wk = 0,143).
30 Beispiel 16
LAP-Assay unter Verwendung von L-Leucyl-4-aminoanilid,
1-Naphthol-2-sulfonat und Laccase
Es wurde eine Substratlösung hergestellt, die L-Leucyl-4-aminoanilid.2HCl
(295 mM) und Kalium-1-naphthol-
2-sulfonat (0,5 mM) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0)
enthielt. 100 /Ul (330 E) Laccaselösung und 50 /ul Arylamidaselösung
(1000 G.-JR E/ml) wurden zu 2 ml der Substratlösung
gegeben und das Gemisch wurde 30 min bei 37°C inkubiert. Das Absorptionsverhältnis des gebildeten
Farbstoffs wurde bei der maximalen Absorptions-* wellenlänge von 565 mn gemessen (OD^ri- = 0,143).
:' i ■
Beispiel 17
LAP-Assay.unter Verwendung von L-Leucyl-4-N,N-dipropylahilid,
1-Naphthol^-sulfonsäure und Laccase
Es wurde eine Substratlösung hergestellt, die L-Leucyl-4-N,N-dipropylaminoanilid.2HCl
(2 mM) und Kalium-pnaphthol-2-sulfonat (0,5 mM) in 0,1 M Phosphatpuffer
(pH 7,0) enthielt. 100/Ul (330 E) Laccaselösung und 5OyUl Arylamidaselösung (1000 G-R E/ml) wurden zu 2 ml
Substratlösung zugesetzt und das Gemisch wurde 10 min bei 37°C inkubiert. Das Absorptionsverhältnis des gebildeten
Farbstoffs wurde bei der maximalen Absorptions wellenlänge von 650 nm gemessen (Ο^βκη = 0,430).
Beispiel 18
LAP-Assay unter Verwendung von L-Leucyl-3»5-dichlor-4-hydroxyanilid,
1-Naphthol-2-sulfonat oder Phenol und Laccase
• Es wurde eine Substratlösung hergestellt, die L-Leucyl-3,5-dichlor-4-hydroxyanilid.HCl
(2 mM) und Kalium-1-naphthol-2-sulfonat
(0,5 mM) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) enthielt. 100 /ul Laccaselösung (330 E) und
20/ul Arylamidaselösung (1000 G-R E/ml) wurden zu 2 ml Substratlösung zugesetzt und das Gemisch wurde 10 min
bei 370C inkubiert. Das Absorptionsverhältnis des ge-
35 bildeten Farbstoffs wurde bei 630 nm bestimmt 0,535).
Das obige 1-Naphthol-2-sulfonat wurde durch 0,5 mM Phenol
ersetzt und der gebildete Farbstoff bei 610 nm gemessen
(ODg10 =0,111).
5 Beispiel 19
LAP-Assay unter Verwendung von L-Leucyl-4-N-ethyl-N-hydroxyethylaminoanilid,
2,6-Dibromphenol und Laccase
100/ul Laccaselösung (330 E) und 20/ul Arylamidaselösung
(1000 G-R E/ml) wurden zu 2 ml Substratlösung
gegeben, die L-Leucyl-4-N-ethyl-N-hydroxyethylaminoanilid.2HCl
(2 mM) und 2,6-Dibromphenol (0,5 mM) in
0,1 M Phosphatpuffer (pH 7|0) enthielt. Das Ganze wurde 5 min bei 370C inkubiert. Das Absorptionsverhältnis des
gebildeten Farbstoffs wurde bei 705 nm gemessen (Wjqcj
1,47).
Beispiel 20
LAP-Assay unter Verwendung von L-Leucylanilid, 5»5-Dibrom-4-hydroxyanilin
und Laccase
■i In Beispiel 19 wurde das L-Leucyl-4-N-ethyl-N-hydroxyethylaminoanilid.2HCl
durch L-Leucylanilid.HCl (2 mM) ersetzt. Das Absorptionsverhältnis des gebildeten Farb-Stoffs,
wurde bei der maximalen Absorptionswellenlänge bei 655 nm gemessen (0^gKK =0,178).
Beispiel 21
LAP-Assay unter Verwendung von L-Leucyl-2-ethylanilid, 3,5-Dibrom-4-hydroxyanilin und Laccase
In Beispiel 19 wurde das L-Leucyl-4-N-ethyl-N-hydroxyethylaminoanilid.2HCl
durch L-Leucyl-2-ethylanilid.HCl (2 mM) ersetzte Das Absorptionsverhältnis des gebildeten
Farbstoffs wurde bei der maximalen Absorptionswellenlänge bei 675 nm gemessen (QDg,-,,- = 0,428).
1 Beispiel 22
LAP-Assay unter Verwendung von L-Leucyl-2-carboxyanilid,
3,5-Dibrom-4-hydroxyanilin oder 4-N,N=Diethylaminoanilin
und Laccase
100/ul Laccaselösung (33° S) und 50/ul Arylamidaselösung
(1000 G-R E/ml) wurden zu der Substratlösung mit einen Gehalt an L-Leucyl-2-capboxyanilidoHCl (2 mM) und 3,5-Dibrom-4-hydroxyanilin
(O95 mM) in 0s1 M Phosphatpuffer
(pH 7,0) gegeben und das Gemisch wurde Ί0 min bei 37°C
inkubiert. Das Absorptionsverhältnis des gebildeten Farbstoffs wurde bei der maximalen Absorptionswellenlänge
von 645 nm gemessen (QDg^j- = 0?397).
In dem obigen Beispiel wurde 3,5-Dibrom-4-hydroxyanilin
durch 4-N,N-Diethylaminoanilin.2HCl (0,5 mM) ersetzt.
Das Absorptionsverhältnis des gebildeten Farbstoffs
wurde bei der maximalen Absorptionswellenlänge von 690 nm gemessen (Od5qo - Of613)·
20 . .
B- e i sp i e 1 23
LAP-Assäy unter Verwendung verschiedener synthetischer
Substrate, Kuppler und Laccase
25 ". Synthetisches Substrat für den LAP-Assay:
(A) L-Leucyl-3»5-dibrom-4-hydroxyanilid.HCl
(b) L-Leucyl-4-NrN-diethylaminoanilid.2HCl oder
(C) L-Leucyl^-N.N-dimethylaminoanilid^HCl.
30 Kuppler:
(1) N-Ethyl-N-hydroxyethylanilin
(2) 2,6-Dibromphenol
(3) 2,4-Dichlorphenol
(4) 2,6-Dimethoxyphenol
35 (5) Anilin
(6) m-Toluidin
(7) Anthranilsäure
(8) m-Methylphenol
(9) o-Carboxymethylphenol
(10) N-Ethyl-N-hydroxyethyl-m-toluidin
(11) N,N-Dimethyl-m~toluidin
(12) o-Ethylanilin
(13) tt-Naphthol
(14) N,N-Dimethylanilin
(15) N,N-Diethylanilin (.16) o-Chlorphenol
(17) m-Chlorphenol
(18) m-Ethy!phenol
(19) o-Methoxyphenol
(20) 4-Chlor-m-phenylendiamin
(21) 2-Methyl-6-chlorphenol
(22) 2-Chlor-5-methy!phenol
(23) 4-Chlor-1-naphthol
(24) i-Naphthol-2-carbonsäure.
20
Es wurde eine Substratlösung hergestellt, die synthetisches
Substrat (2 mM) und Kuppler (0,5 mM) in 0,1 M
Phosphatpuffer (pH 7,0) enthielt. 100/ul Laccaselösung
(330 E) und 50/ul Arylamidaselösung (1000 G-R E/ml) wurden zu 2 ml Substratlösung zugesetzt und das Ganze
wurde 10 min bei 370C inkubiert. Das Absorptionsverhältnis
des gebildeten Farbstoffs wurde bei der maximalen
Absorptionswellenlänge gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt.
Tabelle 4
Kuppler Synthetisches Substrat für IAP
(1) OD705 = 3,712 OD730 =1,849
(Ε) OD670 =1,031 OD705 = 0,187 OD700= 0,168
(3) OD660 = 0,508 OD695 = 0,259
0D580 = °'567 OD635 = °'157
(5)
(6)
(7)
(8)
(9)
(10)
(11)
(12)
(13)
(14)
(15)
(16)
(17)
(18)
(19)
(20)
(21)
(22)
(23)
(24)
OD
655
OD
675
OD
645
OD
600
OD
590
OD
715
OD
675
OD
575
OD
700
OD
705
OD
650
OD
650
OD
605
OD
590
OD
630
OD
610
OD
635
OD
580
0.45
0.396
0.401
0.495
0.693
0.421
1.08
0.338
0.261
0.536
0.698
0.495
0.338
0.468
0.842
0.63
0.567
0.356
0.419
OD
690
OD
710
OD
690
OD
665
OD
650
OD
745
OD
740
OD
700
OD
640
OD
730
OD
730
OD
690
0.301 |
OD690 |
- 0 |
.271 |
0.260 |
OD700 |
= 0 |
,234 |
0.24 4 |
OD690 |
= 0 |
.219 |
0.201 |
|
|
|
0.329 |
|
|
|
3.79 |
|
|
|
3.54 |
|
|
|
2.05 |
|
|
|
0.157 |
|
|
|
1.01 |
OD725 |
= 0 |
.907 |
1.22 |
|
|
|
0.449 |
OD680 |
= 0 |
.404 |
|
OD685 |
=0. |
203 |
OD640 = °·05
Beispiel
γ-GTP-Assay unter Verwendung von y-L-Glutamyl-4-N,N-diethylaminoanilid,
1-Naphthol-2-sulfonat und Laccase
Es wurde eine Substratlösung hergestellt, die γ-L-35 Glutamyl-4-NfN-diethylaminoanilid (5 ioM), Glycy!glycin
(100 mM) und Kalium-i-naphthol-2-sulfonat (0,5 mM) in
50 mM Phosphatpuffer (pH 8,0) enthielt. 100/ul Laccase
(1000 E/ml) und 50/ul Serum (γ-GTP = 416 mE/ml) wurden
zu 2 ml Substratlösung gegeben und das Ganze wurde bei 370C inkubiert. Das Absorptionsverhaltnis des gebildeten
Farbstoffs wurde zu jedem Zeitpunkt der Reaktion bei 655 mn gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in
Fig. 16 dargestellt. Serum (γ-GTP =105 mE/ml) wurde gemessen und die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 17
gezeigt. Aus den Fig. 16 und 17 wird ersichtlich, daß
die γ-GTP-Aktivität durch das erfindungsgemäße Verfahren
in ausgezeichneter Weise bestimmt werden kann. Das Reaktionsgemisch wird gleichzeitig mit Beginn der γ-GTP-Einwirkung
gefärbt, so daß eine Hochgeschwindigkeitsbestimmungermöglicht wird. Die Absorptionskurve des
gebildeten Farbstoffs ist in Fig. 18 gezeigt.
B e i sp i e 1 25
γ-GTP-Assay unter Verwendung von y-L-Glutamyl-4-NfN-diethylaminoanilid,
1-Naphthol-2-sulfonat und Laccase
" * 1 ml der Substratlösung des Beispiels 24 wurde in eine
j Reaktionszelle (Innenvolumen 1 ml), die mit einer Sauer- \ stoffelektrode versehen und auf 37°C vorgewärmt worden
j war, eingegeben. Hierzu wurden 100/ul einer Lösung
: mit einem Gehalt an Laccase (200 E; und Serum (γ-GTP =
j 416 mE/ml) gegeben. Dann wurde das Gemisch bei 370C
inkubiert. Die Menge an verbrauchtem Sauerstoff wurde durch die Sauerstoffelektrode gemessen. Die Rate an
verbrauchtem Sauerstoff ist in Fig. 19 dargestellt. Die Figur zeigt, daß die γ-GTP-Aktivität mit Vorteil
gemessen werden kann.
1 Beispiel 26
γ-GTP-Assay unter Verwendung von y-=L~Glutamyl=4-N,N-diethylaminoanilid,
1-Napiithol-2=sulfonat und Ascorbat-Oxidase
2 ml einer Substratlösung wurden gemäß Beispiel 24 hergestellt. 100/ul Ascorbat-Oxidase (100 E) und 50/ul
Serum (γ-GTP = 416 mE/ml) wurden zugegeben und das Gemisch wurde 5 min bzw. 10 min bei 370C inkubiert. Das
Absorptionsverhältnis des gebildeten Farbstoffs wurde zu jedem Zeitpunkt der Reaktion bei 655 mn (maximale
Absorptionswellenlänge) gemessen« Die optische Dichte bei 655 nm nach 5minütig@r Umsetzung beträgt ODg5-C =
0,949 und nach lOminütiger Umsetzung ODg55 = 19895.
Beispiel 27
γ-GTP-Assay unter Verwendung von y-L-Glutamyl-3f5-dichlor-4-hydroxyanilid,
1-Naphthol-2-sulfonat und Laccase oder Tyrosinase
Es wurde eine Substratlösung hergestellt, die γ-L-Glutamyl-3,5-dichlor-4-hydroxyanilid
(5 mM), Glycylglycin (100 mM) und Kalium-i-naphthol-2-sulfonat
(0,5 mM) in 50 mM Boratpuffer (pH 7,1) enthielt. 100 /ul
25 Laccaselösung (100 E) und 50/ul Serum (γ-GTP =
416 mE/ml) wurden zu 2 ml Substratlösung zugegeben.
Das Gemisch wurde 10 min bei 370C inkubiert. Das Absorptionsverhältnis des gebildeten Farbstoffs wurde bei
630 nm (maximale Absorptionswellenlänge) gemessen
30 (OD630 = 1,044).
In dem obigen Beispiel wurde Laccase durch 100 / Tyrosinaselösung (IOO E) ersetzt und ansonsten auf glei
che Weise verfahren. Das Ergebnis betrug O 1,042.
Beispiel 28
γ-GTP-Assay unter Verwendung verschiedener, synthetischer Substrate für γ-GTP, Kuppler und Ascorbat-Oxidase
Synthetisches Substrat:
(A) y-L-Glutamyl-4-N,N-diethylaminoanilid
(B) γ-Ι^ΰ1υΪΒπ^1-4,Ν,Ν-ά1πιβΐ1^1βΐη1ηοβηί11α
(G) y-L-Glutamyl-4,NfN-dipropylaminoanilid
(D) y-L-Glutamyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid.
'
Kuppler:
(1) Kalium-1-naphthol-2-sulfonat
(2) 2,5-Dimethy!phenol
(3) 2,6-Dibromphenol
(4) 2,6-Dimethoxyphenol ·
(5) N,N-Diethylanilin
(6) N-Ethyl-N-hydroxyethylanilin
(7) Ν,Ν-Dimethyl-m-toluidin
(8) o-Ethylanilin (9) m-Chlorphenol
(10) ο-Methylphenol (11.) o-Metho3cyphenol
(12) a-Naphthol
(13) Phenol.
25
Es wurde eine Substratlösung hergestellt, die Substrat
(5 mM)f Glycylglycin (100 mM) und Kuppler (0,5 mM) in
50 mM Boratpuffer (pH 8,0) enthielt. 100 /ul Ascorbat-Oxidase-Lösung
(100 E) und 50/ul Serum (γ-GTP =
30 416 mE/ml) wurden zu 2 ml Substratlösung gegeben und
das Gemisch wurde 5 min bei 37°C inkubiert. Das Absorptionsverhältnis des gebildeten Farbstoffs wurde bei
der maximalen Absorptionswellenlänge gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt.
ω ο
to
fco
O
CJl
cn
Tabelle 5
Kuppler
Synthetisches Substrat
|
(A) |
0.368
|
(B) |
= 0 |
.978
|
(C) |
0.902 |
(D) |
= 0.803
|
(1) |
|
0,313
|
OD650 |
|
|
OD650 " |
|
OD630
|
= 0.645
|
(2) |
|
1.362
|
|
= 0 |
.379 |
|
|
OD585 |
= 1.120 |
(3> |
OD705 = |
1.627
|
OD700 |
= 0 |
.322 |
|
|
OD670 |
= 0.511 |
(4) |
OD635 = |
2.426
|
OD595 |
1 |
.404
|
|
|
OD580
|
|
(5) |
OD730
e
|
1.871
|
OD725 |
|
|
|
|
|
= 1.907 |
(6) |
OD730 = |
0.453 |
|
|
|
|
|
OD705 |
|
(7) |
OD740 = |
0.331 |
|
|
|
|
|
|
= 0.826 |
(8) |
OD700
=
|
|
|
|
|
|
|
OD675 |
= 0.495 |
(9) |
Ot)695 = |
0.297 |
|
|
|
|
|
OD655 |
= 0.622 |
(10) |
OD650 = |
|
|
|
|
|
|
OD590 |
= 0.605 |
(11) |
|
|
|
|
|
|
OD590 |
|
(12) |
OD64 0 = |
|
= 0 |
.562 |
|
|
|
= 0.717 |
(13) |
|
OD655 |
|
|
OD610 |
|
|
|
|
|
|
49
l Beispiel 29
LAP-Assay unter Verwendung von L-Leucyl-3,5-dichlor-4-hydroxyanilid
und Natriumperjodat/p-Xylenol
Es wurde eine Substratlösung hergestellt, die L-Leucyl-3,5-dichlor-4-hydroxyanilid.HCl
(5 mM), gelöst in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0), enthielt. Von einem Patienten erhaltene Serumproben (20 /ul, LAP = 236 G-R Einheiten)
wurden zu 1 ml der Substratlösung zugesetzt. Das Gemisch wird gut vermischt und 20 min bei 370C inkubiert. 3 ml
einer Lösung eines Oxidationsmittels, enthaltend Natriummetaperjodat
(2 mM) und p-Xylenol (10 mM) in 0,2N KOH, zur Entwicklung einer Färbung zugesetzt. Das Absorptionsverhältnis des gebildeten Farbstoffs wurde bei 585 nm
15 gemessen, wobei OD1-oc = 0,18 erhalten wurde.
Beispiel 30
LAP-Assay unter Verwendung von L-Leucyl-3,5-dibrom-4-
hydroxyanilid und Natriummetaperjodat - p-Xylenol
Es wurde eine Substratlösung hergestellt, die L-Leucyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid.HCl
(5 mM), gelöst in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0), enthielt. Eine von einem Patienten
erhaltene Serumprobe (20/Ul, LAP = 250 G-R Einheiten)
wurde zu 1 ml der Substratlösung zugesetzt. Das Ganze wurde gut vermischt und 20 min bei 37°C inkubiert.
3 ml einer Lösung eines Oxidationsmittels mit einem Gehalt an Natriummetaperjodat (2 mM) und p-Xylenol (10 mM)
in 0,2N KOH wurden zur Farbentwicklung zugesetzt. Das Absorptionsverhältnis der Farbe wurde bei 585 nm gemessen
(°D535 = 0,18).
Beispiel 31
γ-GTP-Assay unter Verwendung von y-L-Glutamyl-3,5-dichlor-4-hydroxyanilid
und Natriummetaperjodat - p-Xylenol
1 Es wurde eine Substratlösung hergestellt, die γ-L-
Glutamyl-3,5-dichlor-4-hydroxyanilid (5 mM) und Glycylglycin
(5 mM) in 5 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) enthielt. 10/Ul einer Serumprobe (γ-GTP = 130 mE/ml) vrarden zu
0,5 ml der Substratlösung zugesetzt. Das Ganze wurde
gut vermischt und 20 min bei 37°C inkubiert. 2 ml einer Oxidationsmittel-Lösung, enthaltend Natriummetaperjodat
(2 mM) und p-Xylenol (10 mM) in 0,2N KOH,. wurden zur
Farbentwicklung zugesetzt. Das Absorptionsverhältnis wur !0 de bei 585 nm gemessen (ODcgc =0,112).
Beispiel 32
γ-GTP-Assay unter Verwendung von γ-L-Glutamy1-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid
und Natriummetaperjodat - p-Xylenol
Es wurde eine Substratlösung hergestellt, die γ-L-Glutamyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid
(5 mM) und Glycylglycin (100 mM), gelöst in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0),enthielt. 10/ul einer Patienten-Serumprobe
(γ-GTP =130 mE/ml) wurden zu 0,5 ml der Substratlösung : zugesetzt, und man inkubierte 20 min bei 370C 2 ml
einer Oxidationsmittel-Lösung, enthaltend Natriummetaperjodat
(2 mM) und p-Xylenol (10 mM) in 0,2N ROH,wurden zur Farbentwicklung zugesetzt. Das Absorptionsverhältnis
25 wurde bei 585 nm gemessen (0D,-gc = 0,140).
Beispiel 33
LAP-Assay unter Verwendung von L-Leucyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid
und Natriummetaperjodat - 2-Chlor-5-methylphenol
Es wurde eine Substratlösung hergestellt, die L-Leucyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid.HCl
(5 mM), gelöst in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0), enthielt. 20/ul einer Patienten-Serumprobe
(LAP = 250 G-R Einheiten) wurden zu 1 ml
der Substratlösung zugegeben, und man inkubierte 20 min bei 370C. 3 ml Oxidationsmittel-Lösung, enthaltend
NatriuiniEetaperjodat (2 mM) und 2-Chlor-5-methylphenol
(5 mm) in 0,2N KOH, wurden zur Farbentwicklung zugesetzt.
Das AbsorptionsverhältniB der Farbe wurde bei 635 mn gemessen
(0Ε>555 = 0,33). ·
Beispiel 34
γ-GTP-Assay unter Verwendung von y-L-Glutamyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid,
Natriummetaperjodat - 2-Chlor-5-methylphenol
Es wurde eine Substratlösung hergestellt, die γ-L-Glutamyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid
(5 mM) und Glycylglycin (100 mM), gelöst in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH
8,0), enthielt. 10/ul einer Serumprobe (γ-GTP =
130 mE/ml) eines Patienten wurden zu 0,5 ml der Substratlösung gegeben, und man inkubierte 20 min bei 370C.
2 ml einer Oxidationsmittel-Lösung, enthaltend Natriummetaperjodat
(2 mM) und 2-Chlor-5-methylphenol (5 mM) in 0,2N KOH, wurden zur Farbentwicklung zugegeben. Das
Absorptionsverhältnis wurde bei 635 nm gemessen (0D535 =
0,214).
25 Beispiel 35
LAP^Assay unter Verwendung von L-Leucy1-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid
und Natriumpentacyanoamminoferrat
60 ml O.,396iges Hydroperoxid wurden zu 2 g Natriumpentacyanoamminoferroat,
gelöst in 20 ml Wasser, gegeben.
Weiterhin wurden 20 ml einer 1Oftigen Natriumbicarbonatlösung
zugesetzt. 4 g Dextran T-10 (Pharmacia) wurden zugegeben, um eine unverdünnte Farbentwickler-Lösung
herzustellenο Eine unverdünnte Lösung zum Abbruch der
Reaktion und zur Entwicklung der Farbe wurde hergestellt,
indem 50 ml 0,2 M Citratpuffer (pH 4,5), enthaltend Λ%
NaCl und O,5$6 Tween 80,zu 1 ml der unverdünnten Farbentwickler
lösung gegeben wurden.
20/ul einer Serumprobe (LAP = 250 G-R Einheiten) eines
Patienten wurde zu L-Leucyl-3,5-dibrom-4-hydroxyani-•lid.HCl
(5 mM), gelöst in 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0), gegeben und damit gut vermischt. Das Gemisch
wurde 20 min bei 370C inkubiert. 5ml der Lösung zum Abbruch
der Reaktion und zur Farbentwicklung wurden zugesetzt und das Gemisch wurde 20 min bei Raumtemperatur
stehengelassen, um eine Färbung zu entwickeln. Das Absorptionsverhältnis
bei 700 nm wurde gemessen 0,21).
Beispiel 56
γ-GTP-Assay unter Verwendung von γ-L-Glutamy1-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid
und Natriumpentacyanoamminoferrat
20/Ul einer Serumprobe (γ-GTP = 130 mE/ml) eines Patienten
wurden zu 1 ml einer Lösung, welche . γ-L-Glutamyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid
(5mM) und Glycylglycin (100 mM) in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) enthielt,
gegeben. Es wurde gut durchgemischt und das Gemisch wurde
20 min bei 370C inkubiert. Gemäß Beispiel 35 wurde
die Reaktion abgebrochen und die Farbentwicklung durchgeführt. Es wurde ein Absorptionsverhältnis von ODy00 =
0,132 ermittelt.
30
Beispiel 37
LAP-Assay unter Verwendung von L-Leucyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid
und Natriumpentacyanoamminoferrat
Es wurde eine Substratlösung hergestellt, die L-Leucyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid.HCl
(5 mM), gelöst in 0,1 M
Phosphatpuffer (pH 7,0), enthielt. 20/ul einer Serumprobe (LAP = 250 G-R Einheiten) eines Patienten wurden
zu 1 ml der Substratlösung zugesetzt. Das Ganze wurde
gut durchgemischt und 15 min bei 370C inkubiert. 4 ml
einer Lösung, hergestellt durch Zugabe von 90 ml 0,2 K EDTA-2Na-Lösung (pH 11) zu 30 ml 1%iger Natriumpentacyanoamminoferratlösung,
wurden zugesetzt und das Gemisch wurde 15 min bei 37°C inkubiert. Das Absorptionsverhält
nis wurde bei 730 nm gemessen (OD7^0 = 0,232).
1?6ige Natriumpentacyanoamminoferratlösung wurde hergestellt,
indem eine Lösung von Λ% Natriumnitroprussid
Na[Fe(CN)5NO]-1% Natriumcarbonat 15 min mit UV-Licht bestrahlt
wurde.
15
Beispiel 38
Standardkurve für γ-GTP unter Verwendung von γ-L-Glutamyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid
Es wurde eine Substratlösung hergestellt, die Hydroxyanilid
(5 mM) und Glycylglycin (100 mM) in 50 mM Tris-HCl-Puffer
(pH 8,0) enthielt. 10/ul Serum (γ-GTP = 7k
bis 370 mE/ml) wurden zu 0,5 ml der Substratlösung gegeben
und es wurde gut durchgemischt. Das Gemisch wurde 20 min bei 37°C inkubiert. Die Lösung eines Oxidationsmittels,
enthaltend Natriummetaperjodat (2 mM) und p-Xylenol (10 mM) in 0,2N KOH, wurde zugesetzt, um eine
Färbe zu entwickeln. Das Absorptionsverhältnis der gebildeten
Farbe wurde bei 585 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 20 zusammengestellt. Daraus wird
ersichtlich, daß die Serum γ-GTP mit Vorteil gemessen werden kann.
l Beispiel 59
LAP-Assay unter Verwendung von L»Leucyl-3s,5-dichlor-4-hydroxyanilid
oder L-Leucyl~3,5-dibrom-4-hydroxyanilid,
2,5-Dimethylphenol und Ascorbat-Oxidase
5
Es "wurde eine Substratlösung hergestellt, die L-Leucyl-3,5-dichlor-4-hydroxyanilid.HCl
(2 mM) oder L-Leucyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid.HCl
(2 mM) und 2„5 Dimethylphenol (2 ml·!) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) enthielt.
Ascorbat-Oxidase (130 E) und 20/ul einer Serumprobe
(LAP =1113 G-R E/ml) eines Patienten wurden zu 2 ml der Substratlösung gegeben. Das Gemisch wurde 10 min
bei 370C inkubiert. Das Absorptionsverhältnis wurde
bei der maximalen Absorptionswellenlänge gemessen. Es
15 wurden folgende Ergebnisse erhalten!
L-Leucyl-3,5-dichlor-4-hydroxyanilid:
20 Beispiel 40
LAP-Assay unter Verwendung von L-Leucyl-3,5-dichlor-4-hydroxyanilid,
2,5-Dimethylphenol und Laccase
Es wurde eine Substratlösung hergestellt, die L-Leucyl
3,5-dichlor-4-hydroxyanilid.HCl (2 mM) und 2,5-Dimethylphenol (2 mM) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0)
enthielt. 20/ul einer Laccase (330 E) und Arylamidase
(1000 G-R E/ml) enthaltenden Lösung wurden zu 2 ml der Substratlösung zugesetzt. Das Gemisch wurde 10 min
bei 370C inkubiert. Das Absorptionsverhältnis bei
585 nm betrug ODc35 = 0,386.
1 Bei spiel 41
γ-GTP-Assay unter Verwendung von y-L-Glutamyl-3,5-dichlor-4-hydroxyanilid,
2,5-Dimethylphenol und Ascorbat-Qxidase
Es wurde eine Substratlösung hergestellt, die γ-L-Glutamyl-3,5-dichlor-4-hydroxyanilid
(5 mM), Glycylglycin (100 mM) und 2,5-Dimethylphenol (0,5 mM) in 50 mM Boratpuffer (pH 8,0) enthielt. 100/ul Ascorbat-Oxidase
(100 E) und 50/ul Serum (γ-GTP = 416 mE/ml) wurden zu
2 ml der Substratlösung gegeben und das Gemisch wurde 5 min bei 37°C inkubiert. Das Absorptionsverhältnis bei
585 nra war ÖD,-^f. = 0,547.
15 Beispiel 42
y-GTP-Assay unter Verwendung von y-L-Glutamyl-3,5-dichlor-4-hydroxyanilid
oder y-L-Glutamyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid,
2,5-Dimethylphenol und Laccase
20 Es wurde eine Substratlösung hergestellt, die γ-L-
Glutamyl-3,5-dichlor-4-hydroxyanilid (5 mM) oder γ-L-G]Lutaiayl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid
(5 mM), Glycylglycin (100 mM) und 2,5-Dimethylphenol (0,5 mM) in
50 mM Boratpuffer (pH 8,0) enthielt. 100 /öl Laccaselösung (100 E) und 50/ul Serum (y-GTP = 416 mE/ml)
wurden zu 2 ml der jeweiligen Substratlösung gegeben. Das Gemisch wurde 5 min bei 370C inkubiert. Das Absorptionsverhältnis
der gebildeten Farbe wurde gemessen. Da bei wurden folgende Ergebnisse erhalten:
y-L-Glutamyl-3,5-dichlor-4-hydroxyanilid: ODc8C = 0,476
y-L-Glutamyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid: OD585 β 0,526
Die Erfindung wird weiterhin anhand beiliegenden Zeichnungen näher erläutert; es zeigen:
Fig. 1 das IR-Spektrum von L-Leucyl-3,5-dichlor-4-hydroxyanilid.HCl;
Fig. 2 das IR-oSpektrum von BOC-L-Leucyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid;
Fig. 3 das IR-Spektrum von y-L-Glutarayl-3,5-dichlor-4-hydroxyanilid;
Fig. 4 das, IR-Spektrum von Y-L-Glutamyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid;
Fig. 5 die Absorptionskurve eines Farbstoffs, gebildet aus L-Leucyl-4-N,N-diethylaminoanilid, 1-Naphthol-2-sulfonat,
Laccase und Serum;
Fig. 6 und 7 die Kurve der Veränderung des Absorptionsverhältnisses
, erhalten durch kontinuierliche Messung der Erhöhung des Absorptionsverhältnisses im
Verlauf der Zeit unter Verwendung von L-Leucyl-4-N,N-diethylaminoanilid,
i-Naphthol-2-sulfonat, Laccase
und Serum;
Fig. 8 die Kurve der Veränderung des Absorptionsverhältnisses,
erhalten wie bei den Fig. 6 und 7, mit der Ausnahme, daß das 1-Naphthol-2-sulfonat durch
Phenol ersetzt wurde;
Fig. 9 die Absorptionskurve des gebildeten Farbstoffs bei den gleichen Bedingungen wie in Fig. 8;
Fig.10 die Kurve der Veränderung des AbsorptionsVerhältnisses
wie in Fig. 6 und 7, mit der Ausnahme, daß das L'-Leucyl-4-N,N-diethylaminoanilid durch L-Leucyl-4-N>N-dimethylaiminoanilid
ersetzt wurde;
Fig.11 die Kurve der Veränderung des Absorptionsverhältnisses
wie in Fig. 10, mit der Ausnahme, daß das 1-Naphthol-^-sulfonat durch Phenol ersetzt wurde;
Fig.12 die Kurve der Veränderung des Absorptions-Verhältnisses
wie in den Fig. 6 und 7, mit der Ausnahme, daß das L-Leucyl-4-N,N-diethylaminoanilid,die Laccase
und das Serum durch L-Leucyl-3f5-dibrom-4-hydroxyanilid,
Ascorbat-Oxidase und Arylanddase ersetzt wurden;
Fig. 13 die Absorptionskurve des gebildeten
Farbstoffs bei gleichen Bedingungen wie in Fig. 12;
Fig. 14 die Kurve des Verhältnisses des Sauerstoff verbrauche in Abhängigkeit von der Reaktionszeit
unter Verwendung von L-Leucy1-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid,
i-Naphthol-2-sulfonat, Ascorbat-Oxidase und
Arylamidase;
Fig. 15 die Kurve des Verhältnisses des Sauerstoff verbrauche in Abhängigkeit von der Reaktionszeit
unter Verwendung von L-Leucyl-3>5-dibrom-4-hydroxyanilid,
i-Naphthol-2-sulfonat, Laccase und Arylamidasej
Fig. 16 und 17 die Kurve der Veränderung des Absorptionsverhältnisses
durch kontinuierliche Messung der Erhöhung des Absorptionsverhältnisses in Abhängigkeit
von der Reaktionszeit unter Verwendung von γ-L-Glutamyl-4-N,N-diethylaminoanilid,
Glycylglycin, 1-Naphthol-2-sulfonat, Laccase und Serum;
Fig. 18 die Absorptionskurve des gebildeten Farbstoffs bei gleichen Bedingungen wie in den Fig. 16
und 17;
Fig. 19 die Kurve des SauerstoffVerbrauchs in
Abhängigkeit von der Reaktionszeit unter Verwendung von y-L-Glutamyl-4-N,N-diethylaminoanilid, Glycylglycin,
i-Naphthol-2-sulfonat, Laccase und Serum; und
Fig. 20 die Standardkurve von γ-GTP unter Verwendung
von 7-L-Glutamyl-3,5-dibrom-4-hydroxyanilid, Glycylglycin, p-Xylenol und Natriummetaperöodat.
Ende der Beschreibung. 30