DE3331003C2

DE3331003C2 - Verfahren zur Stabilisierung des Tumor-Nekrose-Faktors und diesen enthaltende wäßrige Lösung oder Pulversubstanz

Info

Publication number: DE3331003C2
Application number: DE3331003A
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Fuji Shizuoka Hayashi; Masanobu Nagaokakyo Kyoto Komiya
Original assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd; Asahi Kasei Kogyo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp; Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1982-08-31
Filing date: 1983-08-27
Publication date: 1986-07-10
Also published as: GB2126588B; IT8367886A0; ES525228A0; FR2532178B1; US4457916A; ES8706446A1; GB8323271D0; IT1200970B; DE3331003A1; FR2532178A1; GB2126588A

Abstract

Beschrieben werden ein Verfahren zur Stabilisierung des Tumor-Nekrose-Faktors (TNF), bei dem ein Stabilisierungsmittel, ausgewählt aus einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel, wenigstens einer Substanz, ausgewählt aus der aus D-Glucose, D-Galactose, D-Xylose, D-Glucuronsäure, einem Salz der D-Glucuronsäure, Trehalose, einem Dextran und einer Hydroxyethyl-Stärke bestehenden Gruppe und Mischungen aus diesen einer TNF enthaltenden wäßrigen Lösung oder Pulversubstanz zugesetzt werden, sowie eine stabile wäßrige Lösung oder Pulversubstanz, die TNF und eine wirksame Menge eines solchen Stabilisierungsmittels ausgewählt aus einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel, einem spezifischen Zucker oder einer zuckerähnlichen Verbindung und Mischungen daraus enthalten. Die TNF enthaltende wäßrige Lösung oder Pulversubstanz läßt sich über einen längeren Zeitraum aufbewahren, ohne an Aktivität einzubüßen, und ist stabil beim Einfrieren, beim Auftauen, bei der Lyophilisierung, bei der Wärmebehandlung od.dgl.

Description

20 tan-fettsäur°ester, einem Saccharose-fettsäureester und einem Glycerin-fettsäureester.

6. Verfaiiran nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel ausgewählt ist aus einem Polyoxyethylen-fettsäureester mit einem gesättigten oder ungesättigten Fettsäure-Rest mit 8 bis 20 Kohlenstoff-Atomen, in dem die Stoffmenge des addierten Ethylenoxids etwa 4 bis 50 mol beträgt, einem Polyoxyethylen-alkylether mit einer gesättigten oder ungesättigten Alkyl-Gruppe mit 8 bis 20 Kohlenstoff-Atomen, in dem die Stoffmenge des addierten Ethylenoxids etwa 5 bis 55 mol beträgt, einem Polyoxyethylen-alkylphenylether mit einer gesättigten oder ungesättigten Alkyl-Gruppe mit 5 bis 10 Kohlenstoff-Atomen, in dem die Stofftrienge des addierten Ethylenoxids etwa 5 bis 55 mol beträgt, einem Polyoxyethylen-sorbitanfettsäureester mit einem gesättigten oder ungesättigten Fettsäure-Rest mit 8 bis 20 Kohlenstoff-Atomen, in dem die Stoffmengen des addierten Ethylenoxids etwa 5 bis 50 mol beträgt, einem Polyoxy-

ethylen-glycerinfettsäureester mit einem gesättigten oder ungesättigten Fettsäure-Rest mit 8 bis 20 Kohlen- |

stoff-Atomen, in dem die Stoffmenge des addierten Ethylenoxids etwa 5 bis 5ύ mol beträgt, einem Poiyoxyet- |

hylen-hydrierten Rizinusöl oder einem Polyoxyethylen-Rizinusöl, in dem die Stoffmenge des addierten |

Ethylenoxids etwa 20 bis 15- mol beträgt, einem Polyoxyethylen-polyoxypropylen-alkylether mit einer κ

gesättigten oder ungesätigten Alkyl-Gruppe mit 12 bis 18 Kohlenstoff-Atomen und einem Ethylenoxid-Gehalt von etwa 65 bis 85 Gew.-"', einem Polyoxyethylen-polyoxypropylen-Blockpolymerisat mit einem Zahlenmittel des Molekulargewichts von etwa 3000 bis 15 000 und einem Ethylenoxid-Gehalt von etwa 65 bis 85 Gew.-°/o. einem Sorbitan-fettsäureester mit einem gesättigten oder ungesättigten Fettsäure-Rest mit δ bis 20 Kohlenstoff-Atomen und einem Saccharose-fettsäureester oder einem Glycerin-fettsäureester, der ein Monosäure-ester der Saccharose oder des Glycerins mit einer gesättigten oder ungesättigten FeUsäure mit 8 bis

40 20 Kohlenstoff-Atomen ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel ausgewählt ist aus Polyoxyethylen(20)-sorbitanmonooleat, Polyoxyethylen(60)-hydriertem Rizinusöl, einem Polyoxyethylen-polyoxypropylen-Blockpolymerisat mit einem Zahlenmittel des Molekulargewichts von etwa 8350 und einem Ethylenoxid-Gehalt von 80 Gew.-%.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-ionische oberflächenaktive |

Mittel in einer Konzentration von 1 μg/ml bis 1 mg/ml der den Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) enthaltenden wäßrigen Lösung zugesetzt wird, wobei diese wäßrige Lösung eine TNF-Aktivität von 10² bis 10⁹ Ein- i|

heiten/ml besitzt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels 5 μg/ml bis 100 μg/ml beträgt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Stabilisierungsmittel wenigstens eine Substanz ausgewählt aus der aus D-Glucose, D-Galactose, D-Xylose, D-Glucuronsäure, einem Salz der m D-Glucuronsäure, Trehalose. einem Dextran und einer Hydroxyethyl-Stärke bestehenden Gruppe ist, wel- | ehe in einer Konzentration von 10 mg/ml bis 500 mg/ml der den Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) enthaltenden wäßrigen Lösung zugesetzt wird, wobei diese wäßrige Lösung eine TNF-Aktivität von 10² bis 10^q Ein- !leiten/ml besitzt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Substanz 100 mg/ml bis 500 mg/ml beträgt.

12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß weiterhin die wäßrige Lösung des Tumor-Nekrose-Faktors mit dem zugesetzten Stabilisierungsmittel der Lyophilisierung unterworfen wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabilisierung des Tumor-Nekrose-Faktors.

Carswell et al. entdeckten einen Tumor-Nekrose-Faktor (im folgenden einfach als »TNF« bezeichnet). Sie berichteten, daß TNF eine Substanz ist, die im Serum von mit Endotoxin behandelten Mäusen, Ratten oder Kaninchen gefunden wird, die mit einem Immunopotentiator wie Bacillus Calmelte-Guerin (BCG)₁ Corynebac-

teria oder Zymosan sensibilisiert worden waren, und daß TNF Nekrose in einer Mannigfaltigkeit transplantierter Mäuse-^Tumoren ohne toxischen Effekt auf den Tumor-tragenden Empfänger induziert [vgl. Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 72 (9), 3666-3670 (1975)].

Danach wurden zahlreiche Berichte über die biochemischen und physiologischen Eigenschaften des Mäuse-TNF und Kaninchen-TNF veröffentlicht [vgl. z. B. Proc. NaL Acad. Sei. USA, 73 (2), 381 -385 (1976); Expl. Cell Biol. 47, 53-60 (1979); Br. J. Cancer 38, 302-309 (1978), und ibid. 42, 416-422 (1980)]. Es ist zu erwähnen, daß auch über einen cytotoxischen Faktor, eine Substanz, von der angenommen wird, daß sie mit TNF identisch ist, von einigen Forschern beachtet wurde [vgl. zum Beispiel Infect, immun. 28 (1), 204—211 (1980)].

Auch die Herstellung von TNF in vitro wurde mitgeteilt. Beispielsweise bestimmte und veröffentlichte Matthews dL· optimalen Bedingungen, unter denen TNF in vitro durch die einkernigen (mononuklearen) Phagocyten aus verschiedenartigen Geweben normaler und mit BCG-Injektionen behandelter Kaninchen erzeugt wird [vgl. Br. J. Cancer 44,418—424 (1981)]. Nach seiner Arbeit werden die optimalen Mengen TNF durch mononukleare Phagocyten in Gegenwart von Endotoxin erzeugt, und alveolare und peritoneale Makrophagen sind die potentesten TNF-Produzenten. Weiterhin erzeugen aufgrund seines Berichts die Makrophagen von mit BCG-Injektionen behandelten Kaninchen signifikant mehr TNF als diejenigen von normalen Tieren. In der Zwischenzeit haben Männel et al. berichtet, daß die mit Makrophagen angereicherten Zellen des Peritoneal-Exsudats aus BCG-infizierten Mäusen einen cytotoxischen Faktor freisetzen, wenn sie in vitro mit Lipopolysaccharid (Endotoxin) stimuliert werden [vgl. Immun. 30 (2), 523—530 (1980), und ibid. 33 (1), 156—164 (1381)].

In bezug auf die charakteristischen Eigenschaften des TNF ist bekannt, daß TNF, neben seiner Aktivität der Induzierung von Nekrose in verschiedenartigen Tumoren, eine Aktivität ausübt, die nicht spezifisch auf die Art 2c der Lebewesen gerichtet ist. Beispielsweise vermag Kaninchen-TNF Nekrose in Mäuse-Tumor ; zu induzieren. Weiterhin ist bekannt, daß TNF in vitro keinerlei signifikante cytotoxische Wirkung auf normale Z-Jien ausübt und eine cytotoxische Wirkung auf bestimmte Arten neoplastischer Zellinien ausübt (beispielsweise L-M- und Meth-A-Zellen). Wie bereits oben dargelegt wurde, besitzt TNF Antitumor-Aktivität, übt seine Wirkung nicht spezifisch hinsichtlich der Art der Lebewesen aus und zeigt keinerlei schädliche Wirkung gegenüber normalen Zellen. Infolgedessen werden an den klinischen Einsatz von TNF ils Antitumor-Medikament in der Fachwelt große Erwartungen geknüpft.

Es ist auch bekannt, daß nur eine sehr geringe Menge des TNF in einem Säuger oder einem Gewebekultur-System induziert wird. Zur Sicherstellung einer breiten und sicheren klinischen Anwendung des TNF als Antitumor-Medikament ist es infolgedessen absolut notwendig, das in einem Sauger oder einem Gewebekultur-System induzierte rohe TNF zu isolieren und hochgradig zu reinigen. Weiterhin ist bei der Durchführung der Erzeugung des als Antitumor-Medikament zu verwendenden TNF im großen Maßstab gewöhnlich erforderlich, das hochgereinigte TNF in Form einer Lösung oder einer eingefrorenen Masse über einen längeren Zeitraum hinweg aufzubewahren und die TNF-Lösung zu lyophilisieren. Seitens der Anmelderin wurde jedoch gefunden, daß die Aktivität von hochgereinigtem TNF in ausgeprägter Weise beim Lagern, Einfrieren, Auftauen und Lyophilisieren desselben abnimmt.

Der Änmeiderin ist keine Veröffentlichung bekannt, in der die Stabilität von hochgereinigtem TNF untersucht wird. Unter solchen Umständen läßt sich eine wirksame und stetige Versorgung mit hochgereinigtem TNF nicht sicherstellen, insbesondere nicht im technischen Maßstab, ungeachtet der Kenntnis, daß TNF ein wirksames Antitumor-Medikament ist.

Zur Überwindung der angesprochenen Schwierigkeit in bezug auf Stabilität des TNF wurden seitens der Anmelderin ausgedehnte und eingehende Untersuchungen durchgeführt. Dabei wurde ganz überraschend gefunden, daß der Zusatz einer wirksamen Menge eines nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels, eines spezifischen Zuckers, einer zuckerähnlichen Verbindung und von Mischungen aus diesen als Stabilisierungsmittel zu einer den TNF enthaltenden wäßrigen Lösung oder Pulvermasse eine Lagerung des TNF über einen längeren Zeitraum hinweg ermöglicht, ohne daß es seine Aktivität einbüßt, und das TNF stabil macht für das Einfrieren, Auftauen, Lyophilisieren, eine Wärmebehandlung oder dergleichen. Die vorliegende Erfindung beruht auf diesen Befunden.

Dementsprechend ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Stabilisierung des TNF verfügbar zu machen.

Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß zu einer den Tumor-Nekrose-Faktor entnaltenden wäßrigen Lösung oder PulvTSubstanz eine wirksame Menge eines Stabilisierungsmittels ausgewählt aus wenigstens einem nichtionischen oberflächenaktiven Mittel und/oder wenigstens einer Substanz ausgewühlt aus der aus D-Glucose, D-Galactose, D-Xylose, D-Glucuronsäure, einem Salz der D-Glucuronsäure, Trehalose, einem Dextran und einer Hydroxyethyl-Stärke bestehenden Gruppe zugesetzt wird.

Es ist Ziel dieses Verfahrens, eine stabile TNF-Lösung oder ein stabiles TNF-Pulver verfügbar zu machen, worin die TNF-Aktivität über einen längeren Zeitraum hinweg erhalten bleibt und die beim Einfrieren, Auftauen, Lyophilisieren, bei einer Wärmebehandlung oder dergleichen stabil ist.

Hierbei wird eine stabile wäßrige Lösung oder Pulversubstanz verfügbar g^mficht, die TNF und eine wirksame Menge eines Stabilisierungsmittels ausgewählt aus einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel, wenigsicns einer Substanz ausgewählt aus der aus D-Glucose, D-Galactose, D-Xylose, D-Glucuronsäure, einem Salz der D-Glucuronsäure, Trehalose, einem Dextran und einer Hydroxyethyl-Stärke bestehenden Gruppe und Mischungen aus diesen enthält.

Die genannten und andere Ziele, Merkmale und Vorteile werden für Fachleute aus der folgenden ausführlichen Beschreibung sowie den Patentansprücheain Verbindung mit den Zeichnu ixen deutlich.

F i g. 1 zeigt eine graphische Darstellung der Wirkung der Konzentration des Polyoxyethylen(20)-sorbitanmonooleats(Tween 80)au'dieTNF-Restaktivität nach 7tägiger Lagerung bei 4°C.

Fig.2 zeigt eine graphische Darstellung der Wirkung der Konzentration des Polyoxyethylen(6)-stearats

(Nissan Nonion S-6) auf die TN F-Restaktivität nach 7tägiger Lagerung bei 4°C.

F i g. 3 zeigt eine graphische Darstellung der Wirkung der Konzentration des Polyoxyethyien(23)-I;iurylethers (Brij 35) aufdieTNF-Restaktivität nach 7tägiger Lagerung bei 4⁰C.

F i g. 4 zeigt eine graphische Darstellung der Wirkung der Konzentration des Polyoxyethylen(60)-hydriertcn Rizinusöls (NIKK.OL HCO-60) aufdieTNF-Restaktivität nach 7tägiger Lagerung bei 4°C.

F i g. 5 zeigt eine graphische Darstellung der Wirkung der Konzentration des Polyoxyethylen(20)-polyoxypropylen-Blockpolymerisats (Pluronic F68) aufdieTNF-Restaktivität nach 7tägiger Lagerung bei 4° C.

F i g. 6 zeigt eine graphische Darstellung der Wirkung der Konzentration der Trehalose auf die TNF-Restaktivität nach 7tägiger Lagerung bei 4°C.

ίο Eine weitere ausführliche Erläuterung der Abbildungen wird im folgenden in Verbindung mit dem Beispiel 3 (§ gegeben.

S Der Begriff »TNF«, wie er hierin verwendet wird, bezeichnet eine physiologisch aktive Substanz, die dadurch

induziert wird, daß wenigstens eine Substanz, die zur Stimulierung des reticulo-endothelialen Systems befähigt

ist, einem Sauger verabreicht wird und danach dem Säuger Endotoxin von einem gramnegativen Bacterium injiziert wird, oder dadurch, daß Endotoxin von einem gramnegativen Bacterium einem Gewebekultur-System zugesetzt wird, das aktivierte Makrophagen von einem Säuger enthält, wobei diese Substanz Nekrose verschiedener Tumoren hervorruft, wenn sie passiv auf tumortragende Sauger übertragen wird, oder eine Substanz, die mittels beliebiger Verfahren erzeugt wird und Eigenschaften besitzt, die denjenigen der vorbezeichneten physilogischen aktiven Substanz ähnlich sind.

Das in der vorliegenden Erfindung einzusetzende TNF wird mittels einer Mehrzahl von in der Fachwelt bekannten Verfahren erzeugt, darunter das Verfahren von Matthews et al. [vgl. Br. J. Cancer 42,416—422 (1980)] und das Verfahren von Green et al.[vgl. J. Natl. Cancer Inst. 59 (5), 1519-1522 (1977)].

Typische Arbeitsweisen zur Herstellung des in der vorliegenden Erfindung einzusetzenden TNF sind die folgenden:

Zuerst wird wenigstens eine Substanz, die die Fähigkeit zur Stimulierung des reticulo-endothelialen Systems besitzt, einem Sauger (z. B. Maus. Kaninchen, Meerschweinchen etc.) intravenös oder intraperitoneal injiziert. Als Substanzen mit der Fähigkeit zur Stimulierung des rticulo-endothelialen Systems werden im allgemeinen grampositive Bakterien, Protozoen oder Hefen verwendet, die dem Sauger entweder als lebende Mikroorganismen, tote Mikroorganismen (z. B. nlch Wärmebehandlung oder Formalin-Behandlung) und Mikroorganismus-Zellextrakte verabreicht werden. Zu Beispielen für grampositive Bakterien zählen Propionibacteria wie Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum) und Propionibacterium granulosum (Corynebacterium granulosum), Mycobacteria wie Bacillus Calmette-Guerin (BGCG) und Mycobacterium smegmatis und Nocardiae wie Nocardia erythropolis und Nocardia gardneri. Als geeignete Protozoen sind beispielsweise Plasmodium oder Toxoplasma einsetzbar. Als geeignete Hefe wird im allgemeinen von Saccharomyces cerevisiae oder anderen extrahiertes Zymosan verwendet. Es können auch synthetische hochmolekulare Verbindungen wie Pyran-Copolymerisat einsetzbar sein.

Als zweites wird 7 bis 14 Tage nach der Verabreichung der obenerwähnten, zur Stimulierung des reticulo-endotheiiaien Systems befähigten Substanz Endotoxin von einem gramnegativen Bacterium, beispielsweise ein von Eschericia coli. Pseudomonas aeruginosa oder Salmonella typhosa abgeleitetes Lipopolysaccharid, dem betref-

40 fenden Sauger intravenös verabreicht.

Als drittes werden 13 bis 2 h nach der Injektion Körperflüssigkeiten (z. B. Ascites, Lymphe etc.) und/oder Serum oder Plasma des Säugers entnommen, oder innere Organe wie Leber. Milz etc. werden homogenisiert und mit physiologischer Kochsalzlösung extrahiert. Diese Körperflüssigkeiten, Serum, Plasma und/oder Extrakte innerer Organe können als rohe Lösung des TNF eingesetzt werden. Von ihnen werden jedoch im allgemeinen

45 Serum oder Plasma verwendet.

Wie oben erwähnt wurde, sind die Verfahren zur Herstellung des in der vorliegenden Erfindung einzusetzenden TNF nicht auf das im Vorstehenden beschriebene Verfahren beschränkt. Das auf dem Gen-Engineering beruhende Verfahren und die Gewebekultur-Methode, wobei Zellen mit der Fähigkeit, TNF zu erzeugen, zum Einsatz gelangen, lassen sich ebenfalls wirksam anwenden. Es ist anzumerken, daß diese Verfahren auch für die

50 Herstellung von Human-TNF einsetzbar sind.

Das nach einem der obenerwähnten Verfahren hergestellten TNF kann gereinigt werden durch Anwendu· g der nachstehend aufgeführten Arbeitsweisen für sich allein oder in Kombination, wodurch eine gereinigte wäßrige Lösung erhalten wird, die lyophilisiert wird, wodurch ein gereinigtes TNF-Pulver entsteht. Als geeignete biochemische Arbeitstechniken für die Reinigung des TNF lassen sich beispielsweise die Technik des Aussalzens unter Verwendung von Ammoniumsulfat, die Ionenaustausch-Chromatographie unter Benutzung eines Anionenaustausch-Harzes. die Gelfiltrationstechnik und die Elektrophoresetechnik nennen. Mit zunehmender Reinheit des TNF aufgrund der Anwendung der vorstehenden Reinigungstechniken ist zu beobachten, daß das TNF allmählich zunehmend instabil wird. Beispielsweise ist eine Probe mit einer spezifischen Aktivität von 500 000 Einheiten/mg (die spezifische Aktivität wird ausgedrückt in Einheiten der TNF-Aktivität pro 1 mg Protein: die Einheit der TNF-Aktivität wird weiter unten definiert) recht instabil, wie aus den in den Beispielen angegebenen Daten zu ersehen ist. Auch die TNF-Proben mit einer spezifischen Aktivität von weniger als 500 000 Einheiten/mg erleiden in einem gewissen Maße eine Abnahme der betreffenden Aktivität, wenn sie aufbewahrt oder Arbeitsgängen des Einfrierens, Auftauens, Lyophilisierens und anderen Arbeitsgängen unterworfen werden.

Dementsprechend richtet sich die vorliegende Erfindung auf die Stabilisierung des TNF. das zu einem hohen Grade gereinigt und dadurch destabiiisiert wurde. Das gemäß der vorliegenden Erfindung zu stabilisierende TNF kann in Form entweder einer Lösung oder eines Pulvers vorliegen. Es wird jedoch bevorzugt, daß das /u stabilisierende TNF in Form einer Lösung vorliegt

Vorzugsweise hat die zu stabilisierende TNF-Lösung einen pH-Wert von 5 bis 10, und weiterhin wird bevorzugt, daß das Lösungsmittel für die zu stabilisierende TNF-Lösung ein geeigneter Puffer ist Als geeigneter Puffer zu erwähnen ist beispielsweise ein Phosphat-Puffer und ein Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCI-Puffer. Je nach Bedarf wird der TNF-Lösung ein Salz wie Natriumchlorid oder Kaliumchlorid zugesetzt. Beispielsweise wird der tNF-Lösung ein Salz zur Herstellung einer isotonischen Lösung zugesetzt, wenn die TNF-Lösung zu Injektionszwecken verwendet wird. Der Zweck der Saiz-Zugabe ist jedoch nicht auf den vorgenannten beschränkt. Die Konzentration eines solchen Salzes in der TNF-Lösung kann je nach dem Zweck der Salz-Zugabe bestimmt werden. Wenn beispielsweise die fertige TNF-Lösung zur Injektion verwendet wird, wird eine isotocischc Lösung aus der TNF-Lösung durch Zusatz von Natriumchlorid bis zu einer Konzentration von 0,15 M hergestellt

Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine wirksame Menge eines Stabilisierungsmittels ausgewählt aus einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel, wenigstens einer Substanz ausgewählt aus der aus D-Glucose, D-Galactose, D-Xylose, D-Glucuronsäure, einem Salz der D-Glucuronsäure, Trehalose, einem Dextran und einer Hydroxyethyl-Stärke bestehenden Gruppe und Mischungen aus diesen zu einer wäßrigen Lösung, die TNF enthält, oder einem Pulver, das TNF enthält, hinzugefügt.

Die aus der aus D-Glucose, D-Galactose, D-Xylose, D-Glucuronsäure, einem Salz der D-Glucuronsäure, Trehalose, einem Dextran und einer Hydroxyethyl-Stärke bestehenden Gruppe ausgewählte Substanz wird im folgenden häufig auch als »Zucker oder zuckerähnliche Verbindung« bezeichnet.

Als geeignetes nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel, das in der vorliegenden Erfindung zu verwenden ist, kann erwähnt werden ein Poiyoxyethyien-fettsaureester, ein Poiyoxyethyien-aikyiether, ein Folyoxyethylen-alkylphenylcther, ein Polyoxyethylen-sorbitanfettsäureester, ein Polyoxyethylen-glycerinfettsäureester, ein Polyoxyethylen-hydriertes Rizinusöl, ein Polyoxyethylen-Rizinusöl, ein Polyoxyethylen-polyoxypropylenalkylether, ein Polyoxyethylen-polyoxypropylen-Blockpolymerisat, ein Sorbitan-fettsäureester, ein Saccharose-fettsäureester, ein Glycerin-fettsäureester und dergleichen. Unter dem Gesichtspunkt der Dispergierbarkeit oder Löslichkeit bevorzugt eingesetzt wird ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel mit einem HLB-Wert (Wert des Hydrophilizität-Lipophilizität-Verhältnisses) von 9 bis 20, wobei ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel mit einem HLB-Wert von 13 bis 18 in der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt verwendet wird.

Der HLB-Wert des in der vorliegenden Erfindung zu verwendenden nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels kann mit Hilfe verschiedener wohlbekannter Methoden gemessen werden, beispielsweise mittels des in J. Soc. Cosmetic Chemists 5,249 (1954), beschriebenen Verfahrens.

Als Poiyoxyethyien-fettsaureester wird ein Poiyoxyethyien-fettsaureester mit einem gesättigten oder ungesättigten Fettsäure-Rest mit 8 bis 20 Kohlenstoff-Atomen, in dem die Stoffmenge des addierten Ethylenoxids (im folgenden als »EO« bezeichnet) etwa 4 bis 50 mol beträgt, bevorzugt. Als solche Poiyoxyethyien-fettsaureester können beispielsweise erwähnt werden ein Polyoxyethylenstearat, ein Polyoxyethylenlaurat und ein Polyoxyethylenoleat, in dem jeweils die Stoffmenge des addierten EO 4 bis 50 mol beträgt.

Als Polyoxyethylen-alkylether wird ein Polyoxyethylen-alkylether mit einer gesättigten oder ungesättigten Alkyl-Gruppe mit 8 bis 20 Kohlenstoff-Atomen, in dem die Stoffmenge des addierten EO etwa 5 bis 55*mol beträgt, bevorzugt. Als solche Polyoxyethylen-alkylether können beispielsweise erwähnt werden ein Poiyoxyeihylenlaurylcther, ein Polyoxyethylencetylether, ein Polyoxyethylenstearylether und ein Polyoxyethylenoleylether, in dem jeweils die Stoffmenge des addierten EO 5 bis 55 mol beträgt.

Als Polyoxyethylen-alkylphenylether wird ein Polyoxyethylen-alkylphenylether mit einer gesättigten oder ungesättigten Alkyl-Gruppe mit 5 bis 10 Kohlenstoff-Atomen, in dem die Stoffmenge des addierten EO etwa 5 bis 55 mol beträgt bevorzugt. Als solche Polyoxyethylen-alkylphenylether können beispielsweise erwähnt werden ein Polyoxyethylenoctylphenylether und ein Polyoxyethylennonylphenylether, in dem jeweils die Stoffmenge des addierten EO 5 bis 55 mol beträgt

Als Polyoxyethylen-sorbitanfettsäureester wird ein Polyoxyethylen-sorbitanfettsäureester mit einem gesättigten oder ungesättigten Fettsäure-Rest mit 8 bis 20 Kohlenstoff-Atomen, in dem die Stoffmenge des addierten EO etwa 5 bis 50 mol beträgt, bevorzugt Als solche Polyoxyethylen-sorbitanfettsäureester können beispielsweise erwähnt werden ein Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, ein Polyoxyethylensorbitanmonopalmitat, ein Polyoxyethylensorbitanmonostearat ein Polyoxyethylensorbitanmonooleat und ein Polyoxyethylensorbitantristearat, in dem jeweils die Stoffmenge des addierten EO etwa 5 bis 50 mol beträgt

Als Polyoxyethylen-glycerinfettsäureester wird ein Polyoxycthylen-glycerinfettsäureester mit einem gesättigten oder ungesättigten Fettsäure-Rest mit 8 bis 20 Kohlenstoff-Atomen, in dem die Stoffmenge des addierten EO etwa 5 bis 50 mol beträgt bevorzugt Als solche Polyoxyethylen-glycerinfettsäureester können beispielsweise erwähnt werden ein Polyoxyethylenglycerylmonostearat und Polyoxyethylenglycerylmonooleat, in dem jeweils die Stoffmenge des addierten EO etwa 5 bis 50 mol beträgt.

Als Polyoxyethylen-hydriertes Rizinusöl und Polyoxyethylen-Rizinusöl werden ein Polyoxyethylen-hydriertes Rizinusöl und ein Polyoxyethylen-Rizinusöl. in dem die Stoffmenge des addierten EO etwa 20 bis 150 mol beträgt bevorzugt

Als Polyoxyethylen-polyoxypropylen-alkylether wird ein Polyoxyethylen-polyoxypropylen-alkylether mit einer gesättigten oder ungesättigten Alkyl-Gruppe mit 12 bis 18 Kohlenstoff-Atomen und einem EO-Gehalt von etwa 65 bis 85 Gew.-°/o bevorzugt Als solcher Polyoxyethylen-polyoxypropylen-alkylether kann beispielsweise erwähnt werden ein Polyoxyethylen-polyoxypropylen-cetylether mit einem EO-Gehalt von etwa 65 bis 85 Gew.-%.

Als Polyoxyethylen-poIyoxypropylen-Blockpolymerisat wird ein Polyoxyethylen-polyoxypropylen-Blockpolymerisat mit einem Zahlenrnitte! des Molekulargewichts von etwa 3000 bis 15 000 und einem EO-Gehait von etwa 65 bis 85 Gew.-% bevorzugt

Als Sorbitan-fettsäureester wird ein Mono- oder Sesqui-Ester eines Sorbitans mit einer gesättigten oder

ungesättigten Fettsäure mit 8 bis 20 Kohlenstoff-Atomen bevorzugt. Als solche Sorbilan-fetlsiiui'ccster können beispielsweise erwähnt werden ein Sorbhanmonolaurat, ein Sorbitanmonopä'mitat urtd ein SorbitanscsquiolcuL

Als Saccharose-fettsäureester wird ein Monoester der Saccharose mit einer gesättigten oder ungesättiglcn Fettsäure mit 8 bis 20 Kohlenstoff-Atomen bevorzugt. Als solche Saccharose-fettsäureester können beispiclsweise erwähnt werden ein Saccharosemonopalmitat und ein Saccharosemonostearat.

Als Glycerin-fettsäureester wird ein Monosäure-ester des Glycerins mit einer gesättigten oder ungesättigten Fettsäure mit 8 bis 20 Kohlenstoff-Atomen bevorzugt. Als solche Glycerin-fettsäureester können beispielsweise erwähnt werden ein Glycerylmonostearat und ein Glycerylmonooleat.

Von den im vorstehenden genannten nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln werden besonders bevorzugt ein Polyoxyethylen-sorbitanfettsäureester, ein Polyoxyethylen-hydriertes Rizinusöl, ein Polyoxyethylen-Ri- :zinusöl und ein Polyoxyethylen-polyoxypropylen-Blockpolymerisat wie oben definiert verwendet, weil diese Verbindungen relativ niedrige Toxizität besitzen. Ein Polyoxyethylen-sorbitanmonooleat (Stoffmenge des addierten EO: 20) [im folgenden als »Polyoxyethylen(20)-sorbitanmonooleat« bezeichnet, und andere nicht-ionische oberflächenaktive Mittel werden im folgenden in der gleichen Weise bezeichnet], Polyoxyethylen(60)-hydriertes Rizinusöl und ein Polyoxyethylen-polyoxypropylen-Blockpolymerisat mit einem Zahlenmittel des Molekulargewichts von etwa 8350 und einem EO-Gehalt von 80 Gew.-% werden vor allen anderen bevorzugt.

Die vorgenannten nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel können für sich allein oder in Kombination verwendet werden.

Wie bereits obenerwähnt kann als Zucker oder zuckerähnliche Verbindung wenigstens eine Substanz aus der aus D-Glucose, D-Galactose, D-Xylose, D-Glucuronsäure, einem Salz der D-GIucuronsäure, Trehalose, einem Dextran und einer Hydroxyethyl-Stärke bestehenden Gruppe genannt werden.

Als Salz der D-Glucuronsäure erwähnt seien ein Alkali-Salz, etwa das Natrium-Salz und das Kalium-Salz, oder ein Erdalkalimetall-Salz wie das Calcium-Salz und das Magnesium-Salz.

Als Hydroxyethyl-Stärke kann eine Hydroxyethyl-Särke mit einem mittleren Molekulargewicht von 30 000 bis 400 000, vorzugsweise von 200 000, verwendet werden.

Als Dextran wird ein Dextran mit einem mittleren Molekulargewicht von 10 000 bis 80 000 bevorzugt. Als solche Dextrane seien erwähnt Dextraon 10, Dextran 40 bzw. Dextran 70 mit Molekulargewichten von 10 000, 40 000 bzw. 70 000.

Unter den Zuckern oder zuckerähnlichen Verbindungen wird Trehalose vor allen anderen bevorzugt.
Die vorgenannten Zucker oder zuckerähnlichen Verbindungen können für sich allein oder in Kombination verwendet werden.

Weiterhin können in der vorliegenden Erfindung auch Derivate von D-Glucose, D-Galactose, D-Xylose, D-Glucuronsäure und Trehalose eingesetzt werden, etwa Phosphatester oder deren Salze, Methylether und Methylgiycoside, da auch sie eine TNF-stabilisierende Wirkung besitzen.

Das in der vorliegenden Erfindung einzusetzende nicht-ionische oberflächenaktive Mittel wird zugesetzt in einer Konzentration von 1 μg/ml bis 1 mg/ml der TNF-Lösung, vorzugsweise von 5 μg/ml bis 500 μg/ml und besonders bevorzugt von 5 ug/ml bis 100 μg/ml, wobei diese wäßrige Lösung eine TNF-Aktivität von 10² bis 10⁹ Einheiten/ml besitzt (die Einheit der Aktivität wird später definiert). Die Art und Weise, in der das nichi-iönisehe oberflächenaktive Mittel zugesetzt wird, ist nicht kritisch. Beispielsweise kann das nicht-ionische obcrflächenaktive Mittel direkt der TNF-Lösung zugesetzt werden. Alternativ kann das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel vorher in Wasser oder einem geeigneten Puffer oder einem organischen Lösungsmittel wie Ethanol gelöst und dann der TNF-Lösung zugegeben werden. Die Zugabe des nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittels kann zu einem beliebigen Zeitpunkt während der Reinigungsstufe oder der Stufe der Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen erfolgen.

Wenn zwei oder mehr verschiedenartige nicht-ionische oberflächenaktive Mittel zum Einsatz gelangen, werden sie in solchen Mengen zugesetzt, daß ihre Gesamt-Menge in den oben angegebenen Bereich fällt.

Die in der vorliegenden Erfindung einzusetzende Zucker-Verbindung oder zuckerähnliche Verbindung werden in einer Konzentration von 10 mg/ml bis 500 mg/ml, vorzugsweise von 100 mg/ml oder mehr, derTNF-Lösung zugesetzt, wobei diese wäßrige Lösung eine TNF-Aktivität von 10² bis 10⁹ Einheiten/ml besitzt. Der obere Grenzwert für die Menge des Zuckers oder der zuckerähnlichen Verbindung wird gewöhnlich festgelegt unter dem Gesichtspunkt der Löslichkeit des Zuckers oder der zuckerähnlichen Verbindung und der Viskosität der entstehenden Lösung sowie unter dem wirtschaftlichen Gesichtspunkt. Der obere Grenzwert der Menge des Zuckers oder der zuckerähnlichen Verbindung liegt im allgemeinen bei 500 mg/ml der TNF-Lösung. Wenn das zu stabilisierende TNF in Pulverform vorliegt werden der Zucker oder die zuckerähnliche Verbindung in solcher Menge zugesetzt, daß eine wäßrige Lösung, die durch Lösen des pulvrigen TNF in solcher Weise hergestellt wird, daß sie eine Aktivität von 10² bis 10⁹ Einheiten/ml zeigt, die obengenannten Konzentrationen des Zuckers bzw. der zuckerähnlichen Verbindung besitzt

Die Art und Weise, in der der Zucker oder die zuckerähnliche Verbindung zugesetzt wird, ist nicht kritisch. Beispielsweise können der Zucker oder die zuckerähnliche Verbindung direkt der TNF-Lösung zugesetzt werden. Alternativ können der Zucker oder die zuckerähnliche Verbindung vorher in Wasser oder einem geeigneten Puffer gelöst und dann der TNF-Lösung zugegeben werden. Als weitere Möglichkeit können der Zucker oder die zuckerähniiche Verbindung mit dem TNF-Pulver vermischt werden. Die Zugabe des Zuckers oder der zuckerähnlichen Verbindung kann zu einem beliebigen Zeitpunkt während der Reinigungsstufe oder der Stufe der Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen erfolgen.

Wenn zwei oder mehr verschiedenartige Zucker oder 7-ickerähnliche Verbindungen zum Einsatz gelangen, werden sie in solchen Mengen zugesetzt daß ihre Gesamt-Menge in den oben angegebenen Bereich fällt.

Das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel und der Zucker oder die zuckerähnlichen Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind, können in Kombination eingesetzt werden. In einem solchen

Falle können das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel und der Zucker oder die zuckerähnlichen Verbindungen in solchen Mengen zugesetzt werden, daß sie in die jeweiligen oben angegebenen Bereiche fallen.

Vorzugsweise werden die Aufbewahrung und Reinigung wie auch die Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen aus der TNF-Lösung, in die ein gemäß der vorliegenden Erfindung einzusetzendes Stabilisierungsmittel eingearbeitet ist, sofern es sich um Lösungen handelt, bei einer Temperatur von O⁰C bis 30⁰C, vorzugsweise von 0°Cbis 10°C, vorgenommen. Wenn die TNF-Lösung in gefrorener Form gelagert wird, wird die Läget temperatur vorzugsweise unterhalb von O⁰C, besonders bevorzugt unterhalb von — 20'C gehalten.

Die TNF-Lösung, in die eine wirksame Menge wenigstens eines Stabilisierungsmittels gemäß der vorliegen-. den Erfindung eingearbeitet ist, behält ihre TNF-Aktivität während der AuFoewahrung, unabhängig davon, ob sie in Form einer Lösung oder in gefrorener Form vorliegt, oder während der Arbeitsgänge der Reinigung und der Anfertigung pharmazeutischer Präparate.

Weiterhin ist das Verfahren zur Stabilisierung des TNF gemäß der vorliegenden Erfindung auch anwendbar auf die Lyophilisierung. Zur Erläuterung sei festgestellt, daß, wenn TNF-Löüungen (insbesondere im Fall des hochgereinigten TNF) der Lyophilisierung unterworfen werden, ihre Aktivität in ausgeprägter Weise abfällt. TNF-Lösun&en, die eine wirksame Menge wenigstens e'ines Stabilisierungsmittels gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten, werden jedoch unter Beibehaltung von etwa 50% oder mehr ihrer Aktivität zu einem TNF-Pulver lyophilisiert. Das TNF-Pulver kann unter Bildung einer stabilen wäßrigen TNF-Lösung aufgelöst werden, in der die Konzentration des Stabilisierungsmittels und des TNF in den oben definierten Bereich fallen. Das Stabilisierungsmittel, wie es in der vorliegenden Erfindung angegeben ist. kann alternativ in die lyophilisierten TNF-Präparate eingearbeitet werden. Wenn das TNF in Pulverform aufbewahrt ist, wird vorzugsweise die Aufbewahr jngstemperatur bei 25°C oder darunter gehalten.

Zur Analyse der Aktivität des TNF werden gewöhnlich zwei Verfahren angewandt, nämlich das in-vivo-Verfahren, bei dem der Effekt der Tumor-Nekrose in vivo gemessen wird, und das in-vitro-Verfahren, bei dem der cytotoxische Effekt auf neoplastische Zellen in vitro gemessen wird.

Als in-vivo-Methode kann beispielsweise diejenige von Carswell et al. [vgl. Proc. Nat. Acad. ScL, USA, 72 (9), 3666—3670 (1975)] genannt werden. Nach dieser Methode werden BALB/c-Sarkom-Meth-A-Zelien (2 χ 10⁵-Zellen) jeweils intradermal in die Achselhöhle von (BALB/c χ C57BL/6)-Fi -Mäusen transplantiert, und 7 Tage später werden Mäuse mit Tumoren von 7 bis 8 mm Durchmesser, guter Vaskularisierung und keinerlei spontaner zentraler Nekrose für die Untersuchung aussortiert. Eine TNF-Probe (0,5 ml) verdünnt mit physiologischer Kochsalz-Lösung wird durch die Schwanzvene jeder der Mäuse injiziert. Die Aktivität der TNF-Probe wird 24 h später nach den folgenden Maßstäben bewertet:

(-): keine Veränderung;

(+): geringfügige hämorrhagische Nekrose;

(++): mäßige hämorrhagische Nekrose (zentrale Nekrose erstreckt sich über annähernd 50% der

Tumoroberfläche);
(+ + +): ausgeprägte hämorrhagische Nekrose (massive Nekrose, die nur einen schmalen lebensfähigen

Rand entlang des Umfangs des Tumors beläßt).

Als in-vitro-Methode für die Analyse der TNF-Aktivität können beispielsweise diejenige von Ruff et al. [vgl. Lymphokines, Vol. 2, hersg. von E. Pick, Academic Press, N. Y., 245—248 (1981)] und diejenige von KuII et al. [vgl. J. Immunol. 126(4), 1279-1283(1981)]genannt werden.

Das seitens der Anmelderin eingesetzte in-vitro-Verfahren zur Analyse der TNF-Aktivität wurde entwickelt unter Verbesserung der obengenannten Methoden. Das in-vitro-Verfahren der Anmelderin, in dem die cytotoxische Aktivität des TNF gegen L-M-Zellen (American Type Culture Collection CCL 1.2) gemessen wird, wird •folgendermaßen durchgeführt: Als Kulturgefäße werden Mikrotiter-Platten mit 96 Vertiefungen, hergestellt von μ. Flow Laboratories, Inc. (USA) verwendet, und L-M-Zellen werden in Eagle's minimalem essentiellen Medium

^ ![vgl. Science 130,432—437 (1959)] kultiviert, das 10 Vol.-% hitze-inaktiviertes fötales Kalbsserum enthielt. Eine

serielle mit dem Medium verdünnte TNF-Probe (0,1 ml) und die L-M-Zellsuspension (0,1 ml; 1 χ ΙΟ⁴ Zellen) ^werden in jeder der Vertiefungen der Platten vermischt, und die Platten werden 48 h bei 37°C in 5% Kohlen-

Stoffdioxid enthaltender Luft inkubiert Am Ende der Kulturperiode wird eine 20proz. wäßrige Lösung von

Glutaraldehyd (20 μΙ) zur Fixierung der Zellen zugesetzt. Nach dem Fixieren werden die Platten mit destilliertem

Wasser gewaschen und trocknen gelassen, und 0,05proz. Methylenblau (0,1 ml) wird zum Färben der lebensfähigen Zellen hinzugefügt Die Platten werden zur Entfernung des überschüssigen Farbstoffs gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen. 3proz. Salzsäure (0,2 ml) wird in jede Vertiefung gegeben, um den Farbstoff aus den gefärbten Zellen zu extrahieren. Die Extinktion jeder Vertiefung wird bei 665 nm mittels eines Titertek Muitiskan, hergestellt von Flow Laboratories, Ine, gemessen. Die Extinktion ist der Zahl der lebensfähigen Zellen proportional. Die TNF-Aktivität, gemessen in Einheiten/ml (U/ml) wird definiert als die reziproke Verdünnung des TNF, die eine Cytotoxizität von 50% hervorruft; sie kann erhalten werden durch Auftragen der Verdünnung gegen die Extinktion in einer graphischen Darstellung. Sämtliche TNF-Aktivitäten, die mit Hilfe der im folgenden angewandten in-vitro-Methode analysiert wurden, sind in der oben definierten Einheit angegeben.

Mit Hilfe des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine wirksame und fortgesetzte Versorgung mit hochgereinigtem TNF, das als ein klinisch anwendbares wirksames Antitumor-Medikament gilt, im technischen Maßstab sichergestellt werden, weil bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung die Aktivität des TNF während der Lagerung erhalten bleibt beim Vorliegen des TNF sowohl in Form einer Lösung als auch ! in Form einer gefrorenen Masse oder eines lyophilisierten Präparats, sowie auch während der Schritte der

Reinigung und der Herstellung pharmazeutischer Präparate. Es wurde auch gefunden, daß die TNF-Lösung oder das TNF-Pulver, worin ein Stabilisierungsmittel ausgewählt aus einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mit-

tel, wenigstens einer Substanz ausgewählt aus der aus D-Glucose, D-Galactose, D-Xylose, D-GIucuronsäure, I

einem Salz der D-Glucuronsäure, Trehalose, einem Dextran und einer Hydroxyethyl-Stärke bestehenden Grup- *■

pe und Mischungen aus diesen eingearbeitet ist, dem menschlichen Körper sicher verabreicht werden kann, da 3

das anwesende Stabilisierungsmittel keine Antigenizität im Menschen besitzt; infolgedessen ist die neue Zusam- f

mensetzimg gemäß der vorliegenden Erfindung besonders wertvoll, wenn TNF klinisch als Antitumor-Medika- |

ment angewandt e/ird. fr

Es ist weiterhin darauf hinzuweisen, daß das in der vorliegenden Erfindung einzusetzende StabiUsierungsmit- !!

tel die Messung der Reinheit des TNF nicht stört so daß bei Einarbeitung des in der vorliegenden Erfindung |

einzusetzenden Stabilisierungsmittels in eine TNF enthaltende wäßrige Lösung oder PulvermasEe die Reinheit |

des TNF in der wäßrigen Lösung oder Pulvennasse exakt bestimmt werden kann. |

Darüber hinaus kann das in der vorliegenden Erfindung einzusetzende Stabilisierungsmittel in hoher Qualität |*. unter zumutbaren Kosten erhalten werden.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand des folgenden Bezugsbeispiels, der Arbeitsbeispiele und der Vergleichsbeispiele näher erläutert, ist jedoch nicht auf diese beschränkt.

Bezugsbeispiel

Weibliche Kaninchen, jeweils im Gewicht von 2 bis 3 kg, erhielten jeweils intravenöse Injektionen von 75 mg |·

mit Formalin abgetöteter Zellen von Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum; Wellcome Research J

Laboratories, England). Acht Tage später erhielt jedes Kaninchen eine intravenöse Injektion von 100 μg Endoto- w

sin (Lipöpuijsaccharid von Escherichia coli 026 : 86. hergesteiit von Difco Laboratories, USA). Das Blut jedes f.

Kaninchens wurde durch fcardiiie Punktion 2 h nach der Injektion des Endotoxins entnommen, und das gewon- |

nene Blut wurut ,r.it einer kleinen Menge Heparin vermischt Das Blut wurde 15 min mit einer Rotationsge- |

schwindigkeit von 3000 min-' zentrifugiert Als Produkt wurde ein Plasma mit einer TNF-Aktivität von %

2500 U/ml erhalten. |

Das so gewonnene TNF-haltige Plasma (101) wurde mit 5 1 0.03 m Phosphat-Puffer (pH 7,8) verdünnt Das |

verdünnte Plasma wurde auf eine Säule (10 cm χ 42 cm) mit DEAE-Sepharose CL-6B (hergestellt und vertrieben jf

von Pharmacia Fine Chemicals AB. Schweden) gegeben, die mit 0,03 M Phosphat-Puffer (pH 7,8), der 0,13 M '|,

NaCl enthielt, ins Gleichgewicht gesetzt worden war. Die Säule wurde mit 2,5 10,03 M Phosphat-Puffer (pH 7,8), J|

der 0,13 M NaCl enthielt gewaschen, und das adsorbierte TNF wurde eluiert mit einem linearen NaCI-Gradien- ψ

ten. der aus 5,010,03 M Phosphat-Puffer (pH 7,8), der 0.15 M NaCl enthielt, und 5,010,03 M Phosphat-Pu ff er (pH %

7.8). der OJ M NaCl enthielt bestand. Die Durchfluß-Geschwindigkeit betrug 230 ml/h, und es wurden Fraktio- |%

nen von 45 ml abgenommen. Die TN F-Aktivität wurde gefunden in den Fraktionen, die mit 0,20 bis 0,24 M NaCl V¹

eluiert wurden. Die Fraktionen mit TNF-Aktivität wurden vereinigt und über Nacht gegen 0,03 M Tris-HCl-Puf- !*:

fer (pH 7,2), der 0.13 M NaCl enthielt dialysiert !

Die dialysierte TNF Lösung wurde erneut Chromatographien über eine DEAE-Scpharose CL-eB-Säule, die |

mit 0.03 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,2). der 0,15 M NaCl enthielt, ins Gleichgewicht gesetzt worden war. Das ?

adsorbierte TNF wurde eluiert mit einem linearen NaCl-Gradienten, der aus 500 ml des vorstehenden Gleichgc- '

wichts-Puffers und 500 ml 0.03 M Tris-HCl-Puffer (pH 7.8), der 03 M NaCl enthielt bestand. Die Durchfluß-Ge- ;;

schwindigkeit betrug 40 ml/h, und es wurden Fraktionen von 10 ml abgenommen. Die Fraktionen mit TNF-Akti- !'■

vität wurden vereinigt und konzentriert. ι.

Das Konzentrat wurde gel-filtriert durch eine Säule (5 cm χ 100 cm) mit Sephacryl S-200 (hergestellt und ,p

vertrieben von Pharmacia), die mit 5mM Phosphat-Puffer (pH 7,0), der 0.15 M NaCl enthielt, ins Gleichgewicht ,·

gesetzt worden war. Die Elution wurde mit dem für die Gleichgewichtseinstellung benutzten Puffer durchge- ί

führt Die Durchfluß-Geschwindigkeit betrug 80 ml/h, und es wurden Fraktionen von 13 ml abgenommen. Die J

Fraktionen mit TNF-Aktivität wurden vereinigt und durch Ultrafiltration konzentriert. <t.

Für die auf diese Weise erhaltene TNF-Lösung wurde eine spezifische Aktivität von 5,0 χ ΙΟ⁵ U/mg Protein )

und eine Reinheit, die 10 OOOmal hoher war als diejenige des Plasmas, gefunden. I

Die auf diese Weise erhaltene TNF-Lösung wurde erneut an der gleichen Säule (Sephacryl S-200) unter «

Verwendung des gleichen Puffers Chromatographien, wodurch eine TNF-Lösung erhalten wurde, die eine |

spezifische Aktivität von 1.0 χ ΙΟ⁶ U/mg Protein besaß. «

Beispiel 1 |

\ 55 Kaninchen-TNF mit einer spezifischen Aktivität von 5,0 χ 10⁵ U/mg, erhalten nach den Arbeitsweisen, die im |

Bezugsbeispiel beschrieben wurden, wurde mit 0.1 M Phosphat-Puffer (pH 7.0) verdünnt, der 0.15 M Natrium- ι

chlorid enthielt, so daß eine TNF-Lösung mit einer TNF-Aktivität von 1000 U/ml erhalten wurde. Zu aliquoten i Anteilen der so erhaltenen TNF-Lösung wurden verschiedenartige nicht-ionische oberflächenaktive Mittel, wie sie in der Tabelle 1 aufgeführt sind, getrennt als Stabilsierungsmittel in solchen Mengen hinzugefügt, daß die erhaltene Lösung eine Konzentration von 10 ^%lm\ aufwies.

Für jede der erhaltenen Lösungen wurde die verbleibende Restaklivität bestimmt für

i) Proben, die 2 d, 7 d bzw. 30 d bei 4°C aufbewahrt worden waren;

ii) Proben, die einem Cyclus des Einfrierens (-70⁰C) und Auftauens und drei solchen Cyclen unterworfen worden wären, und

iii) Proben, die dem Einfrieren bei —70⁰C, der Lyophilisierung und der 7tägigen Aufbewahrung bei 25°C unterworfen worden waren.

Bei der Durchführung des genannten Tests wurde die TNF-Lösung, in die kein Stabilisierungsmittel eingearbeitet worden war, als Kontrolle verwendet. Das lyophilisierte Präparat [vgl. oben unter iii)] wurde in sterilem destilliertem Wasser gelöst und dann der Analyse der TNF-Aktivität unterworfen.

Zur Bestimmung der Restaktivität wurde die Aktivität jeder Probe in vitro oder in vivo mittels der im vorstehenden beschriebenen Verfahren analysiert. Bei der in-vitro-Methode wurde die Restaktivität (°/o) aus 5 dem Analysenwert nach der folgenden Gleichung berechnet:

Restaktivität (%) = -g- χ 100,

A die TNF-Aktivität der Probe nach der Aufbewahrung oder physikalischen Behandlung ist und B die TNF-Aktivität der Probe vor der Aufbewahrung oder physikalischen Behandlung ist

Bei der in-vivo-Methode wurde jede Probelösung mit Hilfe des Mini-Module NM-3 (Warenzeichen der von Asahi Chemical Industry Co. Ltd, Japan, hergestellten und vertriebenen Ultrafiltrationsapparatur) eingeeDgt„so daß ihre Konzentration das Dreißigfache der Ausgangskonzentration betrug. Dann wurden jeweils 0,5 ml der so konzentrierten TNF-Lösungen durch die Schwanzvene jeweils einer Gruppe von 5 tumortragenden Mäusen injiziert Die TNF-Aktivität wurde 24 h gemäß den im Vorstehenden beschriebenen Kriterien bestimmt Die 20 erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 1 zusammengestellt.

Tabelle 1

Stabilisierungswirkuing nicht-ionischer oberflächenaktiver Mittel

Bedingungen	in vivo	Lagerung bei 4°	5	7	C(Lösung)	in vivo	Einfrieren—	9	3	4	Lagerung	5	OO
Konirolle			93	<3		Tage	Auftauen	56	60	bei 25° C	57	Ca)
			90	90		7		60	72	(lyophil,	57
vor der Lagerung oder	+ + +4,H-H-I		85	99		-5		41	63	Präparat)	56	LU
physikal. Behandlung	+ + +5	in vitro	95	97		+ + +3, + + 1,+I		48	48	in vitro	50
Analysenmethode der Aktivität	+ + +4, + +I	Tage	90	95		+ + +2, + +I,+2		55	75	Tage	59	O
in vitro	+ + +3, + +2	2	91	95	30	+ + +2, + +I,+2	in vitro	43	60	7	55	O
	+ + +3,+ +2	99	90	<3	+ + +3, + + 1,+I	Wiederholungen	59	40	51	Ca)
	+ + +4,+ +1	90	97	80	+ + +2,+ +2,+I	1	67	52	60
100	+ + +4, + +I	71	93	85	+ + +3, + + 1,+I	58	60	59
100	+ + +2, + +1, +2	95	96	85	+ + +2, + +2, +1	69	45	57
100	+ + +4, + +1	98	88	93	+ + +3,+ + 1,+I	63	32	61
100	+ + +4, + +I	90	90	92	+ + +3, + +1,+I	47	40	50
100	+ + +3,+ +2	97	95	90	+ + +3, + +1,+I	44	50	52
100	+ + +3,+ +2	97	96	90	+ + +2, + + I,+2	66	70	61
100	+ + +4, + +I	99	96	82	+ + +3, + +1,+I	88	74	68
100	+ + +4, + +I	95	98	85	+ + +2,+ +2,+I	78	82	57
100	+ + +4, + +1	92	92	80	+ + +2, + +2, + I	70	62	69
100	+ + +3,+ +2	90	97	95	+ + +4, + + I	60	65	63
100	+ + +4, + +I	99	100	90	+ + +2,+ +2,+I	75	53	69
100	+ + +4, + +1		98	84	+ + +5
100	+ + +3, + +2			95	+ + +3,+ +2
100	+ + +4, + +1			100	+ + +5
100			90
100			98
100	92
100	95
100
100

Stabilisierungsmittel (Warenzeichen oder Trivialname) Kontrolle (ohne Stabilisierungsmittel) POE(4)-laurat (Nissan Nonion L-4) POE(6)-stearat (Nissian Nonion S-6) POE(6)-oIeat (Nissan Nonion O-6) POE(20)-laurylether (Nissan Nonion K-220) POE(23)-laurylether (Brij 35) POE(20)-cetylether(Brij 58) POE(20)-stearylether(Nissan Nonion S-220) POE(15)-oley lether (Nissan Nonion E-215) POE(9 -10)-octylph enylether (Triton X-100) POE(10)-nonylphenylether (Nissan Nonion NS-210) Sorbitan-monopalm hat (N IKKOL SP-10) Sorbitan-sesquioleat (NlKKOL SO-15) POE(20)-sorbitanmonolaurat (Tween 20) POE(20)-sorbitanmonostearat (Tween 60) POE(20)-sorbitanmonooIeat (Tween 80) POE(20)-sorbitantristearat (Tween 85) POE(60)-hydriertes Rizinusöl (NlKKOL HCO-60) POE(40)-Rizinusöl (NIKKOL CO-40TX) POE-polyoxypropylen-Blockpolymerisat (Pluronic F68)

Anmerkungen siehe nächste Seite.

Anmerkungen zu Tabelle 1:

Die Zahlen in den mit »in vitro« bezeichneten Spalten bezeichnen die Restaktivität, wie sie im vorstehenden definiert wurde.

Die Zahlen in den mit »in vivo« bezeichneten Spalten bezeichnen die jeweilige Anzahl der Mäuse. Die 5 Bedeutung der Symbole ( — , +, + + etc.) ist im vorstehenden angegeben.

POE ist die Abkürzung für »Polyoxyethylen«.

Nissan Nonion:

Warenzeichen der nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel, die von Nippon Oil and Fats Co, Ltd, Japan, ίο

hergestellt werden. N1KK.OL:

Warenzeichen der oberflächenaktiven Mittel, die von Nikko Chemicals Co, Ltd, Japan, hergestellt werden. Briji.Tween, Triton und Pluronic:

Trivialnamen der nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel. 15

Die nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel in der Tabelle mit den Trivialnamen Briji oder Tween sind

Erzeugnisse der Wako Pure Chemical Industries, Ltd, Japan.

Triton X-100 in der Tabelle ist ein Erzeugnis der Rohm & Haas Co, USA.

Pluronic F68 in der Tabelle ist ein Erzeugnis der Asahi Denka fCogyo K. K, Japan.

Beispiel 2

Zu aliquoten Anteilen der TNF-Lösung mit der gleichen TNF-Aktivität wie die in Beispiel 1 eingesetzte Lösung wurden verschiedenartige Zucker und zuckerähnliche Verbindungen, wie sie in der Tabelle 2 aufgeführt sind, getrennt als Stabilisierungsmittel zur Herstellung von jeweils zwei Lösungen in solchen Mengen hinzuge- 25 fügt, daß die erhaltenen unterschiedlichen Lösungen Konzentrationen von 100 mg/ml und von 300 mg/ml aufwiesen. Die Stabilisierungswirkung der Zucker und zuckerähnlichen Verbindungen wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 bestimmt. Jedoch konnten die Probelösungen, zu denen Dextran oder Hydroxyethylstärke hinzugefügt war, nicht auf V30 ihres ursprünglichen Volumens konzentriert werden, und infolgedessen wurde ihre TNF-Aktivität nicht nach der in-vivo-Methode analysiert. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 2 30 zusammengestellt.

jj 40

\ ⁴⁵

f ⁵⁰

55

11

SSg^

Tabelle 2

Stabilisierungswirkung von Zucker und zuckerfthnltchen Verbindungen

Stabilisierungsmittel

Kontrolle (ohne Stabilisierungsmittel)

D-Glucose

Bedingungen	Kontrolle	Lagerung bei 4°	C (Lösung)	Einfrieren—	Lagerung
Konzentration	vor der Lagerung oder			Auftauen	bei 25° C
mg/ml	physikal. Behandlung				(lyophil.
					Präparat)
	Analysenmethode der Aktivität
	in vitro in vivo	in vitro	in vivo	in vitro	in vitro
		Tage	Tage	Wiederholungen	Tage
		2 7	30 7	1 3	7

100

<3

<3 -5

100 300	100 100	4-4-4-3,4-4-2 4-4-4-4, 4-4-1	75 84	90 91	66 86	4-4-4-2, 4-4-2; 4-1 4-4-4-3,4-4-1,4-1	54 88	37 82	51 65	U) OJ
100 300	100 100	4-4-4-4, 4- 4-1 4-4-4-4, 4-1	88 74	68 80	35 75	4-4-4-1,4-4-2,4-2 4-4-4-2, 4-4-3	45 76	36 57	48 60	OJ ι—^
100 300	too 100	4-4-4-3,4-4-2 4-4- 4-4, 4-4-1	62 79	51 70	24 50	4-4-4-1, 4-4 4-4-4-1.4-4-2, 4-2	50 82	36 70	47 61	O OJ
100 300	100 100	+ 4- 4-5 4-4-4-4,4-1	82 87	77 93	72 97	4-4-4-2, 4-4-2, 4-1 4-4- 4-4,4-1	57 58	35 47	54 54
100 300	100 100	4- + 4- 4, 4- 4-1 4-4-4-3,4-4-2	100 100	97 86	91 100	4-4-4-4, 4-4-1 4-4-4-4. 4-4-1	81 91	56 84	82 90
100 300	100 100	—	78 100	60 83	23 53	—	46 65	36 83	53 67
100 300	too 100	—	62 73	50 65	15 27	—	69 71	46 69	62 64
100 300	100 100	—	96 86	cn Ln (O 09	42 43	—	75 70	49 57	54 61

D-Galactose D-Xylose D-Glucuronsäure (Na) Trehalose Dextran 10 Dextran 70 Hydroxyethylstärke Anmerkungen zu Tabelle 2:

Die Zahlen in den mit »in vivo« bezeichneten Spaten bezeichnen die jeweilige Anzahl der Mäuse. Die Bedeutung der Symbole (-. +. + + etc.) ist im vorstehenden angegeben.

Das mittlere Molekulargewicht der Hydroxyethyi'stärke beträgt etwa 200 000.

sgsasagB^i^^

Beispiel 3

Zu aliquoten Anteilen der TNF-Lösung mit der gleichen TNF-Aktivität wie die in Beispiel 1 eingesetzte Lösung wurden jeweils Polyoxyethylen(20)-sorbitanmonooleat (Tween 80, ein Erzeugnis der Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan), Polyoxyethylen(6)-stearat (Nissan Nonion S-6, ein Erzeugnis der Nippon Oil and Fats Co., Ltd., Japan), Polypxyethylen(23)-laurylether (Brij 35, ein Erzeugnis der Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan), Polyoxyethylen(60)-hydriertes!Rizinusöl (NIKKOL HCO-60, ein Erzeugnis der Nikko Chemical Co., Ltd., Japüiif, Polyoxyethylen-polyoxypropylen-Blockpolymerisat (Zahlenmittel des Molekulargewichts: etwa 8350; EO-Gehalt'i 80%).(Pluronic F68, ein Erzeugnis der Asähi Denka Kögyo K. K., Japan) und Trahalose getrennt als Stabilisierungsmittel zur-Herstellung'von Lösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen hinzugefügt. Jede der erhaltenen Lösungen wurde 7 Tage bei 4° C aufbewahrt und danach der Analyse der TNF-Aktivität nach der in-vitro-Methode unterzogen. Die TNF-Restaktivität wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 berechnet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den F i g. 1 bis 6 dargestellt.

Beispiel 4

Kaninchen-TNF mit einer spezifischen Aktivität von 1,Ox 10⁶ U/mg, das nach den im Bezugsbeispiel beschriebenen Arbeitsweisen erhalten worden war, wurde mit 0,1 M Phosphat-Puffer (pH 7,0), der 0,15 M Natriumchlorid enthielt, verdünnt, wodurch TNF-Lösungen mit der jeweiligen Aktivität 100 ü/mi, iOOO U/'mi, Ϊ0 000 U/mi und 100 000 U/ml hergestellt wurden. Zu einem aliquoten Anteil der auf diese Weise hergestellten TNF-Lösungen wurden NIKKOL HCO-60 und Trehalose getrennt in solchen Mengen hinzugefügt, daß die erhaltenen unterschiedlichen Lösungen Konzentrationen von 10 μg/m! und von 100 mg/ml aufwiesen. Jede der erhaltenen TNF-Lösungen wurden 7 Tage bei 4°C aufbewahrt und dann der Analyse der TNF-Aktivität nach der in-vitro-Methode unterzogen. Die TNF-Restaktivität wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 berechnet. Als Kontrollen wurden aliquote Anteile der jeweiligen TNF-Lösungen, in die weder NIKKOL HCO 60-60 noch Trehalose eingearbeitet worden waren, ebenfalls der Analyse der TNF-Aktivität unterzogen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 3 aufgeführt.

Tabelle 3 |

Stabilisierungswirkung von NIKKOL HCO-60 und Trehalose

Konzentration des TNF, O(Kontrolle) NIKKOLHCO-60 Trehalose

U/ml ^g/ml 100 mg/ml |

100 3 86 79

1 000 5

10 000 43

100 000 47

Die Zahlen bezeichnen die prozentuale Restaktivität des TNF. 4<;

Vergleichsbeispiel 1

Die TNF-Stabilisierungswirkung und die cytotoxische Aktivität verschiedener oberflächenaktiver Mittel und _i

Alkohole wurde untersucht. Als nicht-ionische oberflächenaktive Mittel wurden Polyoxyethylen(20)-sorbitan- 45 I

monooleat (Tween 80), Polyoxyethylen(60)-hydriertes Rizinusöl (NIKKOL HCO-60) und Polyoxyethylen-polybxypropylen-blockpolymerisat (Pluronic F68) eingesetzt. Als Vergleichs-Zusatzstoffe wurden Natriumdodecylsulfat (ein anionisches oberflächenaktives Mittel), Cetyltrimethylammoniumbromid (ein kationisches oberflächenaktives Mittel) und verschiedene Alkohole, wie sie in der Tabelle 4 aufgeführt sind (die wohlbekannte Stabilisierungsmittel für die Lösungen gebräuchlicher, physiologisch aktiver Substanzen sind), eingesetzt.

Die TNF-Stabilisierungswirkung und die cytotoxische Aktivität der obenerwähnten Zusatzstoffe wurden nach den folgenden Verfahren geprüft:

86	79
99	96
98	10!
101	98

i) Stabilisierungswirkung

Zu aliquoten Anteilen der gleichen TNF-Lösung, die auch in Beispiel 1 eingesetzt wurde, wurden die im |

vorstehenden genannten oberflächenaktiven Mittel jeweils in verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt (0,05 mg/ml und 0,5 mg/ml im Falle der oberflächenaktiven Mittel, 5 mg/ml im Falle des Ethanols und 100 mg/ml im Falle der anderen Alkohole. Anschließend wurde die prozentuale TNF-Restaktivität jeder Lösung in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 bestimmt

ii) Cytotoxische Aktivität

TNF-Lösungen mit den gleichen Zusatzstoff-Konzentrationen wie unter i) angegeben wurden hergestellt und

lOOfach mit Eagle's minimalem essentiellen Medium wie im vorstehenden erwähnt verdünnt. Anschließend

5 wurde die cytotoxische Aktivität jeder der verdünnten Lösungen in der gleichen Weise wie im vorstehenden für

die Analyse der TNF-Aktivität nach der in-vitro-Methode beschrieben analysiert. Bei dieser Analyse erfolgte die

Auswertung der TNF-Aktivität nach den folgenden Kriterien:

+ (cytotoxii'eh): Letalität von 50% oder mehr der L-M-Zellen;

ίο - (nicht cytotoxisch): Letalität von weniger als 50% oder mehr der L-M-Zellen.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in derfolgenden Tabelle 4 aufgeführt.

14

SS^iSiSSiw^SiSS'^SSSSSSäSSai

Tabelle 4

Bedingungen	Cytotoxische	Lagerung bei 4° C	in vivo
Konzentration	Aktivität	Methode der Analyse der Aktivität	Tage
(mg/ml)		in vitro	0
		Tage
		0 2 7 30

-5

Zusatzstoff

(Warenzeichen oder Trivialname)

Kontrolle (ohne Stabilisierungsmittel) — — 100 5 <3 <3 + + +4,+ + I

POE(20)-sorbitanmonooleat(Tween80)
POE(60)-hydriertes Rizinusöl(NIKKOL HCO-60) POE-polypropylen-Blockpolymerisat (Pluronic F 68) Natriumdodecylsulfat

Cetyltrimethylammoniumbromid

0,05 0,5

0|05 0,5

100 100	100 100	96 100	95 98	+ + +4, + + +3,	+ + 1 + +2	+ + +3,+ +2 + + +3,+ +2	CO CO
100 100	97 98	100 96	98 98	+ + +3, + + +4,	+ +2 + + 1	+ + +3, + +2	CO H-».
100 100	99 97	91 100	85 95	+ + +4, + + +5	+ + 1	+ + +5 + + +3, + +2	003
100	60 *	8	<3 *	+ + +4,	+ +1	+ 1,-4 -4, tot 1

+ + +2, + +2, +1 -4, tot 1 + + +3,++2 -2, tot 3

Polyethylenglycol 1500 100 —

Polyethylenglycol 6000 100 —

Sorbit 100 -

Glycerin 100 -

Propylenglycol 100 —

Ethanol 5 —

Anmerkung zu Tabelle 4: * ■■'-'-]

*) Die TNF-Aktivität nach der in-vitro-Methbdekonnte wegen der cytotoxischcn Aktivität des!Zusatzstoffs!gegenüberden L^;M-Zellen'nichtänälysieft'wefaen. '"

100	7	<3	<3	+	+ +4, + + I	-5	-4
100	52	<3	<3	+	+ +3,+ +2	+ 1,
100	5	<3	<3	₊	+ +4, + + I	-5
100	10	<3	<3	+	+ +4.+I	-5	-4
100	10	<3	<3	■ +	+ +3, + + 1,+I	+ 1.
100	<5	<3	<3	■+■	+ +3, ++2	-5

Vergieichsbeispiel 2

Als in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Zucker und zuckerähnliche Verbindungen wurden D-GIucose, Natrium-D-glucuronat, Trehalose und Hydroxyethylstärke (mittleres Molekulargewicht: etwa 200 000) eingesetzt Als Vergleichs-Zusatzstoffe wurden verschiedenartige Zucker und zuckerähnliche Verbindungen eingesetzt, die wohlbekannte Stabilisierungsmittel für die Lösungen gebräuchlicher, physiologisch aktiver Substanzen sind.

Zu aliquoten Anteilen der gleichen TNF-Lösung, die auch in Beispiel 1 eingesetzt wurde, wurden jeweils die im vorstehenden genannten Zucker und zuckerähnlichen Verbindungen zugegeben. Für jeden Zusatzstoff ίο wurden jeweils zwei Lösungen mit Konzentrationen von 10 mg/ml und 200 mg/ml hergestellt Jede der erhaltenen TNF-Lösungen wurde 7 Tage bei —4° C aufbewahrt und danach der Analyse nach der in-vitro-Methode wie im vorstehenden erwähnt unterworfen. Die prozentuale TNF-Restaktivität wurde aufgrund der erhaltenen Werte der TNF-Aktivität in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 berechnet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 5 aufgeführt

Tabelle 5 Zusatzstoff

I

Kontrolle (ohne Stabilisierungsmittel)

D-Glucose

D-Gl'jcuronsäure (Na)

Trehalose 25 Hydroxyethylstärke

D-Arabinose

D-Ribose

D-Fructose

D-Mannose 30 Sorbit

Inosit

GIuconsäure(Na)

D-Glucosamin (HCl)

Lactose 35 Maltose

Saccharose

/^-Cyclodextrin

Chondroitin-Schwefelsäure A (Na)

Dextran-Schwefelsäure 40 (Na: Molekulargewicht etwa 60 000)

Wie aus den oben beschriebenen Beispielen und Vergleichsbeispielen hervorgeht, läßt sich mit Hilfe des Verfahrens zur Stabilisierung des TNF gemäß der vorliegenden Erfindung die TNF-Aktivität während der Aufbewahrung des TNF in Form einer Lösung und während der Operationen des Einfrierens, Auftauens, der Lyophilisierung, der Wärmebehandlung oder dergleichen stabil aufrechterhalten.

Konzentration	Restaktivitat
mg/ml	%
	<3
200	89
200	75
200	94
200	63
200	<3
200	<3
200	<3
200	<3
200	<3
200	<3
200	20
10	3
200	<3
200	<3
200	<3
10	<3
10	3
to	<3

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Stabilisierung des Tumor-Nekrose-Faktors, dadurch gekennzeichnet, daß zu einer den Tumor-Nekrose-Faktor enthaltenden wäßrigen Lösung oder Pulversubstanz eine wirksame Menge eines Stabilisierungsmittels ausgewählt aus wenigstens einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel, und/oder wenigstens einer Substanz ausgewählt aus der aus D-Glucose, D-Galactose, D-Xylose, D-Glucuronsäure. einem Salz der D-Glucuronsäure, Trehalose, einem Dextran und einer Hydroxyethyl-Stärke bestehenden Gruppe zugesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Stabilisierungsmittel ein nicht-ionisches ίο oberflächenaktives Mittel ist

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel einen HLB-Wert von 9 bis 20 besitzt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet daß das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel einen HLB-Wert von 13 bis 18 besitzt.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel ausgewählt ist aus einem Polyoxyethylen-fettsäureester, einem Polyoxyethylen-alkylether, einem Polyoxyethylen-alkylphenylether, einem Polyoxyethylen-sorbitanfettsäureester, einem Polyoxyethylen-glycerinfett- „.

säureester, einem Polyoxyethylen-hydrierten Rizinusöl, einem Polyoxyethylen-Rizinusöl, einem Poiyoxyet- ä

hylen-polyoxypropylen-alkylether, einem Polyoxyethylen-polyoxypropylen-Blockpolymerisat, einem Sorbi-