DE3316601A1 - METHOD FOR IMMOBILIZING PROTEINS OR ENZYMES - Google Patents

Abstract

In order to proceed to the immobilization of proteins, amino acid blocks with functional side chains are inserted in the non-essential portions of amino acid sequences of protein molecules by using the genetic engineering technologies. Thereafter, a cross-linking of the inserted portions is effected with the carrier material.

Description

Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen Process for immobilizing proteins

oder Enzymen ====~==================~=================== Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen, insbesondere von Enzymen, bei dem Proteine mit Trägermaterialien verknüpft werden. or enzymes ==== ~ ================= ~ ==================== The invention relates to a method for immobilizing proteins, in particular enzymes, in which proteins are linked to carrier materials.

In weiten Bereichen der chemischen und medizininischen Analytik, der Medizintechnik und der industriellen Produktion von Feinchemikalien ist es wünschenswert, Proteine und Enzyme stabil mit Trägermaterialien zu verknupfene So ließe sich z.B. durch fixierte Enzyme, immobilisierte Antikörper oder gebundene Antigene der apparative Aufwand für analytische Tests verkleinern; Oberflächen, die mit physiologischen Systemen in Berührung kommen, könnten durch Proteinbedeckung körperverträglich gemacht werden; durch fixierte Enzyme könnten die Produktionsprozesse kontinuierlich gestaltet werden, was die Kosten für den Katalysator senken und die Abtrennung der Enzyme aus den Produkten überflüssig machen würde.In many areas of chemical and medical analysis, the Medical technology and industrial production of fine chemicals it is desirable Proteins and enzymes to be linked stably with carrier materials. by fixed enzymes, immobilized antibodies or bound antigens of the apparatus Reduce the effort required for analytical tests; Surfaces with physiological Systems that come into contact could be made compatible with the body through a protein covering will; Fixed enzymes could make the production processes continuous which will reduce the cost of the catalyst and the separation of the enzymes would make the products superfluous.

Eine Vielzahl von Immobilisierungsmethoden ist bekannt-.A variety of immobilization methods are known.

Diese bestehen in der physikalischen Adsorption von Proteinen an inerte Trägersubstanzen, im Einschluß in die Poren von polymeren Gelen, in der Quervernetzung von Proteinen mit bifunktionellen Reagenzien und in der kovalenten Verknüpfung mit einem reaktiven, unlöslichen Träger.These consist in the physical adsorption of proteins to inert ones Carrier substances, including in the pores of polymeric gels, in the cross-linking of proteins with bifunctional reagents and in the covalent linkage with a reactive, insoluble carrier.

Die Verwendbarkeit von proteinbedeckten Materialien und die Standzeiten enzymfixierter Reaktoren hängt wesentlich von der Stabilität der Protein-Trägerverbindung, der Resistenz gegen das Auswaschen und der Regenerierbarkeit des Systems ab. Keine der bekannten Immobilisierungsmethoden liefert ein Produkt, daß allen Anforderungen genügt. Die Gefahr des Auswaschens der Proteine bzw. Enzyme ist gering bei der kovalenten Verknüpfung der Proteine an Träger oder mit sich selbst. Die Verknüpfungsreaktionen beruhen alle darauf, daß die Proteine oder Enzyme über Amino-, Carboxy- oder andere funktionelle Gruppen der Aminosäureseitenketten in rein statistischer Weise mit den Verknüpfungsoberflächen oder Trägern reagieren. Dabei läßt sich nicht vermeiden, daß Gruppen, die für die biologische Aktivität verantwortlich sind, ebenfalls reagieren. Damit geht die biologische Aktivität verloren. Die statistische Wahrscheinlichkeit, das biologisch essentielle Gruppe an der Verknüpfungsreaktion beteiligt sind, ist um so größer, je größer die Anzahl der funktionellen Gruppen innerhalb der Aktivitätszentren verglichen mit der Anzahl der Gruppen außerhalb der Zentren der Proteine und Enzyme liegen. Zudem ist das Regenerieren, d.h. der Austausch inaktivierter Proteinmoleküle durch neue, aktive Moleküle praktisch unmöglich. Die Regenerierung bereitet bei adsorptiven Prozessen in der Regel keine Schwierigkeiten. Die Stabilität der Protein-Trägerinteraktion ist jedoch gering. Bei den Einpolymerisierungs- verfahren ist die Regenerierung nur in seltenen Fällen mdglich. Zudem ist die Auswaschgefahr relativ groß.The usability of protein-covered materials and the service life enzyme-fixed reactors depends largely on the stability of the protein-carrier compound, the resistance to leaching and the regenerability of the system. No the known immobilization methods provide a product that meets all requirements enough. The risk of washing out the proteins or enzymes is low with the covalent Linking the proteins to carriers or to themselves. The linking reactions are all based on the fact that the proteins or enzymes have amino, carboxy or other functional groups of the amino acid side chains in a purely statistical manner the linking surfaces or carriers react. It cannot be avoided that groups responsible for biological activity also respond. This means that the biological activity is lost. The statistical probability the biologically essential group involved in the linking reaction is the greater the number of functional groups within the activity centers compared to the number of groups outside the centers of proteins and enzymes lie. In addition, there is regeneration, i.e. the exchange of inactivated protein molecules practically impossible with new, active molecules. The regeneration prepares for adsorptive processes usually do not pose any problems. The stability of the protein-carrier interaction however, it is minor. In the case of the polymerisation procedure is the Regeneration is only possible in rare cases. In addition, the risk of washing out is relative great.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, das die Stabilität der kovalenten Verknüpfung erreicht, ohne daß dadurch die Proteine oder Enzyme inaktiviert werden. Es sollte ein Produkt erhalten werden, in welchem die Verknüpfung reversible gestaltet werden kann.The invention is therefore based on the object of providing a method which achieves the stability of the covalent link without affecting the proteins or enzymes are inactivated. A product should be obtained in which the link can be made reversible.

Diese Aufgabe ist erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß in die nichtessentiellen Teile der Aminosäurensequenzen von Proteinmolekülen auf gentechnischem Wege Blöcke von Aminosäuren mit funktionellen Seitenketten eingebaut und anschließend die eingebauten Teile mit dem Trägermaterial verknüpft werden. Vorteilhafte Ausführungsformen des Verfahrens sind in den Unteranspruchen 2 bis 5 beschrieben.This object is achieved according to the invention in that in the non-essential Parts of the amino acid sequences of protein molecules by genetic engineering blocks of amino acids with functional side chains incorporated and then the built-in Parts are linked to the carrier material. Advantageous embodiments of the Process are described in subclaims 2 to 5.

Die Verteilung der reaktiven Gruppen innerhalb eines Proteinmoleküls ist durch die Aminosäuresequenz bestimmt.The distribution of reactive groups within a protein molecule is determined by the amino acid sequence.

Die Reihenfolge der Aminosäuren ist genetisch in der Erbmasse der Gene fixiert und kann mit genetischen Methoden in einem engen Rahmen verändert werden. Diese Methoden lassen jedoch eine gerichtete Veränderung nicht zu, so daß eine deutliche Umverteilung der für die Fixierung der Proteine oder Enzyme verantwortlichen Aminosäuren nur mit aller größtem Aufwand zu erwarten ist.The order of the amino acids is genetic in the hereditary mass of the Genes are fixed and can be changed within a narrow framework using genetic methods. However, these methods do not allow a directed change, so that a clear one Redistribution of the amino acids responsible for the fixation of proteins or enzymes can only be expected with the greatest possible effort.

Die bekannten gentechnischen Methoden erlauben es nicht nur, Gene zu isolieren und in andere Organismen zu übertragen, sondern auch Gen-Elemente spezifisch zu veränderna wie z.B. Teile der Information zu deletieren, die lntormation mit anderen Elementen zu ergänzen oder ganze Bereiche zu substituieren. Mit diesen Eingriffen kann das Genprodukt, d.h. das Protein oder Enzym, spezifisch und gerichtet verändert werden.The known genetic engineering methods not only allow genes to isolate and transfer to other organisms, but also gene elements specifically a such as deleting parts of the information that lntormation to be supplemented with other elements or to substitute entire areas. With these The gene product, i.e. the protein or enzyme, can intervene in a specific and targeted manner to be changed.

Erfindungsgemäß werden die gentechnischen Methoden dazu benutzt, die Aminosäuresequenzen von Proteinmolekülen so zu verändern, daß die Verteilung der funktionellen Gruppen, die für die Verknüpfung von Proteinen an Oberflächen oder Trägermaterialien herangezogen werden können, derart gestaltet wird, daß durch die Immbolisierungsreaktion die biologische Aktivität der Proteine möglichst nicht verloren geht. Dazu werden klonierte Gene mit gentechnischen Methoden an einer oder mehreren Stellen geschnitten, die in nichtessentiellen Bereichen der Proteine liegen. In diese Stellen werden Blöcke von vorzugsweise n x 3 Nukleotidpaaren eingebaut, die für eine bestimmte Aminosäure oder Aminosäurefolge kodieren, wobei n eine ganze Zahl ist. Die Nukleotid-Blöcke können z.B. für Lysin, Thyrosin, saure oder andere Aminosäuren mit funktionellen Seitenketten kodieren. Vorzugsweise werden n x TGT/ACA oder n x TGC/ACG-Blöcke eingebaut. Diese Nukleotide kodieren für Cystein. Hinzu kommen die Randnukleotide, die sicherstellen, daß das Leseraster des Gens nicht verändert wird.According to the genetic engineering methods are used to Modify amino acid sequences of protein molecules in such a way that the distribution of the functional groups that are used for linking proteins to surfaces or Support materials can be used, is designed such that through the The biological activity of the proteins is not lost as far as possible goes. For this purpose, cloned genes are attached to one or more using genetic engineering methods Cut areas that are in non-essential areas of the proteins. In blocks of preferably n x 3 nucleotide pairs are incorporated into these sites code for a specific amino acid or amino acid sequence, where n is a whole Number is. The nucleotide blocks can be used e.g. for lysine, tyrosine, acidic or other Code amino acids with functional side chains. Preferably n x TGT / ACA or n x TGC / ACG blocks installed. These nucleotides code for cysteine. In addition come the edge nucleotides that ensure that the gene's reading frame is not is changed.

Der Einschub der Nukleotidsequenzen in die Gene hat zur Folge, daß bei der Expression der Gene Blöcke von Aminosäuren mit funktionellen Seitenketten in nichtessentielle der Proteine eingebaut werden. Damit verändert sich das Verhältnis der reaktiven Gruppen innerhalb und außerhalb der Aktivitätszentren der Proteinen und der Enzyme derart, daß bei der kovalenten Immobilisierung stark erniedrigte oder keine Inaktivierungsraten zu erwarten sind. Der Einbau von Cysteinblöcken in die Proteine hat überdies den Vorteil, daß die Immobilisierung über Disulfitbrücken erfolgt, die durch einfaches Waschen mit Merkaptanen oder anderen Reduktionsmitteln wieder gelöst werden kennen. Damit wird erreicht, daß Protein- bzw.The insertion of the nucleotide sequences into the genes has the consequence that in the expression of the genes blocks of amino acids with functional side chains be incorporated into non-essential of the proteins. This changes the relationship the reactive groups inside and outside the activity centers of the proteins and the enzymes in such a way that the covalent immobilization was greatly reduced or no inactivation rates are expected. The incorporation of cysteine blocks in the proteins also has the advantage that the immobilization over Disulfite bridges are made by simply washing with mercaptans or others Knowing reducing agents to be dissolved again. This ensures that protein respectively.

Enzymverbindungen mit Oberflächen oder Träger entstehen, die gleichzeitig stabil gegen das Auswaschen sind, ohne daß die Regenierbarkeit verloren geht.Enzyme compounds with surfaces or carriers arise at the same time are stable against washing out without losing their ability to be regenerated.

Als Träger können alle Materialien eingesetzt werden, die durch an sich bekannte Methoden an der Oberfläche modifizierbar sind oder reaktive Gruppen zur kovalenten Bindung von Anfang an besitzen. Die reversible Verknüpfung erfolgt vorzugsweise durch Oxidation/Reduktionsreaktionen.All materials can be used as a carrier, which by an known methods on the surface can be modified or reactive groups for covalent bonding from the start. The reversible link takes place preferably by oxidation / reduction reactions.

Die Herstellung eines fusionierten Gens wird im folgenden am Beispiel von ß-Galaktosidase erläutert. Hierzu wird das Gen einer ß-Galaktosidase-Mutante in DMS-Vektoren kloniert und mit EcoRI gespalten. In diese Spaltstelle wird ein Polynukleotid-Doppelstrang mit 6 x TGT/ACA, SATTGT/CA am 5'-Ende und /ETWA am 3'-Ende hineinkloniert. Das so veränderte Gen wird anschließend in Escherichia coli-Bakterien kloniert, das Produkt isoliert und mit einem Träger, dessen Oberfläche zur Einführung von SE-Gruppen modifiziert wurde, durch Oxidation verbunden. Die entstandenen Disulfid-Brücken können durch Reduktion wieder leicht gespalten werden. Dieses Beispiel wird schematisch wie folgt dargestellt. nicht essentiell für Aktivität ThrMetIleThrAsnSerLeuAlaValValLeuGln - (N-Terminus von t3-Gal) .ATGACCATGATTACGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAA... (5'-Ende des Gens) -TACTGGTACTAATGCTTAAGTGACCGGCACCAAAATGTT... Spaltung Spaltung mit EcoRI n t ATGACCATGATTACG AATTCACTGGCCGTCGTTTTACAA TACTGGTACTAATGCTTAA + GTGACCGGCAGCAAAATGTT Insertion von AATTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGT CAACAACAACAACAACAACATTAA > t ATGACCATGATTACGAATTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAA TACTGGTACTAATGCTTAACAACAACAACAACAACAACATTAAGTGACCGGCAGCAAAATGTT ThrMetlleThrAsnCysCysCysCysCysCysCysAsnSerLeuAlaValValLeuGln y inserierter Bereich (Cys hat -SH) The production of a fused gene is explained below using the example of β-galactosidase. For this purpose, the gene of a ß-galactosidase mutant is cloned in DMS vectors and cleaved with EcoRI. A polynucleotide double strand with 6 × TGT / ACA, SATTGT / CA at the 5 'end and / about the 3' end is cloned into this cleavage site. The gene modified in this way is then cloned in Escherichia coli bacteria, the product is isolated and linked by oxidation to a carrier whose surface has been modified to introduce SE groups. The resulting disulfide bridges can easily be cleaved again by reduction. This example is shown schematically as follows. not essential for activity ThrMetIleThrAsnSerLeuAlaValValLeuGln - (N-terminus of t3-Gal) .ATGACCATGATTACGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAA ... (5 'end of the gene) -TACTGGTACTAATGCTTAAGTGACCGGCACCAAAATGTT ... Cleavage Cleavage with EcoRI nt ATGACCATGATTACG AATTCACTGGCCGTCGTTTTACAA TACTGGTACTAATGCTTAA + GTGACCGGCAGCAAAATGTT Insertion of AATTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGT CAACAACAACAACAACAACATTAA > t ATGACCATGATTACGAATTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAA TACTGGTACTAATGCTTAACAACAACAACAACAACAACATTAAGTGACCGGCAGCAAAATGTT ThrMetlleThrAsnCysCysCysCysCysCysCysAsnSerLeuAlaValValLeuGln y advertised area (Cys has -SH)

Claims (5)

Patentansprüche 1. Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen, insbesondere von Enzymen, bei dem Proteine mit Trägermaterialien verknüpft werden, dadurch gekennzeichnet, daß in die nichtessentiellen Teile der Aminosäure sequenzen von ProteinmolekUillen auf gentechnischem Wege Blöcke von Aminosäuren mit funktionellen Seitenketten eingebaut und anschließend die eingebauten Teile mit dem Trägermaterial verknüpft werden. Claims 1. A method for immobilizing proteins, in particular of enzymes, in which proteins are linked to carrier materials, characterized in that that in the non-essential parts of the amino acid sequences of protein molecules blocks of amino acids with functional side chains incorporated by genetic engineering and then the built-in parts are linked to the carrier material. 2. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen des Proteins mindestens ein Mal in einem nichtessentiellen Bereich geöffnet und in diese Offnung ein Block von Nukleotiden kloniert wird.2. The method according to claim 2, characterized in that the gene of the protein opened at least once in a non-essential area and a block of nucleotides is cloned into this opening. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß n x 3 Basenpaare, vorzugsweise n x TGT/ACA oder n x TGC/ACG plus Randnukleotide zur Verhinderung einer Veränderung des Leserasters des Gens pro Öffnung kloniert werden, wobei n eine ganze Zahl bedeutet.3. The method according to claim 2, characterized in that n x 3 base pairs, preferably n x TGT / ACA or n x TGC / ACG plus edge nucleotides to prevent a Change in the reading frame of the gene per opening can be cloned, where n is a whole Number means. 4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das durch Hineinklonieren von Nukleotidpaaren veränderte Gen in einem Mikroorganismus kloniert, nach dem Züchten das veränderte Protein isoliert und auf chemischem Wege kovalent mit einem Trägermaterial verbunden wird.4. The method according to claim 2 or 3, characterized in that the gene modified by cloning in nucleotide pairs in a microorganism cloned, after cultivation the modified protein is isolated and chemically is covalently bonded to a carrier material. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial durch Einfügung von SH-Gruppen an der Oberfläche modifiziert wird.5. The method according to claim 4, characterized in that the carrier material is modified by inserting SH groups on the surface.