DE3316601A1

DE3316601A1 - Verfahren zur immobilisierung von proteinen oder enzymen

Info

Publication number: DE3316601A1
Application number: DE19833316601
Authority: DE
Inventors: Urs J. Dr. 6238 Hofheim Hänggi
Original assignee: Battelle Institut eV
Current assignee: Battelle Institut eV
Priority date: 1983-05-06
Filing date: 1983-05-06
Publication date: 1984-11-08
Also published as: WO1984004537A1; EP0143807A1

Description

Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen
oder Enzymen ====~==================~=================== Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen, insbesondere von Enzymen, bei dem Proteine mit Trägermaterialien verknüpft werden.
In weiten Bereichen der chemischen und medizininischen Analytik, der Medizintechnik und der industriellen Produktion von Feinchemikalien ist es wünschenswert, Proteine und Enzyme stabil mit Trägermaterialien zu verknupfene So ließe sich z.B. durch fixierte Enzyme, immobilisierte Antikörper oder gebundene Antigene der apparative Aufwand für analytische Tests verkleinern; Oberflächen, die mit physiologischen Systemen in Berührung kommen, könnten durch Proteinbedeckung körperverträglich gemacht werden; durch fixierte Enzyme könnten die Produktionsprozesse kontinuierlich gestaltet werden, was die Kosten für den Katalysator senken und die Abtrennung der Enzyme aus den Produkten überflüssig machen würde.
Eine Vielzahl von Immobilisierungsmethoden ist bekannt-.
Diese bestehen in der physikalischen Adsorption von Proteinen an inerte Trägersubstanzen, im Einschluß in die Poren von polymeren Gelen, in der Quervernetzung von Proteinen mit bifunktionellen Reagenzien und in der kovalenten Verknüpfung mit einem reaktiven, unlöslichen Träger.
Die Verwendbarkeit von proteinbedeckten Materialien und die Standzeiten enzymfixierter Reaktoren hängt wesentlich von der Stabilität der Protein-Trägerverbindung, der Resistenz gegen das Auswaschen und der Regenerierbarkeit des Systems ab. Keine der bekannten Immobilisierungsmethoden liefert ein Produkt, daß allen Anforderungen genügt. Die Gefahr des Auswaschens der Proteine bzw. Enzyme ist gering bei der kovalenten Verknüpfung der Proteine an Träger oder mit sich selbst. Die Verknüpfungsreaktionen beruhen alle darauf, daß die Proteine oder Enzyme über Amino-, Carboxy- oder andere funktionelle Gruppen der Aminosäureseitenketten in rein statistischer Weise mit den Verknüpfungsoberflächen oder Trägern reagieren. Dabei läßt sich nicht vermeiden, daß Gruppen, die für die biologische Aktivität verantwortlich sind, ebenfalls reagieren. Damit geht die biologische Aktivität verloren. Die statistische Wahrscheinlichkeit, das biologisch essentielle Gruppe an der Verknüpfungsreaktion beteiligt sind, ist um so größer, je größer die Anzahl der funktionellen Gruppen innerhalb der Aktivitätszentren verglichen mit der Anzahl der Gruppen außerhalb der Zentren der Proteine und Enzyme liegen. Zudem ist das Regenerieren, d.h. der Austausch inaktivierter Proteinmoleküle durch neue, aktive Moleküle praktisch unmöglich. Die Regenerierung bereitet bei adsorptiven Prozessen in der Regel keine Schwierigkeiten. Die Stabilität der Protein-Trägerinteraktion ist jedoch gering. Bei den Einpolymerisierungs- verfahren ist die Regenerierung nur in seltenen Fällen mdglich. Zudem ist die Auswaschgefahr relativ groß.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, das die Stabilität der kovalenten Verknüpfung erreicht, ohne daß dadurch die Proteine oder Enzyme inaktiviert werden. Es sollte ein Produkt erhalten werden, in welchem die Verknüpfung reversible gestaltet werden kann.
Diese Aufgabe ist erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß in die nichtessentiellen Teile der Aminosäurensequenzen von Proteinmolekülen auf gentechnischem Wege Blöcke von Aminosäuren mit funktionellen Seitenketten eingebaut und anschließend die eingebauten Teile mit dem Trägermaterial verknüpft werden. Vorteilhafte Ausführungsformen des Verfahrens sind in den Unteranspruchen 2 bis 5 beschrieben.
Die Verteilung der reaktiven Gruppen innerhalb eines Proteinmoleküls ist durch die Aminosäuresequenz bestimmt.
Die Reihenfolge der Aminosäuren ist genetisch in der Erbmasse der Gene fixiert und kann mit genetischen Methoden in einem engen Rahmen verändert werden. Diese Methoden lassen jedoch eine gerichtete Veränderung nicht zu, so daß eine deutliche Umverteilung der für die Fixierung der Proteine oder Enzyme verantwortlichen Aminosäuren nur mit aller größtem Aufwand zu erwarten ist.
Die bekannten gentechnischen Methoden erlauben es nicht nur, Gene zu isolieren und in andere Organismen zu übertragen, sondern auch Gen-Elemente spezifisch zu veränderna wie z.B. Teile der Information zu deletieren, die lntormation mit anderen Elementen zu ergänzen oder ganze Bereiche zu substituieren. Mit diesen Eingriffen kann das Genprodukt, d.h. das Protein oder Enzym, spezifisch und gerichtet verändert werden.
Erfindungsgemäß werden die gentechnischen Methoden dazu benutzt, die Aminosäuresequenzen von Proteinmolekülen so zu verändern, daß die Verteilung der funktionellen Gruppen, die für die Verknüpfung von Proteinen an Oberflächen oder Trägermaterialien herangezogen werden können, derart gestaltet wird, daß durch die Immbolisierungsreaktion die biologische Aktivität der Proteine möglichst nicht verloren geht. Dazu werden klonierte Gene mit gentechnischen Methoden an einer oder mehreren Stellen geschnitten, die in nichtessentiellen Bereichen der Proteine liegen. In diese Stellen werden Blöcke von vorzugsweise n x 3 Nukleotidpaaren eingebaut, die für eine bestimmte Aminosäure oder Aminosäurefolge kodieren, wobei n eine ganze Zahl ist. Die Nukleotid-Blöcke können z.B. für Lysin, Thyrosin, saure oder andere Aminosäuren mit funktionellen Seitenketten kodieren. Vorzugsweise werden n x TGT/ACA oder n x TGC/ACG-Blöcke eingebaut. Diese Nukleotide kodieren für Cystein. Hinzu kommen die Randnukleotide, die sicherstellen, daß das Leseraster des Gens nicht verändert wird.
Der Einschub der Nukleotidsequenzen in die Gene hat zur Folge, daß bei der Expression der Gene Blöcke von Aminosäuren mit funktionellen Seitenketten in nichtessentielle der Proteine eingebaut werden. Damit verändert sich das Verhältnis der reaktiven Gruppen innerhalb und außerhalb der Aktivitätszentren der Proteinen und der Enzyme derart, daß bei der kovalenten Immobilisierung stark erniedrigte oder keine Inaktivierungsraten zu erwarten sind. Der Einbau von Cysteinblöcken in die Proteine hat überdies den Vorteil, daß die Immobilisierung über Disulfitbrücken erfolgt, die durch einfaches Waschen mit Merkaptanen oder anderen Reduktionsmitteln wieder gelöst werden kennen. Damit wird erreicht, daß Protein- bzw.
Enzymverbindungen mit Oberflächen oder Träger entstehen, die gleichzeitig stabil gegen das Auswaschen sind, ohne daß die Regenierbarkeit verloren geht.
Als Träger können alle Materialien eingesetzt werden, die durch an sich bekannte Methoden an der Oberfläche modifizierbar sind oder reaktive Gruppen zur kovalenten Bindung von Anfang an besitzen. Die reversible Verknüpfung erfolgt vorzugsweise durch Oxidation/Reduktionsreaktionen.

Die Herstellung eines fusionierten Gens wird im folgenden am Beispiel von ß-Galaktosidase erläutert. Hierzu wird das Gen einer ß-Galaktosidase-Mutante in DMS-Vektoren kloniert und mit EcoRI gespalten. In diese Spaltstelle wird ein Polynukleotid-Doppelstrang mit 6 x TGT/ACA, SATTGT/CA am 5'-Ende und /ETWA am 3'-Ende hineinkloniert. Das so veränderte Gen wird anschließend in Escherichia coli-Bakterien kloniert, das Produkt isoliert und mit einem Träger, dessen Oberfläche zur Einführung von SE-Gruppen modifiziert wurde, durch Oxidation verbunden. Die entstandenen Disulfid-Brücken können durch Reduktion wieder leicht gespalten werden. Dieses Beispiel wird schematisch wie folgt dargestellt.

nicht essentiell für Aktivität

ThrMetIleThrAsnSerLeuAlaValValLeuGln - (N-Terminus von t3-Gal)

.ATGACCATGATTACGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAA... (5'-Ende des Gens)

-TACTGGTACTAATGCTTAAGTGACCGGCACCAAAATGTT...

Spaltung Spaltung mit EcoRI

n t

ATGACCATGATTACG AATTCACTGGCCGTCGTTTTACAA

TACTGGTACTAATGCTTAA + GTGACCGGCAGCAAAATGTT

Insertion von

AATTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGT

CAACAACAACAACAACAACATTAA

> t

ATGACCATGATTACGAATTGTTGTTGTTGTTGTTGTTGTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAA

TACTGGTACTAATGCTTAACAACAACAACAACAACAACATTAAGTGACCGGCAGCAAAATGTT

ThrMetlleThrAsnCysCysCysCysCysCysCysAsnSerLeuAlaValValLeuGln

y

inserierter Bereich (Cys hat -SH)

Claims

Patentansprüche 1. Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen, insbesondere von Enzymen, bei dem Proteine mit Trägermaterialien verknüpft werden, dadurch gekennzeichnet, daß in die nichtessentiellen Teile der Aminosäure sequenzen von ProteinmolekUillen auf gentechnischem Wege Blöcke von Aminosäuren mit funktionellen Seitenketten eingebaut und anschließend die eingebauten Teile mit dem Trägermaterial verknüpft werden.
2. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen des Proteins mindestens ein Mal in einem nichtessentiellen Bereich geöffnet und in diese Offnung ein Block von Nukleotiden kloniert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß n x 3 Basenpaare, vorzugsweise n x TGT/ACA oder n x TGC/ACG plus Randnukleotide zur Verhinderung einer Veränderung des Leserasters des Gens pro Öffnung kloniert werden, wobei n eine ganze Zahl bedeutet.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das durch Hineinklonieren von Nukleotidpaaren veränderte Gen in einem Mikroorganismus kloniert, nach dem Züchten das veränderte Protein isoliert und auf chemischem Wege kovalent mit einem Trägermaterial verbunden wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägermaterial durch Einfügung von SH-Gruppen an der Oberfläche modifiziert wird.