DE3315264C2 - - Google Patents

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Reinigung von rohen Trehalosedimycolaten (TDM). Aus Bakterien iso­ lierte TDM ergeben zusammen mit Zellwandgerüst (CWS) eine Zusammensetzung, die bei der Unterdrückung und Rückbildung von Tumorzellen wirksam ist.

Die Kombination von Zellwandgerüst und TDM ist bekannt (siehe Biologically Active Components from Mycobacterial Cell Walls. II. Suppression and Regression of Strain-2 Guinea Pig Hepatoma; Meyer, et al., Journal of the National Cancer Institute Monograph No. 39, SS. 115-120, Oktober 1972).

Unter Zellwandgerüst versteht man im wesentlichen eine Zell­ wand, aus der ein großer Anteil der normalerweise darin enthaltenen Proteine und Lipide entfernt wurden. Es han­ delt sich dabei um ein polymeres Mycolsäurearabinogalactan­ mucopeptid, das Trehalosemycolatreste ("P3") und un­ verdaute Tuberculoproteine enthält. Zellwandgerüst erhält man aus den Mycobakterien M. smegmatis, M. phlei, Nocardia rubra, Nocardia asteroides, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium parvum, M. kansasii, M. tuberculosis (Stamm H 37 RV und Ayoma B), und M. bovis Stamm BCG, je­ doch nicht ausschließlich nur aus diesen. Außerdem kann es auch noch aus Nicht-Mycobakterien wie E. coli, B. abor­ tus und Coxiella burnettii hergestellt werden.

Das Verfahren zur Herstellung von Zellwandgerüst ist sehr zeitaufwendig. Bakterien wie M. bovis, Stamm BCG (Bacil­ lus Calmette-Guerin) werden zu diesem Zweck gezüchtet und dann abgeerntet. Der erhaltene Vollzellrückstand wird dann auf einen Zellfraktionator (Ribi Cell Fractionator®) aufgegeben, der die Zellen aufbricht und die äußere Umhüllung bzw. Zellwand von protoplasmatischen Verun­ reinigungen abtrennt. Die erhaltenen Zellwände werden da­ nach einer Reihe von Lösungsmittelextraktionen und enzy­ matischen Behandlungen (z. B. mit Trypsin und/oder Chymotryp­ sin) unterworfen, wodurch man dann das gereinigte Zell­ wandgerüst erhält.

Die zweite Komponente, die Trehalosedimycolate (TDM), kön­ nen aus Mycobakterien hergestellt werden, wie z. B. aus M. avium, M. phlei, M. tuberculosis (Stamm H 37 RV und Ayoma B), M. bovis Stamm BCG, M. smegmatis, M. kansasii, Nocar­ dia rubra, M. bovinis und Corynebacterium diphtheriae.

Die Bakterien, wie z. B. M. avium, werden gezüchtet, abge­ erntet und dann durch Hitzeeinwirkung abgetötet. Die Zellmasse wird mit verschiedenen Lösungsmitteln extrahiert, wonach die aktive, in einem Lösungsmittel lösliche Frak­ tion extrahiert wird. Das Extrakt wird durch eine Reihe von Lösungsmittelextraktionen gereinigt, wodurch man TDM erhält (siehe Biologically Active Components from Mycobac­ terial Cell Walls, I. Isolation and Composition of Cell Wall Skeleton and Component P₃; Azuma, et al., Journal of the National Cancer Institute, Band 52, S. 95-101, 1974). Wie in dieser Literaturstelle beschrieben wird, können die TDM dann weiter durch Zentrifugalchromatographie an feinverteiltem Kieselgel gereinigt werden.

Die wie oben beschrieben hergestellte CWS- und TDM-Komponen­ te können in Form einer Öltröpfchenemulsion zur Herstel­ lung einer antitumoral wirksamen injizierbaren Zusammen­ setzung verwendet werden (siehe Immunitherapy with Non-viable Microbial Components; Ribi, et al; Annals of the New York Academy of Science, Band 227, S. 228-238, 20. Sept. 1976).

Die bekannten Emulsionen haben jedoch einen erheblichen Nachteil. Die in den gereinigten TDM zurückbleibenden Verunreinigungen beeinträchtigen nämlich erheblich die Wirk­ samkeit der Zusammensetzung, indem sie Effektivität bei der Tumorbehandlung einschränken. Bisherige Versu­ che, die TDM weiter zu reinigen, waren jedoch mit wieder­ holter zeitaufwendiger und kostspieliger Elution durch Hochdruckkieselgelsäulen verbunden. Es wurde nun gefun­ den, daß bei Verwendung einer Niederdrucksäule auf (z. B. ca. 0,7 bis 5,6 bar) mit Kieselgelteilchen mit einer Teilchengröße von ca. 15 bis 63 µm überraschenderweise und wirksam faktisch sämtliche Verunreinigungen aus den rohen TDM entfernt werden können.

Aufgabe der Erfindung war daher die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur Reinigung von rohem TDM unter Erhalt eines gereinigten TDM-Produktes, das zur Bereitung einer antitumoral wirksamen Öl-in-Kochsalzlösung-Emulsion mit CWS kombiniert werden kann.

Diese Aufgabe wird wie aus den vorstehenden Ansprüchen er­ sichtlich gelöst.

Die Literaturstellen "Chemical Abstracts 89, 1978, 53 312 und 99 686", "Chemical Abstrats 94, 1981, 206 885", "Che­ mical Abstracts 97, 1982, 138 322" und Azuma et al., J. Natl. Cancer Inst. 52, 95 (1974) dokumentieren die ursprüngliche Anwendung eines Verfahrens zur Reinigung von Trehalosedimy­ colaten bakteriellen Ursprungs.

Die obengenannten fünf Literaturstellen beschreiben wie vie­ le andere aus der Literatur bekannte die Reinigung oder Ver­ wendung von durch Chromatographie an feinverteiltem Gel ge­ reinigten Trehalosedimycolaten. Unter diesen Verfahren be­ finden sich auch die von den Erfindern genannten, die sie in bezug auf den Stand der Technik zur Reinigung von Tre­ halosedimycolaten als "wiederholbare, zeitaufwendige und kostspielige Eluierung durch Hochdruckkieselgelsäulen" be­ zeichneten.

Die Chromatographie an feinverteiltem Gel ist kostspielig und umfangreich, da es teure und spezielle Ausrüstungen er­ fordert, und für eine Abtrennung großer Mengen an Material nicht sehr zufriedenstellend ist. Es unterscheidet sich vom erfindungsgemäßen durch die Verwendung von Kieselgel mit äußerst feiner Teilchengröße, während beim erfindungsge­ gemäßen Verfahren weitaus größere Kieselgel-Teilchen verwendet werden. So wie Wasser den Lehmboden sehr viel langsamer durchdringt wie Sand, erfordert es einen viel höheren Druck, um das Lösungsmittel durch feinverteiltes Kieselgel zu pres­ sen, als durch normales Kieselgel. Es ist der erforderliche hohe Druck, der das bekannte Verfahren so sehr verteuert und langwieriger gestaltet im Gegensatz zum erfindungsgemä­ ßen. Der Vorteil mit feinverteiltem Kieselgel zu arbeiten liegt im allgemeinen darin, daß kleinere Kieselgelteilchen eine wirksamere Trennung der Komponenten zulassen als grö­ ßere Teilchen. Deshalb ist es nicht offensichtlich, daß mit einer aus relativ großen Teilchen bestehende Kieselgel­ säule der gleiche Reinheitsgrad erreicht werden kann wie mit kleineren Teilchengrößen.

Es ist ebenfalls wichtig, daß vor der Einführung des fein­ verteilten Kieselgels bei Versuchen zur Reinigung von TDM, bei denen Kieselgele mit einer Teilchengröße, die der er­ findungsgemäßen vergleichbar ist, verwendet werden, keine ausreichende Reinheit erreicht wurde, es sei denn, das ro­ he TDM wurde mehrere Male chromatographiert.

"Chemical Abstracts 90, 1979, 134 832" beschreibt die Rei­ nigung von Trehalosemonomycolaten.

Trehalosemonomycolatester weisen unterschiedliche Eigen­ schaften zu Dimycolatestern auf.

"Chemical Abstracts 90, 1979, 134 664", "Chemical Abstracts 91, 1979, 71 422" und Prome et al., Eur. J. Biochem., 63, 543 (1976) zeigen, daß eine Reinigung von bakteriellem TDM durch Anwendung verschiedener Verfahren erreicht werden kann. In allen sind jedoch mehrere Stufen der Chromatographie erfor­ derlich (in der ersten Literaturstelle 4 Stufen, in der zwei­ ten 2 Stufen und bei Prome et al. 2 Stufen), wogegen beim erfindungsgemäßen Verfahren nur eine Stufe der Chromato­ graphie erforderlich ist. Bei allen diesen Verfahren wird mindestens eine Kieselgelsäule verwendet, und eine Eluie­ rung wird mit Lösungsmitteln wie Chloroform, Methanol, Etha­ nol, Aceton und Petrolether erreicht. Die nach der Lehre dieser, eine wiederholte Eluierung umfassenden Verfahren, gereinigten TDM zeigen eine Reinheit, die mit der erfin­ dungsgemäßen erzielten Reinheit unter Berücksichtigung gleicher Kriterien (d. h. Dünnschichtchromatographie) ver­ gleichbar ist. Jedoch wurde diesseits festgestellt, daß er­ findungsgemäß hochgereinigtes TDM durch eine einzige Chro­ matographiestufe erhalten wird, d. h. ein wiederholtes Elu­ ieren ist nicht erforderlich.

Zur Lösung der rohen TDM kann eine große Zahl apolarer Lösungsmittel verwendet werden. Bevorzugt werden dabei z. B. Chloroform, Ether, Hexan, Methanol, Ethanol, Tetra­ hydrofuran, Petrolether, Heptan, Methylenchlorid, Ligroin, Propanol, Butanol, Ethylacetat, Benzol, Toluol, Essig­ säure u. a. einschließlich der Gemische davon.

Die einzelnen Fraktionen der gereinigten TDM werden mit­ einander vereinigt, wonach das Lösungsmittel entfernt wird. Das erhaltene Produkt weist faktisch keine nach­ weisbaren Verunreinigungen auf, d. h. die Reinheit be­ trägt 99,9% oder mehr. Bei Verwendung des oben beschrie­ benen Verfahrens läßt sich ohne wiederholte Reinigung ein hochreines TDM-Produkt erhalten. Dieses kann wirk­ sam mit dem CSW auf übliche Weise vereinigt werden, wo­ durch man eine starke antitumoral wirkende Zusammenset­ zung erhält.

Die nachfolgenden Beispiele dienen lediglich der Illustra­ tion und schränken die in den Ansprüchen beanspruchte Er­ findung nicht ein.

Beispiel 1 Herstellung von Roh-TDM

600 g (Feuchtgewicht) ganze Zellen von M. phlei, die vor­ gängig durch Wärmeeinwirkung abgetötet worden waren, wur­ den über Nacht mit Hilfe eines Magnetrührwerks in 4 l 95%igem Ethanol gerührt und dann durch einen 27 cm-Buch­ nertrichter mit 24,0 cm-Whatman Nr. 1-Filterpapier in einen 2 l-Filterkolben filtriert. Danach wurde die etha­ nolische Lösung entfernt. Der Zellrückstand wurde in einem 2 l-Kolben in 1500 ml einer Diethylether-Ethanol- Lösung (1 : 1) erneut suspendiert und über Nacht mit Hilfe eines Magnetrührwerks gerührt und danach, wie oben be­ schrieben, abfiltriert. Danach wurde die Ether-Ethanol- Lösung entfernt und eine zweite Ether-Ethanol-Extraktion durchgeführt und wieder abfiltriert. Nach Entfernung der Ether-Ethanol-Lösung wurde der Zellrückstand erneut in 1500 ml einer Chloroform-Methanol-Lösung (2 : 1) suspen­ diert und über Nacht mit Hilfe eines Magnetrührwerks gerührt und durch einen Buchnertrichter abfiltriert oder bei 10 000 min^-1 während 30 Sekunden zentrifugiert. Die Chloroform-Methanol-Lösung wurde entfernt. Die Extraktion und Filtration wurde zweimal wiederholt. Der Zellrück­ stand wurde luftgetrockner und abgefüllt. Die drei Chlo­ roform-Methanol-Lösungen wurden miteinander vereinigt und an einem Rotationsverdampfer in einem abgewo­ genen Rundbodenkolben eingedampft. Das Gewicht des Chlo­ roform-Methanol-Rückstandes betrug 13,0 g.

Der Rückstand wurde in 500 ml einer Chloroform-Methanol- Lösung (2 : 1) gelöst und während 1 Stunde mit Hilfe eines Magnetrührwerks gerührt und danach durch einen Sinter­ glas-Buchner-Trichter (grob, 300 ml) abfiltriert. Das Lösungsmittel wurde an einem Rotationsverdampfer in einem abgewogenen Rundbodenkolben abgedampft, wodurch man einen Rückstand von 12,5 g erhielt. Der erhaltene Rückstand wurde erneut in 400 ml Diethylether suspendiert und mit Hilfe eines Magnetrührwerks während 1 Stunde ge­ rührt. Die Suspension wurde dann in Zentrifugenflaschen mit Doppelschraubverschluß in einem GSA-Rotor bei 5000 min^-1 während 30 Minuten zentrifugiert. Die etherlö­ liche Fraktion wurde dann abdekantiert. Sowohl die ether­ lösliche als auch die etherunlösliche Fraktion wurden aufbewahrt.

Die etherunlösliche Fraktion wurde in 200 ml einer Chloro­ form-Methanol-Lösung (2 : 1) gelöst und danach durch einen Buchner-Trichter abfiltriert.

Die etherlösliche Fraktion wurde an einem Rotations­ verdampfer in einem angewogenen Rundbodenkolben einge­ dampft, wodurch man einen etherlöslichen Rückstand er­ hielt. Dieser wurde in 300 ml Ether gelöst und danach in 900 ml Ethanol ausgefällt. Das Präzipitat wurde durch einen Buchner-Trichter mit Whatman Nr. 1-Filterpapier abfiltriert und mit der Chloroform-Ethanol-Lösung (2 : 1), welche die oben be­ schriebene etherunlösliche Fraktion enthielt, vereinigt. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wurde an einem Rotationsverdampfer in einem abgewogenen Rundbodenkolben eingedampft, wodurch man 6,5 g eines Rückstandes erhielt.

Der Rückstand wurde in 200 ml einer Chloroform-Methanol- Lösung (2 : 1) gelöst und dann in einen 500 ml-Scheidetrich­ ter gegossen. Diese Lösung wurde danach tropfenweise in einen mit einem Magnetwerk ausgestatteten 2 l-Kolben der 600 ml Aceton enthielt, gegossen. Das erhaltene Prä­ zipitat wurde in einen Buchner-Filter abfiltriert, luft­ getrocknet und dann in eine abgewogene Flasche gegeben, wodurch man 4,5 g Roh-TDM erhielt.

Beispiel 2 Reinigung der Roh-TDM

2 g der in Beispiel 1 erhaltenen Roh-TDM wurden in 2 ml einer Chloroform-Methanol-Lösung (10 : 1) gelöst und dann in ein 5 ml-Rohr zur Probenvolumenbestimmung gegeben. Der restliche Teil des Rohrs wurde mit dem Lösungsmittel gefüllt. Die Lösung wurde auf eine Silikagel®-60-Säule (25 × 1000 mm) mit einer Teilchengröße von ca. 50 bis 63 µm mit Hilfe einer Pumpe aufgegeben. Die Säule wurde mit 800 ml Chlo­ roform und danach mit 1200 ml einer Chloroform-Methanol- Lösung (98 : 2) bei einer Geschwindigkeit von 4 ml/min elu­ iert (die Fließgeschwindigkeit ist kritisch, da gefunden wurde, daß die Auflösung geringer ist, wenn die Fließge­ schwindigkeit zu stark zunimmt. Eluiert wird daher im all­ gemeinen bei einer Fließgeschwindigkeit zwischen ca. 0,1 ml und 20 ml/min, gewöhnlich bei einer Geschwindigkeit zwi­ schen ca. 2 und 5 ml/min). Der Säulenabfluß wurde dann mit einem Fraktionssammler verbunden. Es wurden Fraktionen zu je 8 ml pro Rohr gesammelt, wobei die Säule mit 3500 ml einer Chloroform-Methanol-Lösung (96 : 4) eluiert wurde. Die Röhrchen, die gereinigte TDM enthielten, wurden mit Hilfe der Fleckenanteile der verschiedenen Fraktio­ nen auf Dünnschichtchromatographieplatten (Silikagel®F-254, 5 × 10, Dicke 0,25 mm) ermittelt, wobei man als Eluierungs­ mittel eine Chloroform-Methanol-Lösung (10 : 1) verwendete und diese Fraktionen mit vorgängig isolierten reinen TDM verglich. Die Sichtbarmachung der Dünnschichtchromatogra­ phieplatten erfolgte durch Besprühen der Platten mit 10%iger (Gewicht/Volumen) Phosphormolybdänsäure in Ethanol. Die Fraktionen, die gereinigte TDM erzielten, wurden mit­ einander vereinigt, wonach das Lösungsmittel auf einem Rotationsverdampfer in einem abgewogenen Rundboden­ kolben abgedampft wurde. Auf diese Weise erhielt man 358 mg gereinigte TDM.

Claims (2)

1. Verfahren zur Reinigung von aus Mycobakterien erhaltenen ro­ hen Trehalosedimycolaten durch Chromatographie ihrer Lösungen in apolaren Lösungsmitteln an Kieselgel, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man die Lösung auf eine Nieder­ druck-Kieselgelsäule mit einer Teilchengröße von ca. 15 bis 63 µm aufgibt, den Druck zwischen ca. 0,7 und 5,6 bar hält, sowie mit einer Geschwindigkeit von ca. 0,1 bis 20 ml/min eluiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man mit einer Geschwindigkeit von ca. 2 bis 5 ml/min eluiert.