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" Verfahren zur Gewinnung von leberwirkssmen Glykosiden aus Picrorrhiza
kurroa und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel In Indien wird die Pflanze
Picrorrhiza kurroa Royle ex Benth (Scrophulariaceae) medizinisch oft verwendet.
Wie aus der Literatur hervorgeht, haben Abkochungen oder alkoholische Auszüge Wirksamkeit
gegen Erkrankungen des Leber - Galle systems.
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So konnte V. N. Pandey (Dissertation Benares Hindu University, Varanasi
1966) die klinische Wirksamkeit des Extraktes aus den Wurzeln dieser Pflanze bei
infektiöser Hepatitis mit Gelbsucht nachweisen. G.N. Charturvedi und R.H. Singh
(Curr. Med. Pract., Bd. 9 (8), 1955, 5. 451) berichteten über eine- starke Wirkung
von Abkochungen aus den Wurzeln der Pflanze bei gelbsüchtigen Albinoratten.
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Es ist bekannt, dass die Wurzeln und Wurzelstöcke von Picrorrhiza
kurroa stark bitterschmeckende Ester-Glykoside
in relativ grosser
Menge enthalten. So beschrieben R.P.Rastogi et al. in J.Sci.Ind.Res., Sect. B, Bd.8
(1949), S. 173 und Bd. 18 (1959), ". 219 ein Glykosid, das sie Kutkin nannten und
folgende Struktur vor
K. Basu et al., Experentia, Bd. 26 (1970), S. 818 schlugen folgende Struktur für
Kutkin vor
Ein weiteres bitterschmeckendes Ester-Glykosid beschrieben J. Yosioka et al., Xetrahedron
Letters 969, S. 3837, das sie als Picrosid I bezeichneten und folgende Struktur
vorschlugen
Picrosid I = Zimtsäureester des Catalpols Es wurde nun gefunden, dass es auf technisch
leicht durchflrbare Weise gelingt, therapeutisch wertvolle Ester aus den Wurzeln
und Wurzelstöcken von Picrorrhiza kurroa in wesentlich höherer Ausbeute anzureichern
und zu isolieren. Dabei wurde ein neues, in grosser Menge vorkommendes Esterglykosid
isoliert, das als Picrosid II bezeichnet wird.
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Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Geirjirinung
von leberwirksamen GlyPosiden aus Picrorrhiza kurroa, das dadurch gekennzeichnet
ist, dass man die getrocknete Droge in zerkleinertem Zustand mit einem wasserhaltigen
organischen wassermischbaren Lösungsmittel bei einer Temperatur von etwa 10 bis
loooc extrahiert, den erhaltenen Extrakt 1 vom organischen Lösungsmittel befreit,
den wasserhaltigen Rückstand mit einem lipophilen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel
bei einer Temperatur von etwa 10 bis 700C extrahiert, die wässrige Phase mit etwa
15 bis 20 Gewichtsprozent Ammoniumsulfat versetzt und anschliessend mit einem organischen
Iiösungsmittel extrahiert, das zwischen etwa 60 und 1100C siedet und in Wasser eine
mässige Löslichkeit aufweist, den erhaltenen Extrakt II trocknet, unter vermindertem
Druck zur Trockene eindampft, den Rückstand durch Gegenstromverteilung zwischen
Wasser (obere Phase) und einem Gemisch aus Chloroform und Äthanol (3 : 2) (untere
Phase) reinigt und gegebenenfalls das in der wässrigen Phase vorliegende, im wesentlichen
aus Picrosid I und II bestehende Produkt an Kieselgel oder Polydextrangel Sephadex
OR LH 20 in seine Komponenten auftrennt.
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In der Praxis wird das erfindungsgemässe Verfahren so durchgefillirt,
dass man die getrocknete Droge in gut zerkleinertem Zustand mit einem wasserhaltigen
organischen wassermischbaren Lösungsmittel (Wassergehalt 10 bis 70 Volumprozent,
vorzugsweise 30 bis 40 Volumprozent) bei einer Temperatur von 10 bis loooc extrahiert,
den erhaltenen Extrakt 1 unter vermindertem oder normalem Druck vom organischen
Lösungsmittel befreit und
mit einem lipophilen, mit Wasser praktisch
nicht mischbaren Lösungsmittel bei einer Temperatur von etwa 10 bis 700C extrahiert.
Vorzugsweise wird als Lösungsmittel für diesen Zweck ein halogenierter niederer
aliphatischer Eohlenwasserstoff verwendet, z.B. Nethylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff
oder Trichloräthylen. Trichloräthylen ist im Verfahren der Erfindung ein besonders
geeignetes Lösungsmittel und wird daher bevorzugt.
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Die wässrige Phase wird nach der Extraktion mit dem lipophilen Lösungsmittel
mit 15 bis 20 Gewichtsprozent smmoniumsulfat versetzt und anschliessend mit einem
organischen Lösungsmittel extrahiert, das zwischen etwa 60 und 1100C siedet und
im Wasser eine gewisse Löslichkeit aufweist. Geeignete Lösungsmittel sind: Butanon,
n-Butanol und Isobutanol. Butanon, d.h. Methyläthylketon, eignet sich besonders
gut. Der erhaltene Extrakt II wird nach dem Troclmen z.B. über wasserfreiem Natriumsulfat
vorzugsweise unter vermindertem Druck eingeengt und der Rückstand unter vermindertem
Druck bei einer Temperatur von etwa 30 bis 700C getrocknet. Das so erhaltene rohe
Glykosidgemisch, das in einer Ausbeute von 10 bis 15 Prozent auf eingesetztes Pflanzenmaterial
anfällt, wird in der diese weiter gereinigt, dass eine Gegenstronwerteilung mit
Wasser als Oberphase und Chloroform / Äthanol als Unterphase über 4 Stufen erfolgt.
Die vereinigten Wasserphasen enthalten überwiegend Picrosid I und Picrosid II. Durch
Filtration über Kieselgel oder Polydex-trangel Sephadex X LK 20 wird ein Produkt
erhalten, das aus zwei
chromatographie Stoffen besteht, aus dem
Picrosid I und II. Die Dünnschicht-/ an DC Kieselgelplatten Fertigplatten Merck
F254, Laufmittel Butanon 85, Äthanol 15, Entwickler Vanillin j Phosphorsäure, liefert
2 Flecken (Rf = 0,55 dunkelblau, Picrosid I und Rf 0,79 grüngelb, Picrosid II).
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Dieses Gemisch zeigt im pharmakologischen Test Leberschutzwirkung.
Die Leberschutzwirkung mit dem gereinigten Glykosidgemisch wurde an männlichen Ratten,
ca. 200 g schwer und 3 bis 6 Monate alt, geprüft. Zu diesem Zweck wurden die Tiere
nach der Methode von O.H. Schwietzer und G. Schaetz (Pathologie, Diagnostik und
Therapie der Bebererkrankungen, 4. Preiburger Sympos.
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195G, Springer Verlag 1957) mit Thioacetamid vergiftet. Es wurden
4 Kollektive zu je 12 Ratten benutzt. 3 Gruppen erhielten mit der Nahrung täglich
35 mg Thioacetamid (TAA), die 4.Gruppe nur Futter. Eine der drei Gruppen erhielt
zusätzlich zum TAA 100 mg gereinigtes Picrorrhiza-Glykosid-Gemisch und die 2.Gruppe
täglich 100 mg Silymarin, von dem eine Leberschutzwirkung bekannt ist (vergl. DT-OS
1 963 318), + TAA.
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Der Versuch wurde über 100 Tage ausgeführt.
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Von der mit TAA vergifteten Gruppe waren nach 95 Tagen alle Tiere
gestorben. Von der unbehandelten Gruppe waren 2 Tiere, von der Picrorrhiza + TAA-Gruppe
3 Tiere und von der mit Silymarin behandelten Gruppe 8 Tiere gestorben.
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mit Überlebensrate von/Thioacetamid vergifteten Ratten nach 100 Tagen:
nicht vergiftet TAA + TAA + Picrorrhiza Silylmarin vergiftet 83,3 Prozent 75 Prozent
33 Prozent O Prozent Die Trennung der beiden Picroside kann nur chromatographisch
erfolgen. Durch Chromatographieren an Kieselgel mit Chloroform / Äthanolgemischen
oder an Polydextrangel Sephadex # LH 20 mit Aceton wird Picrosid II als bisher noch
nicht in der Literatur beschriebene Substanz isoliert. Das Glykosid ist amorph.
Die quantitative Analyse lieferte folgende Werte: C: 53,8 Prozent 5,5 Prozent NOCH:
6,1 Prozent.
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Das Ultrarotabsorptionsspektrum des Picrosids II in KBr ist in Fig.
1 wiedergegeben.
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Aus spektroskopischen Untersuchungen und Abbaureaktionen errechnet
sich die Summenformel C2DH28°13 Beim Verseifen von Picrosid II mit wäßriger Bariumoxid-Lösung
wird das Glykosid in Vanillinsäure und in das bekannte Catalpol gespalten (H.Schmidt
et al. J.org.Chem. 31 (1966), S. 500). Somit ist die neue Substanz ein Vanillinsäureester
des Catalpols.
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Weitere physikalische Eigenschaften von Picrosid II: [α]D20
= ~ 1790 + 20 (Methanol; c = 2)
Dunnschichtchromatographie: (Adsorbens
Si02 GF) Butanon / Äthanol 85 + 15 Rf = 0,39 Chloroform / Methanol 4 + 1 Rf = 0,15
Die Substanz zeichnet sich durch eine gute Leberschutz- und choleretische Wirkung
aus.
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Die Leberschutzwirkung wurde an weißen Mäusen geprüft. Dazu wurden
4 Gruppen von jeweils 20 weißen Mäusen benützt. Bei 3 Gruppen wurde durch einmalige
orale Verabreichung von 0,02 ml/g Tetrachlorkohlenstoff in Olivenöl eine Leberscnädigung
hervorgerufen. Die 4. Gruppe erhielt nur Ölivenöl und diente als Kontroll-Gruppe.
Dann wurde den Tieren der ersten vergifteten Gruppe 5-tägig jeweils 0,5 mg von Picrosid
II in 0,1 ml Gummiarabicum-Schleim pro 10 g Körpergewicht oral verabreicht. Die
Tiere der zweiten vergifteten Gruppe erhielten 2 mg des in der deutschen / Offenlegungsschrift
1 963 318 beschriebenen Na-Salzes des bekannten Silybinbernsteinsäurehalbesters
unter den gleichen Bedingungen. Die beiden Leergruppen erhielten 5-tägig 0,1 ml
Gummiarabicum-Schleim pro 10 O g Körpergewicht. Danach wurde die Leberschädigung
durch die Bromsulphalein-Ausscheidung (BSP) ermittelt.
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BSP Kontrollgruppe 1,8 CCl4 vergiftete Gruppe ohne Behandlung 6,7
CCl4 vergiftete Gruppe + 0,5 mg Picrosid II 2,0 CCl4 vergiftete Gruppe + 2 mg Na-Salz
3,0 des Silybinbernsteinsäurehalbesters
Cholereseversuche an Ratten
beiderlei Geschlechts nach der im Praktikum der Pharmakologie und Toxikologie von
A.Grish, VEB Gustav Fischer-Verlag Jena 1969, S. 310 beschriebenen Methode brachten
eine starke Zunahme der Gallenabsonderung der mit Picrosid II behandelten Tiere.
2 mg Picrosid entsprechen der Wirkung von 1 mg Natriumsalz der Dehydrocholsäure.
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Wegen ihrer sehr guten Leberschutz- und gallentreibenden Wirkung eignet
sich Picrosid II oder das Gemisch mit Picrosid I allgemein zur Behandlung von Lebererkrankungen,
besonders solcher, die mit einer ungenügenden Gallenproduktion einhergehen.
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Die Applikation kann oral oder intravenös erfolgen, wobei die Dosierung
je nach Gewicht des Patienten etwa 15 bis 50 mg beträgt.
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Zur oralen Verabreichung kommen insbesondere Tabletten oder Dragees
in Betracht, die den Wirkstoff in einer Menge von 10 bis 50 mg pro Verabreichungsdosis
neben den HilSs- und Trägerstoffen, wie Talkum, Stärke, Milchzucker usw., enthalten.
Zweckmäßig wird diese Form gegen den Angriff der Magensalzsäure mit den üblichen
Methoden magensaftresistent gemacht.
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Zyr i.v. Applikation verwendet man vorzugsweise Lösungen der Substanz
in Wasser unter Zusatz von Lösungsmitteln wie Äthanol oder Propylenglykol.
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Beispiel 1 18,5 kg gemahlene Picrorrhiza Droge wurden mit 18,5 Liter
Wasser befeuchtet und in einen Percolator gefüllt. Nach 3 Stunden wurde mit 150
Liter 70prozentigem Aceton (v/v) percoliert und
das Percolat kontinuierlich
unter vermindertem Druck bei 300C eingeengt. Nach Beendigung der Percolation wurden
56 kg Extrakt erhalten, der durch Ausschütteln mit 3 mal e 10 Liter Trichloräthylen
von lipophilen Stoffen befreit wurde. Die.verbleibende wäßrige Phase wurde mit 15
kg Ammoniumsulfat und 20 Liter -vollständig Butanon versetzt und solange geruhrt,
bis das Ammoniumsulfat/ gelöst war. Es bildeten sich zwei Schichten, die getrennt
wurden. Die untere wäßrige Phase wurde noch 2 mal mit je 20 Liter Butanon ausgerührt
und jedesmal getrennt. Die vereinigten Butanonphasen wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat
getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingeengt. Der verbleibende pulverförmige
Rückstand wurde bei 30 bis 400C im Vakuumtrockenschrank getrocknet. Es wurden 2,75
kg roher Glykosid-Extrakt erhalten.
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Der Extrakt zeigte im Dünnschichtchromatogramm auf Kieselgelplatten
Fertigplatten "MerckB, Laufmittel Butanon / Äthanol (85 : 15), Entwickler Vanillin
/ Phosphorsäure, 5 Flecke mit 2 Hauptflecken.-bei Rf 0,55 und 0,39.
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B e i s p.i e 1 2 200 g des gemäß Beispiel 1 hergestellten Extraktes
wurden der Gegenstromverteilung zwischen zwei Phasen, obere Phase Wasser, untere
Phase Chloroform / Äthanol (3 : 2), unterworfen. Die Verteilung wurde in 4 Schütteltrichtern
mit je 750 ml oberer und unterer Phase durchgeführt. Es zeigte sich, daß in den
4 oberen Phasen besonders die Picroside I und II angereichert waren. Deshalb wurden
die oberen Phasen vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.
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Rückstand 175 g.
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Zweckmäßiger ist es, wenn man die vereinigten oberen Phasen mit 600
g (NE4)2S04 und 1,5 Liter Butanon versetzt und solange rührt, bis sich das Salz
aufgelöst hat. Es bilden sich 2 Schichten, die getrennt werden. Die untere wäßrige
Phase wird noch 1 mal mit 1 Liter Butanon ausgerührt und getrennt. Die vereinigten
Butanonphasen werden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und
unter vermindertem Druck eingeengt. Der verbleibende, pulverförmige Rückstand wird
bei 300 bis 400C im Vakuumtrockenschrank getrocknet.
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Es werden 170 g rohes Gemisch (Picrosid I und II enthaltend) erhalten.
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DC Kieselgel Fertigplatten "Merok", Laufmittel Butanon/ Äthanol (85
: 15), Entwickler Schwefelsäure, 2 Flecke mit Rf 0,55 und 0,32 neben wenig anderen
Substanzen.
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Beispiel 3 100 g Polydextrangel Sephadex # LH 20 wurden mit 500 ml
Aceton im Erlenmeyerkolben unter Umschwenken angeschlämmt, 3 Stunden quellen gelassen
und daim in eine Säule von 500 mm Höhe und 35 mm Durchmesser gegeben. Nach dem Abtropfen
des überstehenden Acetons wurden 20 g des gemäß Beispiel 2 gewonnenen Picrosid-Gemisches
in wenig Aceton gelöst und auf die Säule gegeben. Die Elution erfolgte mit 2 Liter
Aceton. Nach dem Abtrennen der ersten 100 ml wurden 1,5 Liter aufgefangen, unter
vermindertem Druck eingeengt und im Vakuumtrockenschrank getrocknet. Der gelbe Schaum
wurde gepulvert und wog 12 g. Da s Das Dünnschichtchroniagramm zeigte, wie im Beispiel
2 beschrieben, die beiden
Picroside.
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Beispiel 4 500 g Kieselgel, Korngröße 0,05 bis 0,2 mm, wurden mit
Aceton in einem Erlenmeyerkolben unter Umschwenken ausgeschlämmt, dann in eine Säule
von 700 mm Höhe und 60 mm Durchmesser gegeben und mit 500 ml Aceton gewaschen. 100
g des nach Beispiel 2 gewonnenen Picrosidgemisches wurden unter Erwärmen in 300
ml Aceton gelöst und auf die Säule gegeben. Nach dem Einziehen erfolgte die Elution
mit 3 Liter Aceton, ohne zu fraktionieren. Das gesamte Eluat wurde winter vermindertem
Druck zur Trockene gebracht und im Vakuumtrockenschrank getrocknet. Der resultierende
gelbe Schaum wurde getrocknet und wog 75 g.
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Das Dünnschichtchromatogramm war mit dem in Beispiel 3 erhaltenen
identisch.
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Beispiel 5 20 g der gemäß Beispiel 2 gewonnenen Picrosidglycoside
wurden in wenig Methanol in einem Rundkolben gelöst und mit 10 g Kieselgel (Korngröße
0,05 - 0,2 mm)versetzt Die Mischung wurde anschließend im Rotationsverdampfer bei
30 bis 40° getrocknet.
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Der Rückstand wurde auf eine Säule von 300 g Kieselgel (Korngröße
0,05 bis 0,2 mm) gegeben, die durch Einschlammen des Adsorbens mit Chloroform /
Methanol 98 + 2 bereitet worden war.
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Es wurde mit Chloroform / Methanol 9 + 1 eluiert, und am Fraktionssammler
wurden Fraktionen von 10 ml aufgefangen. Durch DC -Kontrolle, wie im Beispiel 2
beschrieben, wurde in den Fraktionen 175 bis 211 reines Picrosid II nachgewiesen.
Die vereinigten Fraktionen hinterließen nach dem Einengen unter verminderten
Druck
4,6 g Picrosid II.
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Beispiel 6 5 g des in Beispiel 7 beschriebenen Glykosidgemisches
wurden in wenig Aceton gelöst und auf eine Säule von 350 g Kieselgel (Korngröße
0,05 bis 0,2 mm) gegeben und am Fraktionssammler mit Aceton chromatographiert. Die
Aufarbeitung erfolgte wie im Beispiel 5.
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Es wurden 2,3 g reines Picrosid II erhalten.
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Beispiel 7 6 g des im Beispiel 3 beschriebenen Picrosidgemisches
wurden in wenig Aceton gelöst und auf eine Säule, die aus 200 g Polydextrangel Sephadex
LH ph 20 mit Aceton bereitet worden war, gegeben. Durch Chromatographieren am Fraktionssammler
wurden 4 g Picrosid II gewonnen.