DE2659459C3

DE2659459C3 - Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure

Info

Publication number: DE2659459C3
Application number: DE2659459A
Authority: DE
Inventors: Robert Carl Wantagh N.Y. Nubel (V.St.A.)
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1976-03-03
Filing date: 1976-12-30
Publication date: 1980-01-03
Also published as: NL7612594A; BR7607882A; BE848666A; CA1066214A; IT1192152B; MX3997E; IE44168B1; GB1507813A; DE2659459B2; FR2343046A1; US4014742A; IE44168L; FR2343046B1; AR222444A1; DE2659459A1

Description

Wegen ihrer leichten Assimilierung, ihrer Schmackhaftigkeit und geringen Toxizität ist Zitronensäure eine der meistverwendeten Säuren in der Lebensmittel- und pharmazeutischen Industrie. Die Zitronensäure findet weitverbreitete Verwendung als ein Sauermacher in Getränken und auch als ein Antioxidans zum Hemmen des Ranzigwerdens von Fetten und Ölen. Sowohl die Säure als auch ihre Salze werden als Puffer bei der Herstellung von Marmeladen, Gelees und Gelatinepräparaten und außerdem als Stabilisatoren in verschiedenen Nahrungsmittelprodukten verwendet. Bisher verwendete man bei der Zitronensäuregärung gewisse Stämme von Aspergillus niger in wäßrigen Nährmedien, die Melasse, Saccharose, Dextrose usw. als Hauptquelle für assimilierbaren Kohlenstoff enthielten.

Jüngere, in der BE-PS 7 24 553, JP-PS 20 707 und US-PS 37 17 549 beschriebene Entwicklungen betreffen Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch aerobe Züchtung von Zitronensäure anhäufender Hefe in wäßrigen Nährmedien, die Kohlenhydrate als Hauptquelle für assimilierbaren Kohlenstoff enthalten.

In der DEOS 20 50 361 wird ein Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure durch aerobe Züchtung eines bestimmten Candida lipolytica-Hefestammes unter Verwendung von normalen Paraffinen mit 9 bis 19 C-Atomen als Hauptquelle für assimilierbaren Kohlenstoffbeschrieben.

Obgleich mit Hilfe dieses Verfahrens eine relativ gute Ausbeute an Zitronensäure guter Reinheit erzielt werden konnte, erwies sich die alleinige Verwendung von normalen Paraffinen als Hauptkohlenstoffquelle als relativ teuer, und außerdem ist es auf die Züchtung eines bestimmten Candida lipotytica*Stammes beschränkt

Aufgabe der Erfindung war es deshalb, für ein Verfahren zur Herstellung Von Zitronensäure, bei dem man einen Zitronensäure anhäufenden Hefestamm der Gattung Candida aerob in einem Wäßrigen Nährmedw um züchtet, eine preiswertere Hauptquelle für assimilierbaren Kohlenstoff zu finden, um ein derartiges

Verfahren wirtschaftlich interessanter zu gestalten.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß Paraffingatsch, ein billiges Nebenprodukt des SchmieröI-Refiningverfahrens, für das zur Zeit nur ein sehr geringer Bedarf besteht, sich ausgezeichnet als Hauptkohlenstoffquelle für assimilierbaren Kohlenstoff bei der Züchtung diverser Candida-Stämme eignet, wenn es zusammen mit einem geeigneten Soiubiiisierungsmittei, wozu auch η-Paraffine gehören, verwendet wird,

IQ obgleich es bei Raumtemperatur eine feste, im wäßrigen Nährmedium nicht dispergierbare Substanz ist und somit als solches der metabolischen Verwendung durch Candida-Zellen nicht ohne weiteres zur Verfügung steht

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure, bei dem man einen Zitronensäure anhäufenden Hefestamm der Gattung Candida aerob in einem wäßrigen Nährmedium, das genug einer leicht assimilierbaren Kohlenstoffquelle enthält, um das Wachstum zu fördern, jedoch nicht genug, um die Anhäufung von Zitronensäure zu gestatten, züchtet, ist dadurch gekennzeichnet, daß man, nachdem mindestens 50% der leicht assimilierbaren Kohlenstoffquelle verbraucht worden sind, Paraffingatsch als Hauptkohlenstoffquelle für assimilierbaren Kohlenstoff zusammen mit einem Soiubiiisierungsmittei, und zwar einem Alkanol mit 4 bis 10 C-Atomen in jedem Alkylrest, Niederalkylester von Alkansäuren mit 2 bis 6 C-Atomen, Alken oder Alkan mit 8 bis 19 C-Atomen, Terpentin, Mineralöl oder Gemische davon, in einem Verhältnis von Soiubiiisierungsmittei zu Paraffingatsch von 0,25 :1 bis 2 :1 in das wäßrige Medium einführt, die aerobe Züchtung fortsetzt, bis sich mindestens etwa ! g Zitronensäure je Liter »äßrigem Nährmedium ange-

!5 häuft hat, und die Zitronensäure gewinnt.

Es besitzt gegenüber dem Verfahren der DE-OS 20 50 361 den Vorteil, daß es wesentlich preisgünstiger und außerdem auf eine Vielzahl von Candida-Stämmen anzuwenden ist.

Im erfindungsgemäßen Verfahren ist Erdölwachs die Hauptquelle für assimilierbaren Kohlenstoff.

Erdölwachs, in der Erdölindustrie allgemein bekannt als Paraffingatsch. ist ein relativ homogenes Material, das aus langkettigen Kohlenwasserstoffen mit 20 bis 30

4^r> C-Atomen besteht. Es ist eine feste Substanz bei Raumtemperatur und besitzt einen Gefrierpunkt von etwa 45°C. Paraffingatsch wird aus bestimmten paraffinbasischen Schmierölfraktionen aus den Destillationseinheiten hergestellt. Genauer gesagt, werden die

Öle mit geeigneten Lösungsmitteln vermischt, unter Bildung von Wachskristallen abgekühlt und dann filtriert, um das Wachs vom Gemisch zu entfernen. Weitere Lösungsmittelbehandlung, Entfernung des Lösungsmittels und Behandlung mit Dampf ergibt das

halbraffinierte Wachs, das die Forderungen der FDA Food Additive Regulations siibpart D & F Section 121.1156und 121.2586 erfüllt.

Es scheint nur ein geringer laufender Bedarf für die großen Mengen an Paraffingatsch zu bestehen, die als Nebenprodukt des Schmieröl Refiningverfahrens anfallen. Der Preis liegt derzeit etwa in derselben Größenordnung wie Rohöl. Es gibt keine Literatur oder Berichte zum Stand der Technik über die Verwendung dieses Materials als Gärsubstrat für die Herstellung von

mikrowellen Produkten.

Die Neuheit der vorliegenden Erfindung Üegt in der Verwendung dieses festen Kohlenwasserstoffabfallpfoduktes als leicht verfügbares billiges Substrat für die

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Herstellung von Zitronensäure durch einen Zitronensäure anhäufenden kohlenwasserstoff-assimilierenden Hefestamm, der zur Gattung Candida gehört. Dies erfolgt, indem man zuerst den Candida-Stamm in einem wäßrigen Nährmedium wachsen läßt, das eine leicht zu handhabende Quelle von assimilierbarem Kohlenstoff enthält, so daß eine große Menge Candida-Zellen erhalten werden können. Diese leicht zu handhabende Kohlenstoffquelle kann Glucose sein, ein Pflanzenöl, ein Fettsäureester oder Gemische davon, ein Normalparaffin mit 9 bis 19 C-Atomen oder Gemische davon oder andere dem Fachmann bekannte Kohlenstoffquellen. Die bevorzugte Kohlenstoffquelle ist Glucose in einer Konzentration von 5 bis 10 Gew.-°/o/VoU vorzugsweise 7,5 Gew.-%/VoI. Außerdem enthält das Medium eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, wie Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Weizenkleie, Sojabohnenmehl, Harnstoff, Aminosäuren und Peptone. Es ist auch wohl bekannt, daß Vitamine wie Biotin und Thiamin und Miüjralkationen und Anionen, wie Natrium, Kalium, Cobalt, Phosphat und Sulfat, ebenfalls günstig für das Wachstum von Hefen sind.

Die Menge an leicht assimilierbarer Kohlenstoffquelle im Produktionsmedium ist begrenzt auf die Menge, die ausreicht für das Wachstum der zugesetzten Candida-Zellen, reicht jedoch nicht aus, um die Anhäufung von Zitronensäure zu gestatten (weniger als 0,5 g/l). Die obere Konzentrationsgrenze ist festgesetzt als diejenige Menge, zu der jede weitere Zugabe die Anhäufung von Zitronensäure gestattet (größer als 0,5 g/l). Wenn Glucke im Produktionsmedium verwendet wird, ist die Konzentration 1 bis 3 Gew.-°/o/VoI., vorzugsweise 2 Gew.-%/Vol.

Die Gärung kann so lange fortschreiten, bis mindestens 50% und vorzugsweise 80 ο der Glucose assimiliert sind (etwa 24 Stunden). Danach wird eine Menge an Paraffingatsch zugesetzt, die eine Konzentration von mindestens 3 Gew.-% des Mediums ergibt, vorzugsweise 5 bis 20 Gew. %, zusammen mit einem Solubilisierungsmittel. Die Zugabe von Paraffingatsch und Solubilisierungsmittel kann dadurch erfolgen, daß man diese gesamte Kombination auf einmal zugibt oder durch Zugabe zu unterschiedlichen Zeiten während der Gärung. Beispielsweise können nach der ersten Zugabe gleiche Zugaben in Abständen von 24 Stunden während des Gärzyklus erfolgen.

Kritisch für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Verwendung und Auswahl eines geeigneten Solubilisierungsmittels für den Paraffingatsch. Das Solubilisierungsmittel dient dem Lösen oder teilweisen Lösen des Paraffingatsch, so daß es vollständig dispergierbar in der wäßrigen Phase des Gärmediums und somit der metabolischen Verwendung durch die wachsenden Candida-Zellen verfügbar gemacht wird. Die Wahl des Solubilisierungsmittels hängt von Faktoren ab wie v. nichthemmende Wirkung auf das Wachstum von Candida-Zellen, gute Löslichkeit für Paraffingatsch. geringe Flüchtigkeit, niedrige Kosten und leichte Erhältlichkeit. Diese Kriterien werden weitestgehend erfüllt durch Alkanole mit 4 bis 10 C-Atomen in jedem m> Alkylrest, Niederalkylester von Alkansäuren mit 2 bis b C-Atomen, Alkenen und Alkanen mit 8 bis 19 C-Alomen, Terpentin, Mineralöl und Gemische davon-Ein geeignetes Solubilisierungsmittel ist Kerosin, das ein Gemisch aus Erdölkohlenwasserstoffen, hauptsächlich aus der Methanreihe mit 10 bis 16 C-Atomen je Molekül ist. Die Menge oder das Verhältnis an Solubilisierungsmittel zu Paraffingatsch hängt bis zum gewissen Grad

■es

)0 von der Art des Solubilisierungsmittels ab, beträgt jedoch im allgemeinen 0,25 :1 bis 2:1. Die bevorzugten Solubilisierungsmittel sind Octan, Nonan und Decan im Verhältnis zum Paraffingatsch von 1 :1. Dieses Verhältnis kann während der Zugabe zur Gärung verändert werden, wird jedoch im allgemeinen auf einer festgesetzten Menge gehalten.

Da der Paraffingatsch und das Solubilisierungsmittel in der wäßrigen Phase des Nährmediums nicht miscLbar sind, ist es erwünscht, sie während der Gärung in einer fein dispergierten Form zu halten, um somit sicherzustellen, daß eine große Oberfläche des Materials mit der wäßrigen Phase in Kontakt kommt Auf diese Weise wird ein optimaler Kontak: zwischen den Hefezellen, der wäßrigen Phase und dem Paraffingatsch erzielt.

Bevorzugte Maßnahmen zur Erzielung dieser Faktoren sind submerse Gärung und schnelles Rühren des Gemisches, während gleichzeitig Luft hindurchgeführt wird, z. B. durch Anschwänzen.

Es können die üblichen Temperaturen, wie sie in der Technik der Hefegärung bekannt sind, z. B. etwa 20 bis 37° C, angewandt werden, wobei ein bevorzugter Bereich bei 25 bis 29° C mit einer 4- bis 7tägigen Gärung liegt Die Produktgärung wird fortgesetzt, bis mindestens 1 g Zitronensäure pro Liter des Mediums angehäuft worden ist. Die anfängliche Wachstumsperiode der Hefezellen zur Herstellung des Inokulums beträgt vorzugsweise 24 bis 48 Stunden. Diese allgemeinen Wachstums- und Gärbedingungen sind in der Technik bekannt sowie auch die Methoden zur Gewinnung der hergestellten Zitronensäure als freie Säure, Natriumsalz oder Calciumsalz durch Zentrifugieren, Filtrieren, Einengen unter Vakuum etc. bekannt sind.

Jeder der bekannten. Zitronensäure anhäufenden Candida-Stämme eignet sich für die vorliegende Erfindung und liefert unterschiedliche Mengen an angehäufter Zitronensäure, wie es aus der Technik bekannt ist. Geeignete Stämme sind vo" verschiedenen Hinterlegungsstellen der ganzen Welt verfügbar und werden in früheren Patenten beschrieben. Beispiele für Zitronensäure anhäufende Stämme sind Candida lipolytica, Candida guilliermondii, Candida tropicalis, Candida parapsilosis und Candida brumptii. Die bevorzugten Zitronensäure anhäufenden Stämme sind diejenigen, die zur Species Candida lipolytica gehören.

Nachstehend werden Methoden zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Zitronensäure beschrieben mit reinen Bezugsproben "on Zitronensäure und !•^zitronensäure als Voraussetzung. Gaschromatographie stellt eine empfindliche Methode zur Differenzierung und Bestimmung der Menge an Isozitronensäure in Gegenwart von Zitronensäure dar.

Analysenmethoden
I. Papierchromatographie

Die nachstehenden Systeme stellen eine bequeme halbquantitative Maßnahme zur Bestimmung von Zitronensäure im Gärmedium dar. Konzentrationen von Zitronensäure, selbst geringer als 1 g je Liter des Mediums, können leicht durch diese chromatographischen Methoden bestimmt Werden.

L Lösungsmittelsystem A

Dieses Lösungsmittelsystem ist ein Volumenge·· misch von 80 Teilen Methyläthylketön, 6 Teilen Aceton, 12 Teilen destilliertem Wasser und 2 Teilen

ίο

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Ameisensäure. Zitronensäure zeigt einen Rr von etwa 0,59 bis 0,64 mit diesem System.

2. Lösungsmittelsystem B

Dieses Lösungsmittelsystem besteht aus 1 VoIumenteil Ameisensäure, 2 Teilen Cineol und 3 Teilen n-Propanol. Der Rr von Zitronensäure mit diesem System beträgt etwa 0,40 bis 0,45.

3. Losungsmittelsystem C

Dieses Lösungsmittelsystem besteht aus einem Gemisch aus Wasser/gesättigter Ameisensäure/ Äther, das durch gemeinsames Schütteln in einem Scheidetrichter eines Gemisches aus 210OmI Äthyläther, 300 ml Ameisensäure und 275 ml Wasser hergestellt worden ist Nach dem Schütteln wird die obere Lösungsmittelschicht als das Chromatographier-Lösungsmittel verwendet Der Rf von Zitronensäure mit diesem System beträgt 0^0 bis 035.

Eine 5 bis 10-Mikroliter-Probe der wäßrigen Phase des abfließenden Materials, das λ ie vorstehend beschrieben aus dem Gärmedium abgetrennt worden war, wurde bei 8O⁰C im Vakuum getrocknet, um jegliche Isozitronensäure in Lacton umzuwandeln, in Wasser wieder gelöst und auf das Papier getan, wonach das Chromatogramm auf übliche Weise durchgeführt wurde. In diesen Analysen wurde allgemein Whatman No. 1-Papier als das Absorbens und Bromcresol Grün als Indikator verwendet (hergestellt durch Lösen von 0,25 g Bromcresol Grün in 400 ml Aceton und Einstellen der Lösung auf grüne Farbe). In allen Fällen wurde eine authentische Probe Zitronensäure mit jedem Chromatogramm als Standard mitverwendet.

II. Pentabromaceton-Analyse

Verschiedene Methoden, zu denen die Bildung von Pentabromaceton gehört, können zur Bestimmung von Zitronensäure in Gegenwart von Isozitronensäure angewandt werden. Eine bevorzugte Methode wird beschrieben durch H. A. K r e b s in Biochem. J. 54. 73 (1953), und in Methods in Enzymology. Bd. XIII, verlegt durch J. M. Löwenstein, Seite 515.

III. Gaschromalographie

Dies ist eine andere quantitative Methode zur Bestimmung von Zitronensäure und Isozitronensäure, die im vorliegenden angewendet wurde. Die Analyse wird mit einem Gaschromatograph Modell Pye 104 durchgeführt mit einem Flammenionisationsdetektor unter folgenden Bedingungen:

Säule = Glas, 2,10 m χ 0,63 cm, gefüllt mit

3% OV17 auf Chrom W(HP)
Säulentemperatur = 140 bis 150⁰C
Nachweisblocktemperatur (detection block)
= 230⁰C

Heliumfließgeschwindigkeit = 50 ml/Min.
Wasserstoff-Fließgeschwindigkeit = 50 ml/Min.
Luftfließgeschwindigkeit - 500 ml/Min.
Probengröße = lOMikrolitef

Eine Standardprobe wurde hergestellt, indem man zuerst 60 mg wasserfreie Zitronensäure und 1,8 mg Isozitronensäure genau auswog. Diese würden in 3,0 ml Tetrahydrofuran (THF) gelöst, worauf 20 μΐ Schwefelsäure und anschießend 1,0 ml N,O^Bis-(trimethylsl· lyljacetamid (BSA) zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde dann 1 Stunde lang auf 6C°C erhitzt, und eine ΙΟ-μΙ-Portion wurde in den Gaschromatographen eingespritzt. Das dabei erhaltene Chromatogramm zeigt Peaks, die der Zitronensäure und der Isozitronensäure entsprechen, wobei die Bereiche unter den Peaks zweckmäßigerweise mit Hilfe eines Integrators berechnet wurden, der an den Gaschromatographen angeschlossen war.

Eine Probe der wäßrigen Phase des abfließenden Stoffes, abgetrennt vom Gärmedium, wurde dann genommen, und 1,0 m! davon wurden mindestens 4 Stunden lang gefriergetrocknet Dem getrockneten Rückstand wurden 10 ml THF, 100 μΐ Schwefelsäure und 10 Glaskugeln zugesetzt Das Gemisch wurde dann kräftig geschüttelt, um das Auflösen des trockenen Rückstandes sicherzustellen, 3 ml der Lösung wurden in eine Glasampulle getan, 1,0 ml BSA wurden zugesetzt und das Gemisch dem Gaschromatographen zugeführt und genauso behandelt, w·^ vorstehend für die Standardprobe beschrieben. U-e Mengen an Zitronensäure und Isozitronensäure in der Hrobe konnten leicht berechnet werden durch Vergleich des erhaltenen Chromatogramms mit demjenigen, das fur die Standardprobe erhalten wurde.

Beispiel 1

Zellen von Candida lipolytica NRRL Y-1094. die auf einer Kartoffeldextroseagarcchrägkultur gezüchtet worden waren, wurden in einen Fernbach-Kolben, der 800 ml eines sterilen Mediums der folgenden Zusammensetzung enthielt, inokuliert:

Bestandteil	Gramm/Liter
Glukose	75,0
MgSO₄ ■ 7 H₂O	0.25
KH₂PO₄	0.50
Calciumphytat	0,50
40 (NH₄)₂SO₄	4,0
CaCO₃	5.0
Hefeextrakt	1.0

Der inokulierte Kolben wurde bei 26° C auf einem Rotationsschüttler 48 Stunden lang inkubiert, wonach eine 100-ml-Portion der gezüchteten Kultur (Inokulum der ersten Stufe) aseptisch in einen 4-1-Fermenter übertragen wurde, der 2 1 steriles Medium enthielt, das die gleiche Zusammensetzung hatte, wie dasjenige, das im Fernbach-Kolben verwendet wurde. Der Fermenter wurde mit 175OUpM gerührt, und Luft wurde durch einen Sprinkler mit einer Geschwindigkeit von 29,88 I je Stunde je Liter des Mediums eingeführt. Die Temperatur wurde auf 26°C gehalten.

Die Gärung wurde im Fermenter 72 Stunden lang fortgesetzt, wonach 100-ml-Portioneii (Inokulum der zweiten Stufe) in eine Reihe identischer Fermenter übergeführt wurden, wobei jeder 21 des sterilen Mediums folgender Zusammensetzung enthielt:

Bestandteil

Gramm/Liter

Glukose

Thiaminhydrochlorid

MgSO₄ ·7 Η.Ο

CaCO₃

Harnstoff

KH₂PO₄

20,0
0,001
0,20

17,0
4,05
0,75

Zusätze

Gramm Zitronensäure
je Fermenter

n-Nonan keine

Paraffingatsch keine

n-Nonan + Paraffingatsch 73,61

Beispiel 5

Man verfuhr nach Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß man anstelle von n-Octan n-Decan verwendete, wobei man folgende Ergebnisse erzielte:

10

Man ließ die Gärung 24 Stunden lang fortschreiten, wonach 100 ml verflüssigter Paraffingatsch (Moore & Munger, Inc., Stamnford, Conn.) einem der Fermenter zugesetzt wurden. Auf gleiche Weise wurden 100 ml n-Octan einem zweiten Fermenter zugesetzt, und einem dritten Fermenter wurden 100 ml n-Octan und 100 ml Paraffingatsch zugesetzt. Gleiche Zusätze erfolgten zu jedem Fermenter nach 48 Stunden, 72 Stunden und 96 Stunden. Die Gärung in jedem Fermenter ließ man insgesamt 137 Stunden fortschreiten.

Zusätze Gramm Zitronensäure

je Fermenter

n-Octan keine

Paraffingatsch keine

n-Octan + Paraffingatsch 5,44

Beispiel 2

Man verfuhr nach Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß man Glukose durch Sojabohnenöi, Erdnußöl, Butylester von Oleinsäure und Glycerylester von Linolsäure ersetzte, wobei man vergleichbare Ergebnisse erhielt.

Beispiel 3

Man verfuhr nach Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß man n-Octan durch Terpentin, Kerosin, Mineralöl, Butanol, Amylalkohol, Octanol, Decanol, Äthylacetat und Butylhexanoat ersetzte, wobei man vergleichbare Ergebnisse erzielte.

Beispiel 4

Man verfuhr nach Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß man anstelle von n-Octan n-Nonan verwendete, wobei man folgende Ergebnisse erzielte:

Zusätze

20

25

35 Gramm Zitronensäure je Fermenter

n-Decan 5,37

Paraffingatsch keine

n-Decah + Paraffingatsch 181,15

Beispiel 6

Man verfuhr nach Beispiel 5 mit n-Decan zu Paraffingatsch Verhältnissen von 0,25 :1 und 2 :1 und erhielt vergleichbare Ergebnisse.

Beispiel 7

Man verfuhr nach Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß man anstelle von n-öcian n-Dodecan verwetiüeie und erhielt folgende Ergebnisse:

Zusätze

n-Dodecan

Paraffingatsch

n-Dodecan + Paraffingatsch

Gramm Zitronensäure je Fermenter

153,51 keine 208,40

Beispiel 8

Man verfuhr nach Beispiel 7 mit dem Unterschied, daß man n-Dodecan durch ein Gemisch aus n-Alkenen und n-Alkanen mit 9 bis 19 C-Atomen ersetzte, wobei man vergleichbare Ergebnisse erzielte.

Beispiel 9

Man verfuhr nach Beispiel 6, wobei man jeweils einen der folgenden Zitronensäure anhäufenden Candida-Stämme verwendete, wobei man vergleichbare Ergebnisse erzielte:

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Cand'da linolytica	ATCC 8662	ι
Candida lipolytica	ATCC 9773
Candida lipolytica	ATCC 20114	\
Candida lipolytica	ATCC 20182
Candida tropicalis	ATCC 20115
Candida intermedia	ATCC 20178	j
Candida parapsilosis	ATCC 20181
Candida guilliermondii	ATCC 20118
Candida brumptii	ATCC 20117	I

Claims

cn λ xrr\

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Zitronensäure, bei dem man einen Zitronensäure anhäufenden Hefestamm der Gattung Candida aerob in einem wäßrigen Nährmedium, das genug einer leicht assimilierbaren Kohlenstoffquelle enthält, um das Wachstum zu fördern, jedoch nicht genug, um die Anhäufung von Zitronensäure zu gestatten, züchtet, dadurch gekennzeichnet, daß man, nachdem mindestens 50% der leicht assimilierbaren Kohlenstoffquelle verbraucht worden sind, Paraffingatsch als Hauptkohlenstoffquelle für assimilierbaren Kohlenstoff zusammen mit einem Solubilisierungsmittel, und zwar einem Alkanol mit 4 bis 10 C-Atomen in jedem Alkylrest, Niederalkylester von Alkansäuren mit 2 bis 6 C-Atomen, Alken oder Alkan mit 8 bis 19 C-Atomen, Terpentin, Mineralöl oder Gemische davon, in einem Verhältnis von Soiubiiisierungsmittei zu Paraffingatsch von 0,25 : i bis 2 :1 in das wäßrige Nährmedium einführt, die aerobe Züchtung fortsetzt, bis sich mindestens etwa 1 g Zitronensäure je Liter wäßrigem Nährmedium angehäuft hat, und die Zitronensäure gewinnt.