Antibakterielle Mittel LL-C23ö24a, ß und jota und Mikroorganismus
Actinomadura yumaense NRRL 12515
Die vorliegende Erfindung betrifft antibakterielle Mittel und Anticoccidia-Mittel, die mit LL-C23024<x, ß und
jota bezeichnet sind, sowie einen neuen Mikroorganismus Actinomadura yumaense sp. nov. oder Mutanten desselben.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein neues Verfahren zur Herstellung von antibiotischem LL-C23024oc, β und jota
durch Fermentierung des neuen Mikroorganismus Actinomadura yumaense sp. nov. unter kontrollierten Bedingungen.
Das Antibiotikum LL-C23024oc hat folgende Struktur
QMe
COOH
Das Antibiotikum LL-C23O24ß gemäß der vorliegenden Erfindung
unterscheidet sich von bekannten Verbindungen aufgrund seiner physikalischen und chemischen Eigenschaften,
u.a. durch seine Mikroanalyse, seine optische Rotation, sein IR-Spektrum, sein 1^C-NMR-Spektrum und sein 1H-NMR-spektrum.
Das Antibiotikum LL-C23O24ß hat die folgende postulierte
Struktur
1BWCH3
wobei R1 und R2 verschieden sind und jeweils ausgewählt
sind unter H und CH,.
Die obige, postulierte Struktur beruht auf der Elementaranalyse, der optischen Drehung, dem mittels Felddesorptionsmassenspektroskopie
ermittelten Molekulargewicht, dem Schmelzpunkt, dem Infrarot(IR)-Spektrum, dem
'^C-kernmagnetischen Resonanz(^C-NMR)-Spektrum und dem
protonenmagnetischen Resonanz( H-NMR)-Spektrum. Die Ergebnisse
dieser Untersuchungen sind in den Beispielen genauer angegeben und sind in den Zeichnungen dargestellt;
es zeigen:
Fig. I das IR-Spektrum von LL-C23O24ß in KBr;
Fig. II das 13C-NMR-Spektrum von LL-C23O24B;
20 MHz in CDCl,, TMS als interner Standard;
Fig. III das 1H-NMR-Spektrum von LL-C23024B;
80 MHz in CDCl,, TMS als interner Standard.
Tabelle I
13C-NMR-Spektrum von LL-C23024ß (TpM relativ zu TMS)
Chemische Verschiebung (TpM) Anzahl der Kohlenstoffatome-
10.5 11.0 12.2 17.0 .17.7 17.9 22.3 26.1 26·. 8 27.6 30.2
32.0 33-3 33.7 33.8 36.5 36.8
- 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 1 1
Tabelle I (Fortsetzung) Chemische Verschiebung (TpM)
Anzahl der Kohlenstoffatome
39-0 39.9 45.5
57.
60. 66.
67.6
70 71
74 75
79.9 80.8 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
82.1 |
- |
2 |
|
|
1 |
84.5 |
|
1 |
84.7 |
|
1 |
85.6 |
|
" 1 |
86.9 |
Gesamtzahl d.
Kohlenstoff
atome |
1 |
95.8 |
1 |
■ 96.9
|
1 |
97.7 |
1 |
107.5 |
1 |
179.2 |
46 |
|
|
|
|
BAD ORIGINAL
LL-C23024 jota ist ein neues PoIyäther-Antibiotikum mit
äußerst starker Wirkung gegen Coccidia. Es ist mindestens um das 10fache potenter als die meisten anderen, bekannten
Polyäther. Die Werte des Felddesorptionsmassenspektrums zeigen, daß es ein Molekulargewicht von 930 hat. Dieser
Befund in Verbindung mit dem ^C-NMR-Spektrum gestattet
die Voraussage einer möglichen Summenformel von C48H82°17*
LL-C23024 jota scheint vier Methoxygruppen aufzuweisen sowie den gleichen Zucker, der im Polyäther-Antibiotikum
X-14868A (US-PS 4 278 663) beobachtet wurde, sowie eine Carboxylgruppe. Bei dem einzigen anderen Polyäther-Antibiotikum
mit einem Molekulargewicht von 930, das bisher beschrieben wurde, handelt es sich um das Antibiotikum
A28695B (Hedroxyseptamycin) [J.Antibiotics 33(2), 252
(1980)], welches sich hinsichtlich seiner strukturellen und biologischen Eigenschaften signifikant von dem erfindungsgemäßen
Antibiotikum unterscheidet. Die obigen Beobachtungen beruhen auf der Elementaranalyse, der optischen.
Drehung, dem berechneten Molekulargewicht mittels FeIddesorptionsmassenspektroskopie,
dem IR-Spektrum, dem ^C-NMR-Spektrum und dem 1H-NMR-Spektrum. Die Ergebnisse dieser
Messungen sind in den Beispielen im Detail erläutert und in den Zeichnungen dargestellt; es zeigen:
Fig. IV das IR-Spektrum von LL-C23024 jota in KBr;
Fig. V das 1H-NMR-Spektrum von LL-C23024 jota;
80 MHz in CDCl-,, TMS als interner Standard;
Fig. VI das 15C-NMR-Spektrum von LL-C23024
jota; 20 MHz in CDCl,, TMS als interner Standard;
Fig. VII das 13C-NMR-Spektrum von LL-C23024
Öota; (expandierte Skala: 0-50 TpM), 20 MHz in CDCl3,
TMS als interner Standard;
Fig. VIII das 15C-NMR-Spektrum von LL-C23024
jota;(expandierte Skala: 50-110 TpM), 20 MHz in CDCl3,
TMS als interner Standard.
ir
ß -
Das 15C-HMR-Spektrum von LL-C23024 Jota wurde in deuteriertem
Chloroform (CDCl,) bei einer Feldstärke von 20 MHz
erhalten. Die Signale mit ihren relativen chemischen Verschiebungen, in 1 eilen pro Million (TpM), relativ zu
Tetramethylsilan (TMS) und die angenommene Zahl von Kohlenstoffatomen pro Signal sind in Tabelle II zusammengestellt.
Für Chloroform wurden Signale bei 75,4, 77,0 und 78,6 beobachtet.
Tabelle II
Chem.Verschieb, Zahl d.C-Atome Chem.Verschieb. Zahl d.C-
Atome
10.6 |
1 |
59.9 |
1 |
10.9 |
1 |
60.8 |
2 |
11.7 |
1 |
68.5 |
1 |
16.4 |
1 |
68.8 |
1 |
17.6 |
1 |
71.3 |
1 |
18.0 |
1 |
72.2 |
1 |
21.7 |
1 |
76.1 |
1 |
22.9 |
1 |
76.9 |
1 |
24.1 |
1 |
78.5 |
1 |
28.2 |
1 |
81.0 |
1 |
31.2 |
2 |
81.3 |
1 |
32.2 |
1 |
81.-8 |
1 |
33.4 |
1 |
84.8 |
1 |
33.8 |
2 |
85.3 |
1 |
34.2 |
1 |
85.6 |
1' |
36.7 |
1 |
86.8 |
1 |
37.2 |
1 |
88.5 |
1 |
39.4 |
1 |
95.9 |
1 |
40.3 |
1 |
97.9 |
1 |
44.5 |
1 |
99.6 |
1 |
45.5 |
1 |
107.2 |
1 |
47.6 |
1 |
173.0 |
1_ |
56.8 |
1 |
Total |
48 |
Bei den Antibiotika LL-C23024a, β und jota handelt es
sich um organische Carbonsäuren. Sie sind somit fähig, Salze mit nichttoxischen, pharmazeutisch akzeptablen
Kationen zu bilden. Es können daher Salze gebildet werden, indem man das Antibiotikum in Form der freien Säure mit
stöchiometrischen Mengen von Kationen, zweckentsprechend in einem neutralen Lösungsmittel, vermischt. Als Kationen
kommen dabei beispielsweise Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium und Ammonium in Frage sowie organische Aminkationen,
wie Tri-(niederalkyl)-amin (z.B. Triäthylamin, Triäthanolamin), Procain und dergl.. Die kationischen Salze
des Antibiotikums LL-C23024B sind im allgemeinen kristalline Feststoffe, relativ unlöslich in Wasser und löslich
in den meisten herkömmlichen, organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthylacetat, Aceton, Chloroform, Heptan,
Äther und Benzol. Für die Zwecke dieser Erfindung ist das Antibiotikum in Form der freien Säure ihren pharmazeutisch
annehmbaren, nichttoxischen Salzen äquivalent.
Die Antibiotika LL-C23024S und jota sind in vitro gegen
grampositive Bakterien aktiv, wenn sie mittels des Standard-Agarverdünnungsverfahrens untersucht werden. Die
als minimale Hemmkonzentration (MIC) in mcg/ml ausgedrückten Ergebnisse sind in den Tabellen III und IV zusammengestellt.
Die Antibiotika LL-C23O24B und jota sind bei Konzentrationen von 256 mcg/ml oder weniger nicht
wirksam gegenüber gramnegativen Organismen.
Tabelle III in vitro antibakterielle Aktivität von LL-C25O24ß
Organismus
MlCdncg/ml)
Staphylococcus aureus Smith |
11 SSC 80-11 |
ß-hemolytic |
S.SC-80-63 |
64 |
11 |
" SSC 80-32 |
Keller T623 |
64 |
ir |
" SSC 80-38 |
pneumoniae 78-1 |
64' |
Il |
11 LL-14 |
Enterococcus SSC-80-62 |
64 |
Il |
" LL-45 |
ti |
64 |
Il |
" LL-27 |
64 |
Il |
" ATCC 25923 |
128 |
Il |
Streptococcus pyogenes C203 |
64 |
Il |
! |
|
|
Il |
8 |
8 |
64 |
128 |
Tabelle IV
in vitro antibakterielle Aktivität von LL-C23024 .jota
Organismus . ; MIC (mcg/ml)
Enterococcus |
OSU 75-1 |
1 |
.5 |
Enterococcus |
SM 77-15 |
1 |
.5 |
Staphylococcus aureus |
SSC 79-18 |
1 |
|
Staphylococcus aureus |
FU 79-19-2 |
CVi
|
Micrococcus lutea |
PCI 1001 |
1 |
Staphylococcus aureus |
Smith |
0 |
Staphylococcus aureus |
ATCC 25923 |
0 |
|
|
|
|
|
|
ÖRIGIMAL
'-' ■■·4"--- 32383Ί6
-73
Wie aus den obigen Daten hervorgeht, inhibieren die Antibiotika LL-C23024a, ß und jota das Wachstum bestimmter
grampositiver Bakterien und sind somit als topische oder Oberflächen-Antiseptika in Waschlösungen für die Haut,
für Ausrüstungsgegenstände, für Wände, Fußböden und dergl. brauchbar.
Es wurde darüber hinaus festgestellt, daß die antibakteriellen Mittel LL-C23Ö24oc, β und jota in vivo wirksam
sind, und zwar als Anticoccidia-Mittel bei Geflügel. Das wird durch die nachfolgenden Tests erläutert.
2 Tage vor der Inokulation wird mit Medikamenten behandeltes
Futter, welches die Wirkstoffe mit unterschiedlichen Dosisniveaus enthält, verschiedenen Gruppen von 1 Tag alten
Testküken angeboten. Das während des gesamten Tests verwendete Geflügelfutter ist folgendermaßen hergestellt
worden: ^
Vitamin-Aminosäure-Prämix 0,5
Spurenmineralien 0,1
Natriumchlorid 0,3
Dicalciumphosphat 1,2
gemahlener Kalkstein 0,5
stabilisiertes Fett 4,0
getrocknetes Alfalfa, 17% Protein 2,0
Maisklebermehl, 41% Protein '5,0
Menhadenfischmehl, 60% Protein 5,0
Sojabohnenölmehl, 44% Protein 30,0
gemahlener, gelber Mais, fein, zum
Auffüllen auf 100
Das in der obigen Futterzusammensetzung verwendete Vitamin-Aminosäure-Prämix
ist aus der folgenden Formulierung hergestellt . Die Quantitätsangaben beziehen sich dabei auf Einheiten/kg
der fertigen Futterzusammensetzung.
- U0 -
Butyliertes Hydroxytoluol 125,0 mg
dl-Methionin , 500,0 mg
Vitamin A 3300,0 IE
Vitamin D, 1100,0 ICE
Riboflavin 4,4 mg
Vitamin E 2,2 IE
Niacin 27,5 mg
Panthothensäure 8,8 mg
Cholinchlorid 500,0 mg
Folsäure 1,43 mg
Menadion-natriumbisulfat 1,1 mg
Vitamin B^ 11,0 mcg
gemahlener, gelber Mais, fein, zum Auffüllen auf 5,0 g
Die Testküken werden dann inokuliert, und zwar durch direkte Inokulation in den Kropf jedes Kükens unter Verwendung
eines gemischten Inokulums von 5000 sporenbildenden Oocyten von Eimeria acervulina und einer ausreichenden Anzahl
Oocyten von Eimeria tenella zur Erzeugung einer 85 bis 100% Mortalität bei nichtbehandelten Kontrolltieren.
Die Küken haben während der gesamten Testdauer freien Zugang zu Futter und Wasser. 7 Tage nach der Inokulation
werden die Tests abgebrochen. Die Vögel werden gewogen, getötet und ihr Intestinaltrakt wird hinsichtlich Läsionen
untersucht. Die in den folgenden Tabellen V und VI zusammengestellten Ergebnisse zeigen, daß bei den infizierten
Küken eine verbesserte Überlebensrate erreicht wird, wenn ihrem Futter 10 TpM oder mehr der Antibiotika LL-C23024ß
oder jota zugesetzt sind. Die Ergebnisse zeigen ebenso eine signifikante Unterdrückung von intestinalen Läsionen,
die durch Eimeria tenella und Eimeria acervulina verursacht sind.
BAD
|
Antibiotikums LL-C23O24ß |
Tabelle V |
gegen Coccidien bei Küken |
% Vögel mit verringerten
Läsionen |
E.acervulina |
> t 1, 1 >
> V I
) > » |
Bewertung des |
Konz.imFutter
TpM |
als Mittel |
% Überle
bende |
E.tenella |
100 |
|
Verbindung |
|
Anz.d.Vögel
bei Beginn |
|
100 |
100 |
|
|
15 |
|
loo" |
60 |
100 |
|
LL-C23024 β |
10 |
3 |
100 |
0 |
0 |
(Jj .... |
LL-C23024 β |
5 |
5 |
80 |
0 |
100 |
* >
t > i
» t h
λ » i |
LL-C23024 β |
0 |
5 |
46.6 |
100 |
100 |
t · ϊ |
NNC* |
120 |
15 |
100 |
100 |
100 |
|
LL-C23024 β |
60 |
15 |
100 |
100 |
0 |
|
|
30 |
15 |
100 |
0 |
— |
|
|
0 |
15 |
20 |
-- |
100 |
CO
ro |
|
NNC |
15 |
100 |
87 |
100 |
383 |
|
20 |
15 |
100 |
60 |
0 |
LL-C23024 ß |
15 |
15 |
100 |
Ό |
0 |
|
10 |
15 |
60 |
7 |
0 |
|
5 |
15 |
47 |
0 |
-- |
|
0 |
15 |
27 |
-- |
|
|
NNC |
15 |
100 |
|
|
|
|
15 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Tabelle VI
Bewertung des Antibiotikums LL-C23024 .iota als Mittel gegen Coccidien bei Küken
% Überlebende % Vögel mit verringerten Läsionen
E. tenella E.acervulina
100 100
100 100
20 60
0 0
10 100 100 100
7,5 10 100 70 100
Konzentration im Futter |
Anz.d.Vögel |
(TpM) |
zu Beginn |
15 |
5 |
10 |
5 |
5 |
5 |
0 |
15 |
•7?-
Durch die folgenden Tests wird die nematocide Aktivität
demonstriert.
Beispiel A
Bewertung von Testzusammensetzungen hinsichtlich der nematociden Aktivität unter Verwendung der freilebenden,
hermaphroditischen, mikrobivorösen Nematode Caenorhabditis elegans II
Bei den folgenden Tests werden G. elegans zur Bestimmung
der nematociden Aktivität der Fermentationsbrühe und der geernteten Maische, die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung
hergestellt wurden, verwendet. Dieser Organismus wird ebenfalls zur Bewertung von LL-C23024α und
LL-C23024B verwendet, um deren nematocide Aktivität zu
bestimmen.
Bei diesen Tests handelt es sich bei der Fermentations- ;
brühe um die bei der Fermentation erhaltene Mischung von Flüssigkeit und Feststoffen, die entnommen wird, bevor die
Feststoffe, d.h. die geerntete Maische, von der Flüssigkeit abgetrennt wird. Bei der geernteten Maische handelt
es sich um die Feststoffe, die nach der Abtrennung zurückbleiben.
Zur Bewertung der geernteten Maische werden die Feststoffe der geernteten Maische in destilliertem Wasser im Verhältnis
1:1 dispergiert. Die Fermentationsbrühe wird so, wie sie ist, verwendet und enthält sowohl Flüssigkeit als
auch Feststoffe.
Bei den vorliegenden Bewertungen wird C. elegans in einem
C. briggsae Maintenance Medium aufbewahrt. Das Maintenance-Medium ist im Handel erhältlich von Grant Island Biological
Company, Grant Island, New .York, und weist die folgende Zusammensetzung auf. -
Maintenance Medium
(ι)
Komponente
KH2PO4
MnCI2.4H2O
Anorganische Salze
CaCl2.2H2C
CuCl2.2H2O Fe (NH4)2(SO4)2.6H2O
KH2I
KOH
MnC]
ZnCl2
Andere Komponenten
N-Acetylenglucosamin
Adenosin-31-(2!)-phosphorsäure.H
Cytidin-3'-(2')-phosphorsäure
D-Glucose
Glutathion, reduziert Guanosin-3'-(2·)-PO4Na2.H2O
Magnesiumcitrat.5HpO (dibasisch)
Kaliufflcitrat.H2O
DL-Thioktsäure
Thymin
Uridin-3'-(2')-phosphorsäure
Aminosäuren
L-Alanin
L-Arginin !,-Asparaginsäure
L-Cystein-HCl .H2O
Gl-Glutamat (Na).H2O
L-Glutamin
Glycin
L-Histidin
L-Isoleucin
L-Leucin
L-Lysin-HCl L-Methionin
220 |
,50 |
6 |
,50 |
58 |
,80 |
1225 |
,50 |
(a) |
|
22 |
,20 |
10 |
,20 |
15: |
,00 |
365, |
,00 |
323: |
,00 |
1315, |
,00 |
204, |
,00 |
363. |
,00 |
915, |
,00 |
486, |
,00 |
3, |
,75 |
126, |
,00 |
324, |
,00 |
1395, |
00 |
975, |
00 |
1620, |
00 |
28, |
00 |
550, |
00 |
1463, |
00 |
722, |
00 |
283, |
00 |
861, |
00 |
1439, |
00 |
1283, |
00 |
389, |
00 |
PAD
Komponente mg/l
L-Phenylalanin 803,00
L-Prolin 653,00
L-Serin 788,00
L-Threonin 717,00
L-Tryptophan 184,00
L-Tyrosin 272,00
L-Valin 1020,00 Vitamine
p-Aminobenzoesäure 7,50
Biotin 3,75
Cholindihydrogencitrat 88,50
Cyanocobalamin (B1 ) 3,75
Folinat (Ca) 3,75
Myo-inosit 64,50
Niacin 7,50
Pantethein (Pantethine) 3,75
Pantothenat (Ca) 7,50
Pterolyglutaminsäure 7,50
Pyridoxalphosphat 3,75
Pyridoxamin 2HCl 3,75
Pyridoxin HCl 7,50
Riboflavin-5'-Ρ0^(Na).2H2O 7,50
Thiamin HCl 7,50
Literatur:
(1) E.L.Hansen, Proc.Soc.Exp.Bio. &Med.12i, 30-393(1966);
Bemerkungen:
(a) So viel, wie nötig, um den pH auf 5,9 + 0,1 einzustellen.
Für die Bewertungen wird eine Lochplatte mit einer Reihe von kleinen Löchern verwendet. 25 ml der Fermentationsbrühe, der 1:1 Wasser/geerntete Maische-Suspension oder
einer wäßrigen Acetonlösung von LL-C23024oc oder LL-C23024ß, enthaltend 31,25 bis 500 TpM der Testverbindung, werden
2tr
323831.&
unter aseptischen Bedingungen in gesonderten Schächten deponiert. Jedem Schacht werden dann 25 ml des C.elegans
Maintenance Mediums, enthaltend 10 bis 20 adulte Würmer plus Larven verschiedenen Alters plus Eier, zugesetzt.
Die Platten werden anschließend in einen Abzug placiert und 48 h nach der Inokulation untersucht, um die Geschwindigkeit
und den Grad der nematociden Aktivität der Testzusammensetzungen zu beurteilen. Die erhaltenen Daten sind
im folgenden aufgeführt. In den Fällen, in denen bei der Fermentationsbrühe eine Aktivität beobachtet wird, wird
die Brühe weiter verdünnt, um ein 1:4 Brühe/C.elegans-Verhältnis zu schaffen.
Tabelle VII
Zusammensetzung |
Konzentration(TpM)
oder Verdünnung |
1:1
1:4 |
Nematocide Akti
vität während
48 h |
Fermentations
brühe |
D =
D = |
TpM |
8 (keine
Bewegungsfähigkeit) |
geerntete Maische
LL-23024a |
500 |
Il |
7 |
|
250 |
ti |
7 |
|
125 |
15" |
7 |
|
62, |
,25 " |
6 |
|
31, |
TpM |
0 |
LL-23024B |
500 |
Il |
7 |
|
250 |
0 |
Die bei diesen Bewertungen verwendete Aktivitätseinteilung
ist wie folgt:
Aktivitätslegende
8 = keine Bewegungsfähigkeit (scheinbar tot)
7 = merklich reduzierte Bewegungsfähigkeit
6 = verringerte Bewegungsfähigkeit 0 = normale Bewegungsfähigkeit der Species
BAD ORiGtNAL
323831S
Beispiel B
Bewertung von LL-C23024oc als nematocides Mittel gegen
infektiöse Larven von Wiederkäuerneinatoden
Nach dem oben beschriebenen Verfahren wird die Bewertung von LL-C23024a als nematocides Mittel gegen infektiöse
Larven von Wiederkäuernematoden durchgeführt, wobei folgende
Nematodenspecies anstelle von C. elegans verwendet wurden: Haemonhmus contortus, Ostertagia circumcincta,
Trichostrongylus axei, T. colubriformis; sowie der Essigälchenwurm,
Turbatrix aceti. Die erhaltenen Daten sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.
Larven im dritten Häutungsstadium.
In den folgenden Tabellen bezieht sich die Aktivitätseinteilung
auf die zuvor aufgeführte Aktivitätslegende.
in vitro ^-
Konzentr.von
LL-C23O240C
TpM
Tabelle VIII
Aktivität Kep;en (bei 48 Stunden)
H.contort.
0. circum.
T. axei
T. colüb.
500 8
250 7
125 7
62,5 7
31,25 6
0 (Vergl.) 0
8L
8l
T. aceti
6 6 6 6
(a) durchgeführt in Gewebekulturplatten mit 96 Schächten, X14868A, hergestellt in doppeltdestilliertem
Wasser: 25/Ul LL-C23024a-Lösung und 25/ul der Kematodenkultur werden pro
Schacht zugesetzt.
(b) innerhalb von 24 h
OO NJ OJ CO OJ
Beispiel C
Bewertung der nematociden Aktivität des Antibiotikums LL-C23024oc gegen Nematospiroides dubius und Aspicularis
te t rapt era bei Mäusen '
Bei den folgenden Tests werden weibliche, weiße Swiss-Webstermäuse
mit Nematospiroides dubius und Aspicularis tetraptera infiziert und 3-Wochen, gehalten, um die Infektionen
sich entwickeln zu lassen.
Nach diesem Zeitraums des Haltens werden die Mäuse nach
dem Zufallsprinzip in Gruppen von vier aufgeteilt. Die Gruppen werden in getrennte Käfige placiert. Anschließend
wird ein mit Medikamenten behandeltes Futter angeboten, welches von etwa 31,25 TpM bis 4000 TpM der Testverbindung enthält. Das Futter wird den Mäusen eine Woche lang
ad libitum angeboten. Wasser wird ebenfalls ad libitum während der Testperiode zur Verfügung gestellt. Während
der Behandlungsperiode werden die Ausscheidungen der Mäuse untersucht, um zu bestimmen, ob Würmer ausgeschieden
werden. Bei allen behandelten Gruppen wurde festgestellt, daß sie Würmer ausscheiden. Dadurch wird eine nematocide
Aktivität bei allen Konzentrationen der Verbindung gegenüber beiden Nematoden angezeigt. Am Ende der einwöchigen
Behandlung mit medikamentiertem Futter werden die Mäuse getötet und die Inhalte der intestinalen Trakte der Mäuse
werden auf Würmer untersucht. Die erhaltenen Werte sind im folgenden als prozentuale Verringerung von Würmern,
verglichen mit infizierten, nicht-medikamentierten Kontrolltieren,
ausgedrückt.
Bei diesen Tests wurden rohe Fermentationsbrühen bewertet, welche vor Ernte der Maische erhalten wurden und welche
1000 bis 4000 TpM des nematociden Antibiotikums enthielten.
Das Mäusefutter, welches mit 31,25 bis 500 TpM LL-C23024cc,
gelöst in einem Aceton/Wasser-Gemisch (1:1), behandelt war, wurde ebenfalls bewertet.
Testzusammen- Nahrung Aktivität (% Reduktion) gegen
setzung Konz. |
TpM |
N. Dubius |
A.Tetraptera |
+Fermentations- |
|
|
|
brühe |
4000 |
73 |
- |
mit LL-C23034a |
2000 |
44 |
53 |
LL-C23024a |
1000 |
65 |
33 |
|
500 |
70 |
SA++ |
|
250 |
63 |
SA |
|
125 |
61 |
SA |
|
62,5 |
29 |
SA |
|
31,25 |
32 |
SA |
Menge an LL-C23024oc nicht bestimmt
++ geringfügige Aktivität: gesteigerte Zahl von
Pinwürmern bei der fäkalen Untersuchung entdeckt
+++ verglichen mit infizierten,nichtmedikamentierten
Kontrolltieren.
Die neuen antibakteriellen und gegen Coccidia wirkenden Mittel gemäß der Erfindung werden bei der Kultivierung von
Actinomadura yumaense sp. nov. unter kontrollierten Bedingungen gebildet.
Ein repräsentativer Stamm dieses Mikroorganismus wurde von einer Bodenprobe isoliert, die in Yuma County, Arizona,
gesammelt wurde. Der Stamm wird in der Culture Collection der Lederle Laboratories Division, American Cyanamid
Company, Pearl River, New York, als Kultur-Nr. LL-C23024 aufbewahrt. Eine lebensfähige Kultur dieses repräsentativen
Stamms ist bei Culture Collection Laboratory, Northern Regional Center, U.S. Department of Agriculture, Peoria,
Illinois 6i604, hinterlegt und in deren permanenter Sammlung unter der Nr. NRRL 12515 aufgenommen worden.
BAD ORJGiNAL
Taxonomische Charakterisierung von NRRL 12515
Der Stamm IiRRL 12515 ist taxonomisch charakterisiert und
identifiziert worden als Stamm einer neuen Species der Art Actinomadura, welcher als Actinomadura yumaense sp.nov.
bezeichnet wird.
Die kulturellen, physiologischen und morphologischen Merkmale des repräsentativen Stamms NRRL 12515 wurden untersucht,
und zwar unter Verwendung von Verfahren, welche beschrieben wurden von E.B. Shirling und D. Gottlieb,
"Methods for characterization of Streptomyces species",
Internat. J. Syst. Bacteriol. 16:313-340 (1966), und R.E.
Gordon et al., "Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica,
and the nocardin strain", internat. J. Syst. Bacteriol. 24:54-63 (1974). Die bei diesen Untersuchungen verwendeten
Medien wurden ausgewählt unter solchen, welche von T.G. Pridham et al., "A selection of media for maintenance and
taxonomic study of Streptomycetes", Antibiotics Ann., Seiten
947-953 (1956/1957); G.F.Gauze et al., "Problems in
the classification of antagonistic actinomycetes", State Publishing House for Medical Literature, Medgiz, Moskau
(1957); und R.E. Gordon et al., supra, für die taxonomischen Untersuchungen von Actinomyceten und Bodenbakterien
empfohlen werden. Die chemische Zusammensetzung der Zellwände des Mikroorganismus wurde bestimmt unter Anwendung
des Verfahrens von H.A. Lechevalier et al., "Chemical
composition as a criterion in the classification of actinomycetes",
Adv.ApIl.Microbiol. 14:47-72 (1971). Die Phospholipid-Muster
wurden bestimmt unter Anwendung des Verfahrens von M.P.Lechevalier et al., "Chemotaxonomy of
aerobic actinomycetes: phospholipid composition", Biochem. Syst. Ecol.5:249-260 (1977). Einzelheiten sind in den Tabellen
VII bis IX zusammengestellt. Eine allgemeine Beschreibung der Kultur ist unten angegeben. Die unterstrichenen
Farbnamen sind entnommen aus K.K. Kelly und D.B.
Judd, "Color. Universal Language and Dictionary of Names",
U.::. Nat. Bur. Stand., Spec. Publ. 440, Washington, CD.
(1976), und dem begleitenden Inter-Society Color Council, Natl.Bur,Stand.Centroid Color Charts.
Die für diese neue Species, repräsentiert durch den Stamm NRRL 12515, beobachteten Daten wurden mit den Daten verglichen,
die für die bekannten Species der Gattung Actinomadura publiziert sind [M.Goodfellow et al., "Numerical
Taxonoray of Actinomadura and related actinomycetes", J.
Gen.Microbiol. 122:95-111 (1979); L.H.Huang, »Actinomadura macry sp.nov., the producer of antibiotic CP-47,433
and CP-47,434", Internat. J. Syst. Bateriol., 30: 565-568 (1980); J. Meyer, "New species of the genus Antinomadura",
Z.Allgem. Mikrobiol. 19:37-44 (1979); H.Nomura und Y. Ohara, "Distribution of actinomycetes in soil. XI.
Some new species of the genus Actinomadura, Lechevalier et al.", J. Ferment. Technol. 49:904-912 (1971); und T.P.
Preobrazhenskaya et al., "Key for identification of the species of the genus Actinomadura", The Biology of Actinomycetes
and Related Organisms 12:30-38 (1977)]. Die Kultur NRRL 12515 hat eine geringe Ähnlichkeit mit Actinomadura
pelletieri, weist jedoch keine Ähnlichkeit mit irgendeiner anderen beschriebenen Species auf und unterscheidet
sich von A. pelletieri in einer Vielzahl von Eigenschaften. Der Stamm NRRL 12515 wurde daher als der Typenstamm
einer neuen Species bezeichnet und Actinomadura yumaense sp.nov. benannt, wobei die Benennung nach dem Ort der
Sammlung der Bodenprobe erfolgt, aus der der Typenstamm isoliert wurde.
Mikromorphologie
Sporen werden in kurzen, ■ spir'älformigen Ketten (maximale
Länge etwa 20 Sporen/Kette) auf verzweigten, fast verticillaten (quirlblättrigen) Luftsporophoren gebildet. Die
BAD 'ORlGiIMAL
Sporen sind ovoid(eiförmig), 0,6 bis 0,8 Mikron x 1,0 bis
1,4 Mikron, mit einer glatten Oberfläche.
Zellwandzusammensetzung
GesamtzellenhydrolysaiE dieser Kultur enthalten Madurose
(3-0-Methyl-D-galactose) und das Mesoisomere der Diaminopimelinsäure
(DAP) . Die Kultur weist auch ein Typ P-1 Phospholipid-Muster auf und keine anderen diagnostischen Phospholipide
als etwas Phosphatidylglycerin. Diese Charakteristika
sind alle sehr typisch für Mitglieder der Gattung Actinomadura.
Wachstum seigenschaften
Ein gutes Wachstum wird beobachtet auf Bennett's Agar,
Gauze Nr. 2 Agar, NZ-Amin-Stärke-Glucose-Agar (ATCC
Medium 172), Tomatenpaste-Hafermehl-Agar und Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar;
mäßiges Wachstum wird beobachtet auf Benedict's Agar, Czapek1 s" Saccharose-Agar, Glycerin-Asparagin-Agar,
Hickey-Tresner-Agar und Hafermehl-Agar; ein geringes Wachstum wird beobachtet auf Calclummalat-Agar,
Gauze Nr. 1 Agar und anorganische Salze-Stärke-Agar.
Vegetatives Myzel
Auf Media, bei denen gutes Wachstum auftrat, wurde beobachtet, daß sich das vegetative Myzel entwickelte und zusammenrollte
und allmählich gelblich-graue Farbschattierungen annahm.
Luftmyzel und Sporenfarbe
Das Luftmyzel und/oder die Sporenmassen waren weiß bis
264. light gray gefärbt. Die Luftmyzelbildung ist auf den meisten Media leicht.
- .24 -
Lösliche Pigmente
Fehlend auf vielen Media; gelbes Pigment auf Benedict's und Glycerin-Asparagin-Agar; gelb-grünes Pigment auf CaI-ciummalat-Agar;
grünlich-braunes Pigment auf NZ-Amin-Stärke-Glucose-Agar;
orangefarbenes Pigment auf Bennett's und Hefeextrakt-Malzextrakt-Agars.
Physiologische Reaktionen
Keine Melamin-Pigmente auf Pepton-Eisen-Agar und Tyrosin-Agar (IS0--7); starke Peptonisierung von Lackmusmilch;
starke Proteolyse von Nährgelatine; mäßige Reduktion von
Nitrat; keine Hydrolyse von Adenin oder Guanin; starke Hydrolyse von Hypoxanthin, Tyrosin und Xanthin; schwache
Hydrolyse von Stärke; Hydrolyse von Äsculin; variable Hydrolyse von Harnstoff. Kein Wachstum bei 40C, 100C oder
550C; mäßiges Wachstum bei 250C und 450C; gutes Wachstum
bei 320C und 370C. Kohlenhydratnutzung nach dem Verfahren
von T.G.Pridham und D,Gottlieb, "The Utilization of carbon
compounds by some actinomycetales as an aid for species determination", J.Bacteriol, 56:107^114 (1948): gute Nutzung
von Glucose, Glycerin und Trehalose; mäßige Nutzung von Maltose und Saccharose; schlechte Nutzung von Fructose,
Galactose, Inosit, Mannose und Melezitose; keine Nutzung von Adonit, Arabinose, Dulcit, Lactose, Mannit, MeIibiose,
Raffinose, Rhamnose, Salicin, Sorbit und Xylose. Säurebildung aus Kohlenhydraten nach dem Verfahren von
Gordon et al., supra: gute Säureproduktion von Glucose, Glycerin, Maltose, Saccharose und Trehalose; schwache Säureproduktion
von Galactose, Inosit und Mannose. Nutzung von organischen Säuren nach dem Verfahren von Gordon et
al., supra; Nutzung von Acetat, Malat, Propionat, Fyruvat,
Succinat und Tartrat; keine Nutzung von Benzoat, Citrat, Lactat, Mucat und Oxalat.
BAD ORiGiNAL
Tabelle VII Kulturoharakteristika von Actinomadura yumaense NRRL 12515
Inkubation; 14 Tage
Medium
Wachstum Luftmyzel und/oder Sporen
Lösl.Pigment
Temperatur: 28 C Rückseitenfarbe
Benedict's
Agar
Bennett's gut
Agar
Calciummalat-Agar
Czapek's
Saccharose-
Gauze Nr.1
Agar
Gauze Nr.2
Agar
Glycerin-Asparagin
Agar
Hickey-Tresner
Agar
mäßig bis flach, pulvrige Kolonien; Luftmyzel
schlecht weiß bis 264-. light %räy
kein Luftmyzel;gerolltes,vegetatives
Wachstum 95.yellowish gray bis 80. grayish yellowish brown
schlecht flaches Wachstum; spärliches, weißes Luftmycel
mäßig bis flaches Wachstum';mäßiges Luftmyzel
- schlecht vegetatives Wachstum 90»grayish yellow
schlecht farbloses,flaches Wachstum; spärliches, weißes Luftmyzel
gut erhabene, gerollte Kolonien',vegetatives
Myzel 93»Yellowish gray; mäßiges
Luftmyzel, 92.yellowish white
schlecht flache,pulvrige Kolonien; weißes
bis mäßig Luftmyzel
mäßig flache,wachsartige Kolonien* 90.
grayish yellow spärliches Luftmyzel, weiß bis 2b4. light gray
gelblich
orangefarben
geIb-grün
keines
keines
keines
gelb
keines
89.pale yellow
81.dark grayish yellowisn
brown
90.greenish yellow
89. pale yellow
farblos
72 |
. dark orange , |
• |
I t > J |
|
yellow |
J
A » *
ί > * |
89 |
•pale yellow |
> S) |
|
|
* · >
» I |
|
|
» Λ * |
|
|
* · *
|
90 |
. grayish yellow |
OO |
|
|
ro |
|
|
OO |
|
|
OO |
|
|
OO |
|
|
or>
Tabelle VII (Fortsetzung)
Medium Wachstum Luftmyzel und/oder Sporen
Lösl.Pigment
Ri'ickseitenfarbe
gut
anorgan. schlecht Salze-Stärke-Agar
NZ-Amin-Stärke- Glucose-Agar
Hafermehl- mäßig Agar
Tomatenpaste-Hafermehl-Agar
Hefeextrakt- Malzex-^
trakt-Agar
gut
gut
flache,farblose,pulvrige Kolonien;
weißes Luftmyzel
stark gerolltes Wachstum,61.grayish
brown bis 65. brownish black;mäßiges
Lüftmyzel,weiß bis 264.light gray
keines
grünlich-braun
flaches,wachsartiges Wachstum,90.
grayish yellow;mäßiges Luftmyzel,weiß keines
flaches,wachsartiges Wachstum, 91.dark keines
f ravish yellow; Spur eines weißen
üftmyzels
erhabene,wachsartige,gerollte Kolonien,
93. yellowish gray bis grayish yellowish brown; kein Luftmyzel
farblos
78. dark yellowish
brown
90. grayish yellow
orangefarben
78. dark
yellowish
brown
Tabelle VIII
Mikromorphologie von Actinomadura yumaense NRRL 12515
Medium Luftmyzel und/oder sporifere Strukturen Sporenform Sporengröße Sporenoberfläche
Czapek1s Luftsporophoren;verzweigt, fast kreisförmig ovoid 0,6-0,8 Mikron glatt
Saccharose angeordnet;relativ kurze, spirale Ketten χ
Agar von reifen Sporen tragend 1,0-1,4 Mikron
ro co oo co
Tabelle IX
Physiologische |
Medium |
Reaktionen νο·η |
Actinomadura |
yumaense MRRL 12515 |
Pep ton-Eisen-Aga-r* |
Inkubations·*-
dauer (Tage) |
Wachstum |
Physiologische Reaktion |
Tyro, s in-Agar |
7
14 |
gut
!I |
leichte Braunfärbung
Il Il |
Lackmusmilch |
7
14 |
mäßig
gut |
kein Pigment
gelbliches Pigment |
Nährgelatine |
14
28 |
gut
Il |
gute Peptonisierung
starke Peptonisierung |
Nitratbrühe |
14
28 |
gut
Il |
geringfügige Proteolyse
totale Proteolyse |
Adenin-Agar |
14
28 |
gut
Il |
sehr schwache Reduktion
mäßige Reduktion |
Guanin-Agar |
14
21 |
gut
Il |
keine Hydrolyse
11 It |
Hypoxanthin-Agar |
14
21 |
gut
Il |
keine Hydrolyse
Il Il |
Tyrosin-* Agar |
14
21 |
gut
Il |
totale Hydrolyse
Il Il |
Xanthin^Agar |
14
21 |
gut
Il |
starke Hydrolyse
It Il |
14
21 |
gut
It |
mäßige Hydrolyse
starke Hydrolyse |
ro co oo co
Tabelle IX (Fortsetzung)
Medium
Inkubationsdauer (Tage)
Wachstum
Physiologische Reaktion
NZ-Amin mit lösl. Stärke und Glucose-Agar
(ATCC Med. Nr.172)
Harnstoff-Brühe |
28 |
gut |
Äsculin-Brühe |
14
28 |
gut
ti |
Stärke-Agar |
5
10 |
gut
H |
schlechtes oder kein Wachstum bei 4°, 10° und 550C;
mäßiges Wachstum bei 25°C, 28° und 45 C; gutes Wachstum bei 32° und 370C
Zersetzung variabel Hydrolyse
keine Hydrolyse
II ti
OO OO OO
323831G
Tabelle X
Kohlenstoffauellennutzung von Actinomadura yumaense
IRRL 1251g auf ISP-9 Kohlenhydra tnu tzungsmedium
Inkubation: 28 Tage Temperatur: 280C
Kohlens toff quelle.. . Nutzung
Adonit 1-Arabinose
DuIcit
Fructose schlecht
α-Galactose "
d-Glucose gut
Glycerin "
i-Inosit schlecht
Lactose
Kaitose mäßig
d-Mannit
d-Manno.se schlecht
d-Melezitose "
d-Malibiose d-Raffinose 1-Rhamnose
Salicin Sorbit
Saccharose mäßig
d-Trehalose gut
d-Xylose negative Kontrolle
3233316
Tabelle XI
Säurebildung aus verschiedenen Kohlenhydraten mittels Actinomadura yumaense IiRRL 12515 auf Gordon's basalem
anorganischem Stickstoffmedium
Inkubation: 28 Tage |
Temperatur: 280C |
Kohlenstoffquelle |
Säurebildunp; |
|
? Tage 28 Tage |
Adonit
1-Arabinose
Dulcit
Fructose -
d-Galactose - +
d-Glucose +++ +++
Glycerin ++ +++
i-Inosit - +
Lactose
Maltose - +++
d-Mannit
d-Mannose +
d-Melezitose
d-Melibiose
d-Raffinose
1-Rhamnose
Salicin
Sorbit
Saccharose - +++
d-Trehalose - +++
d-Xylose
negative Kontrolle
+++ = starke, positive Reaktion ++ = mäßige, positive Reaktion + = geringe, positive Reaktion
= negative Reaktion
Tabelle XII
Hu!.:;un;_p organischer Säuren mittels Actinomadura yumaense
IRkL 12513 auf Gordon's Modifizierung von Koser1 s Basal
Ärar (Koser's Cjtrst-A/rar)
Inkubation: 28 Ta.^.e Temperatur: 28°C
Kohlenstoff quelle Nutzung
Acetat * +
Benzoat
Citrat
Lactat
Malat +
Muconsäure
Oxalat
Propionat +
Pyruvat +
Cuccinat +
Tartrat +
+ = positive Reaktion; - = negative Reaktion
Es ist darauf hinzuweisen, daß der Ausdruck "Actinomadura yumaense" nicht auf den Stamm Actinomadura yumaense NRRL
12515 oder auf Stämme beschränkt ist, die in vollem Umfang den obigen Wachstums- und mikroskopischen Charakteristika
entsprechen, welche lediglich zur Illustration angegeben sind. Das hier beschriebene Actinomadura yumaen
se umfaßt alle Stämme von Actinomadura yumaense, welche die Antibiotika LL-C23O24a, ß und jοta bilden und welche
nicht eindeutig von Actinomadura yumaense NRRL 12515 und dessen Subkulturen einschließlich der Mutanten und Varianten
derselben unterschieden werden können. Der Begriff "Mutanten" umfaßt die natürlichen (spontanen) Mutanten
dieses Organismus sowie die induzierten Mutanten, die, ausgehend von diesem Organismus, mittels verschiedener,
mutagener Mittel, welche dem Fachmann geläufig sind, hergestellt werden können. Derartige Mittel sind beispielsweise
das Bestrahlen mit Röntgenstrahlung, Ultraviolett-
BAD ORIGINAL
strahlung, das Behandeln mit Stickstofflost, Actinophagen,
Nitrosaminen und dergl.. Ebenfalls sollen die
inter- und intraspezifischen, genetischen Rekornbinanten, die mittels bekannter genetischer Techniken hergestellt
werden können, umfaßt sein. Solche genetischen Techniken sind beispielsweise Konjugation, Transduktion und Techniken
des genetic engineering.
Die Kultivierung von Actinomadura yumaense .kann mit einer
weiten Vielzahl von festen oder flüssigen Kulturmedia durchgeführt werden. Brauchbare Media zur Bildung der
Antibiotika LL-C23024ct, β und jota umfassen eine assimilierbare
Stickstoffquelle, wie Protein, Proteinhydrolysat,
Polypeptide, Aminosäuren, Maiswasser, etc., sowie anorganische Anionen und Kationen, wie Kalium, Natrium, Ammonium,
Calcium, Sulfat, Carbonat, Phosphat, Chlorid, etc.. Spurenelemente, wie Bor, Molybdän, Kupfer, etc., werden
als Verunreinigungen anderer Bestandteile der Media zur Verfügung gestellt. Die Belüftung in Tanks oder Flaschen
erfolgt, indem man sterile Luft durch oder auf die Oberfläche des Fermentiermediums drückt. Eine weitergehende
Bewegung in den Tanks wird durch einen mechanischen Propeller gewährleistet. Ein Antischaummittel, wie Schmalzöl
oder Silikon-Entschäumer, kann erforderlichenfalls zugesetzt werden.
Actinomadura yumaense wird auf geneigten Agar-olatten
(agar slants) aufgezogen und am Leben gehalten, z.B. auf Bennett's Agar, Hefe-Malz-Agar oder ATCC Medium Nr.172.
Das ATCC Medium Nr. 172 ist bevorzugt. Die geneigte Platte wird mit einer Kultur von Actinomadura yumaense inokuliert
und etwa 7 Tage bei 28 bis 370C, vorzugsweise bei etwa 320C, inkubiert. Diese Basiskulturen können
durch serienweise Übertragung auf friscne Agar slants am Leben erhalten werden, oder es kann auch ein Pfropfen
BAD ORIGINAL
des Agars mit einem Gehalt an Myzel von dem gut entwikkelten
Agar slant verwendet werden, um flüssige Media zu inokulieren.
Durch Inokulation von 100 ml sterilem, flüssigem Medium in 500 ml-Flaschen mit den von einem Agar slant der Kultur
abgekratzten oder abgewaschenen Sporenmaterial werden Schüttelflaschen-lmpfZubereitungen von Actinomadura
yumaense hergestellt. Beispiele geeigneter Saatmedia sind die folgenden.
Medium A
Rinderextrakt 0,3
Bacto^ ' Trypton 0,5
Glucose 1,0
Hefeextrakt 0,5
Wasser qs. 100 ( ein Pepton, Warenzeichen von Difco Laboratories, Detroit, Michigan)
Der pH-Wert wird mit einer verdünnten Base, z.B.Natriumhydroxid,
auf 6,8 bis 7,2 eingestellt.
Medium B
0,
Glucose 1
Stärke 2
Hefeextrakt 0,5
NZ-Amin A^ 2 0,5
Calciumcarbonat 0,1
Wasser qs. - 100
( Casein-Verdauungsprodukt, Warenzeichen von Sheffield
Chemical Co., Div. Nat'l.Dairy Products Corp., Norwich,
N.Y.).
Medium B wird bevorzugt.
BAD ORIGINAL
j~ ■' '■■'-'"■ 32383Ί6
Die Flaschen werden bei einer Temperatur von 25 bis 35°C, vorzugsweise bei 32 C, inkubiert und 1 bis 4 Tage auf einer
rotierenden Schüttelmaschine heftig geschüttelt. Dieses Saatinokulum wird anschließend verwendet, um die Fermentationskultur
zu inokulieren. Die Saatkultur kann auch gefroren und gelagert werden, um für anschließende Saatkulturen
ein Inokulum bereitzustellen.
Die im folgenden angegebenen Media sind Beispiele für
brauchbare Media zur Fermentierung von Actinomadura
yumaense, um Antibiotika LL-C23O24a, β und jota herzustellen.
Medium C ö,
Jo__
Glucose 1,5
Glycerin 1,5
Sojamehl^5 . 1,5
Calciumcarbonat 0,1
Natriumchlorid 0,3
Wasser qs. 100
(^ kann durch Baumwollsamenöl oder lösliche Fleischbestandteile
mit gleichem Effekt ersetzt werden).
Medium D 0/
Glucose 3,0
Sojamehl 1,5
Calciumcarbonat 0,1
Natriumchlorid 0,3
Wasser qs. 100
Medium E
0,
Stärke 1
Melassen 2
Sojamehl 1,5
Calciumcarbonat 0,1
Wasser qs. 100
323831S
Kef]iurn F oy
Glucose 3
lösliche Fleischbestandteile 2,5
r.atriumchlorid 0,2
Calciumcarbonat 0,1
Wasser qs. 100
Medium G
0,
Glucose 3
•Sojamehl 0,5
Ammoniumsulfat 0,3
Natriumchlorid 0,2
Calciumcarbonat 0,1
"Wasser qs. 100
Medium H · 0,
Glucose 3
Ammoniumsulfat 0,3
dibasisches Kaliumphosphat 0,1
Calciumcarbonat 0,2
Natriumchlorid 0,1
V/asser qs. 100
Medium D ist bevorzugt.
Die Fermentierung kann in 100 ml der Media in einer 500 ml-Flasche durchgeführt werden, wobei mit 3 bis Λ0%
(Vol/Vol) einer Saatkultur inokuliert wird, die auf die
zuvor beschriebene Weise hergestellt wurde. Die Inkubation erfolgt bei 25 bis 350C, vorzugsweise bei etwa 320C,
während 24 bis 72 h unter Belüftung. Proben der Fermentationskultur können eingefroren und gelagert werden, um
sie später als Inokulum für Saatkulturen zu verwenden.
BAD ORIGINAL
Alternativ kann die Fermentation auch in größeren Fermentationstanks
durchgeführt werden, welche mit einer Belüftungseinrichtung und einer Rühreinrichtung ausgerüstet
sind. Jeder Tank wird mit 3 bis 10% (Vol/Vol) des auf die
oben beschriebene Weise hergestellten Inokulums inokuliert. Die Belüftung wird mit einer Rate von 0,5 bis
2,0 1 steriler Luft/l Brühe/min durchgeführt und das Fermentierungsmedium
wird mittels eines Propellers, der mit 200 bis 400 U/min angetrieben wird, gerührt. Die Temperatur
wird bei 25 bis 35°C, vorzugsweise bei 32°C, gehalten.
Die Fermentation wird so lange fortgeführt, bis sich Antibiotika in dem Fermentationsmedium anreichern, gewöhnlich
nach 100 bis 150 h. Zu diesem Zeitpunkt wird das Antibiotikum geerntet.
Das Antibiotikum kann gemäß den in der US-PS 4 278 663 beschriebenen Verfahren geerntet und gereinigt werden
oder gemäß der folgenden Verfahrensweise.
Die rohe Fermentationsbrühe mit einem Gehalt der gesamten Zellen und hergestellt auf die oben beschriebene Weise
wird mit einem gleichen Volumen eines beliebigen NichtKohlenwasserstoff- wasser-unmischbaren, organischen Lösungsmittels
vermischt. Methylenchlorid oder Äthylacetat ist bevorzugt. Die organische Phase wird abgetrennt und
im Vakuum zu einem öligen Sirup konzentriert.
Der ölige Sirup wird in Methylenchlorid aufgelöst und
auf eine Säule aus Silikagel, Aluminiumoxid, Sephadex LH-20^·
' (Pharmacia Fine Chemicals Div. of Pharmacia, Inc., Piscataway, N.J.) oder Magnesiumaluminiumsilikat gegeben.
Beispiele geeigneter Lösungsmittel zur Entwicklung der Säule sind Diäthyläther, Äthylacetat, eine 1:1- bis 1:7-(VoI/VoI)Mischung
von Methylenchlorid:Äthyläther, 10 bis 40% Aceton in Methylenchlorid, 2 bis 10% niederer Alkohol
(Methanol ist bevorzugt) in Methylenchlorid, 2 bis 15%
Acetonitril in Methylenchlorid, oder 2 bis 15$ Dioxan in
Iiethylenchlorid. Methylenchlorid:Äthylacetat 1:1 (Vol/
Yol) ist bevorzuft. Es werden Fraktionen aufgefangen und
auf das Vorliegen von antibakterieller Aktivität untersucht, und zwar mittels eines Bioassays gegen einen
empfänglichen Organismus, z. B. Bacillus subtilis. Aktive
Fraktionen werden kombiniert und im Vakuum zu einem Rücksxand konzentriert. Dieser Rückstand wird in einem organischen
Lösungsmittel, z.B. t-Butanol (bevorzugt), Benzol oder p-Dioxan, aufgelöst und gefriergetrocknet.
Der gefriergetrocknete Feststoff wird in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, z.B. Methylenchlorid, Hexan,
Methylenchlorid:Äthylacetat, Diäthylather, Hexan:Äthylacetat,
Hexan:Chloroform oder Hexan:Äther, aufgelöst. Diäthyläther
ist bevorzugt. Diese Lösung wird mit Wasser geschüttelt und der pH auf 1,5 bis 4,0, vorzugsweise etwa
2,5, mit einer beliebigen, verdünnten Mineralsäure eingestellt. Die organische Phase wird abgetrennt, mit Wasser
zur Entfernung überschüssiger Säure gewaschen, über einem geeigneten Trocknungsmittel getrocknet, filtriert und im
Vakuum zu einem Rückstand konzentriert.
Dieser Rückstand wird in einem geeigneten Lösungsmittel aufgelöst und die Lösung langsam eindampfen lassen, vorzugsweise
bei etwa 40C. Beispiele geeigneter Lösungsmittel sind Methylenchlorid, Hexan, Methylenchlorid:Äthylacetat,
Diäthylather, Hexan:Äthylacetat, Hexan:Chloroform
oder Hexan:Äther. Hexan:Äther 5:2 (Vol/Vol) ist bevorzugt.
Die resultierenden Kristalle werden gesammelt und mit einem beliebigen, mäßig siedenden Kohlenwasserstoff,
wie Hexan oder Heptan, gewaschen, vorzugsweise bei etwa 400C, und an der Luft getrocknet. Man erhält so als
Endprodukt das Antibiotikum X-14868A in Form der freien Säure.
Falls das Produkt in Form eines Salzes erwünscht ist, kann die freie Säure durch eine Behandlung; mit einem
zv/eckentsprechenden Kation, vorzugsweise in Form einer verdünnten, mineralischen Base, umgewandelt werden, und
zwar nach Verfahrensweisen, die dem Fachmann geläufig sind.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen
näher erläutert. Bei den Media A, B, C, etc. handelt
es sich um die oben definierten. Falls nichts anderes angegeben ist, werden alle Verfahren bei Zimmertemperatur
(ungefähr 220C) und bei 1 at Druck durchgeführt.
Beispiel 1
Gewaschene Sporen von einem Agar slant von Actinomadura yumaense NRRL 12515 werden verwendet, um eine 500 ml Flasche,
enthaltend 100 ml steriles Medium B, zu inokulieren. Die Flasche wird 2 Tage auf einem Rotationsschüttler
bei 280C inkubiert.
Ein 5% Inokulum dieser Kultur wird anschließend zu 100 ml
sterilem Medium C in einer 500 ml Flasche transferiert und 5 Tage bei 280C auf einem Rotationsschüttler inkubiert.
Das Vorliegen von antibiotischer Aktivität wird täglich
mittels eines Bioassays-gegen'Staphylococcus aureus ATCC
6538 P, Bacillus subtilis und Streptococcus faecalis beobachtet und die anthelmintische Aktivität wird mittels
eines Bioassays gegen die freilebende Nematode Caenorhabditis elegans beobachtet.
Beispiel 2
})z v/erden sieben 500 ml Flaschen vorbereitet, jede enthaltend
100 ml eines der folgenden sterilen Media:
Flasche 1: 100 ml Medium C
Flasche 2: 100 ml Medium C mit i,55o Baumwollsamenöl
anstelle des Sojamehls
Flasche 3: 100 ml Medium C mit 1,5Si lösliche
Fleischbestandteile anstelle des Sojamehls
Flasche 4: 100 ml Medium D
Flasche 5: 100 ml Medium Ξ
Flasche 6: 100 ml Medium F
Flasche 7: 100 ml Medium G.
Diese Flaschen werden jeweils mit einem 5% Inokulum von
Actinomadura yumaense NRRL 12515,in Medium B gewachsen,
inokuliert. Die Flaschen werden anschließend 4 bis 6 Tage auf einem Rotationsschüttler bei 280C inkubiert. Jede der
obigen Kulturen erwies sich als aktiv, wenn sie gemäß Beispiel 1 hinsichtlich ihrer antibiotischen Aktivität
untersucht wurde und wenn sie hinsichtlich ihrer Anticoccidienaktivität gegen Eimeria tenella in Kükennieren-Gewebekulturen
untersucht wurde.
Beispiel 3 '"
Gefrorene Fermentationskulturzellen von Actinomadua yumaen
se NRRL 12515 werden verwendet, um eine 100 ml steriles Medium B enthaltende 500 ml-Flasche zu inokulieren. Die
Flasche wird anschließend 4 Tage bei 320C auf einem Rotationsschüttler
inkubiert. Ein 5% Inokulum dieser Kultur
wird anschließend zu 100 ml sterilem Medium H in eirer
500 ml-Flasche transferiert und 5 Tage auf einem Rotationsschüttler bei 280C inkubiert.
Die antibakterielle Aktivität wird gemäß Beispiel 1 festgestellt und die Anticoccidienaktivität gemäß Beispiel
BAD
Das Vorliegen der antibiotischen Aktivität wird ebenfalls
mittels DünnschichtChromatographie auf Silikagelplatten,
.entwickelt in Äthylacetat-.Chloroform 70:30 (vol/
VoI), untersucht.
Beispiel 4
100 ml steriles Medium A in einer 500 ml-Flasche werden mit gewaschenen Sporen eines Agar slants von Actinomadura
yumaense NRRL 12515 inokuliert. Die Flasche wird 2 Tage auf einem Rotationsschüttler bei 320C inkubiert. Ein 5%
Inokulum dieser Kultur wird dann zu 100 ml sterilem Medium H in einer 500 ml-Flasche transferiert und 2 Tage
auf einem Rotationsschüttler bei 320C inkubiert. Ein 5%
Inokulum dieser Kultur wird anschließend zu einer 500 ml-Flasche, enthaltend 100 ml frisches, steriles Medium H,
transferiert und 6 Tage bei 280C auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Die antibakterielle Aktivität wird
gemäß Beispiel 1 festgestellt.
Beispiel 5
Zwei 500 ml-Flaschen, jede enthaltend 100 ml steriles Medium
A, werden mit einer gefrorenen Saatkultur vcn Actinomadura yumaense NRRL 12515 inokuliert und 2 Tage bei 320C
auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Die Inhalte der beiden Flaschen werden anschließend kombiniert und zu
12 1 frischen, sterilem Medium A in einem 20 1 Gefäß gegeben. Diese Kultur wird dann 2 Tage bei 28CJ unter Belüftung
inkubiert. Der Inhalt dieses Gefäßes wird danach in einen 300 1 Saattank, enthaltend 288 1 steriles Medium A,
transferiert. Diese Kultur wird 25 h bei 320C belüftet
und gerührt. Am Ende der 25stündigen Inkubation werden die 300 1 der Saatkultur in einen 1500 1 Fermentor, enthaltend
1200 1 steriles Medium C, überführt. Diese Kultur wird 115 h bei 280C unter Belüftung und Rühren inkubiert.
IAB ORIGINAL
Die Ferrnentationsbrühe wird hinsichtlich ihrer antibiotischen
Aktivität mittels Dunns chi ch tchromato graphi e auf Silikagelplatten, entwickelt in Äthylacetat:Chloroform
70:30 (Vol/Vol), untersucht. Alternativ werden mehrere der
entwickelten Platten einem Bioassay gegen Bacillus subtilis
unterworfen, wobei sich das Vorliegen von antibiotischer Aktivität ebenfalls zeigt.
B eispiel 6
Ein typisches Medium, welches verwendet wird, um das primäre Inokulum wachsen zu lassen, wird gemäß der folgenden
Formulierung hergestellt. c/
Rinderextrakt 0,3
3acto^R'-Trypton 0,5
Glucose 1,0
Hefeextrakt 0,5
Bacto^ Agar 0,1
Wasser qs. 100
Gewaschene oder abgekratzte Sporen und Myzel von einem Agar slant von Actinomadura yumaense NRRL 12515 werden verwendet,
um eine 500 ml-Flasche, enthaltend 100 ml des obigen
sterilisierten Mediums, zu inokulieren. Die Flasche wird auf einen Rotationsschüttler gestellt und 48 h bei 320C
heftig geschüttelt. Das resultierende Flaschen-Inokulum (100 ml) wird verwendet, um 1 1 des gleichen sterilen Mediums
in einer 2 1-Flasche zu inokulieren. Dieses Inokulum
wird mit steriler Luft belüftet, während das Wachstum 48 h bei 280C fortgesetzt wird. Diese 1 1-Kultür wird dann verwendet,
um einen 30 1 Fermentortank, enthaltend das gleiche sterile Medium, zu inokulieren; dieser Tank wird mit
steriler Luft belüftet und 42 h bei 280C inkubiert.
BAD ORIGINAL
Beispiel 7
Ein Fermentationsmedium wird gemäß folgender Formulierung hergestellt. e,
Dextrose 1,5
Glycerin 1,5
Sojamehl 1,5
Calciumcarbonat 0,1
Natriumchlorid 0,3
Wasser qs. 100
Der pH wird mit 6N Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt und
das Medium sterilisiert. Eine 30 1-Portion des gemäß Beispiel 1 hergestellten Inokulums wird verwendet, um 250 1
des obigen Mediums in einem 300 1 Fermentor zu inokulieren. Die Maische wird mit steriler Luft versorgt und mittels
eines Propellers, der mit 220 U/min angetrieben wird gerührt. Die Fermentation wird 97 h bei 32° C durchgeführt.
Anschließend wird die Maische geerntet.
Beispiel 8
Ein Fermentationsmedium wird gemäß folgender Formulierung hergestellt. 0,
Dextrose 3,0
Sojamehl 1,5
Calciumcarbonat 0,1
Natriumchlorid 0,3
Wasser qs. 100
Der pH wird mit 6N Natriumhydroxid auf 7,0 eingestellt und das Medium sterilisiert. Eine 300 1-Portion des gemäß
Beispiel 1 hergestellten Inokulums wird verwendet, um 3000 1 des obigen Mediums in einem Fermentor zu inokulieren.
Die Maische wird mit steriler Luft versorgt und mittels eines Propellers, der mit 100 ti/mi η angetrieben wird,
gerührt. Die Fermentation wird 115h bei 320C durchge-
-BAD ORIGINAL
-IA-
fiibrt. Anschließend v,rird die Maische geerntet.
?. eispiel 9
(1) Die Fernentationsmaische (100 ml) wird mit 6N KCl auf pH 4,0 eingestellt. Die saure Maische wird dann
1 bis 2 h mit einem gleichen Volumen Methylenchlorid gerührt. Das Gemisch aus Maische und Methylenchlorid wird
anschließend filtriert, und zwar unter Verwendung von Diatomeenerde als Filterhilfe. Der Methylenchloridextrakt
wird abgezogen und im Vakuum auf etwa 2 1 konzentriert,
wobei man die teilweise gereinigten Antibiotika erhält.
(2) Chromatographie der teilweise gereinigten Antibiotika auf Silikagel
Eine Glassäule mit einem Durchmesser von 7 cm wird bis zu einer Höhe von 91 cm mit Woelm Silika Gel TSC bepackt.
Das rohe Konzentrat [siehe (1) oben] mit einem Volumen von etwa 2 1 läßt man in die Säule aus Silikagel einsickern.
Die Säule wird dann zunächst mit 3 1.Methylenchlorid und
dann mit Methylenchlorid:Äthylacetat (1:1 nach Volumen) entwickelt. Man erhält insgesamt 126 Fraktionen, jede mit
einem Volumen von 80 ml. Anschließend wird weiter entwikkelt
unter Verwendung von Äthylacetat:Äthanol (7:3)>
um zusätzliche 87 Fraktionen zu erhalten.
Die Fraktionen 58 bis 87, die reich an C23024oc sind, werden
kombiniert und im Vakuum bis zu einem Rückstand mit einem Gewicht von 90,4 g konzentriert. Dieser Rückstand
wird in einem Gemisch von 600 ml Diäthyläther und 600 ml
Hexan aufgelöst. Die resultierende Suspension wird filtriert, wobei man ein klares Filtrat erhält. Das klare
Filtrat wird im Vakuum so weit konzentriert, bis die Kristallbildung
beginnt. Diese Suspension wird über Nacht stehengelassen. Das kristalline C23024a wird auf einem
BAD
- to -
Trichter gesammelt, mit kaltem Äther gewaschen und an der
Luft getrocknet. Man erhält 33,1 g kristallines C23024a.
Weitere 12,4 g C23024a werden durch weitere Verringerung des Volumens der vereinigten Waschlösungen und Filtrate
erhalten.
Die Fraktionen 177 bis 203 aus der Eluierung mit Äthylacetat: Äthanol, welche mit C23024ß angereichert sind, werden
kombiniert und im Vakuum konzentriert. Man erhält 6,7 g teilweise gereinigtes C23024B, das, wie oben beschrieben, behandelt wird.
Die Fraktionen 204 bis 213 aus der Eluierung mit Äthylacetat: Äthanol, welche mit LL-C23024 jοta angereichert
sind, werden vereinigt und im Vakuum zu einer Paste konzentriert und wiederholt mit Methanol extrahiert. Der Methanolextrakt
wird mit Methylenchlorid extrahiert, welches auf eine Säule gegeben wurde, die Woelm Silikagel enthält.
Die Säule wird mit Methylenchlorid gewaschen und dann mit Methylenchlorid:Äthylacetat (2:3) eluiert. Die
Fraktionen (cuts) werden mittels Dünnschichtchromatographie
untersucht und die aktiven Fraktionen v/erden gesammelt, mit Aktivkohle behandelt, konzentriert und wiederholt
mit Heptan extrahiert. Der letzte Heptanextrakt wird 48 h auf O0C gekühlt und die Kristalle werden durch
Filtration von der Mutterlauge entfernt.
Diese Mutterlauge wird anschließend in Methylenchlorid und in eine mit Woelm Silikagel bepackte Glassäule einsickern
lassen. Die Säule wird dann aufeinanderfolge;·.! mit 2 1 Methylen, 8 1 Methylenchlorid:Äthylacetat (1:1)
und 4 1 Äthylacetat:Methanol (9:1) eluiert. Das Eluat
wird in Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen werden hinsichtlich
ihrer antibiotischen Zusammensetzung untersucht. Die aktiven Fraktionen werden kombiniert und im
D Q
Vakuum konzentriert, wobei man einen Rückstand erhält,
der LL-C23O24 jota enthält.
I: e i s ρ i e...l.. 10
(3) V/eitere Reinigung von LL-C23O24ß aus der Chromatographie
auf Silikagel
(R) Kan läßt Sephadex^* "'LH20 in einem Gemisch von Hexan*
Me thy lenchlo r i d-Me tlianö 1 (1G: 5:1) que Ilen. Eine Glas s äu-Ie
mit einem Durchmesser von 5 cm wird bis zu einer Höhe von 36 cm mit dem Gel bepackt. Die Charge, 3 g gereinigtes
LL-C23024ß, wird in 10 ml Methylenchlorid·, 1 ml Methanol und 10 ml Hexan aufgelöst und in die Säule des Gels
einsickern lassen. Die Säule 3 wird anschließend mit einem Lösungsmittel der gleichen Zusammensetzung entwickelt,
wie das, welches zum Aufbringen des Antibiotikums auf die Säule verwendet wurde. Er, werden Fraktionen unter Verwendung
eines Sammlers aufgefangen. Die ersten 23 Fraktionen
haben jeweils ein Volumen von 17 ml. Die Fraktionen 17 bis 26 enthielten C23024ß gemäß Dünnschichtchromatographie
(TLC). Diese Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum konzentriert, wobei man reines, amorphes LL-C23024ß
(1269 "mg) erhält.
B ei s .p. i e 1. 11
Kristallisation, vo.n LL-C23Q24ß als Natriumsalz
Gereinigtes LL-C23Ö24ß(2,4 g), hergestellt wird in den Abschnitten
B und C beschrieben, wird in einem Gemisch von Diäthylather (500 ml), Hexan (16O ml) und Methylenchlorid
(25 ml) aufgelöst. Die resultierende Lösung wird in einen Trenntrichter überfuhrt, der 300 ml destilliertes Wasser
enthält. Verdünnte HCl (1N) wird tropfenweise zugesetzt, bis der pH 2,0 bis 2,5 nach Umschütteln und Absitzen erreicht.
Di;e saure, wäßrige Phase wird verworfen und die mit Säure behandelte, organische Phase dreimal nacheinander
mit 400 ml—Volumen Wasser gewaschen. Die gewaschene,
organische Schicht wird mit einem Teelöffel von Darco
G-60 Pulver 15 min gerührt und durch CeIite filtriert.
Die entfärbte, organische Schicht wird über 500 ml destilliertes Wasser placiert und 5N NaOH wird tropfenweise zugesetzt,
bis der pH 11,0 bis 11,5 nach Schütteln und Absitzen erreicht. Die alkalische, wäßrige Phase wird verworfen
und die zurückbleibende, organische Schicht wird zweimal mit 400 ml-Portionen Wasser gewaschen. Die gewaschene,
organische Schicht wird über Natriumsulfat getrocknet und anschließend im Vakuum zu einem Volumen von
150 ml konzentriert. Dieses Konzentrat wird mehrere Stunden in einem Abzug stehengelassen. Das kristalline LL-C23024B
wird auf einem Trichter gesammelt, mit kaltem Hexan gewaschen und an der Luft getrocknet. Man erhält
402 mg des kristallinen Salzes von LL-C23024ß. An dieser Probe wurden die mikroanalytischen und ausgewählten
spektralen Messungen durchgeführt. Analyse: berechnet für C^H77O1 ^Na C 59,70%;
H 8,33c/o; 0 29,46%; Asche 2,49%. C 61,55; H 8,79;
Asche 3,31; N 0;
Schmelzpunkt [Fisher-Johns Apparat =174
(FD-Massenspektrum) = 924 [a]^ = +3,2 in Methanol].
Beispiel 12
Reinigung; von LL-C23024 .iota
Ein Waters Prep. 500A high performance liquid chromatography
instrument (Flüssigkeitschromatograph) wird unter einem Druck von 500 psi mit einer Silikagelpatrone beladen.
Die Charge, bei welcher es sich um 5,0 g des Rohmaterials von Beispiel 3 handelt, wird in 50 ml Heptan:
Äthylacetat (45:55) aufgelöst und auf die Säule von SiIikagel
injiziert. Die Säule wird anschließend mit dem gleichen Losungsmittelgemisch bei einer Flußrate von
200 ml/min entwickelt, wobei vierzig 200 ml-Fraktionen
BAD ORIGINAL
- 48 -
i!jr/'Pr'c-jri[-,eri v/erden. Die Fraktionen 21 bis 32 werden kombiniert,
zn einerr. Rückstand konzentriert, mit Hexan verriebe··;
und eingedampft. Man erhält reines LL-C23O24 jota. Das
cöige Verfahren wird viermal wiederholt, wobei man eine
kombinierte Gesamtmenge von 230 mg amorphes LL-C23024 jota erhält.
Eine 90 mg-Portion des amorphen LL-C23024 jota wird in
10 ml Diäthylather aufgelöst, mit 10 ml Wasser vermischt
■and mit O,1N Chlorwasserstoff säure auf pH 2,5 eingestellt.
Die Ätherschicht wird mit Wasser gewaschen, mit 0,1N
Hatriumhydroxid auf etwa pH 11 eingestellt, abgetrennt und
wiederum mit Wasser gewaschen. Die Ätherphase wird über
Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zu einem Rückstand konzentriert. Eine Lösung dieses Rückstands in Äther-Hexan
wird langsam eindampfen gelassen, wobei man einen amorphen, weißen Feststoff erhält. Dieser amorphe, weiße Feststoff
hat folgende Eigenschaften.
Elementaranalyse: C 61,79% ; H 8,84%; Asche 0,3296;
p/r
. [oc]£° = +27 (C 0,724, Methanol);
Felddesorptionsmassenspektroskopie: (M+Na) = m/e 953,
das berechnete Molekulargewicht beträgt daher 930.
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