DE3141030C2

DE3141030C2 -

Info

Publication number: DE3141030C2
Application number: DE3141030A
Authority: DE
Inventors: Toyofumi Miya; Yukiharu Kobayashi; Masao Saiki Oita Jp Yano
Original assignee: Kohjin Holdings Co Ltd
Current assignee: Kohjin Holdings Co Ltd
Priority date: 1980-10-15
Filing date: 1981-10-15
Publication date: 1990-04-05
Also published as: FR2491928A1; JPS624399B2; IT1140222B; FR2491928B1; DE3141030A1; GB2085884A; US4515943A; GB2085884B; JPS5767597A; IT8124490A0

Description

Die Erfindung betrifft ein kristallines β-Nicotinamid-adenin-dinucleotid- tetrahydrat und Verfahren zur Herstellung desselben sowie des hochreinen amorphen Produkts.

β-Nicotinamid-adenin-dinucleotid (nachstehend abgekürzt als "NAD" bezeichnet) kommt als Coenzym für verschiedene Oxidoreduktasen in nahezu allen Geweben lebender Körper vor und spielt eine sehr wichtige Rolle beim Energiestoffwechsel und bei der Biosynthese in einem lebenden Körper.

Der Bedarf an NAD ist daher in den letzten Jahren ständig gestiegen, wobei es nicht nur als Reagens für die Forschung in der Biochemie und Physiologie, sondern auch als Chemikalie eingesetzt wird, die für die klinische Diagnose als ein Faktor zur Messung bei der enzymatischen Analyse, zur Messung der Enzymaktivität und der Konzentration eines Substrats unerläßlich ist.

Bisher wurde NAD in fester Form hergestellt durch Isolieren von NAD aus Hefeextrakt oder aus der Kulturbrühe eines Mikroorganismus unter Anwendung verschiedener Isolierverfahren, wie z. B. durch Ionenaustauschchromatographie oder dadurch, daß die erhaltene Lösung von NAD einer Gefriertrocknung unterzogen wurde oder daß NAD mit einem organischen Lösungsmittel ausgefällt, der Niederschlag abgetrennt und getrocknet wurde. Das dabei erhaltene feste NAD ist jedoch amorph, sehr hygroskopisch und zerfließt an der Luft. In vielen Fällen enthält dieses amorphe NAD auch noch Spurenmengen von Verunreinigungen. Das dabei erhaltene amorphe NAD ist instabil und eine Abnahme seiner Reinheit durch thermische Zersetzung und bei der Lagerung und während des Transport ist unvermeidlich. Bekanntlich sind in den thermischen Zersetzungsprodukten ein konkurrierender Inhibitor eines Enzyms sowie Spurenmengen anderer Verunreinigungen enthalten. Die Verwendung eines solchen NAD mit geringerer Reinheit bei der enzymatischen Analyse führt daher zu Ergebnissen, die mit einem großen Fehler behaftet sind (vgl. z. B. Dalziel, "J. Biol. Chem.", Band 238, 1538 (1963)).

Die Herstellung von Kristallen von NAD in Form der freien Säure ist in DE-OS 24 59 932, DE-OS 20 50 267 und in A. D. Winer, "Cristallization of Nicotinamide Adenine Dinucleotide" in "J. Biol. Chem.", Band 239 (1964), Seiten 3598 bis 3600, beschrieben. Während in den beiden erstgenannten Druckschriften die Herstellung von NAD-Kristallen durch Gefriertrocknen einer wäßrigen NAD-Lösung bzw. durch Kristallisation im Vakuum von NADH beschrieben ist, ist zur Durchführung des in der zuletzt genannten Literaturstelle beschriebenen Verfahrens eine große Lösungsmittelmenge erforderlich und es müssen sehr niedrige Temperaturen von beispielsweise -15°C angewendet werden. Als Produkt werden Kristalle von NAD-Trihydrat erhalten, die lange dünne Nadeln oder flache Prismen sind, deren Stabilität gering ist und die sich bei Änderung der Umgebungsfeuchtigkeit leicht in amorphes NAD umwandeln. Außerdem enthält das bei diesem Verfahren erhaltene Produkt noch Reste an nicht-abtrennbarem Lösungsmittel, so daß dieses bekannte Verfahren als industrielles Verfahren zur Herstellung von NAD keine praktische Bedeutung erlangt hat.

Es sind auch bereits Kristalle eines Metallsalzes (Lithiumsalzes) von NAD bekannt. Wenn jedoch NAD in Form der freien Säure gewünscht wird, muß das Metallsalz zuerst mit einem Ionenaustauscherharz behandelt werden, so daß zur Reinigung von amorphem NAD unter Anwendung dieses Verfahrens zahlreiche Verfahrensstufen erforderlich sind, was technisch nachteilig ist.

Aufgabe der Erfindung war es daher, kristallines β-Nicotinamid- adenin-dinucleotid (NAD) in Form der freien Säure bereitzustellen, das eine hohe Reinheit und hohe Stabilität aufweist und das unter Anwendung eines großtechnisch durchführbaren Verfahrens auf einfache und reproduzierbare Weise in guter Ausbeute hergestellt werden kann.

Es wurde nun gefunden, daß diese Aufgabe erfindungsgemäß gelöst werden kann durch kristallines β-Nicotinamid-adenin- dinucleotid-tetrahydrat mit den nachstehend angegebenen Merkmalen, das nach dem nachstehend beschriebenen Verfahren hergestellt werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist kristallines β-Nicotinamid- adenin-dinucleotid-tetrahydrat (NAD-Tetrahydrat) im triklinen System mit einer Raumgruppe von P oder P 1 und den folgenden Gitterkonstanten:

a = 0,8861 nm
b = 1,1181 nm
c = 0,8630 nm
α = 90,82°
β = 103,40° und
γ = 109,71°.

Das erfindungsgemäße kristalline NAD-Tetrahydrat kann in besonders hoher Reinheit hergestellt werden und es weist eine außerordentlich gute Stabilität auf. Es eignet sich besonders gut zur Herstelung von hochreinem amorphem β-Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD).

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung des vorstehend beschriebenen kristallinen b-Nicotinamid-adenin-dinucleotid-tetrahydrats, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine 20 bis 60 gew./vol.-%ige wäßrige Lösung von amorphem β-Nicotinamid-adenin-dinucleotid bei einer Temperatur von 0 bis 20°C kühlt.

Dabei kristallisiert das erfindungsgemäße NAD-Tetrahydrat aus, so daß das erfindungsgemäße Verfahren technisch sehr einfach und außerordentlich wirtschaftlich ist, weil es das gewünschte Endprodukt in hoher Ausbeute mit hoher Reinheit und ausgzeichneter Stabilität liefert.

Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird bei der Durchführung des vorstehend beschriebenen Verfahrens amorphes β-Nicotinamid-adenin-dinucleotid mit einer enzymatischen Reinheit von mindestens 90% verwendet, das insbesondere durch Behandeln mit einem hochporösen, schwach basischen Anionenaustauscherharz vom Acetat-Typ gereinigt worden ist.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von hochreinem amorphem β-Nicotinamid-adenin-dinucleotid, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man kristallines β-Nicotinamid-adenin-dinucleotid-tetrahydrat der vorstehend beschriebenen Art in Wasser löst und amorphes β-Nicotinamid-adenin-dinucleotid in fester Form entweder durch Gefriertrocknen oder durch Ausfällen mit einem Alkohol und anschließendes Abtrennen und Trocknen des Niederschlags gewinnt.

Nach diesem Verfahren ist es möglich, auf technisch einfache Weise amorphes NAD mit einer besonders hohen Reinheit herzustellen.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die beiligenden Zeichnungen näher erläutert. Dabei zeigen:

Fig. 1 eine Mikrophotographie von erfindungsgemäßem kristallinem NAD-Tetrahydrat in 400facher Vergrößerung;

Fig. 2 ein Röntgenbeugungsspektrum von amorphem NAD;

Fig. 3 ein Röntgenbeugungsspektrum des erfindungsgemäßen kristallinen NAD-Tetrahydrats;

Fig. 4 ein IR-Absorptionsspektrum (aufgenommen mittels der KBr-Tablettenmethode) des erfindungsgemäßen kristallinen NAD-Tetrahydrats;

Fig. 5 ein Hochleistungs-Flüssigkeits-Säulenchromatogramm eines gereinigten amorphen NAD-Pulvers, das unter Anwendung einer üblichen Reinigungsmethode, bei der Methanol einer wäßrigen Lösung von NAD zur Ausfällung desselben zugesetzt wird, erhalten wurde; und

Fig. 6 ein Hochleistungs-Flüssigkeits-Säulenchromatogramm des erfindungsgemäßen kristallinen NAD- Tetrahydrats.

Amorphes NAD, das nach einer allgemein bekannten Methode hergestellt wurde, z. B. durch Ausfällen aus einer wäßrigen Lösung von NAD mit einem organischen Lösungsmittel, und anschließende Abtrennung und Trocknung oder Gefriertrocknung der wäßrigen Lösung, wird als Ausgangsmaterial zur Herstellung des erfindungsgemäßen kristallinen NAD- Tetrahydrats verwendet. In vielen Fällen enthält ein derartiges amorphes NAD Verunreinigungen. Diese können nach bekannten Methoden entfernt werden. Erfindungsgemäß gemäß ist es günstig, wenn die enzmatische Reinheit des amoprhen NAD mindestens 90% beträgt, da NAD leicht auskristallisiert und auch die Ausbeute der Kristallisation ansteigt. Vorzugsweise wird das amorphe NAD gereinigt durch Behandeln einer wäßrigen Lösung von amorphem NAD mit einem porösen, schwach basischen Anionenaustauscherharz, das vorher in die Acetatform, Carbonatform, Phosphatform, Hydrochloridform oder OH-Form (Form der freien Base) umgewandelt worden ist.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das amorphe NAD gereinigt durch Leiten einer wäßrigen Lösung von amorphem NAD durch eine Säule mit einem hochporösen, schwach basischen handelsüblichen Anionenaustauscherharz, das in die Acetatform umgewandelt wurde. Da NAD an diesem Anionenaustauscherharz adsorbiert wird, wird das Anionenaustauscherharz vorzugsweise in den geringsten Mengen, die zur Entfernung der Verunreinigungen benötigt werden, verwendet. NAD-Kristalle gemäß der Erfindung, die aus einer wäßrigen Lösung von amorphem NAD erhalten wurden, das nach dieser Methode gereinigt wurde, sind sehr rein und ausgezeichnet als Impfkeime zur Kristallisation von NAD geeignet.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen Kristalle ist es bei der Kristallisation notwendig, daß die Konzentration der wäßrigen Lösung von NAD 20 bis 60 Gew./Vol.-%, vorzugsweise 40 bis 50 Gew./Vol.-%, beträgt. Wenn die Konzentration weniger als 20 Gew./Vol.-% beträgt, so erfolgt die Kristallisation sehr schwer, und die Ausbeute ist sehr gering, ist die wäßrige Lösung aufgrund der hohen Viskosität schwer zu handhaben. Die Konzentration wird daher innerhalb des vorstehenden Bereichs vor oder nach der Reinigung von NAD eingestellt. Die wäßrige Lösung wird bei einer Temperatur von 0 bis 20°C, vorzugsweise 2 bis 8°C, zur Kristallisation gekühlt. Die Kristallisation ist in ein oder zwei Tagen beendet, wenn die wäßrige Lösung stehengelassen wird, und sie ist in einigen Stunden beendet, wenn die wäßrige Lösung leicht gerührt wird, um das Kristallwachstum zu beschleunigen.

Es ist zweckmäßig, beim Kristallisieren getrennt hergestellte NAD-Kristalle als Impfkristalle zu verwenden. Im Falle der Durchführung der Kristallisation unter Verwendung vom Impfkristallen kann das gewünschte kristalline NAD erhalten werden durch Kühlen einer 20 bis 60 Gew./Vol.-% wäßrigen Lösung von NAD bei einer Temperatur von 0 bis 20°C, ohne das NAD der Reinigung mit einem Ionenaustauscherharz, wie dem vorstehend erwähnten hochporösen Ionenaustauscherharz, zu unterziehen. Zwar ist es möglich, die gewünschten Kristalle zu erhalten, selbst wenn die enzymatische Reinheit des verwendeten amorphen NAD gering ist, vorzugsweise jedoch wird ein amorphes NAD mit einer enzymatischen Reinheit von nicht weniger als 90%, insbesondere nicht weniger als 93%, verwendet, da die Kristallisation dann leicht erfolgt und auch die Ausbeute gesteigert werden kann.

Die erzeugten Kristalle werden in üblicher Weise abgetrennt. Erfindungsgemäß erhält man die Kristalle in einer Ausbeute von etwa 90% oder mehr. Die erfindungsgemäßen NAD- Tetrahydrat-Kristalle weisen folgenden Eigenschaften auf:

Analyse für C₂₁H₂₇O₁₄N₇P₂ · 4 H₂O (MG: 735,48):
ber.:
C 34,29; H 4,80; N 13,33; P 8,42%
gef.:
C 34,57; H 4,73; N 13,28; P 8,40%

Wassergehat nach der Karl Fischer-Methode: 9,4%
(theoretischer Wert 9,8).
Kristallsystem: triklines System
Raumgruppe P oder P 1
Gitterkonstanten:

a = 0,8861 nm
b = 1,1181 nm
c = 0,8630 nm
α = 90,82°
β = 103,40°
γ = 109,71°
V = 0,855 nm³

Schmelzpunkt (F.)=128±2°C.
Dichte:
gefunden ρ = 1,550
gerechnet ρ = 1,567 (berechnet als Z=1)

Eine Photographie der erfindungsgemäßen Kristalle, beobachtet durch Mikroskop mit 100facher Vergrößerung ist in der Fig. 1 dargestellt. Auch das Röntgenstrahlen- Beugungsspektrum und das Infrarotspektrum der erfindungsgemäßen Kristalle sind in den Fig. 3 bzw. 4 gezeigt. Die Fig. 2 stellt ein Röntgenstrahlen-Beugungsspektrum von amorphem NAD dar.

Das so erhaltene kristalline NAD Tetrahydrat vom Typ der freien Säure weist keine Fehler des üblichen amorphen NAD auf. Das erfindungsgemäße kristalline NAD-Tetrahydrat liegt in Form von Kristallen mit 4-Kristallwasser vor und ist stabil und nicht hygroskopisch und ist fließfähig. Es weist auch eine ausgezeichnete Lagerungsstabilität auf und besitzt keinen Geruch und ein schönes Aussehen und ist daher von großem gewerblichem Wert. Die erfindungsgemäßen Kristalle verlieren das Kristallwasser nicht, selbst wenn sie zwangsweise entwässert werden, und kehren leicht in die ursprüngliche Kristalle unter Wassergabe zurück. Hinsichtlich der Stabilität der erfindungsgemäßen Kristalle tritt keine Verringerung der enzymatischen Aktivität auf, selbst wenn die Kristalle beispielsweise 24 Tage bei 37°C gehalten werden, obwohl amorphes NAD eine Verringerung der Reinheit um etwa 10% unter den gleichen Bedingungen zeigt und seine Reinheit im Verlauf der Zeit geringer wird. Nach der enzymatischen Analyse ist das erfindungsgemäße kristalline NAD 100% rein als β-NAD, und es wurde kein Einschluß von Enzyminhibitoren, wie LDH (Lactatdehydrogenase)-Inhibitor, festgestellt. Nach der Flüssigkeitschromatographie enthält ein handelsübliches β-NAD eine Spurenmenge von Verunreinigungen, insbesondere α-NAD und ADP-Ribose (Adenosin-5-diphosphat- ribose), jedoch wurden diese Verunreinigungen nicht in dem erfindungsgemäßen kristallinen NAD-Tetrahydrat festgestellt. Die Fig. 5 zeigt ein hochleistungsfähiges Flüssigkeits-Chromatogramm eines handelsüblichen amorphen NAD, das gereinigt wurde durch Ausfällen von NAD unter Zusatz von Methanol aus einer wäßrigen Lösung von amorphem NAD, behandelt mit einem Ionenaustauscherharz, und die Fig. 6 zeigt ein hochleistungsfähiges Flüssigkeits-Chromatogramm des erfindungsgemäßen kristallinen NAD-Tetrahydrats. In der Fig. 5 ist A ein Peak von AMP (Adenosin-5-monophosphat) und B ein Peak von ADP-Ribose. AMP und ADP-Ribose werden in dem handelsüblichen Präparat festgestellt, jedoch lassen sie sich in den erfindungsgemäßen kristallinen NAD-Tetrahydrat nicht feststellen. Die Bedingungen für die hochleistungsfähige Flüssigkeitschromatographie sind im folgenden aufgeführt:

Säule: Anionen-Austauscherharz, NH₂-Porm (4 mm innerer Durchmesser und 30 cm Länge).
Lösungsmittel: 0,1 m NH₄H₂PO₄ (pH 3,5)
Fließgeschwindigkeit: 2,0 ml/min
Registriergeschwindigkeit: 1,0 cm/min
Bestimmung: UV 254 nm, 0,5 AUFS
Konzentration der NAD-Probe: 1,0 mg/ml

Das erfindungsgemäße kristalline NAD-Tetrahydrat ist sehr rein, d. h. etwa 100% rein und enthält keine Verunreinigungen, die zu Fehlern bei der enzymatischen Analyse führen. Es ist auch bei der Lagerung oder beim Transport stabil, und es besteht keine Notwendigkeit, die Temperatur niedrig zu halten, wie dies bei üblichem NAD erforderlich ist. Darüber hinaus weist das erfindungsgemäße Verfahren bei der industriellen Produktion den Vorteil auf, daß ein Reinigungsvorgang, wie er bei einem üblichen Verfahren unter wiederholtem Zusatz einer großen Menge an Lösungsmittel durchgeführt wird, nicht erforderlich ist, und daß die Kristalle aus einer wäßrigen Lösung von NAD ohne Verwendung eines Lösungsmittels erhalten werden können.

Wird ein hochreines amorphes NAD gewünscht, so kann es leicht erzielt werden durch Auflösen des erfindungsgemäßen kristallinen NAD-Tetrahydrat in Wasser und anschließendes Unterziehen der resultierenden wäßrigen Lösung einer Gefriertrocknung oder Zusatz der wäßrigen Lösung zu einem Alkohol, wie Methanol, zur Ausfällung von NAD. Beispielsweise werden die erfindungsgemäßen Kristalle in heißem Wasser gelöst zur Herstellung einer 10 bis 50 gew./vol.-%igen wäßrigen Lösung von NAD, und die wäßrige Lösung wird unmittelbar auf Raumtemperatur, z. B. 18 bis 25°C gekühlt, um die thermische Zersetzung von NAD zu vermeiden. Die wäßrige Lösung wird dann lyophilisiert oder wird in einen Alkohol unter Rühren gegossen, um NAD auszufällen, das abgetrennt und getrocknet wird. Aus der vorstehenden Beschreibung ist hinsichtlich kristallinem NAD-Tetrahydrat und dem Verfahren zu dessen Herstellung ersichtlich, daß dieses Verfahren zur Herstellung von amorphem NAD unter Verwendung der erfindungsgemäßen Kristalle einem üblichen Verfahren darin sehr überlegen ist, daß hochreine Produkte durch eine einfache Verfahrensführung erhalten werden können. So wird durch die Erfindung ein Verfahren zur Reinigung von amorphem NAD bereitgestellt.

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Ein NAD-enthaltender Extrakt, erhalten aus Zellen eines Mikroorganismus, wurde durch Ionenaustauscher- Chromatographie gereinigt, und die erhaltene wäßrige Lösung von NAD wurde zu dem 9fachen des Volumens der wäßrigen Lösung an Methanol gegeben, um NAD auszufällen. Die Ausfällung wurde filtriert, mit einer geringen Methanolmenge gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet unter Bildung eines Pulvers des gereinigten amorphen NAD. Die enzymatische Reinheit des Pulvers betrug 92%. Das so erhaltene amorphe NAD-Pulver wurde als Ausgangsmaterial verwendet.

Eine wäßrige Lösung von 100 g des Pulvers, gelöst in 200 ml Wasser, wurde durch eine Säule von 1,5 cm Innendurchmesser, gepackt mit 20 ml eines handelsüblichen hochporösen schwach basischen Anionenaustauscherharzes, umgewandelt in die Acetatform, von oben über die Säule mit einer Raumgeschwindigkeit von 1 h^-1, geleitet. Anschließend wurden 40 ml entionisiertes Waser durch die Säule geführt und 220 ml der NAD enthaltenden Fraktion in dem Eluat wurden gesammelt.

Die Fraktion wurde auf 5°C gekühlt und bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach 16 h begannen Kristalle, die als Kristallnukleus dienten, an dem Boden eines Gefäßes aufzutreten, und anschließend wurde die Fraktion leicht 5 h bei 5°C zur Erzielung von Kristallen gerührt. Die Kristalle wurden unter Absaugen filtriert, mit einer geringen Wassermenge gewaschen und im Vakuum getrocknet, unter Bildung von 90 g kristallinem NAD-Tetrahydrat. Die enzymatische Reinheit der Kristalle betrug 100% auf Trockenbasis.

Beispiel 2

Ein NAD-enthaltender Extrakt, erhalten aus Zellen eines Mikroorganismus, wurde durch Ionenaustauscher-Chromatographie gereinigt, und das Eluat wurde lyophilisiert unter Bildung von gereinigtem amorphem NAD, dessen enzymatische Reinheit 91% betrug.

Die Verfahrensweise des Beispiels 1 wurde wiederholt, wobei jedoch eine wäßrige Lösung von 500 g des vorstehenden amorphen NAD, gelöst in 1 l Wasser, und ein handelsübliches Ionenaustauscherharz verwendet wurden, unter Bildung von 455 g kristallinem NAD-Tetrahydrat, das 100% enzymatisch rein war.

Beispiel 3

In 200 ml Wasser wurden 100 g eines amorphen NAD-Pulvers (enzymatische Reinheit 93,5%), hergestellt in der gleichen Weise wie im Beispiel 1, gelöst. Zu der erhaltenen wäßrigen Lösung wurden 5 mg kristallines NAD, erhalten im Beispiel 1, als Impfkeime zur Kristallisation gefügt. Die wäßrige Lösung wurde anschließend 6 h bei 5°C gerührt, und die resultierenden Kristalle wurden abgetrennt und getrocknet. Die Ausbeute an kristallinem NAD betrug 91,5 g, und die enzymatische Reinheit betrug 99,8%.

Beispiel 4

Die Verfahrensweise des Beispiels 3 wurde wiederholt, wobei jedoch eine 50 gew./vol.-%ige wäßrige Lösung verwendet wurde, erhalten durch Auflösen in Wasser, von 39 g amorphem NAD mit einer enzymatischen Reinheit von 92%, unter Bildung von 35 g kristallinem NAD. Die so erhaltenen Kristalle enthielten 9,4 Gew.-% Wasser und 90,5 Gew.-% NAD.

In 100 ml destilliertem Wasser wurden 35 g der Kristalle bei 46°C gelöst. Unmittelbar nach dem Auflösen wurde die wäßrige Lösung auf 20°C gekühlt. Die wäßrige Lösung wurde dann durch ein Membranfilter mit einer Porengröße von 0,22 µm filtriert und wurde lyophilisiert, unter Bildung von 32 g eines hochreinen amorphen NAD. Das so erhaltene amorphe NAD- Pulver enthielt 2,8 Gew.-% Wasser und 97 Gew.-% NAD. Die enzymatische Reinheit des Pulves beträgt 99,8% auf Trockenbasis.

Beispiel 5

In 200 ml destilliertem Wasser von 46°C wurden 26 g kristallines NAD, erhalten im Beispiel 4, gelöst, und unmittelbar nach dem Auflösen wurde die wäßrige Lösung auf 20°C gekühlt. Die wäßrige Lösung wurde anschließend durch ein Membranfilter mit einer Porengröße von 0,22 µm filtriert und zu 1,8 l Methanol unter Rühren gefügt. Die resultierende Ausfällung wurde mit einer Dekantiervorrichtung gesammelt, mit einer geringen Menge Methanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet unter Bildung von 23 g von hochreinem amorphem NAD. Das so erhaltene amorphe NAD-Pulver enthielt 95,0 Gew.-% NAD und 3,0 Gew.-% Wasser. Die enzymatische Reinheit des Pulvers betrug 97,9% auf Trockenbasis.

Claims

1. Kristallines β-Nicotinamid-adenin-dinucleotid-tetrahydrat im triklinen System mit einer Raumgruppe von P oder P 1 und den folgenden Gitterkonstanten: a = 0,8861 nm,
b = 1,1181 nm
c = 0,8630 nm,
α = 90,82°,
β = 103,40° und
γ = 109,71°

2. Verfahren zur Herstellung von kristallinem β-Nicotinamid- adenin-dinucleotid-tetrahydrat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine 20 bis 60 gew./vol.-%ige wäßrige Lösung von amorphem β-Nicotinamid-adenin-dinucleotid bei einer Temperaur von 0 bis 20°C kühlt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man amorphes β-Nicotinamid-adenin-dinucleotid mit einer enzymatischen Reinheit von mindestens 90% verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man amorphes b-Nicotinamid-adenin-dinucleotid verwendet, das durch Behandeln mit einem hochporösen, schwach basischen Anionenaustauscherharz vom Acetat-Typ gereinigt worden ist.

5. Verfahren zur Herstellung von hochreinem amorphem β- Nicotinamid-adenin-dinucleotid, dadurch gekennzeichnet, daß man kristallines β-Nicotinamid-adenin-dinucleotid-tetrahydrat nach Anspruch 1 in Wasser löst und amorphes β-Nicotinamid- adenin-dinucleotid in fester Form entweder durch Gefriertrocknen oder durch Ausfällen mit einem Alkohol und anschließendes Abtrennen und Trocknen des Niederschlags gewinnt.