DE3132497A1 - METHOD FOR FORMING A POLYSACCHARID BY MICROORGANISMS - Google Patents

Description

Shell Internationale ":./;.-; ^: Q 1 1A-55 067 U. Shell Internationale ": ./; ^.-; Q 1 1A-55 067 U.

Beschreibungdescription Verfahren zur Bildung eines Polysaccharids durchProcess for the formation of a polysaccharide by MikroorganismenMicroorganisms

Die Erfindung betrifft die Anwendung von mikrobiologischen Zellen in einem inmobilisierten System und insbesondere die Bildung eines Polysaccharids durch immobilisierte Mikroorganismen,,The invention relates to the use of microbiological Cells in an immobilized system and in particular the formation of a polysaccharide by immobilized microorganisms,

1A-55 067 ;'_- i ^ ■·■-'-1A-55 067; '_- i ^ ■ · ■ -'-

sind, vorausgesetzt, daß die Trägerteilchen eine definierte Porengröße besitzen.provided that the carrier particles have a defined pore size.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Bildung eines Polysaccharids, bei dem ein Mikroorganismus, der ein Polysaocharid bildet, enthalten (supported) ist auf einem porösen, feinteiligen, inerten Träger, dessen Porengröße mehr als 0,5 Mm beträgt₍unter Bildung eines immobilisierten Zellsystems, wobei ein wäßriges Nährmedium durch das immobilisierte System geleitet wird und das Polysaccharid-haltige Medium von dem System abgezogen wird.The invention therefore relates to a method for the formation of a polysaccharide in which a microorganism which forms a polysaccharide is contained (supported) on a porous, finely divided, inert carrier, the pore size of which is more than 0.5 μm ₍ with the formation of an immobilized cell system , wherein an aqueous nutrient medium is passed through the immobilized system and the polysaccharide-containing medium is withdrawn from the system.

Das Verfahren ist allgemein anwendbar auf eine Vielzahl von Mikroorganismen, die Polysaccharide bilden. Es kann angewandt werden auf Mikroorganismen, bei denen die Polysaccaridbildung von Wachstum und Vermehrung begleitet ist wie dem Xanthan-bildenden Organismus Xanthomonas campestris. In diesen Fällen führt das Wachstum des Organismus jedoch zur Freisetzung von Zellen aus dem Träger in das Medium, wodurch einige der erfindungsgemäßen Vorteile verloren gehen. Das Verfahren ist besonders geeignet für Mikroorganismen, die Polysaccharide in der stationären Phase des Wachstums zyklus bilden (d, h. die PoIysaccharidbildung ist nicht von Wachstum begleitet). Beispiele für derartige Mikroorganismen sind bestimmte Schleim-bildende Arten der Gattung Pseudomonas, Rhizobium, Alcaligenes und Agrobacterium, besonders Pseudomonas spp* NCIB 11592 und 11264, Rhinzobium •meliloti, Alcaligenes faecalis var. myxogenes, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium tumefaciens und Agrobacterium rhizogenes. Alle diese speziellen Organismen bilden ein besonderes Polysaccharid, enthaltend Glucose und auf jeweils 7 Mol GlucoseThe method is generally applicable to a variety of microorganisms that form polysaccharides. It can be applied to microorganisms where the polysaccharide formation is accompanied by growth and multiplication, such as the xanthan gum-forming Organism Xanthomonas campestris. In these cases, however, the growth of the organism leads to the release of cells from the carrier into the medium, thereby losing some of the advantages of the invention walk. The method is particularly suitable for microorganisms that contain polysaccharides in the stationary Form phase of the growth cycle (i.e. polysaccharide formation is not accompanied by growth). Examples of such microorganisms are certain slime-forming species of the genus Pseudomonas, Rhizobium, Alcaligenes and Agrobacterium, especially Pseudomonas spp * NCIB 11592 and 11264, Rhinzobium • meliloti, Alcaligenes faecalis var. Myxogenes, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes. All of these special Organisms form a special polysaccharide, containing glucose and each 7 moles of glucose

/3/ 3

0,9 bis 1,2 Mol Galactose und 0,65 bis 1,1 Mol Pyruvat zusammen mit 0 bis 2 Mol Succinat und Acetat, dessen Eigenschaften und Anwendung für Ölgewinnungsverfahren im einzelnen in der GB-Anmeldung 8016832*beschrieben ist. In dieser Anmeldung sind auch im einzelnen die Charakteris vi des neuen Stammes NCIB 11592 der Art Pseudomonas beschrieben.0.9 to 1.2 moles of galactose and 0.65 to 1.1 moles of pyruvate along with 0 to 2 moles of succinate and Acetate, its properties and uses for oil recovery processes in detail in the UK application 8016832 * is described. In this application are also in detail the characteristics vi of the new strain NCIB 11592 of the species Pseudomonas described.

Das Trägermaterial sollte natürlich chemisch und biologisch inert sein unter den Anwendungsbedingungen und geeignete Materialien sind anorganische Oxide von Silicium, Aluminium, Zirkon, Magnesium und deren Gemische. Es hat sich gezeigt, daß die wirksame Zurückhaltung der mikrobiologischen Zellen auf (bzw. in) dem Träger abhängt von der geeigneten Wahl der Porengröße in den Trägerteilchen und wie oben angegeben sollte diese größer als 0,5 V& sein. Allgemein werden die besten Ergebnisse erzielt, wenn die Porengröße mindestens 1 yum beträgt. Bevorzugte Porengrößen betragen 2 bis 30/um. Die Größe der Trägerteilchen ist weniger kritisch als die Porengröße, um eine günstige Arbeitsweise zu erzielen, und in der Praxis wird die Teilchengröße zum Teil durch die Arbeitsbedingungen bestimmt, unter denen das immobilisierte System angewandt werden soll, z. B. ob es in Form eines Festbettes oder als Aufschlämmung angewandt werden soll. Im allgemeinen sollte die Teilchengröße weniger als 1 mm betragen und bei Anwendung in einem Aufschlämmungsreaktor hat es sich gezeigt, daß üblicherweise die besten Ergebnisse erzielt werden, wenn Teilchen mit einer Größe von 100 bis 600 um, insbesondere 150 bis 300/um angeandt werden.The carrier material should of course be chemically and biologically inert under the conditions of use and suitable materials are inorganic oxides of silicon, aluminum, zirconium, magnesium and mixtures thereof. It has been shown that the effective retention of the microbiological cells on (or in) the carrier depends on the suitable choice of the pore size in the carrier particles and, as indicated above, this should be greater than 0.5 V & . In general, the best results are achieved when the pore size is at least 1 μm. Preferred pore sizes are 2 to 30 μm. The size of the carrier particles is less critical than the pore size in order to achieve a favorable operation and in practice the particle size is determined in part by the working conditions under which the immobilized system is to be used, e.g. B. whether it is to be used in the form of a fixed bed or as a slurry. In general the particle size should be less than 1 mm and when used in a slurry reactor it has been found that usually the best results are obtained when particles of a size of 100 to 600 µm, especially 150 to 300 µm, are used.

Das Aufbringen der Zellen auf den Träger kann auf verschiedene Weise erfolgen, wobei sich jedoch zweiThe cells can be applied to the carrier in various ways, but there are two ways

*) (= EP-r-Anmeldung 812004794 vom 06,05,81)*) (= EP-r application 812004794 from 06.05.81)

/4/ 4

1A-55 067 ' -' -: 4 --."..- '■ 1A-55 067 '-' -: 4 -. "..- '■

Verfahren allgemein als günstig erwiesen haben. Bei einem Verfahren werden die mikrobiologischen Zellen nach bekannten Verfahren in einem Fermenter gezüchtet, sodaß man eine Paste der erforderlichen Zellen erhält, die mit den Trägerteilchen vermischt wird. Das Gemisch wird dann einem Vakuum ausgesetzt und das Vakuum aufgehoben, sodaß der Atmosphärendruck die Paste in die Poren des Trägers preßt. Die überzogenen Teilchen werden dann eine kurze Zeit (einige Stunden) gealtert und anschließend der Überschuß an Zellen abgewaschen. Ein alternatives und bevorzugtes Verfahren besteht in dem Wachstum in situ, bei dem der feinteilige Träger in einem geeigneten Wachstumsmedium suspendiert wird, das dann mit dem gewünschten Organismus beimpft wird. Das beimpfte,den Träger ent--' haltene Wachstumsmedium wird dann unter entsprechenden Bedingungen inkubiert, um ein Wachstum des Organismus zu erreichen und nach einer entsprechenden Zeit werden die freien Zellen abgewaschen, wobei das zellhaltige immobilisierte System verbleibt. Bei einer Abwandlung dieses Verfahrens wird frisches Wachstumsmedium, das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, kontinuierlich während der Immobilisierung in den Reaktor geleitet, um geeignete Bedingungen für das Festsetzen der Zellen auf den Trägerteilchen zu erhalten. Wenn das Wachstum in situ durchgeführt wird, hat es sich häufig gezeigt, daß höhere und stabilere Beladungen mit Zellen erzielt werden können-durch Verwendung von hohen Nähr-Procedures have generally proven beneficial. In one process, the microbiological cells cultured in a fermenter according to known methods so that a paste of the required cells is obtained, which is mixed with the carrier particles. The mixture is then placed under vacuum and the vacuum canceled, so that the atmospheric pressure presses the paste into the pores of the carrier. The coated particles are then aged for a short time (a few hours) and then the excess of cells is washed off. An alternative and preferred method consists in the growth in situ, in which the finely divided Support is suspended in a suitable growth medium, which is then mixed with the desired Organism is inoculated. The inoculated, the carrier un- ' The growth medium held is then incubated under appropriate conditions to allow growth of the To reach the organism and after a corresponding time the free cells are washed off, whereby the cell-containing immobilized system remains. A modification of this process will result in fresh Growth medium containing a source of assimilable carbon and nitrogen, continuously passed into the reactor during immobilization to create suitable conditions for the attachment of the cells to obtain on the carrier particles. When the growth is done in situ it has often been shown that higher and more stable loadings of cells can be achieved by using high nutrients

30 stoffgehalten in dem Wachstumsmedium.30 substance content in the growth medium.

Das wäßrige Nährmedium sollte ein Substrat für die Polysaccharidbildung durch den Mikroorganismus enthalten. Im Falle solcher Mikroorganismen,'die PoIysaccharid in der stationären Phase ihres Wachstumszyklus bilden, ist das Nährmedium vorzugsweise ein solches, das während es das erforderliche SubstratThe aqueous nutrient medium should contain a substrate for polysaccharide formation by the microorganism. In the case of those microorganisms that form polysaccharide in the stationary phase of their growth cycle, the nutrient medium is preferably a such that while it is the required substrate

/5/ 5

1A-55 067 ' — S --"" - .' .1A-55 067 '- S - ""-.' .

zur Verfügung stellt, nicht zu Bedingungen führt, die zum Wachstum zur Vermehrung des Mikroorganismus führen. Derartige nicht-Wachstumsbedingungen können aufrechterhalten werden durch Anwendung eines Mediums, dem eine oder mehrere Komponenten mangeln, die für das Zellwachstum erforderlich sind, z. B. Sulfaj, Phospat oder vorzugsweise Stickstoff₍oder durch andere bekannte Maßnahmen. Das wäßrige Nährmedium enthält üblicherweise eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff zusammen mit kleineren Mengen anorganischer Ionen. Die Kohlenstoffquelle ist günstigerweise ein Kohlenhydrat und bequemerweise Glucose und wird vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 bis 10 Gew₄-96, üblicherweise 1 bis 2 % (Gew_c/Volumen) angewandt. Die Temperatur und der pH-Wert, bei denen das Polysaccharid am wirksamsten gebildet wird, variieren natürlich je nach nach dem Organismus und im Falle von Pseudomonas sp. NCIB 11592 liegt die Temperatur vorzugsweise zwischen 20 und 35°C und der pH-Wert vorzugsweise zwischen 6 und 9. Während der Bildung des Polysaccharids wird das wäßrige Nährmedium üblicherweise kontinuierlich zu dem immobilisierten System mit der gleichen Geschwindigkeit zugeführt;,wie das Polysaccharidhaltige Medium davon abgezogen wird. Das austretende Medium kann als solches verwendet oder es kann nach bekannten Verfahren behandelt werden, um das Polysaccharid daraus zu extrahieren»makes available, does not lead to conditions that lead to growth for multiplication of the microorganism. Such non-growth conditions can be maintained by employing a medium that is deficient in one or more components necessary for cell growth, e.g. B. sulfaj, phosphate or preferably nitrogen ₍ or by other known means. The aqueous nutrient medium usually contains a source of assimilable carbon along with minor amounts of inorganic ions. The carbon source is conveniently a carbohydrate and conveniently glucose and is preferably at a concentration of 0, 1 to 10 wt ₄ -96, usually 1 applied to 2% (w _c / v). the temperature and pH at which the polysaccharide is formed most effective, of course, vary depending on depending on the organism and in the case of Pseudomonas NCIB 11592, the temperature is preferably between 20 and 35 ° C and the pH is preferably between 6 and 9. During the formation of the polysaccharide, the aqueous nutrient medium is usually continuously fed to the immobilized system at the same rate as the polysaccharide-containing one Medium is withdrawn therefrom The escaping medium can be used as such or r it can be treated according to known methods in order to extract the polysaccharide from it »

Einer der Hauptvorteile, der durch die Anwendung des erfindungsgemäßen Immobilisierungsverfahrens erzielt werden kann, besteht in der Leichtigkeit der Trennung des gewünschten Polysaccharids von den Zellen, da diese auf den Trägerteilchen festgehalten werden, die leicht in dem Fermentationsgefäß durch bekannte Vorrichtungen wie Filter, Siebe öder ähnliches zurückgehalten werden können. Darüberhinaus bietet dasOne of the main advantages achieved by using the immobilization method of the invention consists in the ease with which the desired polysaccharide can be separated from the cells these are retained on the carrier particles, which are easily retained in the fermentation vessel by known devices how filters, sieves or the like can be retained. In addition, the

/6/ 6

*) Überlaufvorrichtungen*) Overflow devices

Immobilisierungsverfahren die Möglichkeit einer längeren Lebensdauer der Zellen, d. h. einer längeren Zeit, während der sie das Polysaccharid bilden,ohne daß deutliches Wachstum auftritt. Diese Lebenszeit ist jedoch unweigerlich begrenzt und nicht in allen Fällen deutlich langer als die der freien Zellen. Wenn die Polysaccharidbildung der auf dem Träger enthaltenen Zellen jedoch unter.ein annehmbares Niveau absinkt, kann sie leicht und nahezu vollständig wieder erneuert werden durch Wiederholung der Wachstumsphase-(d. h. Einleitung eines vollständigen Wachstumsmediums, das alle notwendigen Nährstoffe enthält) für eine entsprechende Zeit, günstigerweise unter Auswaschbedingungen, durch die freie Zellen, die von dem Träger freigesetzt werden, entfernt werden. Dann kann wieder ein Nährmedium zugeführt werden, das einen Mangel an beispielsweise Stickstoff aufweist.Immobilization methods, the possibility of longer cell life, d. H. one longer time during which they form the polysaccharide without significant growth occurring. However, this lifetime is inevitably limited and not in all cases significantly longer than that of the free cells. However, if the polysaccharide formation of the cells contained on the carrier is below an acceptable level If the level drops, it can be easily and almost completely renewed by repetition the growth phase - (i.e. introduction of a complete growth medium containing all the necessary Contains nutrients) for an appropriate time, advantageously under washout conditions, by the free cells released from the carrier, removed. Then a nutrient medium can be supplied again, which has a lack of, for example Has nitrogen.

Eine wichtige Anwendung für die erfindungsgemäß gebildeten Polysaccharide liegt in einer verbesserten Ölgewinnung (wie im einzelnen in der GB-Anm. 8016832*angegeben) und daher umfaßt die Erfindung auch ein Verfahren, bei dem das Polysaceharid-haltige Medium nach einer etwaigen erforderlichen Einstellung der Konzentration und/oder Zusatz weiterer Bestandteile in eine flüssigkeitführende, durchlässige Schicht injiziert wird. Bei dieser Anwendung ist es besonders wichtig, daß die Polysaccharidesung keine Zellkörper enthält und ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß dadurch die Bildung von zellfreien Polysaccharidlösungen erleichtert wird. Bei bekannten Verfahren ist es notwendig, die mikrobiologischen Zellen von der viskosen Polysaccharidlösung abzutrennen.An important application for those formed according to the invention Polysaccharide lies in improved oil production (as specified in detail in GB note 8016832 *) and therefore the invention also includes a method in which the polysacharide-containing medium after any necessary adjustment of the concentration and / or addition of further ingredients in a liquid-carrying, permeable layer is injected. With this application it is particularly important that the polysaccharide solution does not contain any cell bodies and there is an advantage of the method according to the invention in that it facilitates the formation of cell-free polysaccharide solutions. At acquaintances In the process it is necessary to separate the microbiological cells from the viscous polysaccharide solution.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren sind die Zellen jedoch auf dem Träger immobilisiert und die entstehendeIn the method according to the invention, however, the cells are immobilized on the carrier and the resulting

*) (= EP-Anmeldung 812004794)*) (= EP application 812004794)

Polysaccharidlösung ist daher im wesentlichen frei von derartigen Zellen.Polysaccharide solution is therefore essentially free of such cells.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert:The invention is further illustrated by the following examples explained:

Beispiel 1example 1

A. Herstellung des immobilisierten Systems 10 A. Preparation of the Immobilized System 10

1. Aufbringen der Mikroorganismen mit Hilfe von Vakuum1. Application of the microorganisms using a vacuum

Pseudomonas sp. NCIB 11592 wurde kontinuierlich in einem Chemap LF-7-Fermentations-Gefäß mit einem Flüssigkeitsvolumen von 4 1 gezüchtet. Die Temperatur wurde auf 28°C gehalten und der pH-Wert durch automatische Zugabe von 2n Alkalilösung (1n NaOH + 1n KOH) auf 6,8 gehalten. Es wurde Luft mit einer Geschwindigkeit von 0,5 l/min in das Fermentations-Gefäß geleitet und die Kultur mit Hilfe eines Turbinenpropellers mit 1 000 UpM bewegt. Frisches, steriles Medium wurde in zwei Strömen kontinuierlich in den Fermenter geleitet und die Kulturbrühe mit Hilfe eines Überlaufs abgezogen, um ein konstantes Arbeitsvolumen in dem Reaktor aufrechtzuerhalten, Die Fließgeschwindigkeit und die Zusammensetzung der Ströme waren:Pseudomonas sp. NCIB 11592 was continuously in a Chemap LF-7 fermentation vessel with one volume of liquid bred from 4 1. The temperature was kept at 28 ° C and the pH value by automatic Addition of 2N alkali solution (1N NaOH + 1N KOH) kept at 6.8. It became air at a speed of 0.5 l / min passed into the fermentation vessel and the culture with the aid of a turbine propeller at 1000 rpm emotional. Fresh, sterile medium and the culture broth were continuously fed into the fermenter in two streams withdrawn with the aid of an overflow in order to maintain a constant working volume in the reactor, The flow rate and the composition of the streams were:

Strom 1: Fließgeschwindigkeit 300 ml/hStream 1: flow rate 300 ml / h

Mineralsalzmedium, wie unten angegeben, enthaltend zusätzlich 20 g/l Glucose und 10 mM H PO..Mineral salt medium, as indicated below, additionally containing 20 g / l glucose and 10 mM H PO ..

/8/8th

TA-55 067TA-55 067

■—* -■ - * -

55,655.6 00 g/lg / l Konzentrationconcentration -- AiMoIAiMoI Bestand
teilDuration
part ^,99^, 99 00 ,^93, ^ 93 mMolmmol MgSO -TH 0MgSO -TH 0 2,3T2.3T χχ
χχ ,3>Τ, 3> Τ ²T^{0 2} T ⁰ CaCl₂.2H₂OCaCl ₂ .2H ₂ O 0,6l0.6l χχ
XX ίο"³ ίο " ³ I₁OI ₁ O 200
20200
20th FeSO₁₊-TH₂OFeSO ₁₊ -TH ₂ O 2,1+1
1,662.1 + 1
1.66 XX ΙΟ"³
ΙΟ"³ ΙΟ " ³
ΙΟ " ³ 20
2020th
20th ZnSO₁₊-TH₂O
CuSO, .5H₂OZnSO ₁₊ -TH ₂ O
CuSO, .5H ₂ O XX ΙΟ"³ ΙΟ " ³ 1010 CoCl₀-OH₅OCoCl ₀ -OH ₅ O XX
XX ίο-³ ίο- ³ 1010 ίο"³
ΙΟ"³ ίο " ³
ΙΟ " ³ 10
1010
10 -Na₀MoO. .2H₉P
KI-Na ₀ MoO. .2H ₉ P
AI

15 Strom 2: Fließgeschwindigkext 60-120 ml/h15 Stream 2: flow rate 60-120 ml / h

21,14 g/l21.14 g / l

Eine Paste der von der oben angegebenen Kulturbrühe durch Abzentrifugieren erhaltene Zellen, die 10Og Zellen (Trockengewicht) pro Liter enthielt, wurde mit den ausgewählten Trägerteilchen vermischt. Dieses Gemisch wurde dann mit Hilfe einer Wasserstrahlpumpe einem Vakuum ausgesetzt und das Vakuum nach 3 bis 5 Minuten aufgehoben. Dieses Verfahren wurde 4 bis 5 Mal wiederholt und das Gemisch 2 bzw. 12 Stunden bei 4⁰C gealtert, bevor es mehrfach mit einer Phosphatpufferlösung gewaschen wurde, um überschüssige Zellen zu entfernen. Die Menge der festgehaltenen Zellen (cell loading) wurde entweder durch Respirationsuntersuchungen mit einer Sauerstoffelektrode oder durchA paste of the cells obtained by centrifugation from the culture broth given above, which paste contained 100 g of cells (dry weight) per liter, was mixed with the selected carrier particles. This mixture was then subjected to a vacuum using a water aspirator and the vacuum was released after 3 to 5 minutes. This process was repeated 4 to 5 times and the mixture was ^{aged for 2 or 12 hours at 4 °} C. before it was washed several times with a phosphate buffer solution in order to remove excess cells. The amount of retained cells (cell loading) was determined either by respiration studies with an oxygen electrode or by

1A-55» 067 -:-t:^;--. '- "■1A-55 »067 -: - ^t:; -. '- "■

Messung der Proteinkonzentration mit Hilfe des Verfahrens von Lowrey et al, bestimmt und angegeben als Milligramm Trockengewicht Zellen pro Gramm Trägermaterial. Diese Versuche wurden mit verschiedenen Trägermaterialien durchgeführte Die Ergebnisse all dieser Versuche sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßt. Measure protein concentration by the Lowrey et al method, determined and reported as Milligrams of dry weight cells per gram of carrier material. These attempts were made with different Carrier materials carried out The results of all these tests are summarized in Table 1 below.

Tabelle 1Table 1

/10/ 10

Tabelle 1Table 1

BeBe ZusammenTogether PorenPores TeilchenParticle ttdd Alterungs-Aging Gehalt an ZellenContent of cells zeichnungdrawing setzungsettlement größesize größesize zeitTime (mg Trockengewicht/
g Träger)(mg dry weight /
g carrier) ( M-m)(M-m) ( μπι)(μπι) Practosil 5000Practosil 5000 KieselsäureSilica 0,50.5 63-12563-125 22 0,10.1 " 10000"10000 IlIl 1,01.0 IlIl 22 VV " 25000"25000 IlIl 2>52> 5 ItIt 22 3/33/3 ¹¹ 25000 ¹¹ 25000 ItIt 2,52.5 ttdd 1212th 21/2621/26 ¹¹ 5000 ¹¹ 5000 ItIt 0,50.5 IlIl 1212th 5;335; 33 Norton 06519Norton 06519 AluminiumoxidAlumina 3-133-13 150-250150-250 22 10,τ10, τ MM. ItIt titi titi 1212th 10,6610.66 titi ItIt ttdd 300-600300-600 1212th 11,511.5 titi «1"1 MM. > 600> 600 1212th 8,08.0 Norton 06U82Norton 06U82 KLeaels äure/IOuminijnoV.KLeaels äure / IOuminijnoV. ttdd 150-300150-300 22 11,211.2 JkI \^Λ, \J ^iI \J K₁J ^ \*/ C_-
Norton SA 6373 JkI \ ^ Λ, \ J ^ iI \ JK ₁ J ^ \ * / C _-
Norton SA 6373 AluminiumoxidAlumina 0,10.1 150-600150-600 22 00 Norton SA 5559Norton SA 5559 titi ₂lu ₂ lu 300-600300-600 22 00 Norton SA 5221Norton SA 5221 AluminiumoxidAlumina 10-3010-30 N. A.N / A. 1212th 10.110.1 Norton SA 5561+Norton SA 5561+ ZirconpxidZirconium oxide 5-805-80 N. A.N / A. 1212th 9>9> Norton SA 6525Norton SA 6525 AluminiumoxidAlumina 3,23.2 ■H.A.■ H.A. 1212th 9,19.1 Norton· SA 5231Norton SA 5231 AluminiumoxidAlumina l-2/15-lOOl-2/15-lOO N.A.N / A. 1212th UJ9UJ9 Norton SA 66O5Norton SA 66O5 AluminiumoxidAlumina 55 N.A.N / A. 1212th 10,810.8 CarborundumCarborundum SAEHSU533'SAEHSU533 ' It
I It
I. 0,30.3 N ,A.N / A. 22 00 Harshaw AL-I83-IFHarshaw AL-I83-IF ItIt N.A.N / A. 500500 22 3;33; 3 ItIt ItIt ttdd 1212th 88th

VJl VJIVJl VJI

1A-55 067 jrf*.- .. 1A-55 067 jrf * .- ..

2. Aufbringen der Mikroorganismen durch Wachstum in situ2. Application of the microorganisms by growth in situ

Pseudomonas sp. NCIB 11592 wurden in einem Biotec-Fermenter mit einem Arbeitsvolumen von 2,5 1 in Gegenwart von 5-10 % (Gew./Volumen) Aluminiumoxid (Norton 06519) mit einer Gasstromgeschwindigkeit von 400 ml/min Luft oder 200 ml/min Sauerstoff und bei einer Rührergeschwindigkeit von 200 UpM gezüchtet, wobei man eine Spannung von gelöstem Sauerstoff von mehr als 60 % Luftsättigung erhielt. Die Temperatur betrug 30°C und der pH-Wert wurde durch automatische Zugabe von 2n Alkalilösung auf 7,0 gehalten und das Wachstumsmedium enthielt das Mineralsalzmedium wie oben angegeben, enthaltend 20 g/l Glucose, 2,11 g/l (NH₄)₂S0₄, 0,680 g/1 KH₂PO₄ und 0,709 g/1 Na₂HPO₄.Pseudomonas sp. NCIB 11592 were in a Biotec fermenter with a working volume of 2.5 1 in the presence of 5-10 % (w / v) aluminum oxide (Norton 06519) with a gas flow rate of 400 ml / min air or 200 ml / min oxygen and grown at a stirrer speed of 200 rpm to obtain a dissolved oxygen tension greater than 60 % air saturation. The temperature was 30 ° C and the pH was kept at 7.0 by automatic addition of 2N alkali solution and the growth medium contained the mineral salt medium as stated above, containing 20 g / l glucose, 2.11 g / l (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , 0.680 g / 1 KH ₂ PO ₄ and 0.709 g / 1 Na ₂ HPO ₄ .

Unmittelbar bevor das Wachstum dieses Ansatzes beendet war (ungefähr 20 Stunden) wurden die Reaktor-, bedingungen geändert und zwar auf eine Gasströmungsgeschwindigkeit von 600 ml/min Luft (oder 300 ml/1 Sauerstoff) und eine kontinuierliche Kultur, die das vorgegebene Medium mit einer Strömungsgeschwindigkeit von mehr als 1 l/h verwertete. Bei dieser hohen Verdünnungsgeschwindigkeit wurden die bereits an dem Träger festgehaltenen Zellen zurückgehalten und wuchsen weiter in dem Träger, während die freien oder nur locker haftenden Zellen ausgewaschen wurden. Die Zellen wurden auf diese Weise gezüchtet, bis keine weitere Zunahme des Zellgehalts beobachtet wurde (48 Stunden) und .der Zellgehalt in dem Träger wurde wie unter A 1 angegeben bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 angegeben.Immediately before the growth of this batch was complete (approximately 20 hours), the reactor, conditions changed to a gas flow rate of 600 ml / min air (or 300 ml / 1 Oxygen) and a continuous culture that the given medium with a flow rate recovered from more than 1 l / h. At this high rate of dilution, the Carrier retained cells retained and continued to grow in the carrier while the free ones or only loosely adhering cells were washed out. The cells were grown in this way until none further increase in cell content was observed (48 hours) and the cell content in the vehicle was as specified under A 1. The results are given in Table 2 below.

Tabelle 2Table 2

/12/ 12

1A-55 0671A-55 067

Tabelle 2Table 2

Zeit seit Beginn der kontinuierlichen Kultur (h)Time since the beginning of continuous culture (h)

Gehalt an Zellen (mg/g)Cell content (mg / g)

Ansatz 1 Ansatz 2Approach 1 Approach 2

72 g/l Träger- 260 g/l konz. Trägerkonz.72 g / l carrier- 260 g / l conc. Carrier Conc.

1515th

2020th

2525th

0 200 20

Uo 6o 8oUo 6o 8o

IT, h
17,2IT, h
17.2

3*5 12,03 * 5 12.0

20 2020 20

B. Bildimg des BiopolvmersB. Image of the Biopolyvmers

1. Yakuumimmobilislßrung und ansatzweise Bildung des Polymers1. Yakuumimmobilization and rudimentary formation of the Polymers

Zellen von Pseudomonas sp. NCIB 11592, Pseudomonas sp. NCIB 11264 und Agrobacterium radiobacter NCIB 9042 wurden auf Aluminiumoxid (Norton 06519) wie oben beschrieben immobilisiert. 10 g jedes Biokatalysators wurden nach Waschen in Schüttelkolben gegeben, enthaltend 100 ml 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, und 10 g Glucose_β Die Kolben wurden mit 200 UpM bei 30⁰C geschüttelt. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:Cells of Pseudomonas sp. NCIB 11592, Pseudomonas sp. NCIB 11264 and Agrobacterium radiobacter NCIB 9042 were immobilized on alumina (Norton 06519) as described above. After washing, 10 g of each biocatalyst were placed in shake flasks containing 100 ml of 10 mM phosphate buffer, pH 7.4, and 10 g of glucose _β. The flasks were shaken at 200 rpm at 30 ^{° C.} The following results were obtained:

Tabelle 3Table 3

/13/ 13

1A-55 0671A-55 067

Tabelle 3Table 3

Stammtribe

PseucLomonas sp. UCIB 11592 Pseudomonas sp. NCIB 1126H 5 Agrcfbacterium radiobacter NCIB 90k2 PseucLomonas sp. UCIB 11592 Pseudomonas sp. NCIB 1126H 5 Agrcfbacterium radiobacter NCIB 90k2

Gehalt an Zellen*)Content of cells *)

(mg/g)(mg / g)

Polymerkonzentration nach 140 h (g/l)Polymer concentration after 140 h (g / l)

9,6
.11 j O 9.6
.11 j O

2,02.0

*) mg Zellen (Trockengewicht)/g Träger*) mg cells (dry weight) / g carrier

"' erliche"'erlich

2.' Vakuiomimmobilisierung und kontinui Bildung des Polymers2. ' Vacuum immobilization and continui Formation of the polymer

Zellen von Pseudomonas sp. NCIB 11592 wurden auf Aluminiumoxid (Norton 06519) wie oben angegeben immobilisiert, !fen erhielt 9»7 mg Zellen (Trockengewicht)/g Träger. 180 g dieses Biokatalysators wurden in ein 4 Liter Biotec-Fermentationsgefäß gegeben, enthaltend 2,8 1 Medium, umfassend das Mineralsalzmedium wie oben beschrieben, sowie 20 g/l Glucose und 10 mM H₃PO^. Die TemperaturCells of Pseudomonas sp. NCIB 11592 were immobilized on aluminum oxide (Norton 06519) as indicated above, and fen received 9.7 mg cells (dry weight) / g carrier. 180 g of this biocatalyst were placed in a 4 liter Biotec fermentation vessel containing 2.8 l medium, comprising the mineral salt medium as described above, and 20 g / l glucose and 10 mM H ₃ PO ^. The temperature

wurde auf 3O⁰C gehalten und der pH-Wert durch automatische Zugabe von 2n Alkalilösung auf 7,0 gehalten. Es wurde Luft mit einer Geschwindigkeit von 400 ml/min in den Reaktor geleitet und die Suspension durch einen Prop eil errühr er mit 200 UpM bewegt. Frisches Medium wurde mit einer Geschwindigkeit von 225 ml/h in den Reaktor gepumpt und die PoIysaccharidlösung mit Hilfe eines Überlaufs abgezogen, wobei eine Absetzvorrichtung vorgesehen war, um ein konstantes Arbeitsvolumen sowie eine konstante Zurückhaltung des Biokatalysators in dem Reaktor zu erreichen.was maintained at 3O ⁰ C and the pH is maintained by automatic addition of 2N alkali solution to 7.0. Air was passed into the reactor at a rate of 400 ml / min and the suspension was agitated by a prop eil at 200 rpm. Fresh medium was pumped into the reactor at a rate of 225 ml / h and the polysaccharide solution was drawn off using an overflow, a settling device being provided in order to achieve a constant working volume and constant retention of the biocatalyst in the reactor.

/14/ 14

1A-55 067 -^Γ1A-55 067 - ^ Γ

Die Polysaccharidkonzentration in dem austretenden Strom (gemessen durch Umsetzung mit Anthron) ist in der folgenden Tabelle angegeben.The polysaccharide concentration in the exiting stream (measured by reaction with anthrone) is in given in the following table.

Tabelle.4Table 4

Zeit Polysaccharidkonzentration - (g/l) Time Polysaccharide Concentration - ( g / L)

20 10 V220 10 V2

⁶³ 11!+ ⁶³ 11! +

139139

0,13 Oj 18 0,20 0,210.13 Oj 18 0.20 0.21

3. Immobilisierung durch Wachstum in situ und kontuierliche Bildung des Polymers.3. Immobilization by growth in situ and continuous formation of the polymer.

Pseudomonas sp. NCIB 11592 wurde auf 180 g Aluminiumoxid (Norton 06519) nach dem unter A 2 angegebenen Verfahren immobilisiert. Nach der Immobilisierung wurde frisches Salzmedium (Stickstoff-frei), enthaltend zusätzlich 20 g/l Glucose und 10. mM H,PÖ,, mit einer Geschwindigkeit von 225 ml/h in den Reaktor gepumpt und die PoIysaccharidlösung entsprechend Beispiel B 2 abgezogen. Nach einem anfänglichen Verlust von Zellen stabilisierte sich der Gehalt an Zellen auf dem Träger während der Polymersynthese auf 10 mg (Trockengewicht)/g. Die Polysaccharidkonzentration in dem austretenden Strom ist in der folgenden Tabelle angegeben.Pseudomonas sp. NCIB 11592 was based on 180 g of alumina (Norton 06519) immobilized according to the method given under A 2. After the immobilization, fresh salt medium (nitrogen-free), additionally containing 20 g / l glucose and 10. mM H, PO ,, at a rate of 225 ml / h are pumped into the reactor and the polysaccharide solution deducted according to example B 2. After an initial loss of cells the content of cells on the support stabilized at 10 mg during polymer synthesis (Dry weight) / g. The polysaccharide concentration in the exiting stream is in the following Given in the table.

Tabelle 5Table 5

/15/ 15

Tabelle 5Table 5

Zeit (K) Polysaccharidkonzentration (g/l·) Time (K) polysaccharide concentration (g / l)

(nach
Immobilisierung)(after
Immobilization)

26 U2 63 8626 U2 63 86

0,730.73

⁰151 0_;U5 ⁰ 151 0 _; U5

0/50/5

4_Φ Wachstum in situ bei unterschiedlichen Nährstoffgehalten und kontinuierliche Bildung des Polymers4 _Φ Growth in situ with different nutrient contents and continuous formation of the polymer

Pseudomonas sp. NCIB 11592 wurde auf Aluminiumoxid (Norton 06519) wie in Beispiel A 2 angegeben immobilisiert mit der Ausnahme, daß das Wachstumsmedium die folgenden Mineralsalzkonzentrationen enthielt: Pseudomonas sp. NCIB 11592 was based on alumina (Norton 06519) immobilized as indicated in Example A 2 with the exception that the growth medium contained the following mineral salt concentrations:

Bestandteil Konz. mg/lIngredient conc. Mg / l

2020th Na₂HPNa ₂ HP Oj₄ Oj ₄ KHgPOKHgPO h.H. MgSOj^MgSOj ^ .7HgO.7HgO FeCl₃ FeCl ₃ .6h_?o.6h _? O CaCIgCaCIg .2HgO.2HgO 2525th ZnSO,ZnSO, .7HgO.7HgO CuSO,CuSO, .5HgO.5HgO MnSOj₄ MnSOj ₄ ^HgO^ HgO CoCIgCoCIg .6HgO.6HgO ^H3^B03 ^H 3 ^B0 3 3030th Na₂MoINa ₂ MoI VSH₂OVSH ₂ O

3000 3000 200 33,4 16,0 0^36 0_;32 0,30 0,36 0₇203000 3000 200 33.4 16.0 0 ^ 36 0 _; 32 0.30 0.36 0 ₇ 20

O₇ 6oO ₇ 6o

/16/ 16

1A-55 067 <·-.._1A-55 067 <· -.._

zusammen mit (NH^)₂ ^S04 und Glucose in Konzentrationen von entweder 0,3 g/l und 10 g/l (i) bzw. 3,0 g/l und 20 g/l (II). Die Zeit des (loading) Wachstums betrug 90 Stunden bei I und 70 Stunden bei II. Den entstandenen immobilisierten Zellsystemen wurde dann ein Nährmedium zugeführt, das sich von dem Wachstumsmedium nur durch Weglassen des Ammoniumsulfats unterschied (diese Modifikation wird als Stickstoff-freies Medium bezeichnet). Die Polysaccharidlösung wurde abgezogen und der Produktquotient (g Polymer/g fixierte Zellen.h) und die Produktivität (angegeben in ml PoIysaccharid/g Zell-haltigen Träger.h) wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 6 angegeben, aus der hervorgeht, daß ein höherer Nährstoffgehalt zu wesentlichen Verbesserungen in dem Zellgehalt des Trägers und der Produktivität führtetogether with (NH ^) ₂ ^S0 4 and glucose in concentrations of either 0.3 g / l and 10 g / l (i) or 3.0 g / l and 20 g / l (II). The time of (loading) growth was 90 hours for I and 70 hours for II. The resulting immobilized cell systems were then supplied with a nutrient medium which differed from the growth medium only in that the ammonium sulfate was omitted (this modification is referred to as nitrogen-free medium) . The polysaccharide solution was drawn off and the product quotient (g polymer / g fixed cells.h) and the productivity (given in ml polysaccharide / g cell-containing carrier.h) were determined. The results are given in Table 6 below, from which it can be seen that higher nutrient levels resulted in substantial improvements in wearer cellular content and productivity

Tabelle 6Table 6

/17/ 17

1A-55 0071A-55 007

toto

Tabelle 6Table 6

Zeit
(h)Time
(H) Gehalt
Zellen
Trägersalary
Cells
carrier an
auf dem
(ngÄ)at
on the
(ngÄ) Pro duktquoti entProduct quoti ent IIII Produktivitätproductivity IIII II. IIII • I• I 0,0020.002 II. o₅io7o ₅ io7 00 li, oUli, oU 53,253.2 0,0070.007 -- 0,071+0.071+ -- 16, U16, U 8_; 778 _; 77 -- 0,0510.051 0;0220; 022 0₇Ui+90 ₇ Ui + 9 0,5700.570 17; 517; 5 -- 26jl26jl -- -- -- -- Ho,5Ho, 5 -- 0,0650.065 o,ol*5o, ol * 5 0_;U830 _; U83 0,5930.593 53,153.1 13)213) 2 -- -- -- -- 65;O65; O 5_;555 _; 55 -- 0,01*80.01 * 8 0_;o650 _; o65 o_? 268o _? 268 0,7280.728 78,178.1 11,211.2 -- O_;O39O _; O39 0;U6T0; U6T 89,389.3 -- 11_; 9711 _; 97 -- -- -- -- 99; 999; 9 -- o.oUoo.oUo 0,03U0.03U 0,1780.178 0,3300.330 113,2113.2 -- 9j6U9j6U -- -- -- -- 126_;5126 _; 5 .-.- 0,0210.021 -- O.O86O.O86 -- 136,5136.5 k, 11 k, 11 -- 0,0280.028 0;03li0; 03li 0_;1130 _; 113 0_;3o00 _; 3o0 137,3137.3 -- 10 j 5910j 59 - -- - -- -- -- l6lj0l6lj0 3,983.98 -- 0,0150.015 0,0290.029 0,0590.059 0^2510 ^ 251 161,6161.6 -- 8j68j6 -- -- -- -- 183,9183.9 5,61t5.61t -- 0;0120; 012 0.03U0.03U 0,0650.065 0,3010.301 185,H185, H. -- 8^968 ^ 96 -- -- -- -- 2U2_;22U2 _; 2 3,123.12 -- Oj 030Oj 030 0,0190.019 0_;0920 _; 092 0,17*+0.17 * + 2U6,32U6.3 -- -- --

/18/ 18th

1A-55 067 . :- )&.-. ":1A-55 067. : - ) & .-. ":

Beispiel 2Example 2

Regeneration der PolysaccharidproduktivitätRegeneration of polysaccharide productivity

Pseudomonas sp. NCIB 11592-Zellen wurden auf Aluminiumoxid (Norton 06519) immobilisiert, entsprechend dem Verfahren des Beispiels B 4 mit dem höheren Nähr·*- stoffgehalt und einer Wachstumszeit von 76 Stunden. Diesem immobilisierte Zellsystem wurde dann mit einer Verdünnungsgeschwindigkeit von 0,08 h~ (Strömungsgeschwindigkeit des Medium geteilt durch das Volumen der Flüssigkeit in dem Reaktor) Stickstoff-freies (aber sonst gleiches) Medium zugeführt, um die Polysaccharidbüdungsphase einzuleiten, die 208 Stunden dauerte. Zu diesem Zeitpunkt war der Polysaccharid-Produktquotient auf einen niedrigen Wert gefallen und das Stickstoff-freie Medium wurde durch ein vollständiges Stickstoff-haltiges Wachstumsmedium mit einer Verdünnungsgeschwindigkeit von 0,4 χ h 96 Stunden lang ersetzt, um die Polysaccharidbildungsfähigkeit der Zellen zu regenerieren. Nach dieser Regenerationsphase wurde wieder die Bildungsphase eingeleitet durch erneutes Einleiten des Stickstofffreien Mediums mit einer Verdünnungsgeschwindigkeit von 0,08 h . Der Gehalt an Zellen auf dem Träger und der Polysaccharid-Produktquotient wurden während dieses Versuches bestimmt und sind in der folgenden Tabelle 7 angegeben, aus der hervorgeht, daß durch die Regeneration die Polysaccharidbildungsfähigkeit des immobilisierten Systems wieder erneut wird.Pseudomonas sp. NCIB 11592 cells were on alumina (Norton 06519) immobilized, according to the method of Example B 4 with the higher nutrient * - substance content and a growth time of 76 hours. This immobilized cell system was then treated with a Dilution rate of 0.08 h ~ (flow rate of the medium divided by the volume the liquid in the reactor) nitrogen-free (but otherwise the same) medium is fed to the polysaccharide formation phase which lasted 208 hours. At this point was the polysaccharide product quotient dropped to a low value and the nitrogen-free medium was replaced by a complete Nitrogen-containing growth medium with a dilution rate of 0.4 χ h for 96 hours replaced by the ability to form polysaccharides to regenerate the cells. After this regeneration phase, the formation phase was initiated again by reintroducing the nitrogen-free medium at a dilution rate of 0.08 h. The content of cells on the carrier and the polysaccharide product quotient were determined during determined this experiment and are given in the following Table 7, from which it can be seen that by the regeneration of the ability of the immobilized system to form polysaccharides becomes again.

Tabelle 7Table 7

1A-55 0671A-55 067

iiii

Tabelle 7Table 7

-- Zeit
(h)Time
(H) Gehalt an
Zellen auf
dem Träger
vmg/g7Content of
Cells on
the carrier
vmg / g7 Pr0duktquotientProduct quotient _;039 _; 039 55 00 35,035.0 0,0010.001 16,2516.25 20 jA20 yrs 0, 0100, 010 39,^339, ^ 3 lU,0lU, 0 0_y03^0 _y 03 ^ 7^,3^7 ^, 3 ^ 9,179.17 0_;0300 _; 030 96,296.2 9,199.19 0_;0l60 _; 0l6 1010 111111 8,68.6 0,0.20.0.2 135135 8,98.9 0_y0110 _y 011 159159 6,986.98 0^,0070 ^, 007 183183 6,86.8 0_;0050 _; 005 208208 6,86.8 0,0100.010 1515th 21» 021 »0 21J21y 262262 38,238.2 281 ■281 ■ 36,936.9 302302 35,735.7 331/0331/0 35,035.0 2020th 16,716.7 22,122.1 Regenerations—Regeneration in,8in, 8 16_;9716 _; 97 Phasephase 77; ¹I77; ¹ I. IU, 5IU, 5 100,8100.8 15,315.3 0,0070.007 iiU,8"iiU, 8 " 12,61*12.61 * 0,0210.021 2525th 1U21U2 13,913.9 o_;oU6o _; oU6 Oj Ο63 Oj Ο63 0,01+30.01 + 3 0,0U90.0U9 CC.

/20/ 20

1A-55 0671A-55 067

Beispiel 3Example 3

Um die Ergebnisse zu zeigen', die mit einem Organismus erhalten wurden, der während der Polymerbildung wachsen muß, wurde eine Paste von Xanthomonas campestris ATCC 13951 durch Wachstum in situ auf drei unterschiedliche Träger aufgebracht. Jedes System (10 g) wurde dann in 100 ml einer 100 mM Tris-Pufferlösung bei pH 7,4, enthaltend 1 % Glucose, gegeben und die Polymerbildung mit Hilfe eines Verfahrens entsprechend demjenigen des Beispiels B 1 oben bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben»To show the results obtained with an organism that must grow during polymer formation, a paste of Xanthomonas campestris ATCC 13951 was grown in situ on three different supports. Each system (10 g) was then placed in 100 ml of a 100 mM Tris buffer solution at pH 7.4 containing 1 % glucose and polymer formation was determined by a method similar to that of Example B1 above. The results are given in the following table »

TrägermaterialCarrier material

Norton Aluminium-20 oxid 06519Norton aluminum-20 oxide 06519

Norton Kieselsäure/Aluminiumoxid 06482Norton silica / alumina 06482

Fractosil 25000 ( Me rck, Da rms t ad t)Fractosil 25000 (Me rck, Da rms t ad t)

Tabelle 8Table 8

Zellgehalt auf
dem Träger (mg/g)Cell content up
the carrier (mg / g)

6,86.8

7,2
8,87.2
8.8

Polymerkonzentrat i on nach 140 h (g/l)Polymer concentration after 140 h (g / l)

1,41.4

0,3 0,70.3 0.7

Aus dieser Tabelle geht hervor, daß Polymer gebildet wird, obwohl die Bildungsgeschwindigkeit geringer ist als diejenige, die mit Pseudomonas sp. NCIB 11592 erreicht wird.From this table it can be seen that polymer was formed although the rate of formation is slower than that generated with Pseudomonas sp. Reached NCIB 11592 will.

VergleichsbeispielComparative example

Alternative ImmobilsierungsverfahrenAlternative immobilization methods

Die folgenden Beispiele zeigen, daß die erfindungsgemäßen Inun&bilisierungsverfahren notwendig sind fürThe following examples show that the immunization processes according to the invention are necessary for

/21/ 21

eine wirksame Polysaccharxdproduktion, da alternative übliche Verfahren nicht geeignet sind.an effective polysaccharide production, as an alternative usual procedures are not suitable.

1. Immobilisierung durch kovalente Bindung1. Immobilization by covalent bonding

Geeignete Träger wurden durch die folgenden Kcpplungsreagenzien aktiviert: 1-Äthyl-3-(3'-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, Glutaraldehyd, Chinon und N-Hydroxy-succinimid. Die aktivierten Träger wurden mit einer Zellpaste von Pseudomonas sp. NCIB 11592 einige Stunden vermischt, um eine wirksame Immobilisierung zu erreichen,. In allen Fällen trat entweder keine deutliche Bindung der Zellen auf oder die gebundenen Zellen verloren ihre Aktivität für dieSuitable carriers were activated by the following coupling reagents: 1-ethyl-3- (3'-dimethylaminopropyl) -carbodiimide, Glutaraldehyde, quinone and N-hydroxy-succinimide. The activated carriers were mixed with a cell paste from Pseudomonas sp. NCIB 11592 mixed for a few hours to achieve effective immobilization. In all cases either no significant binding of the cells to or the bound cells lost their activity for the

15 Polysaccharidsynthese.15 Polysaccharide Synthesis.

2. Immobilisierung durch Gel-Einschluß2. Immobilization by gel entrapment

Verfahren zur Immobilisierung von Zellen in Gelen sind bekannt. Zellen von Pseudomonas sp. NCIB 11592 wurden immobilisiert durch Einschluß in die folgenden Gele: Agar, Polyacrylamid, Calcium-alginate In allen Fällen waren die Zellen ausreichend immobilisiert und behielten ihre Fähigkeit in Gegenwart von Glucoselösung zu atmen. Es wurde jedoch kein Polymer in die Lösung abgegeben. Es wird angenommen, daß die Poren in dem Gel zu klein sind, um das Austreten des Polymers aus den Teilchen zu ermöglichen.Methods for immobilizing cells in gels are known. Cells of Pseudomonas sp. NCIB 11592 were immobilized by inclusion in the following gels: agar, polyacrylamide, calcium alginate In all In cases, the cells were sufficiently immobilized and retained their ability in the presence of glucose solution to breathe. However, no polymer was released into the solution. It is believed that the pores in the gel are too small to allow the polymer to exit the particles.

62246224

Claims (1)

WUESTHOFF-v.PECHMANN-BEHRENS-GOETZ l\ ' WUESTHOFF-v.PECHMANN-BEHRENS-GOETZ l \ ' DIFL.-CHEM. IJR. K. FHFIUl l.l· VON ITC)IMANH PROFESSIONAL REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN ΓΑΤΕΝΤ OFFICE DR.-ING. DIETER BEHRENSDIFL.-CHEM. IJR. K. FHFIUl ll · FROM ITC) IMANH PROFESSIONAL REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN ΓΑΤΕΝΤ OFFICE DR.-ING. DIETER BEHRENS MANDATAIRES AGREES PRES L'oFFICE EUROPEEN DES BREVETS DIPL.-1NG.; DIPL.-WIRTSCH.-l NC. I.UI'l Ι'.Γ GOETiMANDATAIRES AGREES PRES L'oFFICE EUROPEEN DES BREVETS DIPL.-1NG .; DIPL.-WIRTSCH.-l NC. I.UI'l Ι'.Γ GOETi 1A-55 067 D-8000 MÜNCHEN1A-55 067 D-8000 MUNICH Shell Internationale . schweigerstrassi^Shell International. Schweigerstrassi ^ tele fön : (089) 66 20 51 telegramm: protectpatent telex: j 24 070tele fön: (089) 66 20 51 telegram: protectpatent telex: j 24 070 PatentansprücheClaims 1. Verfahren zur Bildung eines Polysaccharids durch Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen in immobilisierter Form auf einem porösen, feinteiligen inerten Träger, dessen Porengröße mehr als 0,5 uns beträgt, mit einem wäßrigen Nährmedium zusammengebracht werden und das Polysaccharidhaltige Medium von dem System abgezogen wirdo1. A method for the formation of a polysaccharide by microorganisms, characterized in that the microorganisms in immobilized form on a porous, finely divided inert carrier, the pore size of which is larger than 0.5 us with an aqueous nutrient medium are brought together and the polysaccharide-containing medium is withdrawn from the system 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das wäßrige Nährmedium kontinuierlich durch das immobilisierte System geleitet wird.2. The method according to claim 1, characterized in that the aqueous nutrient medium is continuously passed through the immobilized system. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß Mikroorganismen angewandt werden, die das Polysaccharid in der stationären Phase des Wachstumszyklus bilden«,3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that microorganisms which form the polysaccharide in the stationary phase of the growth cycle «, 4β Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch g e kennzeichnet , daß als Mikroorganismen eines schleimbildende Spezies der Gattung Pseudomonas, Rhizobium, Alcaligenes oder Agrobacterium angewandt wird. ·4β Method according to claim 1 to 3, characterized in that g e that as microorganisms of a slime-forming species of the genus Pseudomonas, Rhizobium, Alcaligenes or Agrobacterium is used. · /2/ 2 5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Träger ein anorganisches Oxid angewandt wird.5. The method according to claim 1 to 4, characterized in that as a carrier an inorganic oxide is used. 6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß die Porengröße des Trägers 2 bis 30 um beträgt,6. The method according to claim 1 to 5, characterized in that the pore size of the carrier is 2 to 30 µm, 7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch7. The method according to claim 1 to 6, characterized gekennzeichnet, daß der mittlere Teilchendurchmesser des Trägers 100 bis 600 um beträgt.characterized in that the mean particle diameter of the carrier is 100 to 600 µm amounts to. 8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen auf dem Träger immobilisiert worden sind durch Züchtung der Mikroorganismen in Gegenwart des Trägers und eines Wachstumsmediums, das eine Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff zusammen mit essentiellen Mineralien enthält.8. The method according to claim 1 to 7, characterized in that the microorganisms have been immobilized on the support by culturing the microorganisms in the presence the support and a growth medium which is a source of assimilable carbon and nitrogen along with essential minerals. 9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium während der Polysaccharidbildung keinen bzw. nicht ausreichend Stickstoff enthält, um ein aktives Wachstum zu ermöglichen und auf die Phase der PoIysaccharidbildung eine Regenerationsphase folgt, während der das immobilisierte Zellsystem ein vollständiges Wachstumsmedium mit assimilierbarem Kohlen-9. The method according to claim 1 to 8, characterized in that the nutrient medium none or not during polysaccharide formation Contains sufficient nitrogen to enable active growth and to the phase of polysaccharide formation a regeneration phase follows, during which the immobilized cell system is a complete Growth medium with assimilable carbon 30 stoff und Stickstoff enthält«,30 contains substance and nitrogen «, 10. Immobilisiertes Zellsystem zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 9, umfassend einen Polysaccharid-bildenden Mikroorganismus auf einem porösen, feinteiligen inerten Träger mit einer Porengröße von mehr als 0,5 >um.10. Immobilized cell system for performing the method according to claim 1 to 9, comprising a polysaccharide-forming microorganism on a porous, finely divided inert carrier with a Pore size greater than 0.5 µm. /3/ 3 1A-55 067 , · '-"·3 - 1A-55 067, · '- "· 3 - 11. Anwendlang des nach Anspruch 1 bis 9 erhaltenen Polysaccharid-haltigen Mediums,gegebenenfalls nach Einstellung der Konzentration und/oder Zusatz weiterer Verbindungen,zur Injektion in eine flüssigkeitsführende permeable Erdformation.11. Application of the polysaccharide-containing medium obtained according to claim 1 to 9, optionally after adjusting the concentration and / or adding further compounds, for injection into a liquid-bearing permeable earth formation. 62246224