DD286187A5 - METHOD FOR MILKING ACIDIFICATION BY IMMOBILIZED MICROORGANISMS - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Milchsaeuregaerung mittels immobilisierter Mikroorganismen und dient der Durchfuehrung von Hochleistungsgaerungen, bei denen hohe Milchsaeurekonzentrationen in kurzen Gaerzeiten erreicht werden. Dies gelingt erfindungsgemaesz dadurch, dasz ein Gelimmobilisat eingesetzt wird, das nach seiner Herstellung in Abhaengigkeit vom Bakterienstamm mit mindestens (0,2 bis 1,0)1010 viablen Zellen/ml Gel und nach der sich anschlieszenden Aktivierung mit mindestens (1,0 bis 5,0)1010 viablen Zellen/ml Gel beladen ist. Die spezifische Produktivitaet derartiger Immobilisate kann bis zu 200 g Milchsaeure/l Gelh betragen.{Milchsaeure; Gelimmobilisat; Pektatgel; Bakterien; Viabilitaet; Gaerung; Gaeraktivitaet; Gaerzeit; Zellbeladung}The invention relates to a process for lactic fermentation by means of immobilized microorganisms and serves to carry out high-performance fermentations in which high lactic acid concentrations are achieved in short fermentation times. This is achieved according to the invention in that a gel immobilizate is used which, after its production, has at least (0.2 to 1.0) 1010 cells / ml gel and after the subsequent activation with at least (1.0 to 5 , 0) 1010 viablen cells / ml gel is loaded. The specific productivity of such immobilizates may be up to 200 g of lactic acid per liter of gel. Gelimmobilisat; Pektatgel; Bacteria; viability; Fermentation; fermentation activity; fermentation; Cell loading}

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft das Gebiet der biotechnologischen Stoffwändlung und ist anwendbar für die Herstellungvon Milchsäure mittels immobilisierter Mikroorganismen.The invention relates to the field of biotechnological material handling and is applicable to the production of lactic acid by means of immobilized microorganisms.

Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions

Die Immobilisierung von Mikroorganismen als einfache Methode zur ROckhaltung der Mikroorganismen und Erzielung einer hohen Biomassekonzentration im Reaktor wird bei biotechnologischen Stoffwandlungen In zunehmendem Maße angewendet. Auch Milrfrsäuregärungen wurden mit immobilisierten Bakterien im Labormaßstab bereits mehrfach beschrieben. Als Immobilisierungsmatrizes kommen dabei vorzugsweise Alginat· und Cerrageenangel zum Einsatz (z. B. P. Linko et al.: Ann. New York Acad. Sd. 434 (1984] 406-417; Y. Nomura et al.: Biotechnol. Bioeng. 30 [1987] 788-793; H. Büyükgüngör et al.: BIOTECH - FORUM 3 [1986] 80-85; JP-Patent 82144985 [1982], gemSß: Chem. Abstr. 98 [1983] 33 058; P.Audet et al.: Appl. Microbiol. Biotechnol 29 [1988] 11-18).The immobilization of microorganisms as a simple method for retaining the microorganisms and achieving a high biomass concentration in the reactor is increasingly used in biotechnological material transformations. Mildewry fermentations have also been described several times with immobilized bacteria on a laboratory scale. Alginate and carrageenan angels are preferably used as immobilization matrices (eg BP Linko et al .: Ann New York Acad., 434 (1984) 406-417; Y Nomura et al .: Biotechnol., Bioeng., 30 [1987 [0108] 788-793; H. Büyükgüngör et al .: BIOTECH FORUM 3 [1986] 80-85; JP Patent 82144985 [1982], according to: Chem. Abstr. 98 [1983] 33 058; P. Audet et al. : Microbiol Biotechnol 29 [1988] 11-18).

Die Milchsäureendkonzentration beträgt bei den o.g. Laborverfahren überwiegend S 50g/l, mehrfach sogar nur 12 bis 16g/l. Die benötigten Gärzeiten liegen zwischen 7 h für 12,5 g Milchsäure/l und 25 h für 45 g Milchsäure/l bei Einsatz eines nähr· und wirkstoffreichen Mediums. Bei dem Verfahren von Nomura et al. (Biotechnol. Bioeng. 30 (1987) 788-793) beträgt bei einem Gelanteil am Arbeitsvolumen von 0,5 die Gärzeit für die Bildung von 62-73g Milchsäure/l B-8d. Die spezifische Produktivität der bei den o.g. Laborverfahren eingesetzten Immobilisate liegt überwiegend unter 10g Milchsäure/l Gel · h, wobei der Höchstwert für die Beladung mit viablen Zellen unmittelbar nach der Immobilisierung 9 · 10⁷/g Gel betrug und nach 20tägiger intermittierender Präfermentation 1,2 · 10*/g Gel (P. Linko et al.: Ann. New York Acad. Sei. 434 [1984] 406-417). Zusammengefaßt bestehen die Nachteile der bekannten Verfahren zur Milchsäureproduktion darin, daß Milchsäure in zu geringen Konzentrationen oder zu langen Gärzeiten bsi Einsatz von Gelimmobilisaten mit zu niedriger spezifischer Produktivität erzeugt wird.The final lactic acid concentration in the abovementioned laboratory procedures is predominantly S 50 g / l, several times even only 12 to 16 g / l. The required fermentation times are between 7 h for 12.5 g of lactic acid / l and 25 h for 45 g of lactic acid / l when using a nutrient- and drug-rich medium. In the method of Nomura et al. (Biotechnol.Biengeng 30 (1987) 788-793) is at a Gelanteil the working volume of 0.5, the fermentation time for the formation of 62-73g lactic acid / l B-8d. The specific productivity of the immobilizates used in the abovementioned laboratory methods is predominantly less than 10 g lactic acid / liter gel, the maximum value for loading with viable cells immediately after immobilization being 9 × 10 ⁷ / g gel and after 20 days intermittent prefermentation 1.2 · 10 g / g gel (P. Linko et al .: Ann. New York Acad., 434 [1984] 406-417). In summary, the drawbacks of the known processes for producing lactic acid are that lactic acid is produced in too low a concentration or too long fermentation times when using gel immobilizates with too low specific productivity.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Ziel der Erfindung lsi ein Verfahren zur Milchsäuregärung mit gelimmobilisierten Mikroorganismen, bei dem Milchsäure in hoher Konzentration in kurzen Gärzeiten gebildet wird.The aim of the invention is a process for lactic acid fermentation with gel-immobilized microorganisms, in which lactic acid is formed in high concentration in short fermentation times.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Milchsäuregärung mittels gelimmobilisierter Mikroorganismen zu schaffen, bei dem das Gelimmobilisat eine hohe spezifische Produktivität besitzt und bei hohen Milchsäurekonzentrationen stabil bleibt.The object of the invention is to provide a process for lactic acid fermentation by means of gel-immobilized microorganisms in which the gel immobilizate has a high specific productivity and remains stable at high lactic acid concentrations.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß ein Gelimmobilisat verwendet wird, dessen Beladung nach seiner Herstellung in Abhängigkeit vom eingesetzten Bakterienstamm mindestens (0,2 bis 1,0) x 10^<0 viable Zellen/ml Gel und nach der sich anschließenden Aktivierung mindestens (1,0 bis 5,0) χ 10'° viable Zellen/ml Gel beträgt und daß dieses Gelimmobilisat in bekannter Weise zur Milchsäuregärung eingesetzt wird.According to the invention, this object is achieved in that a gel immobilizate is used whose loading after its preparation, depending on the bacterial strain used, at least (0.2 to 1.0) x 10 ^<0 viable cells / ml gel and after the subsequent activation at least ( 1.0 to 5.0) χ 10 '° viable cells / ml gel and that this Gelimmobilisat is used in a known manner for lactic acid fermentation.

Trotz vielfacher Bemühungen gelang es bisher nicht, eine so hohe Beladung geeigneter Gele mit viablen Zellen und damit ein hohes spezifisches Leistungsvermögen der Immobilisate zu erreichen. Das betrifft alle Versuche, die Aktivität von Gelimmobilisaten mit geringer Anfangsbeladung durch anschließende Zellvermehrung in Aktivierungsphasen zu erhöhen sowie auch die durchgeführten Experimente mit bereits nach der Herstellung hochbeladenen Gelon. In allen Fällen lag der Gehalt nn viablen Zellen mit 10*-10*/ml Gel sehr niedrig, was in der Literatur zu der Annahme führte, daß eine Sofortbeladung der Gele mit hohen Zellkonzentrationen keinen wesentlichen positiven Einfluß auf die spezifische Immobilisataktivität hat (S. L. Steenroos et al.: Diotechnol. Letters 4 [1982] 159-164).Despite many efforts, it has not been possible to achieve such a high loading of suitable gels with viable cells and thus a high specific performance of the immobilizates. This concerns all attempts to increase the activity of gel immobilizates with low initial loading by subsequent cell proliferation in activation phases as well as the experiments carried out with highly loaded after production Gelon. In all cases, the level of viable cells with 10 * -10 * / ml gel was very low, which in the literature led to the assumption that immediate loading of the gels with high cell concentrations has no significant positive influence on the specific immobilizate activity (SL Steenroos et al .: Diotechnol. Letters 4 [1982] 159-164).

Überraschenderweise wurde jedoch gefunden, daß Golimmcbilisate mit einem sehr hohen Gehalt an viablen Zellen erhalten werden, wenn bereits bei der Immobilisierung der Zellen ein für jeden Stamm spezifischer Mindestwert der Beladung der C ele mit viablen Zellen vorhanden ist. In diesem Fall ist eine entsprechend geführte Nachaktivierung des frisch hergestellteti Immobilisates stets so erfolgreich, daß je nach eingesetztem Bakterienstamm Eteladungswerte von 1 · 10" bis > 1 · 10" viable Zeü-n/ml Gel erreicht werden und spezifische Produktivitäten bei der Aktivierung von mindestens 50 bis 100g Milchsäure/l Gel h mit Spitzenwerten bis zu 200g Milchsäure/l Gel · h.Surprisingly, however, it has been found that Golimmcbilisate are obtained with a very high content of viable cells, even if there is already a minimum value of the loading of cells with viable cells for each strain during the immobilization of the cells. In this case, a correspondingly carried out after-activation of the freshly prepared immobilizate is always so successful that, depending on the bacterial strain used, loading values of 1 × 10 -5 to 1 × 10 -9 viable cells / ml gel are achieved and specific productivity in the activation of at least 50 to 100 g lactic acid / l gel h with peak values up to 200 g lactic acid / l gel · h.

Der Mindestwert der Immobilisatbeladung bei der Immobilisatherstellung liegtz. B. für den Stamm Lactobacillus spec. IBTB1018 bei etwa 2 · 10* viablen Zellen/ml Gel.The minimum value of the Immobilisatbeladung in Immobilisatstellung is z. B. for the strain Lactobacillus spec. IBTB1018 at approximately 2x10 * cells / ml gel.

Als Immobilisierungsmatrix ist Pekiatgel wegen seiner Beständigkeit bei hohen Milchsäurekonzentrationen gut geeignet (s.a. DO-WP 258419). Erstaunlicherweise ist das mit Bakterienzellen nahezu voll beladene Pektatgel auch bei ständigem Biomassezuwachs und Austritt von Zellen aus dem Gel so stabil, daß es im Langzeiteinsatz sogar in Reaktoren mit intensiver Durchmischung und damit starker mechanischer Beanspruchung, wie z. B. in Rührreaktoren, eingesetzt werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in Reaktoren bekannter Konstruktion und Betriebsweise durchgeführt werden. Beim wiederholten Einsatz eines Lactobacillus spec./Ca-PektaMmmobilisats zur Milchsäuregärung unter Verwendung eines nährund wirkstoffreichen Mediums in einem Ruhrreaktor kann bereits bei einem Immobilisatanteil am Arbeitsvolumen von 0,15 bei 95%igem Zuckerumsatz Milchsäure in einer Konzentration von 80g/l in Gärzeiten von 8 bis 20 h erzeugt werden. In Reaktoren mit höherem Immobilisatanteil und bei Verwendung von Streptococcus spec, sind noch kürzere Gärzsiten möglich. Das Wesen der Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele verdeutlicht.As immobilization matrix, pekietgel is well suited because of its stability at high lactic acid concentrations (see DO-WP 258419). Surprisingly, the bacterial cells almost fully loaded Pektatgel is so stable even with constant biomass growth and leakage of cells from the gel that it is in long-term use even in reactors with intensive mixing and thus strong mechanical stress, such. B. in stirred reactors, can be used. The process according to the invention can be carried out in reactors of known construction and operation. In the repeated use of a Lactobacillus spec./CapektaMmmobilisats for lactic acid fermentation using a nutrient and drug-rich medium in a Ruhr reactor can already at a Immobilisatanteil the working volume of 0.15 at 95% sugar conversion lactic acid in a concentration of 80g / l in fermentation times of 8 be generated until 20 h. In reactors with higher Immobilisatanteil and using Streptococcus spec, even shorter fermentation sites are possible. The essence of the invention is illustrated by the following examples.

Beispiel 1example 1

Ausgehend von 100ml einer Standkultur von Streptococcus spec, und 500ml modifiziertem MRS-Medium mit 45g Glucose/I wurden in einem Rührreaktor bei 40°C und pH 6,0 (Regelung mit β N NaOH) die freien Zellen angezüchtet, anschließend die gebildeten Zellen abzentrifugiert, in 30ml sterilem Wasser resuspendiert, mit einer Lösung von 3g Na-Pektat in 70ml Wasser intensiv vermischt und aus der resultierenden Suspension unter Vervendung einer 0,1 M CaClj-Lösung als Fällbad in bekannter Weise Gelporlen hergestellt (gemäß DD-WP 258419). Die Ausbeute betrug 75g Immobilisat. Die Gelperlen hatten einen Durchmesser von 1,0mm und waren mit 2 · 10'° viablen Zellen/ml Gel beladen. Dieses Immobilisat wurde nach der Herstellung für 10h in einem kontinuierlich betriebenen 0,5-l-Rührreaktor bei 4O⁰C, pH 6,0 und einer auf das Arbeitsvolumen (240ml) bezogenen Verdünnungsrate von 3,7 h~* unter Verwendung von MRS-Medium aktiviert. Am Ende der Aktivierungsphase war das Gel mit 1,2 · 10" viablen Zellen/ml beladen und besaß eine spezifische Produktivität von 131g Milchsäure/l Gel · h. 60g des aktivierten Immobilisats wurde in dem Rührreaktor für 20 unmittelbar aufeinanderfolgende diskontinuierliche Gäransätze bei 40°C und pH 6,0 unter Verwendung von jeweils 220 ml modifiziertem MRS-Medium eingesetzt, wobei das Gel zwischen den einzelnen Gärungen mit sterilem Wasser gewaschen wurde. Die Glucosestartkonzentration im Reaktor lag bei 57-eOg/l. Nach einer Gärzeit von jeweils 2-2,5 h betrug die Milchsäurekonzentratior ',0-52 g/l und die GlucoserestkonzentrationStarting from 100 ml of a stand culture of Streptococcus spec, and 500 ml of modified MRS medium with 45 g glucose / I, the free cells were grown in a stirred reactor at 40 ° C and pH 6.0 (control with β N NaOH), then the cells formed were centrifuged off , resuspended in 30 ml of sterile water, thoroughly mixed with a solution of 3 g of sodium pectate in 70 ml of water and prepared from the resulting suspension using a 0.1 M CaCl 2 solution as precipitation bath in a known manner Gelporlen (according to DD-WP 258419). The yield was 75 g of immobilizate. The gel beads had a diameter of 1.0 mm and were loaded with 2 x 10 'viable cells / ml gel. This immobilizate was after preparation for 10 h in a continuously operated 0.5 l stirred reactor at 4O ⁰ C, pH 6.0 and a working volume (240 ml) related dilution rate of 3.7 h ~ * using MRS Medium activated. At the end of the activation phase, the gel was loaded with 1.2 x 10 "viable cells / ml and had a specific productivity of 131 g lactic acid / l gel.60g of the activated immobilizate was in the stirred reactor for 20 consecutive batch cycles at 40 ° C and pH 6.0 using in each case 220 ml of modified MRS medium, the gel being washed between the individual fermentations with sterile water The starting glucose concentration in the reactor was 57 eOg / l After a fermentation time of 2 For 2.5 hours, the lactic acid concentration was 0-52 g / l and the glucose residual concentration

Beispiel 2Example 2 Ausgehend von 50ml einer Standkultur von Lactobacillus spec, und 22OmI modifiziertem MRS-Medium mit 45g Glucose/IStarting from 50 ml of a stand culture of Lactobacillus spec, and 22OmI modified MRS medium with 45 g glucose / l

wurden in einem Rührreaktor bei 45⁰C und einem mit βN NaüH geregelten pH-Wert von 6,0 die freien Zellen angezüchtet.the free cells were grown in a stirred reactor at 45 ⁰ C and with a regulated .beta.n NaüH pH of 6.0.

160ml des Fermentorinhalts wurden abzentrifugiert, die Zeilen in 15ml sterilem Wasser resuspendiert, mit einer Lösung von1,5g Natrlumpektat in 35 ml Wasser gut vermischt und aus der resultierenden Suspension unter Verwendung einer 0,3 M160ml of the fermentor contents were spun down, the cells resuspended in 15ml of sterile water, mixed well with a solution of 1.5g sodium-pallate in 35ml of water and extracted from the resulting suspension using a 0.3M

CaClj-Lösung als Fällbad 40g Immobilisatperton hergestellt. Die Gelperlen hatten einen mittleren Durchmesser von 1,1 mm undCaClj solution produced as a precipitation bath 40 g Immobilisatperton. The gel beads had a mean diameter of 1.1 mm and

enthielten 4,2 · 10* viable Zellen/ml Gel.contained 4.2 x 10 viable cells / ml gel.

Die Aktivierung des Immobilisats erfolgte in 3 unmittelbar aufeinanderfolgenden diskontinuierlichen Gärungen (Gesamtzeit: 9 h)Activation of the immobilizate took place in 3 consecutive discontinuous fermentations (total time: 9 h).

unter analogen Bedingungen wie bei der Anzucht der freien Zellen. Dabei erhöhte sich die Beladung des Gels mit viablen Zellenauf 5,2 · 10¹VmI; seine mittlere spezifische Produktivität während des 3. Gäransatzes betrug 70g Milchsäure/l Gel · h.under analogous conditions as in the cultivation of free cells. The loading of the gel with viable cells increased to 5.2 x 10 ¹ VmI; its mean specific productivity during the 3rd fermentation was 70g lactic acid / l gel · h.

Dieses aktivierte Immobilisat wurde in dem Rührreaktor bei 45⁰C und pH 6,0 unter Verwendung von jeweils 210ml modifiziertemThis activated immobilized was modified in the stirred reactor at 45 ⁰ C and pH 6.0 using each 210ml MRS-Medium In 14 diskontinuierlichen Gärungen zur Milchsäureproduktion eingesetzt. Die Glucosestartkonzentration imMRS medium Used in 14 discontinuous fermentations for lactic acid production. The glucose start concentration in Reaktor betrug 104 bis 106g/l. Der Rsaktorinhalt wurde am Ende eines jeden Gäransatzes unter pH-Regelung auf etwa 15⁰CReactor was 104 to 106 g / l. The Rsaktorinhalt was at the end of each Gäransatzes under pH control to about 15 ⁰ C.

abgekühlt, danach bis zum erneuten Einsatz bei 4⁰C aufbewahrt, vor Beginn des nächsten Einsatzes die Gärflüssigkeit vomcooled, then stored until re-use at 4 ⁰ C, before the next use, the fermentation of the

Immobilisat abgegossen, das Immobilisat Im Reaktor mit sterilem Wasser gewaschen und anschließend frisches MediumImmobilizat poured off, the immobilizate washed in the reactor with sterile water and then fresh medium

aufgegeben.given up.

Bei diesen Gäransätzen betrug die Milchsäu/oendkonzentration stets 80-82g/l. Die Gärzeiten bis zum 95-97%igenIn these fermentations, the lactic acid concentration was always 80-82 g / l. The fermentation times up to 95-97% Glucoseumsatz lagen für die ersten 4 Gärungen bei 7-8h, für die letzten 4 Gärungen bei 16-19h.Glucose conversion was 7-8h for the first 4 fermentations and 16-19h for the last 4 fermentations. Beispiel 3Example 3 Analog zu Beispiel 1 und 2 wurden Lactobacillus spec, und Streptococcus spec, angezüchtet. Je 200ml dieserLactobacillus spec, and Streptococcus spec, were grown analogously to Examples 1 and 2. 200ml each of these Anzuchtsuspensionen wurden vermischt, danach die Zellen abzentrifugiert, in 22 ml sterilem Wasser resuspendiert, mit einerGrowth suspensions were mixed, then the cells were centrifuged off, resuspended in 22 ml of sterile water, with a Lösung von 2,3g Na-Pektat in 63 ml Wasser intensiv vermischt und unter Verwendung von 0,3 M CaCli-Lösung ImmobilisatperlenSolution of 2.3 g Na pectate in 63 ml of water and thoroughly mixed using 0.3 M CaCl 2 solution Immobilisatperlen

hergestellt. Der Perlendurchmesser betrug 1,2 mm. Das Gel war pro ml mit 2,5 · 10* viablen Zellen von Lactobacillus spec, und7,2 10* viablen Zellen von Streptococcus spec, beladen.manufactured. The bead diameter was 1.2 mm. The gel was loaded per ml with 2.5 x 10 cells of Lactobacillus spec, and 7.2 x 10 cells of Streptococcus spec.

50g dieses Irnmobilisats wurden aktiviert und zur Milchsäureproduktion eingesetzt. Die Aktivierung erfolgte wie in Beispiel 2beschrieben, allerdings nur in einer vierstündigen Gärung. Sie führte zu einem Immobilisat mit 8 · 10* viablen Zellen der Gattung50g of this Irnmobilisats were activated and used for lactic acid production. The activation was carried out as described in Example 2, but only in a four-hour fermentation. It led to a Immobilisat with 8 · 10 * viablen cells of the genus

Lactobacillus und 2,0 · 10™ viablen Zellen der Gattung Streptococcus pro ml Gel. Die spezifische Produktivität des ImmobilisatsLactobacillus and 2.0 × 10 ™ cells of the genus Streptococcus per ml gel. The specific productivity of the immobilizate

betrug 68g Milchsäure/l · h.was 68g lactic acid / lh.

Unter analogen Bedingungen wie in Beispiel 2 wurden 16 diskontinuierliche Gäransätze angeschlossen, bei denen nachUnder analogous conditions as in Example 2, 16 discontinuous gas rates were added, followed by Gärzeiten zwischen 11 und 18h stets Milchsäure in einer Konzentration von 80-82g/l vorlag.Fermentation times between 11 and 18h always lactic acid in a concentration of 80-82g / l was present.

Claims (2)

1. Verfahren zur Milchsäuregärung mittels immobilisierter Mikroorganismen, gekennzeichnet dadurch, daß r/in Gelimmobilisat eingesetzt wird, dessen Beladung nach seiner Herstellung in Abhängigkeit vom eingesetzten Bakterienstamm mindestens (0,2 bis 1,0) x 10¹⁰ viable Zellen/ml Gel und nach der sich anschließenden Aktivierung mindestens (1,0 bis 5,0) x 10¹⁰ viable Zellen/ml Gel beträgt und dieses Gelimmcbilisat in bekannter Weise verwendet wird.1. A process for the lactic acid fermentation by means of immobilized microorganisms, characterized in that r / is used in gelimmobilisate whose loading after its production, depending on the bacterial strain used at least (0.2 to 1.0) x 10 ¹⁰ viable cells / ml gel and after the subsequent activation is at least (1.0 to 5.0) x 10 ¹⁰ cells / ml of gel and this gel is used in a known manner. 2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß Pektatgel als Immobilisierungsmatrix eingesetzt wird.2. The method according to claim 1, characterized in that Pektatgel is used as Immobilisierungsmatrix.