DE2511688A1 - Reagenz zur erkennung von syphilis und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents
Reagenz zur erkennung von syphilis und verfahren zu dessen herstellungInfo
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Description
PATENTANWALT
2 HAMBURG 1
Ballindamm 15
2 HAMBURG 1
Ballindamm 15
Meine Akte: 5863/75
Centre Regional de
Transfusion Sanguine de Lille
Transfusion Sanguine de Lille
21, rue Camille Guerin
Lille, Nord (Frankreich)
Lille, Nord (Frankreich)
Reagenz zur Erkennung von Syphilis und Verfahren zu dessen Herstellung
Die Erfindung betrifft ein Reagenz zur Erkennung von Syphilis, sowie ein Verfahren zur Herstellung des Reagenz.
Bekanntlich erfolgt die diagnostische Erkennung dieser Krankheit in vielen Fällen vermittels einer Flockungs- oder Trü —
bungsreaktion von Kardiolipiden im Serum oder Blutplasma.
Es sind bereits mehrere Reagenzien bekannt, die im wesentlichen aus einer alkoholischen Kardxolxpidlösung bestehen,
so z.B. das Antigen von Kahn oder das Antigen von de Kline. Diese Reagenzien gestatten die Erkennung der Syphilis vermittels
Laboruntersuchungen, die von Hand ausgeführt werden. Zu diesem Zweck werden auf eine Glasplatte einige Bluttropfen
aufgebracht und mit dem Antigen vermischt. Bei positiver Reaktion erscheint eine mit unbewaffnetem Auge sichtbare
Ausflockung.
Es sind in der letzten Zeit mehrere zur automatisierten Blutuntersuchung
geeignete Analysen entwickelt worden, wobei es in diesem Zusammenhang von Interesse wäre, die Syphilisdiagnose
in diese systematischen Untersuchungen einzubeziehen.
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Die zur Ausführung derartiger Untersuchungen derzeit im Handel erhältlichen automatischen Geräte gestatten die parallele
und gleichzeitige Ausführung von fünf bis zu sieben Analysen an jeder Blutprobe. Die Diagnose auf Syphilis auf
einem derartigen automatisierten Wege bereitet jedoch nach wie vor große Schwierigkeiten, da die bekannten, vorgenannten
Antigene für von Hand ausführbare Untersuchungen aus nicht haltbaren Reagenzien bestehen, welche jeweils unmittelbar
vor Ausführung des Tests hergestellt werden müssen. Zur Herstellung der Reagenzien wird eine alkoholische Kardiolipidlösung
mit Wasser verdünnt.
Zur Ausführung der vorgenannten automatischen Untersuchungen sind u.a. nach dem Prinzip des sogenannten "kontinuierlichen
Flusses" arbeitende Geräte, bekannt, bei denen das jeweils benötigte Reagenz in geringe Mengen von Serum oder Blutplasma
unterschiedlicher Herkunft eingeführt wird, welche durch Luftblasen voneinander getrennt sind. Die Serenproben
werden dabei gemeinsam durch biegsame Schläuche geringen Querschnitts vermittels einer Pumpe kontinuierlich umgewälzt.
Die Anzahl der Schläuche entspricht dabei der Anzahl der auszuführenden systematischen Analysen an den Blutproben.
Zu diesen systematischen Untersuchungen gehören beispielsweise die Blutgruppe und die Syphilisreaktion. Nach Zusetzen
der Reagenzien zu den Blutproben werden die Reaktionsprodukte an absorbierendes Papier abgegeben, welches anschließend zur
Begutachtung der Ausfällung zur Verfügung steht, wobei sich erkennen läßt, ob der Test positiv ausgefallen ist.
Ein im Handel erhältliches Gerät dieses Typs mit der Bezeichnung "Technican" (Warenzeichen) ist beispielsweise in einem
Artikel von McGrew mit dem Titel "Automation of a Flocculation Test for Syphilis" (Automatisierung eines Ausflockungstests
für Syphilis), veröff. in "The American Journal of Clinical Pathology", Bd. 50, Nr. 1 beschrieben.
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Zur Erkennung von Syphilis auf automatischen Wege wird daher ein Reagenz benötigt, das wenigstens mehrere Wochen lang
haltbar ist und zu leicht erkennbaren Reaktionen führt, die auch bei Automatisierung wie z.B. nach Aufbringen auf Papier
zweifelsfrei erkennbar sind. Aus diesem Grunde wurde bereits vorgeschlagen, anstelle einer alkoholischen Kardiolipidlösung
ein Reagenz zu verwenden, bei dem die Kardiolipiden an Kohlenstoff
teilchen gebunden sind. Die schwärzliche Verfärbung dieser Teilchen gestattet ein einwandfreies Erkennen des
Testergebnisses.
Einzelheiten über die Herstellung und Anwendung dieses Reagens
sind in der U.S. Patentschrift 3 074 853 beschrieben.
Die Verwendung eines derartigen Reagenz nach McGrew in einem automatischen Gerät mit "kontinuierlichem Fluß" wie z.B. in
dem Gerät "Technican" hat zu guten Ergebnissen geführt.
Das bekannte Reagenz ist jedoch mit dem schwerwiegenden Nachteil behaftet, daß seine Gestehungskosten außerordentlich
hoch sind. Hinzu kommt, daß sich die Reaktion in manchen Fällen nicht mehr erkennen läßt, da sich das Antigen vom
Kohlenstoff gelöst hat.
Durch die Erfindung sollen nunmehr ein für automatisierte Untersuchungen geeignetes Reagenz zur Erkennung von Syphilis,
das über längere Zeiträume hinweg haltbar ist und die deutlich sichtbare Anzeige einer positiven Reaktion durch Ausflockung
auf absorbierendem Papier gestattet, sowie ein Verfahren zur Herstellung eines derartigen Reagenz geschaffen
werden.
Das zur Lösung der gestellten Aufgabe vorgeschlagene Reagenz besteht aus einer alkoholischen Kardiolipidlösung und ist
erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß die in Lösung befindlichen Kardiolipide vermittels eines alkohollöslichen,
verträglichen Farbstoffs in Lösung eingefärbt sind.
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Zur Herstellung des Reagenz werden eine alkoholische Kardiolipidlösung
und ein Lipidfarbstoff auf eine zwischen 40 und 60 0C liegende Temperatur erhitzt, wonach das Gemisch mit
auf gleicher Temperatur befindlichem physiologischem Wasser verdünnt wird.
Das Reagenz ist über längere Zeit hinweg haltbar und eignet sich somit zur Verwendung in Geräten zur automatischen Blutuntersuchung.
Der Herstellungspreis für das Reagenz ist verhältnismäßig niedrig, wobei jedoch das Reagenz eine sehr
hohe Ansprechempfindlichkeit aufweist und eine sehr klare Erkennung der Reaktion gestattet, was darauf zurückzuführen
ist, daß die Größe der in Lösung befindlichen Lipidmizeilen
homogen ist.
Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Reagenz und das entsprechende
Herstellungsverfahren werden im nachfolgenden näher erläutert.
Einer alkoholischen Kardiolipidlösung, die ggf. außerdem Eigelb, Lezithin und auch andere Zusatzmittel enthalten kann,
oder einfach auch zu im Handel erhältlichen Antigenen nach Kahn oder de Kline wird ein in Alkohol löslicher Farbstoff
für die Lipide zugesetzt, welcher sich an die Lipide bindet. Zu diesem Zweck wurden unterschiedliche Farbstoffe untersucht,
wobei sich sagen läßt, daß mit schwarzen Farbstoffen die besten Ergebnisse erzielt wurden, zumindest im Hinblick
auf eine spätere Begutachtung der Ausflockungen auf Papier.
Unter den bekannten, für Lipide geeigneten Farbstoffen lassen sich nennen Amido-Schwarz, Cerol-Schwarz oder Sudan-Schwarz.
Gute Ergebnisse werden auch mit den scharlach- oder puterroten Farbstoffen der Typen Congo oder Ruthenium
erzielt. Die in bezug auf die alkoholische Kardiolipidlösung verwendete Farbstoffmenge ist jeweils abhängig von
den Eigenschaften des verwendeten Farbstoffs und von seinem Lösungsvermögen. Die Farbstoffmenge wird in jedem Falle so
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bemessen, daß die Lösung gesättigt, jedoch ein Überschuß vermieden ist, welcher ohne in Lösung zu gehen zu einer
Ausfällung führen könnte. Bei Verwendung einer zu niedrigen Farbstoffmenge kann es dazu kommen, daß die klare und
einwandfreie Erkennbarkeit der Reaktion beeinträchtigt ist.
Das Gemisch wird während eines von 10 bis 40 Minuten betragenden
Zeitraums bei gleichzeitiger Agitation auf eine Temperatur von 50 bis 60 0C erhitzt, wodurch die Lipide unter
Vermeidung von Denaturierung eingefärbt und damit die Farbstoffe praktisch "fixiert" werden. Das Gemisch wird anschließend
im heißen Zustand mit physiologischem Wasser verdünnt. Damit es bei der Verdünnung zu einer homogenen Ausbildung
der Mizellen kommt, muß unbedingt darauf geachtet werden, daß kein Temperatursprung auftritt. Das
zur Verdünnung verwendete physiologische Wasser sollte daher die gleiche Temperatur wie das Gemisch, d.h. zwischen etwa
30 und 50 0C aufweisen. Der Lösung können ein Konservierungsmittel
und verschiedene, zur Steigerung der Reaktionsempfindlichkeit dienende Zusätze zugesetzt werden.
Das vorgeschlagene Reagenz wurde in Verbindung mit einem
automatischen Gerät vom Typ "Technican" ausprobiert. Die Untersuchung auf Syphilis erfolgte durch das Centre de Transfusion
Sanguine, wobei festgestellt wurde, ob das Blut von freiwilligen Blutspendern gesund und somit zur Blutübertragung
geeignet ist. Die Einzelheiten des Geräts und seiner Anwendung für diese Zwecke sind in der vorgenannten Veröffentlichung
"American Journal of Clinical Pathology", Bd. 50, Nr. 1 und in der dort angegebenen Literatur beschrieben.
Das Gerät wurde beim Einsatz des erfindungsgemäßen Reagenz unverändert benutzt.
Das Verfahren zur Herstellung des Reagenz wird im nachfolgenden anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert.
Das dabei erhaltene Reagenz weist nicht nur eine gute HaIt-
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barkeit auf, sondern liefert auch klar sichtbare Reaktionen.
45 ml einer Antigenlösung nach Kahn wurden mit 145 mg Sudan-Schwarz
versetzt. Das Gemisch wurde dann 20 Minuten lang unter Agitation auf eine Temperatur von etwa 60 0C erhitzt.
Dann wurde das Gemisch eine halbe Stunde lang stehen gelassen, wonach 1 ecm Sumatra-Benzoe zugesetzt wurde. Anschliessend
wurde das auf 50 0C gehaltene gefärbte Antigen tropfenweise
nach und nach in 300 ml physiologisches Wasser (NaCl 15/1000) eingeführt, welches ebenfalls eine Temperatur von
50 0C aufwies. Die dabei erhaltenen gefärbten Lipidmizellen
hatten gleichförmige Größe. Anschließend wurden 3,5 ml gesättigtes (NH.)„ SO zugesetzt. Durch das Ammoniumsulfat
4
wurde die Reaktionsempfindlichkeit gesteigert. Das Reagenz wurde dann auf Umgebungstemperatur abkühlen gelassen und anschließend eine Woche lang bei 4 0C aufbewahrt. Zur Herabsetzung des Prozentsatzes an unzutreffenden positiven Reaktionen wurde schließlich noch pro ml Lösung 1 g Cholinchlorid zugesetzt. Das fertige Reagenz kann bei einer Temperatur von 4 0C über einen Zeitraum von 6 Wochen aufbewahrt werden.
wurde die Reaktionsempfindlichkeit gesteigert. Das Reagenz wurde dann auf Umgebungstemperatur abkühlen gelassen und anschließend eine Woche lang bei 4 0C aufbewahrt. Zur Herabsetzung des Prozentsatzes an unzutreffenden positiven Reaktionen wurde schließlich noch pro ml Lösung 1 g Cholinchlorid zugesetzt. Das fertige Reagenz kann bei einer Temperatur von 4 0C über einen Zeitraum von 6 Wochen aufbewahrt werden.
Reagenzien gleicher Qualität lassen sich auch ausgehend vom Antigen nach de Kline oder den anderen, oben beschriebenen
Farbstoffen herstellen.
Das Reagenz und das vorgeschlagene Herstellungsverfahren
eignen sich besonders gut zur automatisierten Syphilisdiagnose, wobei mit dem vorstehend beschriebenen Gemisch in
einem Gerät für kontinuierlichen Fluß voll zufriedenstellende Ergebnisse erzielt wurden.
Das Reagenz kann selbstverständlich in Abhängigkeit von dem jeweils verwendeten Gerät durch Zusätze geringfügig abgeändert
werden, um etwas unterschiedliche Eigenschaften anzunehmen. So können dem Reagenz zwecks Steigerung der
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Mizellendichte und der Korngröße derselben dienende Stoffe zugesetzt werden, beispielsweise wenn das Reagenz in Geräten
unterschiedlicher Arbeitsweise eingesetzt werden soll.
Die Wirksamkeit und Zuverlässigkeit eines nach dem vorstehend beschriebenen Beispiel hergestellten Reagenz wurde
in folgender Weise geprüft:
389 frische Blutproben zeigten sämtlich nach bekannten Verfahren vier positive Reaktionen, so auf Treponema (Erreger)
nach dem Verfahren von Reiter und Kolmer, sowie auf Kardiolipide vermittels der Reagenzien von de Kline und Kahn.
Bei zweifelhaften Reaktionen wurden die Proben ausgesondert,
Die einwandfreien Proben wurden vermittels eines Geräts
vom Typ "Technican" mit dem vorgeschlagenen Reagenz untersucht. Dabei ergaben sich 384 positive Reaktionen und 5
zweifelhafte Reaktionen. Somithin wurden in 98,7 % aller
analysierten Fälle einwandfreie Ergebnisse erzielt.
- Patentansprüche: 509840/0734
Claims (7)
- Patentansprüche :1J Reagenz zur Erkennung von Syphilis, bestehend aus einer alkoholischen Kardiolipidlösung, dadurch gekennzeichnet, daß die in Lösung befindlichen Kardiolipide vermittels eines alkohollöslichen, verträglichen Farbstoffs in Lösung eingefärbt sind.
- 2. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daßder Lipidfarbstoff aus einem schwarzen Farbstoff besteht, der insbesondere ausgewählt ist aus Sudan-, Amido- oder Cerol-Schwarz.
- 3. Reagenz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Konservierungsmittel wie z.B. Sumatra-Benzoe enthält.
- 4. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, daß ihr gesättigtes Ammoniumsulfat zugesetzt ist.
- 5. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, daß ihr Cholinchlorid zugesetzt ist.
- 6. Reagenz nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß die Farbstoffmenge so bemessen ist, daß die alkoholische Kardiolipidlösung gesättigt ist.
- 7. Verfahren zur Herstellung eines Reagenz zur Erkennung von Syphilis nach einem der Ansprüche 1 - 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine alkoholische Kardiolipidlösung und ein Lipidfarbstoff auf eine zwischen 40 und 60 0C liegende Temperatur erhitzt werden und dann das Gemisch mit auf gleicher Temperatur befindlichem physiologischem Wasser verdünnt wird.509840/0734
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