DE3033030A1 - Thermostabile derivate der urokinase und verfahren zu deren herstellung - Google Patents

Thermostabile derivate der urokinase und verfahren zu deren herstellung

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Description

3G3303Q
SCHIFF ν. FONER STREHL SCHOBEL-HOPF EBBINGHAUS FlNCK _ β _
• 3·
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der chemisch-pharmazeutischen Industrie, und insbesondere auf neue Verbindungen—thermostabile Derivate der Urokinase— und ein Verfahren zu. deren Herstellung.
Die genannten neuen Verbindungen besitzten thermobolytische Aktivität und können in der Medizin als //irkstoffe thrombolytischer Präparate sowie in der Biologie und Biochemie zur Anwendung kommen, wo Untersuchungen über die Thrombenbildung und über das Funktionieren von !Fermentsystemen durchgeführt werden.
Breit bekannt ist die Verwendung von Urokinase in der Medizin als Aktivator des Plasminogens, weil sie gut ausgeprägte thrombolytische Eigenschaften besitzt. Die Urokinase wird bei der Behandlung solcher Erkrankungen wie Lungenembolie, Thrombosen der tiefliegenden Venen, Erkrankung von Gehirngefäßen und Myokardinfarkt verwendet. Die Behandlung mit nativer Urokinase wird jedoch im Zusammenhang mit ihrer Inaktivierung unter Einwirkung von Blut inhibit or en und endogenen Proteasen sowie infolge der Unmöglichkeit der Schaffung eines hohen lokalen Gehaltes an dem Präparat in dem jeweiligen erkrankten Organ kompliziert. Bei der Behandlung mit der Urokinase ist es erforderlich,eine hohe Präparatdosis mehrmals einzuführen. Zur Überwindung der obengenannten Schwierigkeiten führt man eine Vereinigung der Fermente mit hochmolekularen Trägersubsfcanzen durch. Fermentderivate weisen eine erhöhte Stabilität gegenüber verschiedenen inaktivierenden Einwirkungen sowie eine verzögerte Ausführung derselben aus dem Organismus auf.
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Bekannt sind Derivate der Urokinase, die mit hochmolekularen Trägeraubstanzen gebunden ist, so.vie Verfahren für ihre Herstellung. So wird die Urokinase mit Sepharosa - 1VB (,Viman B., ,'/allen P., Eur.I.Biochem. 55,25,1975) unter Aktivierung der Trägers übst anz mit Bromzyan
gebunden. Die Ver?jendung einer derartigen hochtoxischen Verbindung für die Medizinzwecke ist nicht möglich.
Bekannt ist auch ein Verfahren zur Herstellung von Urokinasederivaten, gemäß dem die Urokinase in ein Polyacryl amidgel (Capet. Antanini P.L., Tamenasse J.Con.J.Biochem. 55,890,1975) nach seiner Behandlung mit Natriumnitrit im saueren Medium "vernetzt" wird,wobei die dadurch diazotierte Trägersubstanz unter Azoverbindung mit einem Ferment umgesetzt wird. Dabei vvird ein wasserunlösliches Derivat der Urokinase gewonnen, das ebenfalls in der Medizin nicht verwendet werden kann.
In den Veröffentlichungen sind die wasserlöslichen thermostabilen Derivate der Urokinase, die thrombolytische Aktivität besitzen, nicht beschrieben.
Der Erfindung wurde die Aufgabe zugrundegelegt, neue thermostabile Derivate der Urokinase zu entwickeln, die wasserlöslich sind und thrombolytische Aktivität mit prolongierter »Yirkung besitzen, sowie ein Verfahren für ihre Herstellung,
Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß die neuen Verbindungen thermostabile Derivate der Urokinase, mit einem Copolymer des Acrylamids und der Acrylsäure mit einem Molekulargewicht von 10000 bis 2000CO konventionellen Einheiten und einem Gehalt an Acrylsäure von 1 bis 20% darstellen, die
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von 15 bis 55% Urokinase enthalten und Esterase- und amidolyt is ehe Aktivität in Höhe von 10-80% aufweisen.
Die erf indungsgemäßen neuen Derivate der Urokinase stellen ein weißliches Pulver dar, das leicht löslich in iasser ist. Diese Verbindungen besitzen eine erhöhte Thermo Stabilität infolge der Entstehung von Kovalenzbindungen zwischen dem jeweiligen Ferment und der Trägersubstanz,* sie besitzen auch eine prolongierte thrombolytische Aktivität.
Erfindungsgemäß besteht das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen thermostabilen Derivate der Urokinase darin, daß man ein Copolymer des Acrylamids und der Acrylsäure mit einem Molekulargewicht von 10000 bis 20000 konventionell en Einheit en und einem Gehalt an Acrylsäure von 1 bis 20% mit der Urokinase in Anwesenheit eines Aktivators, des l-Äthyl-3-(>-dimethylaminopropyl) carbodiimide, bei einer Temperatur von 0 bis 25°C in einem schwachalkalischen Medium von 0,001-1,0 Mol Phosphatpuffergemisch umsetzt und anschließend das Endprodukt isolier«. Für die Erreichung einer hohen Ausbeute an Endprodukt wird die Umsetzung während 10-20 Stunden durchgeführt.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren geht die Angliederung der Urokinase an das genannte Copolymer durch die Stufe der Aktivierung von Carboxylgruppen des Copolymers mit l-ÄVthyl-3- -(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid vor sich:
C IrRU=C-NR2-*. T-C-O-C
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wo T eine Trägersubstanz darstellt; dann reagieren die Carboxylgruppen der Trägersubstanz mit Aminogruppen'des Eiweißes
T-C -C + Ho H-P-^J-Q -VH-Pi-N - C- N
2 H
worin P ein Ferment darstellt.
Das Verfahren wird wie folgt durchgeführt.
Eine hochmolekulare Trägersubstanz, Copolymer des Acrylamide und der Acrylsäure mit einem Molekulargewicht von 10000 bis 200000 konventionellen Einheit en und einem Gehalt an der Acrylsäure von 1 bis 20% wird bei schw achalkalische el pH- -.!fert in der Lösung eines Phosphat ρ uff er gemisches (0,001-1,0 Mol) aufgelöst,* dann wird bei einer Temperatur von 0° bis 25°C ein Aktivator, l-Ä'thyl-3-(^-dimethylaminopropyl)carbodi-imid, in die Lösung eingeführt und nach einiger Zeit eine Urokinaselösung in destilliertem Wasser hinzugefügt. Die Reaktion der Bindung wird vorzugsweise wahrend 10-20 Stunden durchgeführt, wonach man das gewonnene Derivat der Urokinase von anderen Stoffen im gel-chromatographischen Verfahren trennt.
Das gewonnene Produkt stellt Urokinase dar, die mit einem synthetischen Polymerträger chemisch gebunden ist. Das Produkt erhält vollständig seine biologische Aktivität nach hochmolekularen Substraten aufrecht, verliert nicht seine katalytische Aktivität bei Lagerung im Kühlschrank (4-50C) im aufgelösten Zustand während 3 Monate (im Unterschied zu Lösungen eines nativen Fermentes) und besitzt eine erhöhte Thermostabilität und eine prolongierte thrombolytische Wirkung.
Die Synthese des genannten wasserlöslichen Polymerträgers
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wird mittels radikaler Copolymer isation von Monomeren in Gegenwart des Ammoniumpero:xydisulf ats in wässariger Lösung durchgeführt. Die Copolymer isation führt man bei einer Temperatur von 600C während vier Stunden durch. Die Gesamtkonzentration der konomere im Reaktionsgemisch beträft 5 Gew.%. Das Copolymer wird mit Methanol gefällt und mit Aceton getrocknet. Der Ge&alt an Acrylsäure im Copolymer beträgt von 1 bis 20 Gew.%.
Es soll hervorgehoben werden, daß die Erhöhung des Gehaltes an Acrylsäure im Copolymer über 20;i hinaus zu keiner Vergrößerung der Menge des gebundenen Eiweißes führt, und der niedrige Gehalt (unter 1%) an Acrylsäure im Copolymer es biologisch inert macht. Die biologische Verträglichkeit der Trägersubstanzen solcher Art wurde vorher nachgewiesenj dadurch konnten sie als Plasmasubstituenten verwendet werden.
Zur besseren Erläuterung der vorliegenden Erfindung führen wir folgende Beispiele für neue thermostabile Derivate der Urokinase, für das Verfahren ihrer Herstellung sowie Versuche auf ihre thrombolytische Wirkung an.
Beispiel 1
In 4ml 0,001 molaren Phosphatpuffergemiscii mit pH 8,3 werden 20 mg Copolymer des Acrylamids und der Acrylsäure mit einem Molekulargewicht von 100000 konventionellen Einheiten und einem Gehalt an Acrylsäure von 3% aufgelöst. Dann werden an der Kälte (40C) 2,5 mg l-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid in diese Lösung eingeführt und 20 Minuten danach gießt man 1 ml der Lösung der nativen Urokinase in destilliertem »V'asser hinzu (250000 ME/ml). Die Reaktion der Bindung wird während 16 Stunden durchgeführt und dann trennt man
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das gewonnene Derivat der Urokinase mit der hochmolekularen Trägersubstanz mit Hilfe der Gel-Chromatographie in einer Kolonne mit Sephaäex G-I50. Das hergestellte Produkt steht nach den kinetischen Parametern der Hydrolyse niedermolekularer Substrate und nach der Thermo Stabilität dem nativen Ferment nicht nach. Mit der Trägersubstanz werden bis 80% der Ausgangsmenge der Urokinase gebunden, die Esterase- und amidolytische Aktivität wird in Höhe von 78-812a aufrechterhalten. Die gewonnene Verbindung verliert nicht ihre katalytische Aktivität nach hochmolekularen Substraten (Plasminogen), und lysiert im Syst em" in vitro" mit der gleichen Geschwindigkeit einen Iviodellthrombus wie das Präparat der nativen Urokinase. Unter physiologischen Bedingungen bei einer Temperatur von 37°G verliert die hergestellte Verbindung praktisch nicht ihre katalytische Aktivität während zweier Tage. Das native Ferment verliert unter den gleichen Bedingungen über 50% seiner katalytisehen Aktivität.
Beispiel 2
Das Verfahren führt man ähnlich wie in Beispiel 1
durch. Als Polymerträgersubstanz wird ein Copolymer des Acrylamids und der Acrylsäure mit einem Molekulargewicht von 10000 konventionell enEinhe it en und einem Gehalt an Acrylsäure von 1% verwendet. Die Umsetzung erfolgt in 0,1 molarer Lösung eines Phosphatpuffergemisches bei einer Temperatur von 25°C während 20 Stunden. In diesem Fall beträgt die Menge der mit der Trägersübstanz gebundenen Urokinase 53%» und die vom Präparat bewahrte Esterase- und amidolytische Aktivität beträgt 50-51%.
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Beispiel 3
Das Verfahren wird ähnlich wie in Beispiel 1 durchgeführt. Ivlan verwendet ein Copolymer des Acrylamids und der Acrylsäure mit einem Molekulargewicht von 200000 konventionellenEinheiten und einem Gehalt an Acrylsäure von 20%. Die Umsetzung führt man in 1,0 molarer Lösung eines Phosphat ρ uff er gemisches bei einer Temperatur von O0C durch. In diesem Fall werden 20% Urokinase mit der Trägersubstanz, bezogen auf die Gesamtmenge des Fermentes, gebunden. Die vom Präparat bewahrte Esterase- und amidolytische Aktivität beträgt 17%.
Hierdurch enthaltan die in Beispiel 1-5 hergestellten Derivate der Urokinase unterschiedliche Mengendes Fermentes, das mit der Trägers übstanz gebunden ist, was auf die große Rolle der Größe der lonenstärke der Lösung zurückzuführen ist, die ihrerseits von der Konzentration des Phosphatpuffergemisches bei der Durchführung der Reaktion ^er Bindung abhängig ist. Sämtliche Derivate besitzen throabolyt ische Aktivität, die der für die native Urokinase vergleichbar ist. ,Vie aus Beispiel 1 zu ersehen ist, besitzen außerden die hergestellten Verbindungen eine erhöhte Thermostabilität und er*- " halten während längerer Zeit ihre katalytisch^ Aktivität aufrecht.
.Beispiel 4
Bs wurden Versuche der thrombolytischen Aktivität der hergestellten Verbindungen gemäß Beispiel 1-J5 im Vergleich mit der thrombolytischen Aktivität des nativen Präparats der Urokinase durchgeführt. Die Lysis des Thrombingerinnsels führte man von der Oberfläche eines Gitters, das für eine homogene Eiweißlösung durchlässig ist und in die Lösung der-
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- ίο -
artig eingetaucht ist, so daß die Unispülung des künstliehen Thrombus mit der gleichmäßig zu vermischenden Lösung gesichert wird. Die Zubereitung von Thromben erfolgt in einem konventionellen Verfahren durch Umsetzung 0,5 ml einer Fibrinogenlösung (10 mg/ml) mit 0,2 ml Thrombinlösung (4 mg/ml), wonach der jeweilige Türombus während einer Stunde gehalten wird. Der dadurch gewonnene Thrombus wird in eine Losung des 0,1 molaren Phosphatpuff ergeiaisch.es mit 0,02 Mol des Dinatriumsalzes der Äthylendiamintetraessigsäure pH=7,4 so getaucht, daß seine untere Oberfläche von dieser Lösung umspült wird, wobei sie Menschenplasminogen (Lys-Pmg 1,0 mg/ml) enthält. Für die Thrombolysis wurden die native Urokinase und die hergestellten Derivate der Urokinase mit Copolymeren in einem Verhältnis genommen, das ihre gleiche Esterase aktivität nach dem niedermolekularen Substrat (AGlke) gewährleistet. Die Geschwindigkeit der Lysis des Fibringerinnsels wurde nach der Änderung (Vergrößerung) der optischen Dichte der Lösung (infolge der Instruktion bei der Thrombolysis des unlöslichen Fibringerinnsels und beim Übergang seiner Fermente in die Lösung) in einem Spektrophotometer bei 280 Nm in der Zeit kontrolliert.
Die Ergebnisse der durchgeführten Versuche sind in der Tabelle angeführt, worin tq oL das Verhältnis des Zuwachses der optischen Dichte der Lösung (infolge der Destruktion bei der Thrombolysis des unlöslichen Fibringerinnsels und des Übergangs seiner Fermente in die Lösung) zur Größe des Zeitabschnittes darstellt, in dem dieser erfolgte und einen. Parameter darstellt, der die Geschwindigkeit der Thrombolysis charakterisiert.
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BADÖRlälNÄi:
Art der zu prüfenden Verbindung
Tabelle
Geschwindigkeit der Lysis eines Thrombus
igd--
At
Native Urokinase
Derivat der Urokinase, das gemäß Beispiel 1 gewonnen wurde
Derivat der Urokinase, das gemäß Bolxpiel 2 gewonnen wurde
Derivat der Urokinase, das gemäß Beispiel J gewonnen wurde
0,49 0,61
0,51
100
125
110
104
Somit ist- aus den in der Tabelle aufgeführten Ergebnissen zu ersehen, daß die hergestellten Derivate der Urokinase mit einem Copolymer in der Effektivität ihrer thrombolytischen /iirkung das native Ferment übertreffen. Die erhöhte Thermo Stabilität der hergestellten Derivate der Urokinase ermöglicht es dem Ferment, seine katalytisch^ Aktivität während einer längeren Zeit im Vergleich zum nativen Präparat aufrechtzuerhalten, ;vas seinerseits zur Prolongierung der thrombolytisehen .Virkung der hergestellten Derivate der Urokinase führt.
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BAD

Claims (2)

PATENTANSPRÜCHE:
1. Thermostabile Derivate der Urokinase mit einem Copolymer von Akrylamid und Acrylsäure mit einem Molekulargewicht von 10000 bis 200000 konventionellen Einheiten und einem Gehalt an Acrylsäure von 1 bis 20% ,die von 15 bis 35% Urokinase und eine Esterase- und amidolytische Aktivität von 10-80% aufweisen.
2. Verfahren zur Herstellung thermostabiler Derivate der Urokinase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Copolymer von Acrylamid und Acrylsäure mit einem Molekulargewicht von 10000 bis 200000 konventionellen Einheiten und einem Gehalt an Acrylsäure von 1 bis 20% mit der Urokinase in Anwesenheit eines Aktivators, l-lthyl-3-O-dimethylaminopropyl)carbodiimide, bei einer Tem-
'■3
peratur von 0° bis 25°C in einem schwachalkalischen Medium von 0,001-1,0 Mol Phosphatpuffergemisch umsetzt.
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ρ _
3· Verfahren nach. Anspruch 2, dadurch g e kennze i chnet, daß man zur Erreichung einer hohen Ausbeute an Endprodukt die Umsetzung im Verlaufe von 10 bis 20 Stunden durchführt.
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DE3033030A 1979-09-28 1980-09-02 Thermostabiles Derivat der Urokinase und Verfahren zu dessen Herstellung Expired DE3033030C2 (de)

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