DE3026044A1 - Parenteraler impfstoff fuer rinder gegen infektioese rinderrhinotracheitis - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft einen Impfstoff für infektiöse Rinderrhinotracheitis (IBR), der durch Extraktion mit einem nichtionischen Detergens aus mit IBR-Virus infizierten Zellen isoliert wird. Das extrahierte, virale Umhüllungsprotein kann in injizierbarer Dosisform durch Vermischen mit einem Ölartigen Adjuvans zubereitet werden. Der Impfstoff ergibt einen hohen Gehalt an Antikörper-Ansprechen und mit ihm kann man das Verbreiten des Virus von infizierten Tieren nach der Immunisierung vermeiden.

Die infektiöse Rinderrhinotracheitis (IBR) wurde erstmals als differenzierte Krankheit von Vieh und insbesondere Rindvieh während der 50er Jahre erkannt. In Übereinstimmung mit den Eigenschaften anderer Herpes-Viren vermehrt sich das IBR-Virus (IBRV) innerhalb eines großen Bereichs von Zellarten und ergibt verschiedene Krankheitsmanifestationen, die u.a. Krankheiten des Atemtrakts, Konjunktivitis, Vulvoyaginitis, Fehlgeburten, Balanoposthitis, Meningoencephalitis, Krankheiten des Verdauungstraktes und tödliche systemische Infektionen verursachen. IBR ist jedoch hauptsächlich als Krankheit des Atemtrakts bekannt, die sich durch Tracheitis, Rhinitis und Fieber auszeichnet. IBR-Infektion ist die häufigste, diagnostizitierte Ursache von Fehlgeburten bei trächtigen Rindern; vergl. Kirkbride et al., J.Am. Vet.Med.Assoc, 162, 556-560 (1973). Das Virus wird leicht übertragen und ist auf der ganzen Welt verbreitet. Einige Rinder entwickeln eine latente Infektion, die reaktiviert werden kann.

Die Kontrolle von IBR basiert hauptsächlich auf der Impfung, und eine Anzahl unterschiedlicher Arten von IBR-Impfstofffen wurde entwickelt; vergl. Kahrs, J.Am.Vet.Med.Assoc., 171, 1055-1060(1977). Diese umfassen parenterale und intranasale Impfstoffe, die beide lebende, abgeschwächte IBRV ausnutzen. Die parenteralen Impfstoffe, die normalerweise

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intramuskulär verabreicht werden, können eine Fehlgeburt bei trächtigen Rindern verursachen und sind daher bei trächtigem Rindvieh kontraindiziert. Weiter kann die Impfung von säugenden Kälbern, die trächtige Rinder benutzen, eine Fehlgeburt, bedingt durch das Ausbreiten des Virus durch die geimpften Kälber, bewirken. Intranasale Impfstoffe sind in dieser Hinsicht sicherer und ergeben humorale Antikörper bei Titern, die mit denen der intramuskulären Impfstoffe vergleichbar sind. Bei der Verabreichung intranasaler Impfstoffe treten jedoch Schwierigkeiten auf. Der Kopf muß festgehalten oder befestigt werden, und man muß sorgfältig darauf achten, daß der Impfstoff tief in beide Nasenlöcher verabreicht wird. Die geimpften Tiere besitzen weiterhin die Neigung, den Impfstoff herauszublasen, wenn sie nach der Impfung schnaufen.

Der Grad der Wirksamkeit der bekannten Impfstoffe ist variabel und die Dauer des Schutzes beschränkt» Man nimmt im allgemeinen an, daß die intramuskuläre Impfung einen besseren Schutz während längerer Dauer ergibt als die intranasale Impfung. Bei der intranasalen Impfung verlangt die übliche Praxis eine jährliche Wiederimpfung, während nur eine gelegentliche Wiederimpfung bei den intramuskulären Impfstoffen empfohlen wird. Es wurden weiterhin inaktivierte IBR-Impfstoffe entwickelt, aber hinsichtlich ihrer Wirksamkeit gibt es Widersprüchlichkeiten. Die jährliche Wiederimpfung wird empfohlen. Weitere Nachteile des inaktivierten Impfstoffes sind die Gefahr einer tödlichen Hyperempfindlichkeitsreaktion (Anaphylaxe) und die nicht tödliche Urticaria.

In der Vergangenheit wurden keine Subeinheits-IBR-Impfstoffe beschrieben. Es wurde jedoch ein Subeinheits-Versuch bei der Herstellung einiger anderer Virusimpfstoffe geprüft; vergl. Rubin et al., Progr. Med.Virol., 21, 144-157 (1975).

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Cappel berichtet über Versuche mit einem Subeinheits-Impfstoff von Herpes simplex-Virus bei Kaninchen; vergl. Arch. Virol. 52, 29-35 (1976). Es wurde gefunden, daß der Subeinheits-Impfstoff so wirksam ist, wie die Immunisierung mit lebenden oder UV-inaktivierten Herpes simplex-Viren. Ähnlich berichten Cox et al. Über Versuche mit einem Subeinheits-Impfstoff für Menschenbabies; vergl. Infect, and Immun., 16, 753-754 (1977). Sowohl Cappel als auch Cox et al. arbeiten mit Extrakten von nichtionischen Detergentien der Viren, da es bekannt ist, daß nichtionische Detergentien Umhüllungsglokoproteine der Viren solubilisieren können; vergl. Helenius et al., Solubilization of Membranes by Detergents, Bioehem. et Birphys.Acta, 415, 29-79 (1975). Sokal gibt jedoch als allgemeine Regel ah, daß Subeinheits-Impfstoffe,die lösliche Antigene enthalten, eine spezifische Immunogenizität oder eine φezifische Schutzwirkung ergeben, die wesentlich geringer ist als die der Virionvakzine; vergl. Sokal,Vaccines of the Future: Immunogenicity of Viral Components, Kapitel 9, Seiten 129-135» in Viruses and Immunity, Koproski, 1975, Academic Press, Inc..

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß Mittel gefunden wurden, mit denen man IBR-Impfstoffe herstellen kann, die ein wesentlich höheres Antikörper-Ansprechen zeigen als irgendwelche im Handel erhältliche oder neu erforschten IBR-Impfstoffe. Die erfindungsgemäß hergestellten Impfstoffe können ein höheres Antikörper-Ansprechen ergeben als das, das man bei Rindvieh feststellt, welches von natürlichen IBR-Infektionen genesen ist.

Die erfindungsgemäßen Impfstoffe werden aus virulentem IBRV, wie aus Feldisolaten von IBRV, oder im wesentlichen nichtabgeschwächtem IBRV hergestellt. Das IBR-Virus vermehr sich in seiner natürlichen oder virulenten Form in einem Zellmediumgemisch, das die Vermehrung des Virus aktiviert. Nach

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der Vermehrung werden die infizierten Zellen von dem Gemisch abgetrennt und mit einer wäßrigen Lösung aus einem nichtionischen Detergens extrahiert. Man erhält eine wäßrige Lösung aus dem antigenen Protein. Der nichtsolubilisierte Rückstand wird von der überstehenden Lösung abgetrennt, die dann als antigener Bestandteil des Impfstoffs verwendet wird. Das lösliche Antigen in wäßriger Lösung wird bevorzugt mit einem geeigneten Adjuvans vermischt, wobei man einen parenteralen Impfstoff in injizierbarer Dosisform erhält. Ölartige Adjuvantien sind bevorzugt, wie Freund«s unvollständiges Adjuvans.

Bei einem wirksamen Dosisgehalt zusammen mit einem geeigneten Adjuvans kann ein Antikörper-Ansprechen erhalten werden, das gegenüber der Krankheit Immunität verleiht und das ebenfalls die Entwicklung von IBR-Infektionen verhindert. Dies wird durch die Tatsache angezeigt, daß geimpfte Tiere, wenn sie mit lebenden, virulenten IBRV in Berührung kommen, das Virus nicht aufnehmen bzw. verbreiten. Diese Tatsache ist sehr unerwartet, da eine Virusverbreitung immer festgestellt wird, wenn Kälber, die mit einem vorhandenen Impfstoff geimpft werden, gefordert bzw. härteren Bedingungen ausgesetzt werden, und es gibt keine bekannten Literaturstellen, die nahelegen, daß die Verhinderung der IBR-Virusausbreitung durch Impfung ermöglicht wird. Das geimpfte Rindvieh entwickelt keine Läsionen oder klinische Zeichen von IBR-Krankheit.

Die erfindungsgemäßen Impfstoffe können bei trächtigen Tieren, bei säugenden Kälbern und bei Kälbern mit mütterlichen Antikörpern verwendet werden. Die Impfstoffe sind frei an aktivem IBR-Virus und verursachen daher keine Infektion oder Übertragung von IBRV. Da die Impfstoffe eine begrenzte antigene Zusammensetzung aufweisen, können serologische Tests entwickelt werden, um Vakzinate von infizierten Tie-

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ren zu unterscheiden. Dies ist mit derzeit erhältlichen IBR-Impf stoff en nicht möglich. Insbesondere kann der erfindungsgemäße Impfstoff bei einem lokalen oder nationalen Ausrottungsprogramm verwendet werden, da die Kontrolle der Virusausrottung wesentlich ist für die Kontrolle der Virusübertragung. Die derzeit verfügbaren IBR-Impf stoffe verhindern die Ausrottung der Viren oder das Auftreten latenter Infektionen nicht.

Bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung kann irgendein virulenter Stamm von infektiösem Rinderrhinotracheitis-Virus (IBRV) verwendet werden. Beispielsweise kann der Cooper-Stamm verwendet werden, der als IBR-angreifendes Virus von Veterinary Services Laboratory, U.S.D.Α., Ames, Iowa, erhältlich ist. Virulente IBRV-Stämme können von anderen Quellen, wie der American Type Culture Collection, erhalten werden. Beispielsweise ist ATCC Nr. VR-188 geeignet. Alternativ können Feldisolate von IBRV infizierten Rindern gesammelt werden, wobei sichergestellt ist, daß solche Isolate vollständig virulent sind. Solche virulenten Stämme können jedoch einer Zahl von in vitro-Zelldurchgängen unterworfen werden, während sie ihre Virulenz beibehalten, was durch die Fähigkeit angezeigt wird, Rindvieh zu infizieren und klinische Anzeichen von IBR, z.B. durch eine durchschnittliche Körpertemperaturerhöhung von über 39,6⁰C (103,5⁰F) zu ergeben.

Virulente IBRV vermehren sich durch Zellkultur. Vorzugsweise werden Rinderzellen verwendet, die IBR-Virus zu einem höheren Titer vermehren können, wie Rinderlungenzellen, Nierenzellen, Testikelzellen usw.. Ausgewählte Linien von Rinderzellen, die für die in vitro-Kultur geeignet sind, können verwendet werden, obgleich auch gute Ergebnisse mit frisch gesammelten Zellen erhalten werden. Für die Zwecke der Virusvermehrung werden die Zellen mit einem geeigneten Nährmedium vereinigt, das das Wachstum der Viren zu einem

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höheren Titer aktiviert. Beispielsweise kann das Grundmedium Eagle's minimum essential medium (MEM) enthalten. Zur Aktivierung der viralen Vervielfältigung ist die Einarbeitung eines fötalen Kalbseruras (FCS) bevorzugt. Beispielsweise kann man 10% FCS für das Zellwachstum verwenden. Man kann auch einen 5% FCS-Gehalt für die Erhaltung der Zellen nach der Infektion verwenden, während sich das Virus vervielfältigt. Innerhalb von 24 Stunden nach der Inokulation mit dem IBRV werden die Zellen abgetötet und die Vermehrung des Virus ist beendigt. Das gewünschte virale Umhüllungsprotein ist mit den Zellmembranen assoziiert, wo es gesammelt wurde, bevor es in IBR virale Teilchen überführt wurde.

Nach Beendigung der Vermehrung werden die Zellen bevorzugt von den flüssigen Medien abgetrennt. Bei einem Verfahren kann dies durch Zentrifugieren erfolgen. Beispielsweise werden die Zellen aus dem Zellkulturmedium heraus isoliert, indem man 60 min bei 100 000 χ g zentrifugiert. Die abgetrennten Zellen werden dann mit einem nichtionischen Detergens extrahiert, das das virale Umhüllungsprotein, das an der Membran assoziiert ist, solubulisiert und das IBR-Virus inaktiviert. Die Zellpellets können dann in Wasser, das das nichtionische Detergens für die Solubilisierung enthält, erneut suspendiert werden. Es können Detergenskonzentrationen von 0,5 bis 5% verwendet werden. Die nichtionischen Detergentien, von denen gefunden wurde, daß sie für die Solubilisierung eines viralen UmhüTlungsglykoproteins geeignet sind, sind bevorzugt. Beispielsweise kann Triton X-100 (Octylphenoxy-polyäthoxyäthanol) verwendet werden. Dieses nichtionische Detergens wird von Rohm & Haas Co., Philadelphia, Pennsylvania, hergestellt und und ist im Handel von Sigma Chemical Co., St.Louis, Missouri, erhältlich. Nonidet P 40 ist ein anderes nichtionisches Detergens, das in der Literatur als geeignet für die selektive Auflösung viraler Umhüllungsproteine beschrieben wurde. Nonidet P 40

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wird, von BDH Chemicals Ltd., Poole, England, hergestellt und in den V.St.A. von Gallard-Schlesinger Chemical Mfg. Corp., Carle Place, New York, vertrieben. Solche nichtionischen Detergentien solübilisieren virale Umhüllungsproteine, ohne daß sie die Proteine beachtlich denaturieren.

Die Behandlung der wäßrigen Detergenslösung mit den zellularen Membranen kann durch mechanische Zerbrechung oder Dispersion der Zellen aktiviert werden. Beispielsweise können die resuspendierten Zellen durch eine Homogenisierungsvorrichtung geleitet werden. Sie können auch einer Beschallung unterworfen werden, wodurch die Behandlung der zellularen Membran und des IBR-Virus mit dem nichtionischen Detergens begünstigt wird. Von dem gewünschten viralen Umhüllungsprotein wird aus den IBR viralen Teilchen selbst nur sei"-·· wenig erhalten, aber eine vollständige Inaktivierung des IBR-Virus ist wünschenswert. Es ist bevorzugt, die Behandlung bei einem neutralen oder etwas alkalischen pH-Wert, wie einem pH-Wert im Bereich von 6,0 bis 9,0, durchzuführen. Ein geeigneter Puffer kann in der wäßrigen Lösung enthalten sein, um den gewünschten pH-Wert aufrechtzuerhalten. Das für die Extraktion verwendete Wasser ist bevorzugt steriles, entionisiertes Wasser. Die Extraktion kann in 1 bis 2 Stunden beendigt sein. Beispielsweise kann mit einer Homogenisierung und/oder Beschallung und einem fortgesetzten Rühren der Zellsuspension in dem wäßrigen Detergens die Extraktion in einer Stunde beendigt sein* Bevorzugt wird die Suspension bei einer Temperatur unter 10°C während der Extraktion gehalten, wie bei einer Temperatur von etwa 4°C. Nach Beendigung der Extraktion wird der Rückstand aus festem Material von der Überstehenden Lösung aus solubilisiertem Protein abgetrennt. Beispielsweise kann die Abtrennung durch Zentrifugieren erfolgen. Die Zelldebris kann durch Zentrifugieren bei 100 000 χ g während 60 min pelletisiert werden.

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Der Extrakt aus subviralem Protein, der so erhalten wird, kann direkt zur Herstellung der Impfstoffe verwendet werden. Es ist jedoch bevorzugt, daß er, wenn er eine ausreichende Konzentration an Protein enthält, mit einem Adjuvans vermischt wird, so daß eine injizierbare Dosisform von Impfstoff erhalten wird. Die pro Dosis verwendete Menge sollte wirksam sein, um die IBR-Krankheit zu verhindern, entweder durch eine einzige Injektion oder durch zwei aufeinanderfolgende Injektionen. Beispielswelse kann der Extrakt 3 bis 6 mg extrahierte Proteinfeststoffe/ml enthalten. Die injizierbare Dosisform des Impfstoffs kann hergestellt werden, indem man gleiche Teile eines geeigneten Adjuvans und des subviralen Proteinextrakts, wie erhalten (ohne Konzentrierung) , vermischt. Obgleich der Impfstoff (Proteinextrakt mit Adjuvans) 0,5 bis 10 mg/ml Gesamtprotein (Feststoffbasis) enthalten kann, wird er normalerweise eine Menge im Bereich von 1 bis 6 mg/ml extrahiertes Protein enthalten. Beispielsweise wird, wenn die Dosis des Impfstoffs 2 ml betragen soll, die Gesamtdosis dann 2 bis 12 mg Gesamtprotein sein, wie eine Gesamtdasis von 2 bis 8 mg.

Gegebenenfalls kann das antigene Protein konzentriert oder vor der Herstellung des Impfstoffs gewonnen werden, wie durch Aussalzen oder Ultrafiltration. Wenn das antigene Protein in fester Form gewonnen wird, wird es bevorzugt in Wasser in der gewünschten Konzentration für die Einarbeitung in den Impfstoff erneut suspendiert« Wie zuvor angegeben, wird die Lösung aus viralem UmhUllungsprotein dann mit einem geeigneten Adjuvans vermischt. Da das Antigen in Lösung ist, ist es bevorzugt, die wäßrige Lösung mit einem Adjuvans des Öltyps zu vermischen. Beispielsweise kann man Freund's Unvollständiges Adjuvans verwenden. Dieses Adjuvans kann aus einer technischen Quelle, wie von Difco Laboratories, Detroit, Michigan, bezogen werden, oder es kann hergestellt werden, indem man Mannit-monooleat mit

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Paraffinöl in Volumenanteilen von 1,5:8,5 vermischt. Der entstehende Impfstoff ist eine Wasser-in-Öl-Emulsion, wobei das Antigen in dispergierter Wasserphase vorliegt. Obgleich die Verhältnisse von Adjuvans zu Proteinextrakt stark variieren können, sind etwa gleiche Verhältnisse bevorzugt.

Die erfindungsgemäßen Impfstoffe sind besonders für Vieh, insbesondere Rindvieh, geeignet, und sie können Kälbern und trächtigen Kühen verabreicht werden. Die Impfstoffe können ebenfalls mit anderen Rinderspecies, wie Ochsen oder Wasserbüffel, verwendet werden. Das Volumen der indizierbaren Dosis kann variieren, wie ein Volumen von 1 bis 4 ml. Eine 2 ml Dosis ist jedoch geeignet. Bei der Verabreichung des Impfstoffs kann man eine einzige Injektion verabreichen, es ist jedoch bevorzugt, zwei aufeinanderfolgende Injektionen pro Tier zu verabreichen. Beispielsweise kann man eine 2 ml Dosis, die 4 bis 8 mg Gesamtprotein enthält, zweimal in Intervallen von 30 Tagen verabreichen. Die Krankheit wird verhindert und die übertragung des IBR-Virus durch Virusverbreitung wird ebenfalls verhindert. Dadurch wird die IBR-Infektion wirksam kontrolliert.

Bei der Entwicklung und der Prüfung der erfindungsgemäß hergestellten Impfstoffe werden die folgenden Materialien und Verfahren verwendet.

Virus - der virulente Cooper-Stamm vpn IBRV wird beim 8. Durchgangswert von der National Veterinary Services Laboratory, Ames, Iowa, erhalten. Der Cooper-Stamm wird zweckdienlicherweise als angreifender Stamm verwendet. Er wird zweimal in Rinderlungenzellen (BLU) durchgeführt und ein Vorratspool bzw. eine Stocklösung, die 1,0 χ 10 plättchenbildende Einheiten (PFU)/ml enthält, wird bei -70⁰C gefroren.

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Zellkulturverfahren - Die bei der vorliegenden Untersuchung verwendeten Zellkulturen werden in Eagle's minimum essential medium (MEM) (Eagle's minimalem wesentlichem Medium), ergänzt mit 10% bestrahltem, fötalem Kälberserum (FCS) (in der Wärme 30 min bei 56°C inaktiviert), 0,5% Lactalbuminhydrolysat und Antibiotika (100 IE Penicillin, 100/Ug Kanamycinsulfat und 100/Ug Streptomycinsulfat pro ml), gezüchtet« Das Medium wird mit 0,i6%igem Natriumbicarbonat und 8 mMol N-2-Hydroxyäthylpiperazin-N'-2-äthansulfonsäure (HEPES) gepuffert. Die Kulturen werden bei 37°C in einer 5%igen CO₂-AtmoSphäre inkubiert.

Virusisolierung - Nasale Sekretionen werden für die Virusisolierung gesammelt, indem man ein 15 cm mit Watte bf4ecktes Stäbchen in seiner vollen Länge in die linke ventrale Nasenmeatus einführt und das Stäbchen dreht, bis es gesättigt ist. Die Wattetupfer werden in 1,0 ml MEM, das die Antibiotika (200 IE Penicillin, 2QOyUg Kanamycinsulfat, 200/Ug Streptomycinsulfat und 15/Ug Amphoteracin B/ml) enthält, eingetaucht und 30 min bei 4°C gehalten. Die Wattetupfer werden dann aus dem Medium entnommen und das Medium wird bei -7O°C gefroren, bis es zum Kultivieren verwendet wird.

Die plättchenbildenden Einheiten des Virus in Proben werden bestimmt durch Inokulation doppelter Kulturen von BLU-Monoschichten mit Reihen zehnfacher Verdünnungen (in MEM) für 3ede Probe Die Inokula werden 60 min adsorbiert, die Monoschichten werden mit MEM gewaschen und mit 1% Agarose, die MEM, 5% FCS und Antibiotika enthält, bedeckt. Die Kulturen werden 72 h bei 37⁰C in einer 5%igen C0₂-Atmosphäre inkubiert. Die Kulturen werden mit 1Obigem gepuffertem Formalin fixiert. Die Agaroseschicht wird entfernt und der Zellfilm wird mit Kristallviolett angefärbt. Der Virustiter wird durch Zählen der PFU bestimmt.

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Plättchenreduktions-Neutralisationstests - Anti-IBR-Serum-Neutralisationstiter werden durch Plättchenreduktions-Neutralisationstests bestimmt. Zweifache Serumverdünnungen von in der Wärme inaktiviertem Serum (30 min bei 56°C) werden mit gleichen Volumen MEM, das 1000 PFU IBRV/ml enthält, vermischt und 60 min bei 37⁰C inkubiert. Monoschichten von BUJ-Zellen in 35 mm 6-Löcher-Kunststoffgewebekulturplatten werden mit 0,2 ml Serum-Virus-Gemisch inokuliert. Nach der Adsorption des Serum-Virus-Gemisches während 60 min bei 37⁰C werden die Kulturen mit MEM gewaschen und mit · 1% Agarose, enthaltend MEM, FCS und Antibiotika, belegt. Die Kulturen werden 72 h bei 37⁰C inkubiert und dann mit 10% gepuffertem Formalin fixiert. Die Agaroseschicht wird entfernt und die Zellfilme werden mit Kristallviolett angefärbt. Der Serumneutralisationstiter ist der reziproke Wert der höchsten Serumverdünnung, die die Plättchenzählung um mindestens 50% reduziert.

Proteinbestimmun^ - Der Proteingehalt wird nach dem Verfahren von Lowry et al, J. Biol.Chem., 193, 265-275, (1951), mit Rinderserumalbumin als Standard analysiert. Der Proteingehalt der Proben, die nichtionisches Detergens enthalten, wird unter Verwendung eines modifizierten Lowry-Verfahrens, wie es in Anal.Bioehem., 86, 346-356 (1977), beschrieben wird, bestimmt.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Impfstoffe und die bei der Untersuchung der Impfstoffe erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Beispielen erläutert.

Beispiel 1 Herstellung der Impfstoffe

Rinderlungenzellen (BLU) werden in 490 cm Zylinderflaschen vermehrt, bis sich Monoschichten ausbilden. Die Monoschichten werden infiziert, indem man das Medium entfernt und

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und 5 ml Stock-IBRV, hergestellt, wie oben beschrieben, zugibt. Nach 60 min Adsorption wird das Inokulum entfernt, die Monoschicht wird mit MEM gewaschen und 30 ml Erhaltungsmedium (MEM, enthaltend 5% FCS) werden zugegeben. Die Zellen werden bei 37°C unter Drehen (1 U/min) inkubiert, bis eine cytopathische Wirkung (CPE) vollständig ist (ungefähr 24 h). Die infizierten BÜJ-Zellen werden von der Oberfläche der Zylinderflasche mit einem Kautschukspatel abgekratzt. Das Zellen-Medium-Gemisch wird 1 h bei 100 000 χ g zentrifugiert. Die entstehenden Pellets werden unter Verwendung einer Modifizierung des Verfahrens von Vestergaard et al, J. Virol., 24, 87-90(1977), solubilisiert. Die Pellets werden in 0,010 Mol Glycin-0,038 Mol Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) (pH = 9,o), enthaltend 0,5$ Triton X-100 (1 ml/Zylinderflasche), suspendiert. Das Gemisch wird mit einer Homogenisierungsvorrichtung homogenisiert und mit zwei 20 sec-Zyklen mit einer Beschallungsvorrichtung in einer Einstellung von 90%Wirksamkeit beschallt. Das Gemisch kann 1 h bei 4°C reagieren, wobei konstant mit einem magnetischen Rührer gemischt wird. Das Gemisch wird 1 h bei 100 000 χ g zentrifugiert und das überstehende Material wird als Impfstoff geerntet. Der Impfstoff wird bei -70⁰C bis zur Verwendung gelagert. Der Impfstoff wird mit einem gleichen Volumen Freund¹S Vollständigem oder Freund¹S Unvollständigem Adjuvans vermischt und mit 200 Schlägen in einer Adjuvans-Mischvorrichtung emulgiert. Ein zweiter Untereinheits-Impfstoff wird unter Verwendung einer Modifizierung des obigen Verfahrens hergestellt. Die Extraktionslösung ist 2,5% Nonidet P-40 (NP-40) in destilliertem Wasser, hergestellt wie von Martin et al. in Infect. Immun., 5» 248 bis 254 (1972), beschrieben.

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Beispiel 2

Bestimmung der Antigenizität des Impfstoffs

Triton X-1OO solubilisierter IBR-Subeinheits-Impfstoff und Zellkontrollpräparationen werden 10 IBR sero-negativen Rindern in zwei intramuskulären Dosen in Intervallen von 20 Tagen, wie in Tabelle A angegeben, verabreicht. Die Tiere werden täglich während der Untersuchung für klinische Anzeichen der Krankheit beobachtet. Die rektalen Temperaturen werden 3 Tage vor der Impfung und 10 Tage nach der Impfung aufgezeichnet. Nasale Sekretionen werden für die Virusisolierung vor der Impfung und an den Tagen 2, und 7 nach der Impfung isoliert. Die Serumproben werden in wöchentlichen Intervallen isoliert.

Versuch 1

Bestimmung der Subeinheitsimpfstoff-Antigenizität

Während der Untersuchung sind alle 10 Tiere bei diesem Versuch klinisch normal. Die rektalen Temperaturen nach der Impfung liegen innerhalb von +1⁰C der Temperaturen, die vor der Impfung aufgezeichnet wurden. Aus den Nasalsekretionen wurden vor oder nach der Impfung keine Viren isoliert. Die Serumneutralisationstiter sind in Tabelle B aufgeführt.

Tabelle A

Impfungsschema für die Bestimmung der Antigenizität von Triton X-100.solubilisiertem IBR-Subeinheitsimpfstoff

Kalb Nr. Impfstoff Dosis(ml)/ Impfung(2)

1 Zellenvergleich ohne Ad^uvans ι

2 Zellenvergleich mit Adjuvans 2

3 IBR-Subeinheit ohne Adjuvans 1

4 ^w 1

5 ^M 2

6 ·· _m 2

7 IBR-Subeinheit mit Adöuvans^u; 2

8 " 2

9 ·· 4

10 » 4,

(1) Freund¹s Vollständiges Adjuvansj (2) 1 ml ohne Adjuvans und 3e 2 ml mit Adjuvans, enthaltend 4,4 mg extrahiertes Protein.

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Tabelle B

Serumneutralisationstiter nach der intramuskulären Verabreichung von Triton X-100 solubilisiertem IBR-Subeinheitsimpfstoff

Kalb	Impfstoff	(ml)	)	T"	Serumneutralisationstiter^ '	7
Nr.				Wochen nach der Impfung (3)
		2 3 4 5b

1	Zellenvergleich ohne Adjuvans	1	<2	<2	<2	<2	<2	<2	<2
2	11 mit Adjuvans	2	<2	<2	<2	< 2	< 2	<2	<2
3	IBR-Subeinheit ohne Adjuvans	1	<2	<2	«^2	< 2	< 2	^2	<2
4	Il	1	<2	<2	^2	< 2	^ 2	<2	< 2
VJl	Il	2	<2	8	4	8	2	2	2
6	Il	2	<2	4	4	8	8	8	4
7	IBR-Subeinheit mit Adjuvanst2i	2	<2	4	8	128	128	128	128
8	Il	2	^2	8	16	1024	512	512	512
9	Il	4	<2	64	128	512	512	512	512
10	Il	4	LZ	64	64	1024	1024	512	512

(1) Der Titer ist als reziproker Wert der höchsten Serumverdünnung, die die Plättchenzählung um mindestens 50% reduziert, angegeben

[2) Freund^fs Vollständiges Adjuvans

3) die zweite Impfstoff^Dosis wird nach 3 Wochen verabreicht
4 vergl. Tabelle A

Beispiel 5 Bestimmung des Immunschutzes

20 IBR-seronegative Kälber (3 bis 6 Monate alt) werden beliebig in fünf Gruppen (jeweils 4 in einer Gruppe) geteilt und in getrennten, verschlossenen, isolierten Räumen während der Untersuchung gehalten. Die Kälbergruppen werden mit 1 bis 5 bezeichnet und intramuskulär,- wie in Tabelle C erläutert, geimpft. 30 Tage nach der Impfung verabreicht man den Kälbern ein Standard-Angriffsvirus-Inokulum (1 χ 10 PFU Cooper Stamm IBR, 10. Durchgang). Eine mit Gas angetriebene Atomisiervorrichtung wird verwendet, um in jedes Nasenloch 2 ml Inokulum abzugeben*

Die Kälber werden täglich auf klinische Anzeichen der Krankheit 7 Tage vor der Impfung bis zum Ende der Untersuchung geprüft. Die rektalen Temperaturen werden 3 Tage vor der Impfung, während 10 Tagen folgend auf jede Impfung, und während 14 Tagen nach dem Angriff aufgezeichnet. Die nasalen Sekretionen werden für die Virusisolierung dreimal vor der Impfung und täglich während 7 Tagen nach der Anfangsimpfung jeder Gruppe gesammelt. Nach dem Angriff werden die Nasalsekretionen bei den folgenden Zeiten gesammelt: 5 min nach dem Angriff; 15 min Intervalle während 1 h nach dem Angriff; stündliche Intervalle während 15 h nach dem Angriff? 18, 20, 22 und 24 h nach dem Angriff; und in 24 h-Intervallen während 14 Tagen nach dem Angriff. Die Serumproben werden dreimal vor der Impfung und in wöchentlichen Intervallen nach der Impfung gesammelt.

Nach der Impfung zeigen 4 von vier Kontrollkälbern und 5 von zwölf geimpften Kälbern gehärtete Schwellungen an den Stellen der Impfstoffinokulation und ein fieberartiges Ansprechen (40 bis 41,1⁰C), das 1 bis 3 Tage andauert. Eine tiefe intramuskuläre Inokulation und ein Vermeiden eines "Impfloches" verhindert die Reaktion bei der zweiten Impfung.

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In Tabelle D sind die Serumneutralisationstiter nach der Impfung land nach dem Angriff dargestellt.

Nach einem intranasalen Angriff mit IBRV sind alle Kälber in den Gruppen 2, 3, 4 und 5 klinisch normal mit Ausnahme der Kälber 5i 10 und 11, die eine milde Infektion des Atemtraktes entwickeln. Klinische Anzeichen der Krankheit umfassen erhöhte Temperatur, intranasale Herpes-Bläschen und fibrino-necrotisches nasales Exsudat. Der klinische Verlauf Der klinische Verlauf der Krankheit, der bei den Kälbern 10 und 11 beobachtet wird, zeichnet sich durch erhöhte Temperatur aus, die über die Resolution der intranasalen Läsionen und nasalen Exsudate anhielt. Die Temperatur kehrt auf die Grundlinienwerte 24 h nach Beginn der Antibiotika-Therapie, 9 Tage nach dem Angriff, zurück. Das Kalb 20 stirbt am 38. Tag nach der Impfung wegen Ursachen, die mit dem Versuch nichts zu tun haben. Eine Obduktion zeigt keine Anzeichen der Krankheit oder irgendeine Läsion an der Impfstelle. Das Aussetzen eines Angriffs der Kontrollkälber ergibt eine ernste Erkrankung der Atemwege, die sich durch erhöhte Temperatur (bis zu 41,7⁰C) und die Bildung ausgedehnter fibrino-necrotischer Plättchen an der Nasenschleimhaut auszeichnet.

Aus den Nasalsekretionen wird vor oder nach der Impfung kein Virus isoliert. Bei den Gruppen 2 und 3 wird das Angriffs - Inokulumvirus 5 und 15 min nach dem Angriff isoliert; es konnte jedoch aus den Nasalsekretionen der Kälber 30 min nach dem Angriff nicht mehr isoliert werden. Das Angriffs-Inokulumvirus konnte aus Nasalsekretionen von Kälbern in den Gruppen 4 und 5 5 min nach dem Angriff des Inokulums nicht mehr isoliert werden. Nach der anfänglichen Clearance des Angriffs-Virusinokulums konnte das Virus aus den Nasalsekretionen 18 h nach dem Angriff bei den' Gruppen 2 und 3 und 22 h bei den Gruppen 4 und 5 iso-

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liert werden. In Tabelle E sind Einzelheiten bei der Ausbreitung des Virus in Nasalsekretionen für die Tage 1 bis 14 nach dem Angriff aufgeführt. Das Virus wird aus den Kälbern 13, 14, 17, 18 oder 19 nach Beginn des intranasalen Angriffs nicht isoliert.

Tabelle C

Impfungsschema für die Bestimmung der Wirksamkeit von Triton X-100 und NP-40 solubilisierten IBR-subviralen Impfstoffen

Impfstoff Impfstoff-

dosis (1)

Triton X-100 solubilisier- 1 ter Zellenvergleich

Triton X-100 IBR-Subeinheit 1

NP-40 IBR-Subeinheit 1

Triton X-100 IBR-Subeinheit 2

NP-40 IBR-Subeinheit 2

(1) Jede Dosis enthält 1 ml Zeilextrakt und 1 ml Freund*s Unvollständiges Adjuvans; jeweils 1 ml des Triton X-100-Extraktes enthält 3»5 mg Protein und bei dem NP-40-Extrakt enthält jeweils 1 ml 5,8 mg Protein. Die zweite Impf dosis wird nach 30 Tagen verabreicht.

Gruppe	Kalb	bis	Nr.
Nr.		bis
1	1	bis	4
2	5	bis	8
3	9	bis	12
4	13	16
5	17	20

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Tabelle D Serumneutralisationstiter nach der intramuskulären .Verabreichung"von Triton X-100 und

	Gruppe/	1	NP-40 solubulisiertem IBR-subviralem Impfstoff	Ö	Serumneutralisationstiter'	Wochen	nach	der Impfung	5	b	7	256	512	8	-	512	Wochen nach	d.Angriff	512	ο
	Tier Nr		Subeinheits-			2	3					1024	1024			1024	(3)		512	ro
			Impfstoff	<2	V							256	128			128	1	2	256	σ>
	Gruppe			<2		<2	< 2	< 2				128	128			128			128	ο
	1		Vergleich	< 2	<2	<2	4. 2	< 2									<2	16
	2	2		<2	< 2	<2	<2	<2				512	512			512	<2	32	512
	3				^ 2	<2	<2	<2				256	256			256	<2	16	512
	4			<2L	<2							256	256			128	<2	32	256
	Gruppe			<2		16	16	32			- nicht anwendbar	(2)						256
	5		Triton X-100	<2	<2	8	16	16							128	512
	6	3	1 Dosis		2	8	16	16						256	512
	7				<2	4	16	32					32	512
ω	8			<2	2								128	512
O	Gruppe			<2		64	32	64
	9		NP-40	<2	2	32	32	64				128	256
σ>	10	4	1 Dosis	<2	<2	64	32	64				128	512 ,
σ>	11				2	64	32	64			256	512
^*	12			<2	4				256		256	1024 !S
ο	Gruppe			<2		16	64	32	1024			I
ca	13		Triton X-100	<2	2	16	32	64	256		512
ω	14	5	2 Dosen	<2	2	8	8	8	128		512
	15				2	8	16	16		64
	16			<2	2				256	128
	Gruppe			<2		8	32	32	256
	17		NP-40	<2	2	8	64	64	256	256
	18		2 Dosen	< 2	2	32	32	64	128	256
	19				<2	16	16	16		128
	20				2					128

Tabelle E Virusisollerung nach dem intranasalen Angriff von Kälbern, die mit Triton X-100 und NP-40 solubilisiertem IBR subviralem Impfstoff geimpft worden sind

Gruppe/ Tier Nr.

Subeinheitsimpf stoff

Virustiter *■' 2 3 4

Tage nach dem Angriff

7 8 9 10 11 12 15 14

Gruppe 1 Vergleich

4 Gruppe 2 Triton X-100 5 1 Dosis

Gruppe 3 NP-40 91 Dosis

Gruppe 4 Triton X-100 13 2 Dosen

Gruppe 5 NP-40 17 2 Dosen 18

3,8	5,3	7,4	7,0	6,7	5,8	5,5	3,2	2,5
2,3	5,0	5,7	7,2	7,3	6,0	6,2	6,0	3,0
3,0	4,8	6,8	7,0	6,8	6,3	5,9	4,0
3,7	5,7	7,7	7,3	7,0	6,0	5,5	3,4	3,0
«.	..	3,0	5,0	5,8	- ,7	5,9	„
-	3,0	3,7	5,5	6,0	5,3	5,0	-
-	2,3	2,3	4,2	6,7	5,6	5,8	4,0	-
-				2,9	1,8	1,5	mm	-
	1,0	4,6	4,8	5,0	3,2	4,3	2,5
—		1,3	1,7	4,0	3,0	4,7	4,0	1,8
-	1,0	3,4	4^7	5,2	4,5	4,5	1,6	-
1,0	3,5	5,8	6,0	6,0	4,5	2,7		-

1,5 1,9 1,2

2,3 1,6

2,9 2,6

3,7 4,6 5,6 4,8 1,5 -

3,0 2,9

Fußnoten zu Tabelle D

(1) Der Titer wird ausgedrückt als der reziproke Wert der höchsten Serumverdünnung, die die Plättchenzählung um mindestens 5O# verringert.

(2) Das Kalb starb am 58. Tag nach der Impfung.

(3) Intranasaler Angriff mit 1 χ 10 PFU Cooper-Stamm IBR-Virus, verabreicht 30 Tage nach der letzten Impfstoff dosis.

Fußnoten zu Tabelle E

(1) Virustiter als 1Og₁₀ plättchenbildende Einheiten/Nasal-Wattebausch .

(2) Wenn keine Werte angegeben sind, wurde kein Virus beobachtet.

Der Ausdruck "Verhinderung der IBR-Krankheit" bedeutet, daß der Impfstoff die Rinder gegenüber der Entwicklung klinischer Anzeichen der Krankheit schützt, wenn sie mit virulentem IBR-Virus angegriffen werden. Bei Vieh, insbesondere bei Rindvieh, ist das hauptsächliche klinische Anzeichen der Krankheit eine Temperaturerhöhung auf 39,7°C (1O3,5°F) oder höher während 2 oder mehrerer Tage. Geimpftes Vieh nach dem Angriff kann, obgleich es keine klinischen Anzeichen der Krankheit zeigt, virulentes IBR-Virus beherbergen, wodurch eine Infektion auf andere, nichtgeimpfte Rinder übertragen werden kann. Wenn daher in der vorliegenden Anmeldung von "Verhinderung oder Prophylaxe der IBR-Infektion" gesprochen wird, bedeutet dies, daß der Impfstoff ebenfalls eine Verbreitung des Virus verhindert wie auch gleichzeitig die Krankheit verhindert. Dieses Ergebnis ist neu und überraschend.

Ende der Beschreibung.

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Claims (10)

Patentansprüche

1. Parenteraler Impfstoff in injizierbarer Dosisform für die Prophylaxe bei Rindern von infektiöser Rinderrhinotracheitis (IBR), dadurch gekennzeichnet, daß er ein IBR virales Umhüllungsprotein in einer Menge, die wirksam ist, die IBR Krankheit zu verhindern, enthält, wobei das virale Umhüllungsprotein durch Vermehrung virulenter IBR-Viren in einem Zell-Mediumgemiseh,das die Vermehrung des Virus aktiviert, Abtrennung der infizierten Zellen aus dem Gemisch, Behandlung der zellularen Membran der abgetrennten Zellen mit einer wäßrigen Lösung eines nichtionischen Detergens unter Bildung einer wäßrigen Lösung des viralen Umhüllungsproteins und Abtrennung der wäßrigen Lösung von dem nichtsolübilisierten Rückstand erhalten worden ist.

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2. Parenteraler Impfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die injizierbare Dosis ein Adjuvans für die Aktivierung des immunogenen Ansprechens der Rinder auf das virale Umhüllungsprotein enthält.

3. Parenteraler Impfstoff in injizierbarer Dosisform für die Immunisierung von Vieh, insbesondere Rindvieh, gegen infektiöse Rinderrhinotracheitis (IBR) und für die Verhinderung einer Übertragung von IBR infektiösem Virus, dadurch gekennzeichnet, daß er eine wäßrige Lösung aus einem viralen IBR-Umhüllungsprotein im Gemisch mit einem mit Wasser unmischbaren öladjuvans enthält, wobei die Impfstoff dosis eine wirksame Menge an viraler Umhüllung für die IBR-Immunisierung und Prophylaxe der IBR-Virusausbreitung umfaßt:und aufeinanderfolgend in zwei Dosisformen pro Tier verabreicht wird, wobei das virale Umhül-lungsr ·._ protein erhalten worden ist durch Vermehrung virulenter IBR-Viren in einem Zellmedium, das die Vermehrung des Virus aktiviert, Abtrennung der infizierten Zellen aus dem Gemisch, Behandlung der zellularen Membranen aus abgetrennten Zellen mit. einer wäßrigen Lösung von nichtionischem Detergens unter Bildung einer wäßrigen Lösung aus viralem Umhüllungsprotein und Abtrennung der wäßrigen Lösung von dem nichtsolubilisierten Rückstand.

4. Parenteraler Impfstoff nach Anspruch 3t dadurch gekennzeichnet, daß die abgetrennte, wäßrige Lösung von Untereinheitsprotein im Impfstoff ohne Konzentrierung des Proteins darin verwendet wird.

5. Parenteraler Impfstoff nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß jede der Dosisformen ein Volumen von im wesentlichen 2 ml aufweist und daß jede Dosis 4 bis 8 mg Gesamtprotein enthält.

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6. Parenteraler Impfstoff nach Anspruch 3> A oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß er frei von aktivem IBR-Virus ist.

7. Verfahren zur Verhinderung von Infektionen von Vieh, insbesondere Rindvieh, durch infektiöses Rinderrhinotracheitis-Virus (IBR-Virus) und Übertragung des IBR-Virus durch Virusverbreitung, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens zwei aufeinanderfolgende Dosen des Impfstoffs verabreicht, der eine Menge an viralem IBR-Umhüllungsprotein enthält, die die Krankheit wirksam verhindert, wobei das virale Umhüllungsprotein erhalten worden ist durch Vermehrung virulenter IBR-Viren in einem Zellmediumgemisch, das die Vermehrung des Virus aktiviert, Abtrennung der infizierten Zellen aus dem Gemisch, Behandlung der zellularen Membranen der abgetrennten Zellen mit einer wäßrigen Lösung eines nichtionischen Detergens unter Bildung einer wäßrigen Lösung aus viralem Umhüllungsprotein und Abtrennung der wäßrigen Lösung von dem nichtsolubilisierten Rückstand.

8. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, daß der Impfstoff ein Adjuvans für die Aktivierung des immunogenen Ansprechens enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß jede der Dosen 4 bis 8 mg Gesamtprotein enthält.

10. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sich der Impfstoff weiter dadurch auszeichnet, daß er frei an aktivem IBR- Virus ist.

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