DE3021006C2

DE3021006C2 - Oberflächenaktives Material und dieses Material enthaltendes pharmazeutisches Mittel gegen Hyalin-Membran-Erkrankung

Info

Publication number: DE3021006C2
Application number: DE3021006A
Authority: DE
Inventors: Fujiwara Akita Tetsuro; Takei Kuki Saitama Tsunetomo; Tanaka Toda Saitama Yuji
Original assignee: Tokyo Tanabe Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Tokyo Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1979-06-02
Filing date: 1980-05-30
Publication date: 1983-03-17
Also published as: CA1161754A; AU5867880A; MX9203482A; US4338301A; JPS55160721A; GB2050832A; JPS619925B2; FR2457872A1; FR2457872B1; GB2050832B; AU520543B2; DE3021006A1

Description

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Methoden zur Behandlung von HMD einen gewissen weise je cm² Oberflächenbereich zugegeben worden ist, Effekt gezeigt haben, werden sie dennoch nicht als wobei die Oberflächenspannung 15-25°C geroessen

solche angesehen, die einen fundamentalen Effekt und unter Benutzung eines Acoma Wilhelmy-Oberflä-

ergeben. chenspannungsmessers und X-Y- -Schreibers, Modell

Andererseits enthalten pulmonare oberflächenaktive s F-3D (hergestellt von Acoma Igaku Kogyo Co, Ltd. Mittel, die von der Lunge von Säugetieren aber nicht und Riken Densbi Co, Ltd.) registriert wordennst

von Menschen extrahiert worden sind, unvermeidlich Die Fig.2 gibt das Infrarotabsorptionsspektrum des

eine erhebliche Menge von sogenannten fremden aktiven Materials der Erfindung wieder, gemessen in

Proteinen und sind im allgemeinen mit vielen Mikroor- einem KBr-Täfelchen mit einem Infrarotspektrophoto-

ganismen verunreinigt, so daß derartige oberfTächenak- io meter (Hitachi 295-ModeII).

tive Mittel zur klinischen Behandlung von menschlicher Die F i g. 3 erläutert das Ultraviolettabsorptionsspek-

HMD nicht verabreicht werden können. trum des aktiven Materials der Erfindung, geroessen m

Es ist im allgemeinen angenommen worden, daß die einer 0,1% igen (Gewicht/Volumen) Lösung des Matechemische Zusammensetzung der konventionellen pul- rials in einem Cyclohexan-Äthanol-Gemisch (Volumenmonaren oberflächenaktiven Mittel 10-20% Protein 15 verhältnis 1 :1) mit einem selbstschreibenden Spektro- und 80-90% Lipoid, bezogen auf das gesamte photometer (Hitachi 340-ModeII). oberflächenaktive Mittel entspricht, wobei das Lipoid Die Herstellung des oberflächenaktiven Materials aus etwa 10% neutralem Lipoid (z.B. Triglycerid, gemäß der Erfindung wird nachfolgend im einzelnen Cholesterin) und etwa 90% Phospholipoid, bezogen auf erläuten:

die besagte Substanz, besteht, wahrend der Phosphat)- 20 (a) Die uus einem normalen Säugetier herausgeschnit-

dylchoiingehalt bezogen auf das gesamte Phospholi- tene Lunge wird in faustgroße Stücke zerkleinert,

poid, 86% beträgt (In dieser Beschreiburg und den welche dann nach dem Entfernen der unerwünschten

Ansprüchen beziehen sich »%« und »Teil« auf das Blutgefäße Luftröhre, Fettmassen und des Bluts mit

trockne Material, falls es nicht anders angegeben ist) einer Fleischhackmaschine oder Homogenisiermaschi-

Das bei klinischen Behandlungen von HMD beim 25 ne fein zerhackt werden. Als Säugetier werden Menschen verwendbare Material ist im Rahmen der geeigr. verweise Rinder, Pferde, Schafe, Schweine, Erfindung untersucht worden, und es ist gefunden Hunde, Katzen oder Kaninchen verwendet Wenn die

worden, daß das oberflächenaktive Material, das aus zerhackte Lunge lyophilisiert wird, ist es möglich, sie

dem Lungengewebe von Säugetieren unter Anwendung aufzubewahren, ohne daß sie eine Qualitätsänderung

einer kombinierten Behandlung mit Aceton und 30 erleidet oder einer Fäulnis unterliegt

Behandlung mit einem Gemisch organischer Lösungs- (b) Eine Elektrolytlösung, wie z. B. eine physiologi-

mittel extrahiert worden war, und zwar nicht nach der sehe Kochsalzlösung, wird zu der zerhackten und wie

konventionellen Verfahren des Differenz-Zentrifugie- vorstehend zubereiteten Lunge gegeben, und das

rens, Dichtegradient-Zentrifugierens und der Dialyse, erhaltene Gemisch wird bei 0-10⁰C für 30-120 Minu-

und das eine neue chemische Zusammensetzung 35 ten gerührt Das Gemisch wird entweder unter Druck

aufwies, indem der Proteingehalt geringer und ein hoher filtriert oder bei einer geringen Geschwindigkeit von

Gehalt an Phosphatidylcholin mit zwei Resten von 500-1500 r.p.M. zentrifugiert, um einen Extrakt zu

gesättigter Fettsäure gegeben war, eine signifikante erhalten.

Verringerung der Oberflächenspannung beim Lungenal- (c) Der Extrakt wird dann bei hoher Geschwindigkeit

veolarraum beim Menschen zeigte, so daß ein klinischer 40 von 12 000—16 000 r.p.m. bei 0-10° C zentrifugiert so

Effekt bei HMD gegeben war, ohne daß der Patient daß ein »rohes Sediment« erhalten wird. In dem »rohen

unter fremden Proteinen zu leiden hatte. Sediment« verbliebene Fragmente von zerhackter

Dementsprechend wird gemäß der Erfindung ein Lunge können durch erneutes Suspendieren des »rohen

oberflächenaktives Material verwendet das aus dem Sediments« in einer Elektrolytlösung und anschließen-

Lungengewebe von Säugetieren extrahiert worden ist 45 des zentrifugieren der Suspension bei ".iner niedrigen

und eine derartige chemische Zusammensetzung besitzt Geschwindigkeit von 500 -1500 r.p.m. entfernt werden,

daß der Phospholipoidgehalt 75,0 - 953% der Gehalt an (d) Das erhaltene obige »rohe Sediment« wird in

neutralem Lipoid 1,8 -14,0%, der Gehalt an vollständi- Wasser suspendiert und die Dichte der Suspension wird

gem Cholesterin 0,0-3,0%, der Kohlenhydrat Kohlen- durch Lösen von Natriumchlorid in dieser Suspension

hydratgehalt 0,1-1,5% und der Proteingchalt so auf einen Wert von 1,07-UO eingestellt Die

O^ - 5,0%, jeweils auf das Trockengewicht des oberflä- eingestellte Suspenuon wird bei mittlerer Geschwindig·

chenaktiven Materials bezogen, beträgt keit von 4000-10 000 r.p.m. bei 0-10°C fCr

Die Fig.l gibt die Vergleichsdiagramme (oder 20-180 Minuten zentrifugiert ο daß sie in drei

sogenannte Hysteresiskurven) von Oberflächenspan- S'hicittn zerlegt wird, von denen die oberste

nung-Oberflächenbereich von bei diesem Test verwen- 55 emulgierte Schaumschicht (nachfolgend kurz »oberste

deter physiologischer Kochsalzlösung wieder, wobei Schicht« genannt; dann abgenommen wird. Die

der schraffierte (mit schrägen Strichen versehene) Teil Reinheit (der Gehalt an erwünschtem oberflächenaktiv

in dieser Figur den Bereich angibt in den die ven Material) der »obersten Schicht« kann durch

Hysteresiskurven fallen, wenn das aktive Material der erneutes Suspendieren der Schicht in einer 93- bis Erfindung tropfenweise zu der Oberfläche von physiolo- 60 26,0%igen (Gewicht/Volumen) wäßrigen Lösung von

gischer Kochsalzlösung in einer Menge von 03=0,8 μg Natriumchlorid und nachfolgendes Zentrifugieren der

je cm² Oberflächenbereich gegeben worden ist, die darin Suspension bei einer mittleren Geschwindigkeit von

befindliche fett ausgezogene Linie stellt ein Beispiel für 4000 -10 000 r.p.m. verbessert werden,

lolche Hysteresiskurven dar, wenn kein aktives (e) die obige »oberste Schicht« wird in Wasser

Material zugegeben worden ist; und die gestrichelte 65 suspendiert und d'e Suspension wird durch eine Linie in dieser Figur stellt die Hysteresiskurve dar, wenn geeignete semipermeable Membran bei 4 —10°C für

0,5 ng von Dipalmitoylphosphatdylcholin-Phosphatidyl- 12-48 Stunden der Dialyse unterworfen, wodurch die

glycerin-Gemisch (Gewrchtsverhältnis 9:1) tropfen- anorganischen Salze, wie z. B. Natriumchlorid, und in

der besagten Schicht zurückgebliebene wasserlösliche organische Verbindungen in äußeres Wasser abgeführt werden. Als semipermeable Membran können mit Vorteil Cellophan-, Collodion- und Blasenmembranen verwendet werden.

(f) Die an der Innenseite der Membran zurückgebliebene Suspension, die die bei der obigen Dialyse nichtdialysierten Materialien enthält (nachfolgend kurz »nicht-dialysierte Suspension genannt), wird bei hoher Geschwindigkeit von 12 000 -16 000 r.p.m. bei 0 -10" C ι ο für 5 — 30 Minuten zentrifugiert, um ein »reines sediment« zu erhalten, dessen Reinheit weiter verbessert werden kann, indem das »reine Sediment« erneut in einer Elektrolytlösung suspendiert und auf einer wäßrigen 0,25-030 M-Saccharoselösung der Flotation π unterworfen wird, wonach dann die der Flotation unterworfene Suspension bei einer ultrahohen Geschwindigkeit von 18 000-40000 r.p.m. bei 0-6" C für

I — £-r SliillSSll cSiftTiiUgiCrt nrnu. LJiSSCS "CrStSnCiiu

beschriebene Verfahren zur Verbesserung der Reinheit >o kann in wirksamer Weise bei den zuvor beschriebenen Verfahrensstufen durchgeführt werden, bei denen die »oberste Schicht« oder die »nicht-dialysierte Suspension« erhalten wird Das so gewonnene »reine Sediment« wird dann unter vermindertem Druck » getrocknet oder Lypophylisiert

(g) Ein Teil des getrockneten »reinen Sediments« wird in 100-300 Teilen Aceton suspendiert, und die Suspension wird nach dem Stehen bei -10 +10° C für 30 — 60 Minuten filtriert so daß ein in Aceton unlösli- m ches Material erhalten wird, aus dem in dem »reinen Sediment« verbliebene übermäßige Mengen von neutralem Lipoid und das vollständige Cholesterin selektiv entfernt worden sind Das in Aceton unlösliche Material wird unter vermindertem Druck getrocknet, und ein Teil des getrockneten Materials wird in 100—300 Teilen eines Gemisch von organischen Lösungsmitteln suspendiert Die Suspension wird nach dem Stehen für 10 — 20 Minuten filtriert um ein »gereinigtes Filtrat« zu erhalten, ads dem der größte Teil des fremden Proteins, das in dem in Aceton unlöslichen Material zurückgeblieben ist selektiv entfernt worden ist Als Gemisch von organischen Lösungsmitteln wird geeigneterweise ein Gemisch von Cloroform-Methanol (2:1) (Volumenverhältnis; nachfolgend ebenfalls), Chloroform-Äthanol (2 :1), Chloroform-Isopropanol (1 :1) oder Äthyläther-Äthanol (1:3) verwendet Das obige erhaltene »gereinigte Ritrat« wurde dem in der Pharmacopeia of Japan, 9. überarbeitete Ausgabe, B Seite 232 vorgeschriebenen Sterilitätstest unterworfen, um eine Bestätigung der Sterilität zu erheben, und die nachfolgenden Verfahrensschritte wurden dann unter sterilen Bedingungen durchgeführt

(h) »Gereinigtes Filtrat« wird mit sterilem Wasser vermischt und nach dem Stehen für l-24Stunde(n) wird das Gemisch der Filtration unterworfen, und das Filtrat wird dann unter vermindertem Druck konzentriert, so daß ein fester Rückstand erhalten wird Der feste Rückstand hat im allgemeinen die gleiche chemische Zusammensetzung wie die des oben be- βο schriebenen oberflächenaktiven Materials der Erfindung, und dieser Rückstand kann lyophilisiert werden, um schließlich das gewünschte Material zu erhalten. In dem Fall jedoch, daß der Phospholipoidgehalt bezogen auf den besagten festen Rückstand, unter 75,0% liegt «ras gelegentlich vorkommt wird das gleiche Lipoid gesondert zugegeben, so daß der Phospholipoidgehalt 75,0-953% beträgt. Wenn das Phospholipoid zugesetzt werden soll, wird geeigneterweise Phosphatidylglycerin, Phosphatidylcholin mit zwei Resten von gesättigter Fettsäure (z. B. Dipalmitoylphosphatidylcholin) oder ein Gemisch davon verwendet. Die chemische Zusammensetzung, die physikalischchemischen Eigenschaften und physiologischen Eigenschaften (einschließlich der toxizität, der Fähigkeit zur Verringerung der intraalveolaren Oberflächenspannung und des klinischen Effektes) des nach obiger Beschreibung hergestellten oberflächenaktiven Mittels der Erfindung werden nachfolgend im einzelnen erläutert:

I. Chemische Zusammensetzung

Das aktive Material enthält Phospholipoid, neutrales Lipoid, vollständiges Cholesterin, Kohlenhydrat und Protein, wobei diese Substanzen alle aus dem Lungengewebe des Säugetieres herstammen. In der Tabelle I werden die Anteile (%) von diesen Komponenten, bezogen Süf dss gsssrnts sktivs Msisris!. azi Verhältnis von Phospholipoidanteil zu Proteinanteil, die einzelnen Phospholipoidanteile (%), bezogen auf das gesamte Phospholipoid, und der Anteil (4) von Phosphatidylcholin mit zwei Resten von gesättigter Fettsäure, bezogen auf das gesamte Phosphatidylcholin, angegeben. Außerdem werden in der Tabelle I das Verhältnis von Phospholipoidanteil zu Proteinanteil und der Anteil (%) von Phosphatidylcholin mit zwei Resten von gesättigter Fettsäc i. bezogen auf das gesamte Phosphatidylcholin, jeweils nach Berechnung anhand der in der Literatur angeführten Werte zum Vergleich angegeben.

Dabei wurden die Bestimmungen der einzelnen Komponentenanteile auf folgende Weise durchgeführt:

Der Phospholipoidanteil wurde durch Bestimmen seines Phosphorgehaltes nach der Methode von King u.a. und nachfolgendes Multiplizieren des erhaltenen Wertes mit 25 ermittelt Der Anteil von neutralem Lipoid wurde nach der kolorimetrischen Methode mit Acetylaceton aber unter Berechnung gemäß dem Glycerintrioleatäquivalent ermittelt Der Gehalt an vollständigem Cholesterin wurde nach der Methode von Rosenthal aber unter Berechnung gemäß dem Cholesterinäquivalent ermittelt und der Kohlenhydratanteil wurde nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode aber unter Berechnung gemäß dem Glucoseäquivalent ermittelt während der Proteinanteil nach der Methode von Lowry u.a. aber unter Berechnung gemäß dem Rinderserumalbuminäquivalent ermittelt wurde. Der Wassergehalt wurde nach Karl Fischer's Methode bestimmt (vgl. Biochemical Journal, 26,292,1932,-Clinica Chimica Acta, 22,393,1968; Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 50, 318, 1957; Analytical Chei.iStry, 28, 350, 1956 und Journal of Biological Chemistry, 193, 265,1956.

Die einzelnen Phospholipoidanteile wurden in der Weise bestimmt daß das gesamte Phospholipoid mittels zwei-dimenskmaler Dünnschichtchromatographie mit einer Dünnschicht aus Silikagel 60 (0,25 mm dick, 20 χ 20 cm groß; hergestellt von Merck Co.) unter Verwendung eines Chloroform-Methanol-Wasser-Gemisches (Volumenverhältnis von 65 :25 :4) als erstes Laufmittel und eines Chloroform-Methanol-7N wäßrige Ammoniaklösung-Gemischs (Volumenverhältnis

230:90:15) als zweites Laufmittel und Jod als Farbentwickler der Fraktionierung unterworfen wurde und dann die Phospholipoidanteile in entsprechenden Dünnschicht-Fraktionen unter Anwendung der gleichen Methode zur Bestimmung des Phospholipoidanteils, wie oben beschrieben ist bestimmt wurden. Der Anteil an

Phosphatidylcholin mit zwei Resten von gesättigter Fettsäure wurde in der Weise bestimmt, daß das gesamte Phosphatidylcholin der Fraktionierung nach der Methode vun Shimojo u. a. (vgl. Journal of Lipid Research, 15, 525, 1974) unterworfen wurde und dann

der Phosphatidylcholinanteil in der Dünnschichtfraktion, die das Phosphatidylcholin mit zwei Resten von gesättigter Fettsäure enthielt, nach der gleichen Methode zur Bestimmung des Phospholipoidanteils, wie sie oben beschrieben ist, bestimmt wurde.

Tabelle 1

Oberflächenaktives Material	konventionelles
der Erfindung	pulmonales
	oberflächen
	aktives Mittel

Zusammensetzung des Materials Phospholipoid

neutrales Lipoid

vollständiges Cholesterin

Kohlenhydrat

Protein

Wasser

Verhältnis von Phospholipoidanteil
zu Proteinanteil

Zusammensetzung von Phospholipoid Phosphatidylcholin Phosphatidylglycerin Phosphatidyläthanolamin Sphingomyelin Phosphatidylinosit und Phosphatidylserin Lysophosphatidylcholin

andere Verbindungen

Anteil von Phosphatidylcholin mit zwei
Resten von gesättigter Fettsäure,
bezogen auf das gesamte Phosphatidylcholin

75,0-95,5%

1,8-14,0%

0,0-3,0%

0,1-1,5%

0,5-5,0% 1,7-6,0%

15,0 oder größer

63,0-85,5%

3,0-12,0%

2,5-7,7%

5,7-7,0%

2,4-7,4%

0,5-2,1% nicht mehr als 1,0%

67,5-90,3% 2,8-6,0

44,5-59,1%

Wie aus den in der Tabelle I angegebenen Werten klar ersichtlich ist, hat das oberflächenaktive Material der Erfindung die Eigenschaften eines niedrigen Proteingehaltes und eines hohen Gehalts an Phosphatidylcholin mit zwei Resten von gesättigter Fettsäure, wobei die Fettsäure dieses Phosphatidylcholins überwiegend Palmitinsäure ist

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II. Physikalisch-chemische Eigenschaften

(a) Fähigkeit zur Verminderung der
Oberflächenspannung

Gemäß der Methode von Wilhelmy wurde das aktive Material der Erfindung tropfenweise zu der Oberfläche von physiologischer Kochsalzlösung in einer Menge von 03—03 Ug je cm² Oberflächenbereich bei einer Temperatur von 15—25°C gegeben, und es wurde ein Mindestoberflächenspannungsbereich von 2,1 —8,8 dyn/cm und ein Maximaloberflächenspanmmgsbereich von 48,2—58,0 dyn/cm erhalten (vgL die Fi g. 1). Diese Werte zeigen, daß die Oberflächenspannung von physiologischer Kochsalzlösung bei Zugabe des Materials der Erfindung etwa nur das 1/343—1/ i,2fache der Oberflächenspannung von physiologischer Kochsalzlösung im Kontrolltest beträgt Der Stabilitätsindex (vgL Archives of Environmental Health, 2, 280,

1961) des Materials war 1,40-1,86, während der durch die Hysteresiskurve desselben begrenzte Bereich 52 ±32 cm² betrug. Die Kompressibilität bei 15 dyn/cm, die durch die Neigung der Kurve (im Original: solpe constant«) bei dem Punkt A in der F i g. 1 ausgedrückt wird, war 0,002 - 0,033.

(b) Optische Aktivität

Die spezifische Drehung des Materials der Erfindung betrug nach der Bestimmung mit einem automatischen Polarimeter, DIP.180 (hergestellt von Nihon Bunko Co, Ltd.)

— : +1,0 + 8,1 (CO^BenzoI).

(c) Löslichkeit

Jeweils 10 mg von dem Material wurden zu 10 ml eines jeweiligen Lösungsmittels gegeben, und das erhaltene Gemisch wurde für etwa 10 s gerührt Die Löslichkeit wurde als positiv (+) bezeichnet wenn das Material optisch gelöst worden war oder als negativ (—) bezeichnet wenn es nicht optisch gelöst worden war. Es soll erwähnt werden, daß wäßrige Suspensionen des Materials neutral oder schwach sauer waren.

Tabelle II Lösungsmittel

Volumenverhältnis

Löslichkeit Chloroform

■enzol

Wasser

Methanol

Äthanol

Aceton

Cyclohexan-Äthanol Äthyläther-Methanol Petroläther-Äthanol Aceton-Methanol Chloroform-Methanol

10 1,0- bis l,5%igen (Gewicht/Volumen) Suspension des Materials in physiologischer Kochsalzlösung langsam in die Trachea eingeträufelt wurde. Das Alveolarvolumen wurde in Form des Wertes je kg Körpergewicht ausgedrückt, und das Alveolarvolumen in der aus 7 Feten bestehenden Kontrollgruppe wurde in der gleichen Weise, wie vorstehend dargelegt ist, gemessen mit der Ausnahme, daß nur physiologische Kochsalzlösung anstelle der Suspension des Materials verwendet wurde.

Die Ergebnisse des Tests werden in der Tabelle III angegeben.

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(d) Adsorptionsspektren

Die infrarot- und Üitravioiettabsorptionsspektren des Materials waren, wie sie in den Fig.2 und 3 angegeben sind.

III Toxizität
(a) Test auf akute Toxizität

Das Material der Erfindung wurde männlichen ICR-Mäusen und männlichen Wistar-Ratten, beide Tierarten 5 Mochen alt, oral bzw. intraperitoneal verabreicht, und es wurde festgestellt, daß bei Mäusen die orale LDw nicht weniger als 3 g/kg betrug und die intraperitoneale LD_M nicht unter 2 g/kg lag, während bei Ratten die orale LD» nicht weniger als 4 g/kg betrug und die intrapertoneale LDs₀ nicht unter 2,5 g/kg lag.

(b) Test auf subakute Toxizität

Das Material wurde ausgewachsenen Wistar-Ratten in einer täglichen Dosis von 500 mg/kg Körpergewicht für eine Dauer von einem Monat intraperitoneal verabreicht. Iregndwelche Änderungen im Körpergewicht traten jedoch nicht auf, und irgendwelche nicht normalen Befunde bei optischen und histologischen Überprüfungen der Lungen sowie auch anderer Hauptorgane wurden nicht ermittelt Darüber hinaus wurden keine systemischen Abnormitäten, die auf fremde Proteine zurückzuführen wären, beobachtet

IV Intra-alveolare Oberflächenspannung
verringernder Effekt

(a) Test auf Vermögen zur Erhaltung des
Alveolarvolumens

so

Unter Benutzung von 7 Kaninchenfetten, die nach 27tägiger Gestation entnommen worden waren, wurde das Vermögen zur Erhaltung des Alveolarvolumens bei nach und nach abnehmenden endotrachealen Drücken getestet Das heißt, der Hals von jedem Fetus wurde aufgeschnitten, um die Trachea freizulegen, mit der ein Wassermanometer dann direkt verbunden wurde, und beginnend nach 5 Minuten nach Behandlung mit dem eo Material, wurden das Alveolarvolumen und der endotracheale Druck kontinuierlich mit dem besagten Manometer gemessen. Die Einstellung des endotrachealen Drucks wurde unter Verwendung einer unabhängigwirkenden 2-Kanalinjektionsspritzpumpe Nr. 940 (hergestellt von Harward Inc.) erzielt welche direkt mit der Trachea verbunden war. Die Behandlung mit dem Material wurde durchgeführt, indem 0,4—0,5 ml einer

Tabelle III	Alveolarvolumen (ml/kg)	Kontroli-
Endotrachealer	Mit dem Material	gruppe
Druck	behandelte Gruppe	13±2
(cm H₂O)	55±2	9±3
30	49 ±3	8±3
25	47 ±3	6±2
20	44±3	4±2
15	39±4	2±2
10	25±3	0
5	17±4
0

Den in der Tabelle III angegebenen Werten ist klar zu entnehmen, daß bei einem endotrachealen Druck von 30 cm H2O das Alveolarvolumen der behandelten Gruppe nicht weniger als 4,2mal so groß ist wie das der Kontrollgruppe. Auch bei einem extrem niedrigen endotrachealen Druck von 5 cm H2O ist das Alveolarvolumen bei der behandelten Gruppe noch groß, und zwar 25 ml/kg, während das der Kontrollgruppe sehr klein ist

(b) Test auf Fähigkeit zur Verringerung des
intraalveolaren Drucks

Unter Benutzung von 5 Kaninchenfeten, die nach 27tägiger Gestation entnommen worden waren, wurde der endotracheale Druck, der zur Aufrechterhaltung des Ventilationsvolumens je Respiration bei 10 ml/kg Körpergewicht unter künstlicher Respiration erforderlich war, mit einem Respirometer MFP-1100 (hergestellt von Nihon Koden Co.; Ltd.) gemessen. Die Messung wurde 5 Minuten nach dem Einflößen von 0,4 ml einer l,0%igen (Gewicht/Volumen) Suspension des Materials in physiologischer Kochsalzlösung in die Trachea durchgeführt Der endotracheale Druck bei der aus 5 Feten bestehenden Kontrollgruppe wurde in der gleichen Weise, wie vorstehend beschrieben ist gemessen mit der Ausnahme, daß nur physiologische Kochsalzlösung anstelle der Suspension des Materials verwendet wurde.

Aus dem Ergebnis des obigen Tests war ersichtlich, daß im Durchschnitt ein niedriger Druck von etwa 12 cm H₂O für die behandelte Gruppe ausreichend war, während für die Kontrollgruppe ein hoher Druck von 45 cm H₂O erforderlich war, der etwa dem Tierfachen des ersteren entsprach.

V Klinischer Test

5 neugeborene Kinder mit schwerer HMD, deren Gestationsalter 28-32 Wochen betrug, wurden ein- oder zweimal mit dem Material der Erfindung behandelt, und nach einer Dauer von 6 Monaten wurden das Schicksal der Kinder und ein Vorhandensein oder

Fehlte von Lungenstörungen bei ihnen verfolgt bzw. ermittelt. Die Behandlung mit dem Material wurde durchgeführt, indem eine l°/oige (Gewicht/Volumen) Suspension des Materials in physiologischer Kochsalzlösung direkt in die Tracheen eingeträufelt wurde, so daß das eingeträufelte Material je kg Körpergewicht bei jeder Behandlung 100 mg entsprach, und gleichzeitig wurde die weiter oben beschriebene konventionelle

kontinuierliche positive Luftwegdruckmethode angewendet. Die Testergebnisse werden in der Tabelle IV angegeben, wobei die dort angegebene »Schwere von HMD« anhand von radiographischen Befunden des Brustkastens, ausgedrückt in fünf Graden nach den Kriterien von Matsumura u. a. (vgl. Shonika,! 5,89,1974, beurteilt wurde, während sich der ;>Behandlungszeitpunkt« auf den Zeitpunkt nach der Geburt besieht.

Tabelle IV	Körpergewicht (kg)	Schwere von HMD	Behandlungszeitpunkt (Stunden)	2.	Ergebnisse	Lungen störungen
Fall Nr.			1.	65	Schicksal	keine
	1,4	V	13	68	überlebte	keine
1	1.1	III	7	-	überlebte	keine
2	1,1	V	4	-	überlebte	keine
3	1,8	V	15	14	überlebte	keine
4	1,4	V	6		überlebte
5

Der obigen Tabelle IV ist zu entnehmen, daß auch die neugeborenen Kinder mit kurzer Gestationsdauer mit schwerer HMD durch die Behandlung mit dem oberflächenaktiven Material der Erfindung überlebt haben. Im Gegensatz dazu ist bekannt, daß bei konventionellen Behandlungsmethoden alle neugeborenen Kinder mit HMD vom Schweregrad V innerhalb von 72 Stunden nach der Geburt starben. .

Die chemische Zusammensetzung, die physikalischchemischen Eigenschaften und die physiologischen Eigenschaften des oberflächenaktiven Materials der Erfindung, die im einzelnen oben beschrieben worden ist bzw. sind, zeigen, daß das Material der Erfindung ein neues Material mit geeigneten medizinischen Wirkungen bei HMD und einem hohen Sicherheitsgrad ist.

Dementsprechend wird ein pharmazeutisches Mittel, das das aktive Material der Erfindung enthält, als geeignetes Arzneimittel bei HMD angesehen. Das pharmazeutische Mittel der Erfindung wird je Behandlung in einer solchen Dosis angewendet, daß das Mittel z. B. bei neugeborenen Kindern mit HMD 50-400 mg, vorteilhafterweise 100 — 200 mg des oberflächenaktiven Materials der Erfindung enthält Das Mittel wird im allgemeinen in 5 —20 ml, vorteilhafterweise in 6—10 ml eines geeigneten Lösungsmittelmediums suspendiert, und die Suspension wird direkt in die Trachea des Patienten innerhalb von 72 Stunden nach seiner Geburt eingeträufelt Die Anzahl von Behandlungen entspricht im allgemeinen einer oder zwei, erforderlichenfalls kann jedoch dreimal oder mehrfach behandelt werden. Die angegebene Dosis und die Behandlungsmethode können je nach dem Zustand des Patienten modifiziert werden, und es können gleichzeitig andere Drogen und/oder Behandlungsmethoden angewendet werden.

Wenn das pharmazeutische Mittel der Erfindung in Suspensionsform hergestellt wird, können geeignete Zusätze zur Verbesserung der Dispersion und Erhöhung der Stabilität des aktiven Materials zugegeben werden. Wenn das pharmazeutische Mittel in flüssiger Form hergestellt wird, können Stabilisatoren, Konservierungsmittel, Mittel zur Regulierung des osmotischen Drucks, Puffer und Suspendiermittel der Flüssigkeit zugegeben werden. Gewünschtenfaiis können auch Germizide als Zusatz verwendet werden. Wenn das Mittel in Pulverform hergestellt wird, das bei der Anwendung in Form einer Suspension in einem Lösungsmittel zu benutzen ist, können außer den oben genannten Zusätzen geeignete Excipientien, Bindemittel und dergl. zugesetzt werden. Zu geeigneten Suspensionsmedien gehören Wasser und physiologische Kochsalzlösung.
Das pharmazeutische Mittel der Erfindung kann in hermetisch abgeschlossenen Behältern, wie z. B. Glasfläschchen und Ampullen, abgepackt und steril gehalten werden.

Das Verfahren zur Herstellung des pharmazeutischen Mittels der Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert:

Pharmazeutisches Mittel 1

100 mg des aktiven Materials eier Erfindung und 6 ml physiologische Kochsalzlösung wurden unter terilen Bedingungen in ein 10-ml-GlasfIiischchen eingetragen, und das Giasfiäschchen wurde mit einem mit Metallschelle verklammerten Gummistopfen verschlossen, so daß ein pharmazeutisches Mittel in Suspensionsform zur Verfügung stand.

Pharmazeutisches Mittel 2

7500 mg des aktiven Materials wurden zu 520 ml destilliertem Wasser gegeben, und das Gemisch wurde mittels eines Ultraschallgenerators zur Bildung einer gleichmäßigen Suspension gerülhrt Jeweils 10 ml der Suspension wurden in 50 einzelne 30-ml-Glas-Fläschchen unter sterilen Bedingungen eingetragen und lyophilisiert, und dann wurden die Glasfläschen mit einem mit Metallschelle verklammerten Gummistopfen unter sterilen Bedingungen verschlossen. Jedem Giasfiäschchen wurden 9 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung beigegeben, um bei der Anwendung damit eine Suspension herstellen zu können.

Pharmazeutisches Mittel 3

150 mg des aktiven Materials und 50 mg Glucose wurden in eine 10-ml-Ampulle nach der üblichen Pulvereinfülltechnik eingetragen, und die Ampulle

wurde unter sterilen Bedingungen verschlossen. Der Ampulle wurden 10 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung betgegeben, um bei der Anwendung damit eine Suspension herstellen zu können.

Die Erfindung soll nun durch die folgenden Beispiele erläutert werden; dy? Angaben in diesen Beispielen sind jedoch nicht als Begrenzungen aufzufassen, weil im Rahmen der Erfindung viele Änderungen in den Einzelheiten möglich sind.

Beispiel 1

32,0 kg Lunges, welche 10 Rindern entnommen worden waren, wurden mit Wasser gewaschen, um anhaftendes unkoaguliertes oder koaguliertes Blut und dcrgl zu entfernen. Diese Lungen wurden in faustgroße Stücke zerteilt, von unnötigen Blutgefäßen. Luftröhren und Fetteilen unter Benutzung von Messern, Scheren ,oder dgL befreit und erneut mit Wasser gewaschen. Die Stöcke wurden mit einer Fleischhackvorrichtung sehr fein zerkleinert und dann lyophilisiert, um getrocknete zerkleinerte Lunge (4,6 kg) zugewinnen.

520 g von der wie vorstehend gewonnenen getrockneten zerkleinerten Lunge wurden zu 18,01 physiologischer Kochsalzlösung gegeben, und das Gemisch wurde für 30 Minuten bei 4° C gerührt Das Gemisch wurde mit einer hydraulischen Presse unter einem Druck von etwa 100 kp/cm² nitriert, um einen Extrakt zu erhalten (16.21). Während der Extrakt in einer Zentrifuge mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 6,21 je Stunde eingespritzt wurde, wurde er bei einer hohen Geschwindigkeit von 14 000 r.pjTL bei 5°C kontinuierlich zentrifugiert, um ein »rohres Sediment« abnehmen zu körnen, das dann in 980 ml physiologischer Kochsalzlösung mit einem Homogenisator suspendiert wurde. Die Suspension wurde bei einer niedrigen Geschwindigkeit von 1000 r.pjn. bei 4° C zentrifugiert um irgendwelches Sediment aus restlichen Fragmenten von Lungengewebe und dergL zu entfernen. Zu der oberen Suspensionsschicht (880 ml), die der vorstehenden Zentrifuge entnommen worden war. wurden 230 g Natriumchlorid gegeben, um die Dichte der Suspension auf etwa 1.20 einzustellen, und die eingestellte Suspension wurde bei einer mittleren Geschwindigkeit von 3000 r.p.m. bei 4* C fOr 30 Minuten zentrifugiert so daß eine »oberste Schicht« entnommen werden konnte. Die »oberste Schicht« wurde erneut in 400 ml einer 26%igen (Gewicht/Volumen) wäßrigen Natriumchloridlösung suspendiert und dann bei einer mittleren Geschwindigkeit von 5000 r.pm bei 4* C für 30 M.nuten zentrifugiert wodurch die Reinheit der »obersten Schicht« verbessert wurde. Die gereinigte »oberste Schicht« wurde in destilliertem Wasser suspendiert und die Suspention wurde einer Dialyse mit einer Cellophanmembran unterworfen, um die enthaltenen anorganischen Salze in äußeres destilliertes Wasser abzuziehen. »Nicht-dialysierte Suspension« wurde entnommen und bei einer hohen Geschwindigkeit von 14 000 r.p.m. bei 4* C für 20 Minuten zentrifugiert, so daß ein »reines Sediment« erhalten wurde, das dann lyophilisiert wurde (Ausbeute 52 g). Das getrocknete »reine Sediment« wurde in \21 Aceton bei 6° C suspendiert und nach dem Stehenlassen für 60 Minuten wurde die Suspension durch Filterpapier filtriert und ein in Aceton unlösliches Material gewonnen.

Das in Aceton unlösliche Material wurde unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet und dann in I I Chloroform-Methanol-Gemisch (Volumenverhältnis von 2:1) suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde fur IO Minuten stehengelassen und dann durch ein GlasfOter filtriert, um ein »gereinigtes Filtrat« zu gewinnen. Eine von dem »gereinigten Fütrat« entnommene Probe wurde dem Sterilitätstest unterworfen, um die Sterilität derselben festzustellen.

(Die nachfolgenden Verfabrensschritte wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt; dieses gut auch für alle nachfolgenden Beispiele).

Das obige »gereinigte Filtrat« wurde durch Vermi-

sehen mit 170 ml sterilem Wasser bei 6°C gewaschen, und das erhaltene Gemisch wurde dann über Nacht stehengelassen. Die organische Lösungsmittelschicht wurde abgenommen und unter vermindertem Druck zu einem festen Rückstand (3,4 kg) konzentriert Eine von dem festen Rückstand entnommene Probe wurde lyophilisiert und dann analysiert, und es wurde festgestellt, daß der Phospholipoidgehalt 71,0% betrug. Dementsprechend wurden 1,6 g Dipalmitoylphosphatidylcholin und 03 g Phosphatidylglycerin zu dem Rest des Ruckstandes gegeben, und das Gemisch wurde in destilliertem Wasser suspendiert und dann zu einem weißen Führer aus dem oberflächenaktiven Material der Erfindung lyophilisiert (5,2 g). Die chemische Zusammensetzung des vorliegenden aktiven Materials wird in der weiter unten folgenden Tabelle V angegeben (wie auch für alle nachfolgenden Beispiele),

Beispiel 2

800 g von der ·η dem Beispiel 1 gewonnenen getrockneten zerkleinerten Lunge wurden zu 34,01 physiolog scher Kochsalzlösung gegeben, und das Gemisch wurde bei 8° C für 13 Stunden gerührt Das Gemisch wurde, während es in eine Zentrifuge mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 8.1 I je Stunde gespritzt wurde, bei einer niedrigen Geschwindigkeit von 1000 r.pm bei 8* C kontinuierlich zentrifugiert und es wurde ein Extrakt (3001) gewonnen. Dann wurde der Extrakt während er in ähnlicher Weise in eine Zentrifuge mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 4,71 je Stunde gespritzt wurde, bei einer hohen Geschwindigkeit von 16 000 r.p.m. bei 2⁹C kontinuierlich zentrifugiert, um ein »rohes Sediment« zu gewinnen, das dann mit 1,21 Wasser vermischt und in diesem mit einem Homogenisator suspendiert wurde. Zu der erhaltenen Suspension wurden 250 g Natriumchlorid gegeben, um deren Dichte auf etwa 1.15 einzustellen, und die Suspension wurde dann bei einer mittleren Geschwindigkeit von 4000 r.p.m. bei 6* C für 150 Minuten zentrifugiert, um eine »oberste Schicht« zu gewinnen. Diese »oberste Schicht«

SO wurde in destilliertem Wasser suspendiert und die Suspension wurde mit einer Cellophanmembran der Dialyse unterworfen, um vorhandene anorganische Salze in das äußere Waster abzuziehea Die gewonnen« »nicht dialysierte Suspension« wurd« auf einer wäßrige 0,70 M-Saccharoselösung der Flotation unterworfen und dann bei einer ultrahohen Geschwindigkeit von 20 500 r.pm. bei 4*C für 90 Minuten zentrifugiert Die milchige Schicht, die sich an der Grenze zwischen der Schicht aus wäßriger Saccharoselösung und der »obersten Schicht« beim Zentrifugieren gebildet hatte, wurde abgenommen und erneut mit einer Cellophanmembran der Dialyse unterworfen, um enthaltene Saccharose in äußeres destilliertes Wasser zu entfernen. Die gewonnene »nicht-dialysierte Suspension« wurde dann bei hoher Geschwindigkeit von 12 000 r.p.m. bei 2°C für 15 Minuten zentrifugiert, und es wurde ein »reines Sediment« erhalten, das dann lyophilisiert wurde (Ausbeute von 7,3 g). Das getrocknete »reine

Sediment« wurde in 1,01 Aceton bei -10° C gelöst, und die Suspension wurde nach dem Stehen für 30 Minuten durch ein Glasfilter filtriert um ein in Aceton unlösliches Material zu gewinnen. Das in Aceton unlösliche Material wurde unter vermindertem Druck bei 20⁰C getrocknet und dann in 1,51 Chloroform-Äthanol-Gemisch (Volumenverbältnis 2; I) suspendiert Die erhaltene Suspension wurde für 10 Minuten stehengelassen und dann durch ein Glasfilter filtriert um ein »gereinigtes Filtrat« zu gewinnen. Das »gereinigte in Filtrat« wurde durch Vermischen mit 300 ml sterilem destilliertem Wasser gewaschen, und dann wurde das erhaltene Gemisch bei 4° C für 3 Stunden stehengelassen. Die organische Lösungsmittelschicht wurde abgenommen und unter vermindertem Druck konzentriert r, und anschließend lyophilisiert wodurch ein steriles weißes Pulver aus dem oberflächenaktiven Material der Erfindung erhalten wurde (43 g).

Beispiel 3

80 g von der in dem Beispiel 1 gewonnenen getrockneten zerkleinerten Lunge wurden zu 2$ I physiologischer Kochsalzlösung gegeben, und das Gemisch wurde bei 0°C für 2 Stunden gerührt Das Gemisch wurde mit Gaze mittels Schwerkraft Filtriert ϊϊ und die Gaze wurde ausgequetscht um einen Extrakt zu erhalten (23 ')· Der Extrakt wurde bei einer Geschwindigkeit von 1500 r.pjn. bei 8° C für 10 Minuten zentrifugiert um irgendwelches Sediment aus restlichen Fragmenten von Lungengewebe und dergl. zu entferncn. Die obere Suspensionsschicht wurde entnommen und erneut zentrifugiert aber bei einer Geschwindigkeit von 12 000 r.pjn. und bei 0° C für 20 Minuten, um ein »rohe* Sediment« zu gewinnen, das dann in 130 ml physiologischer Kochsalzlösung mit einem Homogeni- η sator suspendiert wurde. Zu der erhaltenen Suspension wurden 8,1 g Natriumchlorid gegeben, um deren Dichte auf etwa 1,07 einzustellen, und die eingestellte Suspension wurde bei einer Geschwindigkeit von 10 000 r.pjn. bei 0* C für 180 Minuten zentrifugiert um eine *o »oberste Schicht« zu gewinnen. Diese »oberste Schicht« wurde erneut in 130 ml einer 14,0%igen (Gewicht/Volumen) wäßrigen Natriumchloridlösung suspendiert und dann bei einer Geschwindigkeit von 5000 r.p.m. bei 0°C for 90 Minuten zentrifugiert Dieses Aufreinigungsver- *> fahren wurde zweimal wiederholt Die gereinigte »oberste Schicht« wurde in destilliertem Wasser suspendiert und die Suspension wurde der Dialyse mit einer Cellophanmembran unterworfen, um die vorhandenen anorganischen Salze in äußeres destilliertes w Wasser abzuziehen. Die »nichtdialysierte Suspension« wurde bei einer Geschwindigkeit von 16000 r.p.m. bei 6⁰C für 5 Minuten zentrifugiert um eine »reines Sediment zu gewinnen, das dann lyophilisiert wurde (Ausbeute von 930 mg). Das getrocknete »reine "·» Sediment« wurde in 270 ml Aceton bei 0*C suspendiert und die Suspension wurde nach dem Stehen für 40 Minuten durch ein Glasfilter nitriert um ein in Aceton unlösliches Material zu gewinnen. Das in Aceton unlösliche Material wurde unter vermindertem Druck «" getrocknet und dann in 210 ml Äthylither-Äthanel-Gemisch (Volumenverhältnis 1 :3) suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde für 15 Minuten stehengelassen und dann durch ein Glasfilter filtriert, um ein »gereinigtes Filtrat« zu gewinnen. Das obige »gereinig- *'> te Filtrat« wurde unter vermindertem Druck zu einem Konzentrat konzentriert. Der Phospholipoidgehalt des Konzentrats betrug 73,0%. Daher wurden 410 mg Dipalmitoylphospbatidylcholin und 120 mg Phosphat!· dylglycerm dem Konzentrat zugegeben, und das Gemisch wurde in destilliertem Wasser suspendiert und dann lyophilisiert, wonach ein steriles weißes Pulver aus dem oberflächenaktiven Material der Erfindung (1,071 mg) erhalfen wurde.

Beispiel 4

30 g von der in dem Beispiel 1 gewonnenen getrockneten zerkleinerten Lunge wurden zu 1,31 physiologischer Kochsalzlösung gegeben, und das Gemisch wurde bei 2° C für eine Stunde gerührt Das Gemisch wurde mit Gaze filtriert die dann von Hand ausgequetscht wurde, um einen Extrakt zu gewinnen (1.11). Der Extrakt wurde bei einer Geschwindigkeit von 15 000 npjn. bei 4°C für 15 Minuten zentrifugiert um ein »rohes Sediment« zu gewinnen, das dann in 60 ml physiologischer Kochsalzlösung mit einem H&TOgenisator suspendiert wurde. Die Suspension wurde bei einer Geschwindigkeit von 1500 r.pjn. bei Raumtemperatur für 10 Minuten zentrifugiert um irgendwelches Sediment aus restlichen Fragmenten von Lungengewebe und dergL zu entfernen. Zu der entnommenen oberen Suspensionsschicht (56 ml) wurden 14 g Natriumchlorid gegeben, um die Dichte der Suspension auf etwa 1,20 einzustellen, und die Suspension wurde dann bei einer Geschwindigkeit von 6000 r.pjn. bei 4° C für 60 Minuten zentrifugiert um eine »oberste Schicht« zu gewinnen. Die Reinheit der »obersten Schicht« wurde verbessert durch erneutes Suspendieren der Schicht in 60 ml einer 25,0%igen (Gewicht/Volumen) wäßrigen Natriumchloridlösung und nachfolgendes Zentrifugieren der erhaltenen Suspension bei einer Geschwindigkeit von 6000 r.pjn. bei 4° C für 60 Minuten, um erneut eine »oberste Schicht« zu gewinnen. Dieses Aufreinigungsverfahren wurde dreimal wiederholt Die gereinigte »oberste Schicht« wurde in destilliertem Wasser suspendiert und dann der Dialyse mit einer Cellophanmembran unterworfen, um die enthaltenen anorganischen Salze in äußeres destilliertes Wasser abzuführen. Die »nicht-dialysierte Suspension« wurde bei einer Geschwindigkeit von 15 000 r.pjn. bei 2° C für 15 Minuten zentrifugiert um ein »reines Sediment« zu gewinnen, das dann lyophilisiert wurde (Ausbeute von 302 mg). Das getrocknete »reine Sediment« wurde in 60 ml Aceton bei 2° C suspendiert und die Suspension wurde nach dem Stehen für 30 Minuten durch ein Glasfilter nitriert um ein in Aceton unlösliches Material zu gewinnen. Das in Aceton unlösliche Materia! wurde unter vermindertem Druck getrocknet und dann in 50 nv Chloroform-Methanol-Gemisch (Volumenverhältnis von 2:1) suspends α Die erhaltene Suspension wurde nach dem Stehen für 15 Minuten durch ein Glasfilter nitriert um ein »gereinigtes Filtrat« zu gewinnen, das dann unter vermindertem Druck zu einem festen Rückstand konzentriert wurde. Der Phospholipoidgehalt des Rückstandes betrug 71,0%. Daher wurden dem Rückstand 150 mg Dipalmitoylphosphatidylcholin und 34 mg Phosphatidylglycerin zugegeben, und das Gemisch wurde in sterilem destilliertem Wasser suspendiert, wonach die Suspension lyophilisiert wurde, um ein steriles weißes Pulver aus dem oberflächenaktiven Material der Erfindung zu gewinnen (357 mg).

Beispiel 5

4,5 kg Lunge, welche einem Pferd entnommen worden war, wurden wie in dem Beispiel 1 behandelt, um getrocknete zerkleinerte Lunge zu erhalten (750 g).

Unter Verwendung von 30 g der getrockneten zerkleinerten Lunge wurden die in dem Beispiel 4 beschriebenen aufeinanderfolgenden Verfahrensschritte durchgeführt, um einen festen Rückstand zu erhalten. Der Phospbolipoidgenalt des Rückstandes betrug 684%. Zu ϊ dem Rückstand wurden 280 mg Dipalmitoylpbosphatidylchoun und 28 mg Phospbatidyiglycerin gegeben, und das Gemisch wurde mit Hufe eines Ultraschallgenerators in destilliertem Wasser suspendiert Die erhaltene Suspension wurde zu einem sterilen weißen Pulver aus in dem oberflächenaktiven Material der Erfindung lyophilisiert (448 mg).

Beispiel 6

1,1 kg Lungen, die zwei Schafen entnommen worden π waren, wurden wie in dem Beispiel 1 behandelt, um die getrocknete zerkleinerte Lunge zu erhalten (147 g). Unter Verwendung von 30 g der getrockneten zerkleinerten Lunge wurden die gleichen aufeinanderfolgenden Verfahrensschritte durchgeführt, die in dem Beispiel ."> 4 beschrieben sind, um einen festen Rückstand zu gewinnen. Der Phospholipoidgehalt des Rückstandes betrug 70,6%. Dem Rückstand wurden 149 mg Dipalmitoylphosphatiylcholin und 2 t mg Phosphatidylglycerin zugegeben, und das Gemisch wurde in destilliertem Wasser mit einem Ultraschallgenerator suspendiert Die erhaltene Suspension wurde lyophkisiert, und es wurde ein steriles weißes Pulver aus dem aktiven Material der Erfindung erhalten (314 mg).

Beispiel 7 ^m

2,7 kg Lunge, dm. einem Schwein entnommen worden war, wurden wie in dem Beispiel * behandelt um die getrocknete zerkleinerte Lunge zu erhalten (385 g). Unter Verwendung von 30 g der ge; ackneten zerklei- η «erten Lunge wurden die gleichen aufeinanderfolgenden Verfahrensschritte durchgeführt die in dem Beispiel 4 beschrieben sind, um einen festen Rückstand zu gewinnen. Der Phospholipoidgehalt des Rückstandes betrug 69,4%. Dem Rückstand wurden 207 mg Dipalmi- -to toylphosphatidylcholin und 34 mg Phosphatidylglycerin lugegeben, und das Gemisch wurde in destilliertem Wasser mit einem Ultraschallgenerator suspendiert Die erhaltene Suspension wurde lyophilisiert und es wurde ein steriles weißes Pulver aus dem aktiven Material der Erfindung erhalten (365 mg).

Beispiel 8

330 g Lunge, die einem Hund einer Mischrasse entnommen worden war, wurden wie in dem Beispiel 1 behandelt um die getrocknete zerkleinerte Lunge zu erhalten (37 g).

Unter Verwendung von 30 g der getrockneten terkleinerten Lunge wurden die gleichen aufeinanderfolgenden Verfahrensschritte durchgeführt die in dem H leispiel 4 beschrieben sind, um einen festen Rückstand tu gewinnen. Der Phospholipoidgehalt des Rückstandes betrug 633% Dem Rückstand wurden 174 mg Dipalmitoylphosphatidylcholin und 28 mg Phosphatidylglycerin zugegeben, und das Gemisch wurde in destilliertem no Wasser suspendiert. Die erhaltene Suspension wurde lyophilisiert und es wurde ein schwach-gelbes Pulver aus dem aktiven Matertal der Erfindung erhalten (370 mg).

Beispiel 9 ^

3,0 kg Lunge, die einem Rind entnommen worden war, wurden wie in dem Beispiel 1 behandelt, um die zerkleinerte Lunge zu erbalten (2,6 kg). Die zerkleinerte Lunge wurde zu 15,01 physiologischer Kochsalzlösung gegeben, und das Gemisch wurde bet 10⁰C für eine Stunde gerührt, wonach eine Druckfiltration mit einer hydraulischen Presse unter einem Druck von annähernd 120 kg/cm² durchgeführt wurde, um einen Extrakt zu gewinnen. Der Filtrationsrückstand wurde mit 2,01 physiologischer Kochsalzlösung vermischt und zur Gewinnung eines zweiten Extraktes erneut drickfiltriert Das Gesamtvolumen der obigen beiden extrakte betrug 15^ L Während der Extrakt in eine Zentrifuge mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 3,51 je Stunde eingespritzt wurde, wurde er kontinuierlich bei einer hohen Geschwindigkeit von 15 000 r.pjn. bei 6^eC zentrifugiert um ein »rohes Sediment« zu gewinnen, das dann in 1500 ml physiologischer Kochsalzlösung mit einem Homogenisator suspendiert wurde. Die erhaltene Suspension wurde bei einer niedrigen Geschwindigkeit von 1500r.p.m. bei Raumtemperatur für 10 Minuten zentrifugiert um irgendwelches Sediment aus restlichen Fragmenten des Lungengewebes zu entfernen. Zu der oberen Suspensionsschicht (1350 ml), die bei dem vorstehenden Verfahrensschritt erhalten worden war, wurden 230 g Natriumchlorid gegeben, um die Dichte auf annähernd 1,13 einzustellen, und die Suspension wurde dann bei einer mittleren Geschwindigkeit von 4000 r.pjn. bei 10" C für 120 Minuten zentrifugiert um eine »oberste Schicht« zu erhalten. Die Reinheit der »obersten Schicht« wurde durch erneutes Suspendieren der Schicht in 900 ml einer 25,0%igen (Gewicht/Volumen) wäßrigen Natuumchloridlösung und nachfolgendes Zentrifugieren der erhaltenen Suspension bei einer mittleren Geschwindigkeit von 5000 bei 8° C für 60 Minuten verbessert Die gereinigte »oberste Schicht« wurde in destilliertem Wasser suspendiert und die Suspension wurde entsalzt indem sie der Dialyse mit einer Cellophanmembran gegen äußeres destilliertes Wasser unterworfen wurde. Die »nichtdialysierte Suspension« wurde bei einer hohen Geschwindigkeit von 13 000 r.p.m. bei 3°C für lä Minuten zentrifugiert, um ein »reines Sediment« zu gewinnen, das in 780 ml Aceton bei 0⁰C suspendiert wurde, und die Suspension wurde dann nach dem Stehen für 45 Minuten durch ein Glasfilter filtriert, um in Aceton unlösliches Material zu erhalten. Das in Aceton unlösliche Material wurde unter vermindertem Druck bei 10* C getrocknet und dann in 800 ml Chloroform-Isopropanol-Gemisch (Volumenverhältnis von 1 :1) suspendiert

Die erhaltene Suspension wurde für 10 Minuten stehengelassen und dann durch ein Glasfilter filtriert, um ein »gereinigtes Filtrat« zu erhalten. Das »gereinigte Filtrat« wurde nach dem Waschen durch Vermischen mit 150 ml sterilem destilliertem Wasser und anschließendes Stehentassen des Gemischs bei 0"C für 12 Stunden unter vermindertem Druck konzentriert und dann unter Erhalt eines sterilen weißen Pulvers aus dem oberflächenaktiven Material der Erfindung (2,7 g) lyophilisiert.

Beispiel 10

4,4 kg Lunge, welche einem Pferd entnommen worden war, wurden wie in dem Beispiel 1 behandelt, um die zerkleinerte Lunge zu erhalten (3,9 kg). Die zerkleinerte Lunge wurde in der gleichen aufeinanderfolgenden Verfahrensweise wie in dem Beispiel 9 behandelt, um ein steriles weißes Pulver aus dem oberflächenaktiven Material der Erfindung zu gewinnen (3,4 g).

GtUpiel U

120 g von der wie in dem Betepeil 1 hergestellten getrockneten zerkleinerten Lunge wurden zu 4,01 physiologischer Kochsalzlösung gegeben, und das > Gemisch wurde bei 5"C für 2 Stunden gerührt, Während das Gemisch in eine Zentrifuge mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 7,51 je Stunde eingespritzt wurde, wurde es bei einer niedrigen Geschwindigkeit von 1200 r.pjn. bei 5"C zentrifugiert, um einen Extrakt zu to gewinnen (3,51).

Der Extrakt wurde erneut zentrifugiert, aber bei einer hohen Geschwindigkeit von 14 000 r.pjn. bei 6° C für 30 Minuten, um ein »rohes Sediment« zu erhalten, das dann in 150 ml Wasser mit einem Homogenisator suspendiert ι ~> wurde. Zu der erhaltenen Suspension wurde Natriumchlorid gegeben, um deren Dichte auf etwa 1,17 einzustellen, und die Suspension wurde dann bei einer mittleren Geschwindigkeit von 6000 r.pjn. für 60 Minuten zentrifugiert Die bei dem vorstehenden >o Zentrifugieren erhaltene »oberste Schicht« wurde abgenommen und auf einer wäßrigen Saccharoselösung mit steigender Konzentration von 0,25-0,80M der Flotation unterworfen und dann bei einer uftrahohen Geschwindigkeit von 22 000 r.pjn. bei i°C für 2i 120 Minuten zentrifugiert, um eine milchige Suspensionsschicht zu erhalten. Die milchige Suspensionsschicht wurde in destilliertem Wasser suspendiert und dann der Dialyse mit einer Cellophanmembran unterworfen, um vorhandene Saccharose, Salze, und dergl. in ;n das äußere destillierte Wasser abzuziehen. Die »nichtdialysierte Suspension« wurde bei einer hohen Geschwindigkeit von 12 000 r.pjn. bei 2° C für 15 Minuten zentrifugiert, um ein »reines Sediment« zu gewinnen, das dann lyophilisiert wurde (Ausbeute von 1,1 g). Das κ getrocknete »reine Sediment« wurde in 200 ml Aceton bei 0^GC suspendiert, und die Suspension wurde nach dem Stehen für 30 Minuten durch ein Glasfilter filtriert, um ein in Aceton unlösliches Material zu erhaltea Das 14000 r.p4n bei 2⁰C zentrifugiert, um ein »reines Sediment« zu gewinnen. Das »reine Sediment« wurde erneut in destilliertem Wasser suspendiert, und die Suspension wurde auf einer 0,55 M wäßrigen Saccbaro selösung der Flotation unterworfen und dann bei einer ultrahohen Geschwindigkeit von 28 000 r.pjn. bei 2°C für 90 Minuten zentrifugiert, um eine milchige Schiebt zu gewinnen, die sich an der Grenze zwischen der Schicht aus wäßriger Saccharoselösung und der »obersten Schicht« gebildet hatte. Die milchige Schicht wurde den gleichen aufeinanderfolgenden Verfahrensschritten unterworfen, wie sie in dem Beispiel 11 beschrieben sind, um ein steriles weißes Pulver aus dem aktiven Material der Erfindung zu gewinnen (470 mg).

Beispiel 13

35 kg Lungen, die 10 Rindern entnommen worden waren, wurden wie in dem Beispiel 1 behandelt, um die getrocknete zerkleinerte Lunge zu gewinnen (5,1 kg). 5 kg der getrockneten zerkleinerten Lunge wurden zu 2001 physiologischer Kochsalzlösung gegeben, und das Gemisch wurde nach dem Rühren ,«,ei 10°C für 80 Minuten in fünf ungefähr gleiche Teile get jilt, und jeder dieser Teile wurde unter Anwendung von hydraulischem Druck unter einem Druck von annähernd 110 kp/cm² druckfiltriert, um einen Extrakt zu gewinnen. Das G-samtvolumen der Extrakte betrug 186 L Während der vereinigte Extrakt in eine Zentrifuge mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 101 je Stunde eingespritzt wurde, wurde er bei einer hohen Geschwindigkeit von 15 000 r.p.m. bei 2° C kontinuierlich zentrifugiert, um eine »rohes Sediment« zu gewinnen, das dann in 12,01 physiologischer Kochsalzlösung mit einem Ultraschallgenerator suspendiert wurde. Die erhaltene Suspension wurde bei einer niedrigen Geschwindigkeit von 1500 r.pjn. bei 2° C kontinuierlich zentrifugiert Zu der abgenommenen oberen Suspensionsschicht (10,81) wurde Natriumchlorid gegeben, um deren Dichte auf etwa 1,20 einzustellen. Die Suspension

in Aceton unlösliche Material wurde unter verminder- 4o wurde bei einer mittleren Geschwindigkeit von 7500

tem Druck bei Raumtemperatur getrocknet und dann in 150 ml Chioroform-Äthanol-Gemisch (Volumenverhältnis 2 :1) suspendiert Die erhaltene Suspension wurde für 10 Minuten stehengelassen und dann durch ein Glasfilter mittels Saugwirkung filtriert, wodurch ein »gereinigtes Filtrat« erhalten wurde. Dieses »gereinigte Filtrat« wurde durch Vermischen ro*t 400 ml sterilem Wasser und nachfolgendes Stehenlassen des Gemisch* bei 4° C für 6 Stunden gereinigt und dann unter vermindertem Druck bis zu einem festen Rückstand konzentriert Der feste Rückstand wurde in sterilem destilliertem Wasser suspendiert und die Suspension wurde zu einem sterilen weißen Pulver aus dem aktiven Material der Erfindung lyophilisiert (530 mg).

Beispiel 12 r.p.m. bei 4° C für 60 Minuten zentrifugiert und es wurde eine »oberste Schicht« entnommen, deren Reinheit dann durch erneutes Suspendieren der Schicht in 5,01 einer 26,0%igen (Gewicht/Volumen) wäßrigen Natri-

»ϊ umchloridlösung und Zentrifugieren der erhaltenen Suspension bei einer mittleren Geschwindigkeit von 7500 r.p.m. bei 4"C für 60 Minuten verbessert wurde. Die gereinigte »oberste Schicht« wurde in destilliertem Wasser suspendiert und die Suspension wurde der Dialyse mit einer Cellophanmembran gegenüber äußerem destilliertem Wasser unterworfen. Die »nicht-dialysierte Suspension« wurde bei einer Geschwindigkeit von 12 000 r.p.m. bei 2" C für 30 Minuten zentrifugiert, um ein »reines Sedimer.t« zu gewinnen, das dann

5> lyophi!i«;rt wurde (Ausbeute von 47,6 g). Das getrocknete »reine Sediment« wurde in 10,01 Aceton bei 10° C suspendiert und dis Suspension wurde nach dem Stehenlassen für 60 Minuten mittels Saugwirkung durch ein Glasfilter filtriert um ein in Aceton unlösliches

Die gleiche Verfahrensschritte wie in dem Beispiel 1! wurden durchgeführt und 150 ml der eingestellten Suspension von »rohem Sediment« mit einer Dichte von

annähernd 1,17 wurden hergestellt. Die Suspension W) Material zu gewinnen. Das in Aceton unlösliche wurde bei einer mittleren Geschwindigkeit von 5000 Material wurde unter vermindertem Druck bei Raumr.p.m. für 90 Minuten zentrifugiert, um eine »oberste temperatur getrocknet und dann in 841 Chloroform= Schicht« zu gewinnen. Die »oberste Schicht« wurde in Methanol-Gemisch (Volumenverhältnis von ? : i) susdestilliertem Wasser suspendiert, und die Suspension pendiert. Die Suspension wurde für 10 Minuten wurde entsalzt, indem sie der Dialyse mit einer (>5 stehengelassen und dann mittels Saugwirkung durch ein Cellophanmembran gegenüber äußeren destillierten Glasfilter filtriert, um ein »gereinigtes Filtrat« zu Wasser unterworfer, wurde. Die »nicht-dialysierte gewinnen. Dieses »gereinigte Filtrat« wurde durch Suspension« wurde bei einer Geschwindigkeit von Vermischen mit 1,5 I destilliertem Wasser und Stehen-

to

IS

20

lassen des erhaltenen Gemischs bei 5^s C für 24 Stunden gewaschen. Danach wurde das »gereinigte Filtrat« unter vermindertem Druck zu einem festen Rückstand (38,4 g) konzentriert 30 g des festen Rückstandes wurden in sterilem destilliertem Wasser mit einem Ultraschallgenerator erneut suspendiert und dann zu einem sterilem weißen Pulver aus dem aktiven Material der Erfindung lyophilisiert (28,7 g).

Beispiel 14

450 g von der wie in dem Beispiel 1 hergestellten getrockneten zerkleinerten Lunge wurden zu 16,01 physiologischer Kochsalzlösung gegeben, und das Gemisch wurde für 2 Stunden gerührt Während das Gemisch in eine Zentrifuge mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 5,01 je Stunde eingespritzt wurde, wurde es bei einer niedrigen Geschwindigkeit von 1200r.p.m. zentrifugiert, um einen Extrakt'(1331) zu erhalten. Wahrend der Extrakt in eine Zentrifuge gleichfalls mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 5,01 je Stund« eingespritzt wurde, wurde er bei einer hohen Geschwindigkeit von 15 000 r.p.m. zentrifugiert um ein »rohes Sediment« zu gewinnen, das dann in 700 ml Wasser mit einem Ultraschallgenerator suspendiert wurde. Zu erhaltenen Suspension wurde Natriumchlorid gegeben, um deren Dichte auf etwa 1,20 einzustellen, und die Suspension wurde dann bei einer mittleren Geschwindigkeit von 7000 r.p.m. bei 2" C für 50 Minuten zentrifugiert um eine »oberste Schicht« zu gewinnen, deren Reinheit durch erneutes Suspendieren der Schicht in 0,71 einer 26,0%igen (Gewicht/Volumen) wäßrigen Natriumchloridlösung und nachfolgendes Zentrifugieren der erhaltenen Suspension bei einer Geschwindigkeit von 7000 r.p.m. bei 2° C für 50 Minuten verbessert wurde.

Das Aufreinigungsverfahren wurde viermal wiederholt Die gereinigte »oberste Schicht« wurde in destilliertem Wasser suspendiert und dann der Dialyse mit einer Cellophanmembran gegen äußeres destilliertes Wasser unterworfen. Die »nicht-dialysierte Suspension« wurde bei einer Geschwindigkeit von 15 000 r.p.m. bei 4° C für 10 Minuten zentrifugiert, um ein »reines Sediment« zu gewinnen, das dann lyophilisiert wurde (Ausbeute von 43 g)- Das getrocknete »reine Sediment« wurde in 131 Aceton bei 0°C suspendiert, und die Suspension wurde nach dem Stehenlassen für 30 Minuten durch ein Glasfilter filtriert, um ein in Aceton unlösliches Material zu gewinnen. Das in Aceton unlösliche Material wurde unter vermindertem Druck bei 10⁰C getrocknet und dann in 1,1 I Chloroform-Äthanol-Gemisch (Voli»«nenverhältnis von 2:1) suspendiert Die erhaltene Suspension wurde für 15 Minuten stehengelassen und dann durch ein Glasfilter filtriert, um ein »gereinigtes Filtrat« zu gewinnen. Dieses »gereinigte Filtrat« wurde unter vermindertem Druck zu einem festen Rückstand konzentriert (2,7 g). Weil der Phospholipoidgehalt des Rückstandes 74,0% betrug.

Tabelle V

wurden 75 mg Phosphatidylgylcerin zu 1000 mg des festen Rückstandes gegeben, und das erhaltene Gemisch wurde in sterilem destilliertem Wasser suspendiert wonach die Suspension zu einem weiBen Pulver aus dem aktiven Material der Erfindung lyophilisiert wurde (949 mg).

Beispiel 15

100 g der wie in dem Beispiel 1 hergestellten getrockneten zerkleinerten Lunge wurde zu 4,01 physiologischer Kochsalzlösung gegeben, und das Gemisch wurde bei 6" C für eine Stunde gerührt. Das Gemisch wurde bei einer niedrigen Geschwindigkeit von 1000 r.p.m. bei 4⁰C zentrifugiert, um einen Extrakt zu gewinnen (3,61). Dann wurde der Extrakt bei einer hohen Geschwindigkeit von 15 000 r.p.m. bei 2" C für 15 Minuten zentrifugiert, um ein »rohes Sediment« zu erhalten, das dann mit 120 ml Wasser in einem Homogenisator suspendiert wurde. Zu der erhaltenen Suspension wurde Natriumchlorid gegeben, um deren Dichte auf etwa 1,15 einzustellen, und die Suspension wurde dann bei einer mittleren Geschwindigkeit von 8000 r.p.m. für 80 Minuten zentrifugiert um eine »oberste Schicht« zu gewinnen. Die Reinheit der »obersten Schicht« wurde durch erneutes Suspendieren der Schicht in UOmI einer 20,0%igen (Gewicht/Volumen) wgßrigen Natriumchloridlösung und nachfolgendes Zentrifugieren der Suspension bei einer Geschwindigkeit von 6000 r.p.m. bei 0"C für 80 Minuten verbessert. Die gereinigte »oberste Schicht« wurde in destilliertem Wasser suspendiert und die Suspension wurde mit einer Cellophanmembran gegen äußeres destilliertes Wasser der Dialyse unterworfen. Die »nicht-dialysierte Suspension« wurde bei einer Geschwindigkeit von 14 000 r.p.m. bei 3° C für 15 Minuten zentrifugiert um ein »reines Sediment« zu erhalten, das dann lyophilisiert wurde (Ausbeute von 1,1 g). Das getrocknete »reine Sediment« wurde in 300 ml Aceton bei 0⁰C suspendiert, und die Suspension wurde nach dem Stehenlassen für 30 Minuten durch ein Glasfilter Filtriert um ein in Aceton unlösliches Material zu erhalten. Das in Aceton unlösliche Material wurde unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet und dann in 200 ml Äthyläther-Äthanol-Gemisch (Volumenverhältnis von 1 :3) suspendiert Die erhaltene Suspension wurde für 20 Minuten stehengelassen und dann durch ein Glasfilter filtriert um ein »gereinigtes Filtrat« zu gewinnen. Dieses »gereinigte Filtrat« wurde unter vermindertem Druck zu einem festen Rückstand konzentriert Weil der Phospholipoidgehalt des Rückstandes 683% betrug, wurden 820 mg Dipaimitoylphosphatidylcholin zu 1000 mg des festen Rückstandes gegeben, und das Gemisch wurde in sterilem destilliertem Wasser suspendiert und dann zu einem weißen Pulver aus dem aktiven Material der Erfindung lyophilisiert (1730 mg).

	Beispiel Nr.	2	3	4	5	6	7	8	9
	1
Zusammensetzung des
Materials (%)		87J	86,4	85,9	90,2	86,5	89,6	83,2	954
Phospholipoid	8L6	sa	7,1	7,8	3,0	4,2	3,6	10,9	1,8
neutrales Lipoid	10,6	0,9	1,2	1,0	0,5	0,6	2,1		0,0
vollständiges Cholesterin	23

11 12 13 14 15

94,0 94,5 94,7 75,0 76,1 83,3 1,1 2,0 1,6 14,0 10,8 7,9 0,3 03 0,2 3,0 2,5 1,1

23 24

Fortsetzung Beispiel Nr.

I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Il 12 Ii 14 15

Kohlenhydrat 1,2 0,2 1,1 0,9 0,9 0,7 0,2 0,4 0,2 0,5 0,1 0,1 0,7 1,5 0,8

Protein 2,3 1,2 2,0 1,4 1,7 2,5 0,7 1.3 0,5 0,9 1,6 1,2 5,0 3,1 1,8

Wasser 2,3 5,1 2,1 3,5 4,0 5,2 3,8 2,8 2,9 3,8 1,7 2,0 3,3 6,0 4,6

Verhältnis von Phospho- 35,5 72,9 43,2 59,5 53,1 34,6 128,0 64,0 191,0 104,4 59,1 78,9 15,0 24,5 46,3

lipoidgehalt zu Proteingehalt

Phospholipoidzusammen-

setzung (*/»)

Phosphattidylcholin 74,6 81,3 72,6 72,8 73,6 73,1 71,5 71,9 78,3 69,5 70,6 75,2 63,0 74,2 85,5 Phospattidylglycefin 10,6 4,5 10,3 12,0 8,6 9,0 11,3 10,2 3,0 8,6 6,4 7,9 11,9 11,7 3,5 Phoiphattidyläthanolamin 3,8 4,8 4,3 4,2 6,2 5,1 5,3 7,3 7,5 6,2 7,6 5,6 7,7 5,1 2,5 Sphiügömyeün 5,7 5,7 5,9 5,7 6,0 6,5 5,7 6,0 6,5 6,0 7,0 6,3 7,0 6,3 5,9 Phosphattidylinosit und 3,8 3,8 4,2 4,4 4,8 6,0 4,3 4,2 3,9 7,4 6,1 4,1 7,3 3,5 2,4 Phosphatidylserin Lysophosphatidylcholin 0,8 0,5 2,1 0,6 1,3 0,8 0,6 0,5 1,1 1,2 2,1 0,8 2,1 1,9 0,5

andere Verbindungen 0,3 0,2 0,2 0,1 0,1 0,5 0,3 0,1 0,4 1,0 0,7 0,8 1,0 0,4 0,0

Gehalt von Phosphatidyl- 83,5 88,6 89,2 86,2 83,3 82,1 84,3 88,6 79,8 78,8 83,1 80,6 67,5 86,2 90,3 cholin mit zwei Resten von
gesättigter Fettsäure,
bezogen auf das gesamte
Phosphatidylcholin (%)

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Oberflächenaktives Material mit einem Phospholipoidgehalt von 75,0-95,5%, einem Gehalt an neutralem Lipoid von 1,8--14,0%, einem Gehalt an vollständigem Cholesterin von 0,0-3,0%, einem Kohlenhydratgehalt von 0,1-13% und einem Proteingehalt von 0,5-5,0%. jeweils bezogen auf das Trockengewicht des besagten Materials, bei dem der Phospholipoidgehalt durch Multiplizieren des Phosphorge^aites mit 25 bestimmt worden ist und die einzelnen Gehalte an neutralem Lipoid, vollständigem Cholesterin, Kohlenhyurat und Protein unter Berechnung gemäß dem Glycerintrioleatäquivalent, Cholesterinäquivalent, Glucose^quivalent und Rinterserumalbuminäquivaiem ausgedrückt worden ist, erhältlich aus dem Lungengewebe von Säugetieren durch

a) Herstellen eines Extraktes durch feines Zerkleinern des Lungengewebes, Suspendieren in einer Elektrolytlösung unter Rühren bei 0-10°C für 30 -120 min und Filtrieren unter Druck oder Zentrifugieren bei 500 bis 1500 r.p.m,

b) Herstellen eines rohen Sediments aus dem Extrakt nach a) durch Zentrifugieren bei 12 000 bis 16 000 r.p.m. bei 0 bis 10° C und gegebenenfalls Suspendieren nach a) von im Sediment verbliebenen Lungenfragmenten.

c) Suspendieren des rohen Sediments nach b) in Wasser und Einstellen der Dichte der Suspen- so sion auf 1.07 bis 1,20 bei 0 bis 10⁰C bis zum Zerlegen der Suspension in drei Schichten,

d) Abnehmen der obersten emulgieren Schaumschicht und gegebenenfalls Reinigen durch Suspendieren in einer 9.3 bis 26,0%igen SS NaCI- Lösung mit nachfolgendem Zentrifugieren nach b).

e) Dialysieren der Suspension nach d) durch eine semipermeable Membran für 12 bis 48 Stunden bei 4 bi» 10* C gegen Wasser.

f) Zentrifugieren der nicht dialysierten Bestandteile bei 12 000 bis 16 00 r.p.m. für 5 - 30 min bei Obis 10⁰Czum reinen Sediment,

g) Abtrennen des acetonunlöslichen Anteils aus dem reinen Sediment nach g) und Trocknen dieses Anteils unter vermindertem Druck,

h) Suspendieren des getrockneten Anteils nach g) in sterilem Wasser. Abfiltrieren nach 1 bis 24 Stunden Stehen, und Konzentrieren des Fütrats, gegebenenfalls unter Einstellen des Phospholipoidgehaltes auf 75,0 bis 954 Gew.% durch Zugabe von Pbospnattfdylglycerin, -cbo-Hn, mit zwei Resten von gesättigten Fettsäuren oder ein Gemisch davon vor dem Gefriertrocknen.

Z Oberflächenaktives Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zum Reinigen der in den Stufen d) und f) erhaltenen Produkte diese in eine Elektrolytlösung suspendiert, auf 0,25 bis 0,80 M Saccharoslösung floriert und die der Flotation unterworfene milchige Suspension bei 18 000 bis 40 000 r.pjn. bei 0 bis 6⁰C für 1 bis 24 Stunden zentrifugiert werden.

3. Pharmazeutisches Mittel gegen Hyalin-Membran-Erkrankung, dadurch gekennzeichnet, daß es als wirksamen Bestandteil das oberflächenaktive Material nach Anspruch 1 und 2 enthält

20 Die Erfindung bezieht sich auf ein oberflächenaktives Material, mit seiner Herstellung und ein pharmazeutisches Mittel, das dieses wirksame Material enthält und gegen Hyalin-Membran-Erkrankung geeignet ist

Die Erfindung ist durch die Patentansprüche 1 bis 3 gekennzeichnet

Die Lunge von Säugetieren übt wie allgemein bekannt ist die Respirationsfunktion aus, bei der Luftsauerstoff in das Blut der Lunge aufgenommen und Kohlendioxid aus diesem durch die Zellen abgegeben wird, die innerhalb der Oberfläche einer Vielzahl von Lungenalveolen (d.h. dem Hohlraumteil der Lunge) vorliegen, welche mit der Trachea oder dem Luftweg verbunden sind Viele umfangreiche Untersuchungen in den letzten Jahren in bezug auf die '-ungenphysiologie, insbesondere Respirationsstörungen bei Frühgeburten mit kurzer Gestationsdauer, haben deutlich gemacht daß ein spezifisches Material in Lungenalveolen vorhanden ist das zu der Stabilität von Flüssigkeit-Luft-Grenzfläche darin führt (im allgemeinen pulmonares oberflächenaktives Mittel genannt), wobei ein Mangel an diesem Material Respirationsfunktionsstörungen, die sogenannte Hyalin-Membran-Erkrankung (nachfolgend HMD abgekürzt) zur Folge hat Es sind jedoch etwas unterschiedliche Meinungen über die genaue chemische Natur, insbesondere die chemische Zusammensetzung, von solchem pulmonaren oberflächenaktiven Mittel, das einem lebenden Körper entnommen worden ist vertreten worden.

Zur Behandlung der besagten HMD ist bisher die sogenannte kontinuierliche positive Luftwegdruckmethode angewendet worden, bei welcher Luft oder Sauerstoff durch ein dünnes Polyvinylrohr gedrückt wird; ein Verfahren zur Förderung der Entwicklung der Festuslunge besteht darin, daß der Mutter spezifische Steroidverbindungen verabreicht werden, und kürzlich ist über ein Verfahren berichtet worden, bei dem Phosphatidylcholin und Phosphatidylglycerin, die sich als Hauptkomponenten des pulmonaren oberflächenaktiven Mittels erwiesen haben, durch langsames Einflößen in den Luftweg zugeführt werden (vgl. Summary of Lecture Meeting of Pediatric Research Society, Atlantic City, 1970, S. 84; Pediatrics, 48, 547, 1971; Pedriatic Research, 11, 573, 1977). Obwohl diese konventionellen