DE2930593A1

DE2930593A1 - Illuminator- und sammelvorrichtung fuer fluoreszenzanalyse

Info

Publication number: DE2930593A1
Application number: DE19792930593
Authority: DE
Inventors: Albert Brunsting; Walter R Hogg
Original assignee: Coulter Electronics Inc
Current assignee: Coulter Electronics Inc
Priority date: 1978-07-31
Filing date: 1979-07-27
Publication date: 1980-02-28
Also published as: CA1113763A; FR2432710A1; FR2432710B1; US4199686A; JPS5522189A; GB2027193A; GB2027193B

Description

Patentanwälte . : · : : : Dlpl.-lng. E. Eder C)

DlpL-lng. K. Schiesch,,*. 2930593

•Minchen 40, EUaabettislraSaM

COULTER ELECTRONICS, INC. Hialeah/Florida U.S.A.

Illuminator- und Sammelvorrichtung für Fluoreszenzanalyse

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Beleuchtung einzeln isolierter Teilchen und das Sammeln des daraufhin von den durch die Beleuchtung stimulierten Teilchen ausströmenden fluoreszierenden Lichtes.

In der Zellenforschung kann zwischen einzelnen Zellen auf Grund ihrer quantitativen und qualitativen Charakteristika differenziert werden, wobei eines dieser Charakteristika das Färbverhalten der Zelle ist. Bei Bewertungsverfahren des Färbverhaltens werden die zu messenden Zellenkomponenten (beispielsweise DNA, RNA und Protein) mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert, die unter Beleuchtung fluoreszieren, während der Rest der Zelle auf der Wellenlänge der Fluoreszenz relativ dunkel bleibt. Um eine Grundlage für die Analyse der gesammelten Daten zu erhalten, wird die gegenseitige Abhängigkeit der Helligkeit des fluoreszierenden Lichtes und der Menge oder Art der Zellenkomponente festgestellt. Es ist daher von kritischer Bedeutung, dass das gesammelte Fluoreszenzsignal der Menge des nicht homogen verteilten, in der Zelle enthaltenen fluoreszierenden Materials entspricht und nicht von der Orientierung und/oder Lage der Zelle in der beleuchtenden Strahlung abhängig ist.

030009/0688 - 8 -

* — O —

Für genaue und verlässliche Ergebnisse ist daher offensichtlich die Gleichförmigkeit der Beleuchtung des fluoreszierenden Materials in einer gegebenen Zelle von wesentlicher Bedeutung.

Nach jüngsten Erkenntnissen werden durch die Zellenbeleuchtung mit verhältnismässig schmalen Strahlen einer beleuchtenden Strahlung, wie zum Beispiel Laserlicht, "Glühpunkte" gebildet, d.h. Bereiche relativ hoher Energiedichte im Vergleich zu benachbarten Bereichen innerhalb der Zelle. Diese "Glühpunkte" beruhen auf optischen Effekten an den Grenzen von Zellen und Organellen. Dies trifft besonders auf mit kollimierter Strahlung bestrahlte Zellen zu. Auch ist in der Wissenschaft bekannt, dass konvergierende Strahlen, z.B. Laserstrahlung, mit einem Gauss-schen Intensitätsprofil auf Grund von Diffraktion im Brennpunktbereich kollimiert werden und daher auf gleiche Weise "Glühpunkte" bilden. Bei diesen "Glühpunkten" besteht die Schwierigkeit darin, dass, wenn sie örtlich mit den Bereichen fluoreszierenden Materials in der Zelle zusammenfallen, dieses fluoreszierende Material ein Fluoreszenzsignal hoher Intensität abgibt, wohingegen dieses selbe fluoreszierende Material ein Fluoreszenzsignal niedriger Intensität abgegeben hätte, wenn es nicht im "Glühpunkt" gelegen hätte. Wenn daher viele gleichartige Zellen auf diese Weise beleuchtet werden und ihre Fluoreszenz gemessen wird, lässt sich in ihrer Fluoreszenzverteilung eine künstliche Verbreiterung beobachten, da der "Glühpunkt" in manchen Zellen mit Bereichen hoch fluoreszierenden Materials zusammenfällt und in anderen Zellen mit Bereichen gering fluoreszierenden Materials.

Auch kann die fluoreszierende Strahlung beim Ausströmen aus dem Teilchen oder der Zelle auf ähnliche Weise "Glühpunkte" erzeugen, wie die beleuchtende Strahlung "Glühpunkte" erzeugt. Das beruht auf der Struktur des Brechungskoeffizienten (allgemein komplex) innerhalb einer Zelle und der optischen

030009/0688

293Q593

Grenze zwischen der Zelle und dem Aeusseren. Selbst wenn eine nichtsphärische Zelle beleuchtet wurde, so dass ihr ganzes nicht homogen verteiltes fluoreszierendes Material in den Empfang einer gleichgrossen Strahlung gerät, ist dennoch die Menge des aus der Zelle austretenden und daraufhin gemessenen fluoreszierenden Lichts im Bezug auf die Empfängermittel und die Struktur des Brechungskoeffizienten (allgemein komplex) innerhalb der Zelle und der optischen Grenze zwischen der Zelle und dem Aeusseren von der Orientierung der Zelle abhängig. Infolgedessen wird bei der Analyse von Teilchen, und besonders von biologischen Zellen, zusätzlich zu einem grossen räumlichen Beleuchtungswinkel ein grosser räumlicher Sammelwinkel für die Fluoreszenz benötigt. '

Bei Vorrichtungen des Standes der Technik war es auch als wünschenswert erachtet, das fluoreszierende Licht von einem "Dunkelfeld" einzusammeln. Ein "Dunkelfeld" besteht aus einem Zustand, bei dem das den Fluoreszenzempfänger erreichende Licht relativ frei von der beleuchtenden Strahlung ist. Wenn die beleuchtende Strahlung im Vergleich zu dem vom Fluoreszenzempfänger gesehenen fluoreszierenden Licht beträchtliche Intensität besitzt, wird dadurch die Messung des fluoreszierenden Licht erschwert (oder in manchen Fällen unmöglich gemacht)_; auf Grund des schlechten optischen Störabstands (Verhältnis von optischen Strahlen mit Informationsgehalt zu ungewünschten Strahlen). Infolgedessen entwickelte sich im Stand der Technik die Idee, das fluoreszierende Licht von einem "Dunkelfeld" einzusammeln, so dass die Konzentrierung eingemischter Beleuchtuhgsstrahlung in Gegenwart des fluoreszierenden Lichts minimalisiert und der optische Störabstand maximalisiert würde.

Ein Zellenphotometer aus dem Stand der Technik, das mit dem "Dunkelfeld"-konzept arbeitet, wird unter dem Warenzeichen "Phywe" verkauft. Das Phywe-Gerät bestrahlt die Teilchen

030009/0683

mit einer Strahlung, die durch eine Linse dazu veranlasst wird, zu einem Brennpunkt zu konvergieren^ um sich mit den Teilchen am Brennpunkt zu schneiden. Nach Konvergenz zum Brennpunkt divergiert die Strahlung hinter den Teilchen. Die konvergierende Strahlung durchläuft eine Oeffnung, wobei diese Oeffnung auch das fluoreszierende Licht empfangen kann, das denselben Weg wie die Beleuchtungsstrahlung, aber in der umgekehrten Richtung, durchläuft, um durch die oben erwähnte Linse eingesammelt zu werden. Auf diese Weise bestimmen die Oeffnung und die Linse sowohl die Sammlung des fluoreszierenden Lichts, und den Höchstwinkel der beleuchtenden Strahlung (d.h. die numerische Oeffnung), die beide im Vergleich zum Gesamtraumwinkel von 4ot Raumwinkeleinheiten relativ klein sind.

Die Erfinder der hier vorgelegten Erfindung hatten den Eindruck, dass die Lösung zum "Glühpunkt"-problem darin lag, die Teilchen von vielen verschiedenen Richtungen aus zu beleuchten und auf diese Weise die "Glühpunkte" vollständig auszuschmieren. Darttberhinaus war es der Wunsch der Erfinder, die Sammlung fluoreszierenden Lichts von einem "Dunkelfeld" bei gleichzeitiger Beleuchtung der Teilchen in den verschiedenst möglichen Richtungen über die der Geräte des Standes der Technik hinaus zu erhöhen.

Nach einem ersten Konzept der Erfindung ist vorgesehen: Illuminator- und Sammelvorrichtung für Fluoreszenzanalyse, wobei Bestrahlung eines Teilchenstroms durch eine, beleuchtende Strahlung eine erfassbare fluoreszierende Strahlung erregt, die Vorrichtung einen Sammelspiegel mit einer konkaven Spiegelfläche mit einem ersten Brennpunkt und einem, zweiten Brennpunkt enthält und die Lage des ersten Brennpunkts im überschneidenden Verhältnis mit dem Teilchenstrom steht; Beleuchtungsmittel für den Aufprall organisierter Beleuchtungsstrahlung auf die besagte konkave Spiegelfläche so dass die Beleuchtungsstrahlung nach Reflektion von der

030009/0688 " ^u

_{m m}

IJ^ * ·
JA *

besagten konkaven Spiegelfläche auf den besagten ersten Brennpunkt konvergiert, wodurch die Teilchen am ersten Brennpunkt aus verschiedenen Richtungen durch die von der besagten konkaven Spiegelfläche hervortretende Beleuchtungsstrahlung beleuchtet werden; und Strahlungsteilungsmittel zum Abtrennen der von der besagten konkaven Spiegelfläche reflektierten fluoreszierenden Strahlung von der auf die besagte konkave Spiegelfläche gerichteten Beleuchtungsstrahlung, wodurch die fluoreszierende Strahlung aus dem besagten ersten Brennpunkt heraustritt, von der besagten konkaven Spiegelfläche reflektiert wird_y um sich am besagten zweiten Brennpunkt zu bündeln, und von der Beleuchtungs strahlung abgetrennt wird, um daraufhin erfasst zu werden.

Nach einem zweiten Konzept der Erfindung ist vorgesehen: ein Verfahren für die Beleuchtung eines Teilchenstroms, um die Emission einer fluoreszierenden Strahlung zu stimulieren, bestehend aus: Beleuchtung der einen ersten Brennpunkt einer konkaven Spiegelfläche durchlaufenden Teilchen durch Reflektion einer organisierten Beleuchtungsstrahlung von der konkaven Spiegelfläche, so dass die Beleuchtungsstrahlung auf den ersten Brennpunkt konvergiert, Abtrennung der •fluoreszierenden, von der konkaven Spiegelfläche reflektierten fluoreszierenden Strahlung von der vom ersten Brennpunkt divergierenden Beleuchtungsstrahlung, und Sammlung der fluoreszierenden Strahlung, die von der konkaven Spiegelfläche reflektiert und auf einen zweiten Brennpunkt der konkaven Spiegelfläche fokussiert worden Tst.

Unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen werden nur beispielsweise im folgenden AusführungsbeispieHe der Erfindung beschrieben:

FIGUR 1 zeigt eine Illuminator- und Sammelvorrichtung mit einer konkaven Ellipsoidspiegelflache im Querschnitt;

030009/0688 "

FIGUR 2 zeigt eine schematische Querschnittsdarstellung der Illuminator- und Sammelvorrichtung, wobei die konkave Ellipsoidspiegelfläche einem Raumwinkel von 2ji Raumwinkeleinheiten gegenüber liegt;

FIGUR 3 zeigt eine schematische Querschnittsdarstellung der Illuminator- und Sammelvorrichtung mit einer grösseren . konkaven Ellipsoidspiegelfläche und einem grösseren Beleuchtungswinkel als in FIGUR 2;

FIGUR 4 zeigt eine schematische Querschnittsdarstellung der Illuminator- und Sammelvorrichtung mit einer grösseren konkaven Ellipsoidspiegelfläche und einem grösseren Fluoreszenzsammelwinkel als in FIGUR 2;

FIGUR 5 zeigt eine schematische Querschnittsdarstellung der Illuminator- und Sammelvorrichtung, die ein Paar lichtundurchlässige Sperren enthält;

FIGUR 6 zeigt eine schematische Querschnittsdarstellung einer weiteren Ausführung der Illuminator- und Sammelvorrichtung mit einer konkaven Parabolspiegelfläche;

FIGUR 7 zeigt eine schematische Querschnittsdarstellung noch einer weiteren Ausführung der Illuminator- und Sammelvorrichtung mit einer konkaven Hyperbolspiegelfläche; und

FIGUR 8 ist eine verallgemeinerte " schematische Darstellung der Illuminator- und Sammelvorrichtung, durch die die vorliegende Erfindung realisiert wird.

030009/0688 " ¹³~

Es werden aus einer Vorrichtung bestehende Mittel und ein Verfahren für Fluoreszenzanalyse offenbart, in denen Teilchen aus vielen verschiedenen Richtungen beleuchtet werden, um infolgedessen fluoreszierendes Licht abzugeben, das danach aus vorzugsweise im wesentlichen allen anderen Richtungen einem Dunkelfeld entgegen eingesammelt wird. Wenn Teilchen durch einen relativ schmalen Strahl beleuchtet werden, verursachen die von Teilchen zu Teilchen auftretenden Äbweicfrurgen eine unerwünschte Streuung in den Fluoreszenzmessungen, die eine Funktion der Teilchenorientierung und -lage und der Verteilung der fluoreszierenden Stoffe innerhalb des Teilchens ist, und nicht eine Funktion der Menge des im Teilchen enthaltenden fluoreszierenden Materials. Infolgedessen wird mit den die vorliegende Erfindung realisierenden, aus einer Vorrichtung bestehenden Mitteln und Verfahren dafür gesorgt, dass die unerwünschten Auswirkungen der von Teilchen zu Teilchen auftretenden Abweichungen minimalisiert werden und gleichzeitig im wesentlichen die Gesamtheit des gegen ein Dunkelfeld zur Verfügung stehenden resultierenden fluoreszierenden Lichts eingesammelt wird.

In FIGUR 1 wird eine erste Ausführung einer, allgemein mit der Ziffer 10 gekennzeichneten Illuminator- und Sammelvorrichtung dargestellt. ,In dieser Ausführung besteht die Vorrichtung 10 aus einem Sammelspiegel 12 mit einer konkaven Spiegelfläche 14. Die konkave Spiegelfläche 14 ist als Teil eines Ellipsoids (einer um ihre Hauptachse gedrehten Ellipse) aufgebaut. Die konkave Spiegelfläche 14 besitzt einen ersten Brennpunkt 16 und einen zweiten Brennpunkt 18, die auf einer optischen Achse 20 angeordnet sind. Die Vorrichtung 10 besitzt eine (nicht dargestellte) Teilchenquelle, die einer Zugangsröhre 24 Teilchen zuliefert. Die Teilchen werden in einem Strom einzeln isolierter Teilchen von der Zugangsröhre 24 durch den ersten Brennpunkt 16 in eine Ausgangsröhre 26 mitgerissen und dadurch zu einem (nicht dargestellten) Teilchenausgang geführt. Dieser

03000Ö/0688

- 14 -

Teilchenstrom ist normalerweise in einem gasförmigen oder flüssigen Fluid suspendiert. Zum Einsperren des Fluids ist ein Fenster 28 vorhanden, wobei das Anbringen dieses Fensters 28 bei Anwendung eines Gases freigestellt ist. Das Fenster 28 bietet gleichzeitig Zutritt für die Beleuchtungsstrahlung und einen Austritt für das resultierende fluoreszierende. Licht. Der Mittelpunkt des vorzugsweise sphärischen Fenster 28 befindet sich am zweiten Brennpunkt 18 und verursacht dadurch minimale optische Störungen. Es versteht sich dabei, dass die Zulieferung eines Stromes einzelnisolierter Teilchen mit einer mit Flüssigkeit gefüllten Kammer auf eine Art und mit Mitteln durchgeführt wird, die im Stand der Technik durchaus bekannt sind.

Die eigentliche Funktion der ersten Ausführung der Vorrichtung 10 wird durch Bezugnahme auf die Darstellung der FIGUR 2 besser verständlich. Eine Quelle 30 einer Beleuchtungsstrahlung liefert eine Beleuchtungsstrahlung, die auf den zweiten Brennpunkt 18 konvergiert und ihn durchläuft, um auf die konkave Spiegelfläche 14 aufzutreffen. Auf Grund der wohlbekannten geometrischen Eigenschaften eines Rotationsellipsoids wird ein Strahl, der aus einem Brennpunkt 16 bzw. 18 hervortritt, um auf die konkave Spiegelfläche 14 aufzutreffen, zum anderen Brennpunkt 16 bzw. 18 reflektiert. Infolgedessen konvergiert die Beleuchtungsstrahlung nach einer Reflektion zum ersten Brennpunkt 16, um die diesen durchlaufenden Teilchen zu beleuchten. Die Teilchen werden aus vielen verschiedenen Richtungen über einen räumlichen Beleuchtungswinkel 0 illuminiert. Auf diese Weise werden die Auswirkungen der in der vorangegangenen Beschreibung des Standes der Technik beschriebenen "Glühpunkte¹¹ in der Beleuchtung reduziert, wodurch eine engere Wechselbeziehung zwischem dem eingesammelten fluoreszierenden Licht und der Menge des in einer Zelle enthaltenen fluoreszierenden Stoffes hergestellt wird. Sobald die Teilchen beleuchtet werden, läuft der grösste Teil der Beleuchtungs-

030009/0688 -15-

strahlung durch den ersten Brennpunkt 16 und divergiert. Es ist wichtig, dass man beachtet, dass diese divergierende Beleuchtungsstrahlung in FIGUR 2 kein zweites Mal durch die konkave Spiegelfläche 14 reflektiert wird. Wäre diese Beleuchtungsstrahlung ein zweites Mal durch die konkave Spiegelfläche 14 reflektiert worden, würde sie so reflektiert worden sein, dass sie auf den zweiten Brennpunkt 18 konvergiert. Die Beleuchtung des den gefärbten Zellen beigefügten fluoreszierenden Farbstoffes ruft ein fluoreszierendes Licht hervor, das (im allgemeinen aber nicht perfekt) isotrop aus dem ersten Brennpunkt 16 herausstrahlt. Ein innerhalb des räumlichen Sammelwinkels φ befindlicher Teil dieses fluoreszierenden Lichts wird von der konkaven Spiegelfläche 14 reflektiert und konvergiert dadurch zum zweiten Brennpunkt 18. Dadurch, dass das fluoreszierende Licht über einen relativ grossen Sammelwinkel φ eingesammelt werden kann, werden die in der Beschreibung des Standes der Technik beschriebenen "Glühpunkte" in der Sammlung reduziert.

Auf Grund des Verhältnisses zwischen der aus dem ersten Brennpunkt 16 heraustretenden divergierenden Beleuchtungsstrahlung und der zum zweiten Brennpunkt 18 konvergierenden fluoreszierenden Strahlung, in FIGUR 2 dargestellt, kann das zum zweiten Brennpunkt 18 konvergierende fluoreszierende Licht mit geringfügiger Beleuchtungsstrahlung innerhalb des räumlichen Sammelwinkels φ eingesammelt werden. Genau gesagt ist nach FIGUR 2 die aus dem ersten Brennpunkt 16 heraustretende Beleuchtungsstrahlung innerhalb θ eingeschlossen, wobei B = 2jT Raumwinkeleinheiten. Die Konzentration der mit dem fluoreszierenden Licht vermischten Beleuchtungsstrahlung ist daher im Bezug auf eine Koinzidenzsituation in den beiden Strahlen bedeutend geringer. Da φ durch θ ausgeschlossen wird, kann man sagen, dass das fluoreszierende Licht von einem relativ dunklen Feld gesammelt wird. Das bedeutet, dass der optische Störabstand (das Verhältnis des fluoreszierenden Lichts zu der

030009/0538 " ^1β "

Beleuchtungsstrahlung) bedeutend verbessert ist.

Nach .der Darstellung in der FIGUR 2 enthält die Vorrichtung IO Mittel zum Abtrennen der eintreffenden, zur zweiten Spiegelfläche 14 weiterlaufenden Beleuchtungsstrahlung vom austretenden fluoreszierenden Licht. Die Strahlungstrennmittel können als eines von vielen, in der Technik wohlbekannten üblichen Mitteln, wie z.B. ein Prisma, oder nach den bevorzugten Ausführungen ein dichroitischer Reflektor 32, der einzig das oberhalb bzw. unterhalb einer gegebenen Grenzwellenlänge gelegene Licht reflektiert, ausgeführt werden. Als Sekundärfunktion kann der dichroitische Reflektor 32 zur Unterstützung beim Ausfiltern von Beleuchtungsstrahlung herbeigezogen werden, die beispielsweise auf Grund von θ + k Ueberdeckung oder von Streuung mit dem fluoreszierenden Licht vermischt wurde. (Andere, hier nicht erwähnte Ursachen sind möglich). Obwohl der dichroitische Reflektor 32 relativ zur konkaven Spiegelfläche 14 hinter dem zweiten Brennpunkt 18 gelegen ist, hätte er vor dem zweiten Brennpunkt 18 angeordnet werden können. Obwohl der dichroitische Reflektor 32 in der Darstellung Beleuchtungsstrahlung reflektiert und fluoreszierende Strahlung durchlässt, könnte der dichroitische Reflektor 32 so ausgelegt werden, dass er Beleuchtungsstrahlung durchlässt und fluoreszierende Strahlung reflektiert. In beiden Fällen wird die fluoreszierende Strahlung auf einen optischen Empfänger 34 gelenkt. Der in FIGUR 2 gezeigte optische Empfänger 34 ist wie üblich ausgelegt und wandelt erfassbares fluoreszierendes Licht in elektrische Signale um, die für nachfolgende Datenerfassung bestimmt sind. Der typische Empfänger 34 würde aus wohlbekannten lichtempfindlichen Sensoren bestehen, vorzugsweise in der Form von PhotovervielfacherrÖhren, Vakuum- oder Festkörperphotodioden. Der optische Empfänger 34 kann wahlweise einen normalen Farbsperrfilter enthalten.

- 17 030009/0688

Wie vorstehend erklärt, divergiert die Beleuchtungsstrahlung vom ersten Brennpunkt 16 relativ zu dem auf den zweiten Brennpunkt 18 konvergierenden fluoreszierenden Licht. Infolgedessen kann das auf den zweiten Brennpunkt 18 zulaufende fluoreszierende Licht mit einem verbesserten Störabstand eingesammelt werden. Selbst bei diesem divergierenden Verhältnis läuft ein winziger, auf der optischen Achse 20 zentrierter Mittelkegel der Beleuchtungsstrahlung unmittelbar aus dem ersten Brennpunkt 16 heraus und trifft auf den dichroitischen Reflektor 32, und bildet damit eine unerwünschte Geräuschquelle. Obwohl dieses Geräusch tragbar sein kann, werden in den folgenden Abschnitten einige Einstellungen besprochen, die man zum Ausschalten oder Minimalisieren dieses Beleuchtungsstrahlungskegels machen kann.

Aus FIGUR 2 ist ersichtlich, dass, wenn man seinen Bezugspunkt entlang der optischen Achse 20 vom Brennpunkt 16 auf den Brennpunkt 18 der Figur hin bewegt, die Intensität der Beleuchtungsstrahlung von 16 im Verhältnis zum umgekehrten Quadrat der Bewegungsentfernung abgeschwächt wird. Andererseits konvergiert bei einer derartigen Bewegung des Bezugspunktes entlang der optischen Achse 20 das fluoreszierende Licht zum zweiten Brennpunkt 18 hin. Infolgedessen würde die Einsammlung des fluoreszierenden Lichts in der Nähe des zweiten Brennpunktes 18 die den Empfänger 34 erreichende Beleuchtungsstrahlung reduzieren. Gleichfalls wird bei Vergrösserung der Exzentrizität.der konkaven Spiegelfläche 14 der zweite Brennpunkt 18 nach aussen'verschoben, was eine weitere Minimalisierung des dem dichroitischen Reflektor 32 gegenüberliegenden Raumwinkels und damit der mit dem fluoreszierenden Licht in der Nähe des zweiten Brennpunkts 18 vermischten Beleuchtungsstrahlung bewirkt. Die obige Erklärung von Ellipsoidexzentrizitäten wird einzig zwecks Darstellung der, der Vorrichtung 10 innewohnenden physikalischen Charakteristika und Verhältnisse geliefert. Es ist dabei

030009/0688

- 18 -

zu beachten, dass die am Sammelpunkt mit dem fluoreszierenden Licht vermischte Beleuchtungsstrahlung durch Verkleinerung des dichroitischen Reflektors 32 der FIGUR 2 minimalisiert werden kann, indem der Reflektor 32 dem zweiten Brennpunkt 18 nähergebracht wird und/oder der dichroitische Reflektor 32 und der zweite Brennpunkt 18 durch Vergrösserung der Exzentrizität des Ellipsoids nach aussen verlegt wird. Der Exzentrizität des Ellipsoids und der Kleinheit des dichroitischen Reflektors 32 sind jedoch praktische Grenzen gesetzt.

Um die Notwendigkeit, sich derartigen, oben beschriebenen Konstruktionsproblemen zu unterziehen, zu beseitigen können ■ zusätzliche Mittel vorgesehen werden. Zum Beispiel können nach der Darstellung in FIGUR 3 diese Mittel eine lichtundurchlässige Sperre 38 umfassen, die eine Lochöffnung 40 enthält. Es ist dabei zu beachten, dass der der Oeffnung 40 gegenüberliegende Raumwinkel aus der Sicht des Brennpunkts 16 einen sehr kleinen Bruchteil von 6 darstellt. Auch kann die Einfügung einer oder mehrerer Linsen beträchtliche Teile dieses Beleuchtungsstrahlungskegels ablenken. Durch die Einfügung derartiger Mittel wird der auf der optischen Achse 20 zentrierte Kegel zerstreuter Beleuchtungsstrahlung, der normalerweise vom optischen Empfänger 34 eingesammelt werden könnte, auf wirksame Weise beseitigt.

Eine Abänderung der ersten Ausführung wird in FIGUR 3 dargestellt, in der kollimertes Licht von der Quelle 30 zu einer Linse 36 gelangt. Die (für beleuchtendes wie auch fluoreszierendes Licht benutzte) achromatische Linse 36 konvergiert danach die Beleuchtungsstrahlung zum zweiten Brennpunkt 18, wodurch die Beleuchtungsstrahlung den zweiten Brennpunkt 18 durchläuft und auf die Spiegelfläche 14 auftrifft. Wie bei allen, in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung zur Anwendung kommenden Linsen kann an ihrer Stelle ein Reflektor benutzt werden. Es ist darüberhinaus zu beachten, dass

030009/0888 -19-

es nicht beabsichtigt ist, die vorliegende Erfindung daraufhin einzuschränken, dass sie irgendeine besondere Linsen- oder Reflektoranordnung oder irgendwelche Kombinationen derselben darstellt, insofern, dass derartige Anordnungen viele verschiedene Gestaltungen annehmen können, die in der Technik versierten Personen wohl bekannt sind. Die für die Handhabung des reflektierten fluoreszierenden Lichts und für die Fokussierung der Beleuchtungsstrahlung offenbarten Mittel sind daher an sich als Erläuterung gedacht.

Für Erläuterungszwecke zeigt die FIGUR 2, dass die Spiegelfläche 14 am ersten Brennpunkt 16 einem Raumwinkel von 2"tf Raumwinkeleinheiten gegenüberliegt, wobei die Beleuchtungsstrahlung die gesamte Spiegelfläche 14 bestrahlt. Auf Grund dieser Konstruktion werden den ersten Brennpunkt 16 durchlaufende Teilchen über einen Raumwinkel von 2ττ Raumwinkeleinheiten illuminiert. Es ist beachtenswert, dass bei dieser Konstruktion die Beleuchtungsstrahlung nach Durchlaufen des ersten Brennpunkts 16 keiner weiteren Reflektion von der Spiegelfläche 14 unterzogen wird. Dies ist von Bedeutung, weil jede weitere Reflektion der Beleuchtungsstrahlung die Beieuchtungsstrahlung zum Konvergieren zum zweiten Brennpunkt 18 veranlassen würde. Die Folge davon ist, dass sie mit dem gesammelten fluoreszierenden Licht zusammengemischt würde und/oder unerwünschtes Streulicht verursacht würde. In der in FIGUR 2 gezeigten Ausführung stellt der Beleuchtungswinkel 6 von 2 "ff Raumwinkeleinheiten die Höchstbeleuchtung dar, die ohne zweitmalige Reflektion der Beleuchtungsstrahlung von der konkaven Spiegelfläche 14 erzielt werden kann. In der Praxis wurde die Beleuchtung der Teilchen bei dieser Ausführung auf Grund der, solchen Gegenständen wie Eingangs- und Ausgangsröhren 24 und 26 gegenüberliegenden Raumwinkel etwas, weniger als 2ττ Raumwinkeleinheiten betragen.

030009/0688

In FIGUR 3 ist die konkave Spiegelfläche 14 erweitert, um am ersten Brennpunkt Iß einen Raumwinkel von mehr als 2 "Π Raumwinkeleinheiten zu bilden. Die einfallende Beleuchtungsstrahlung ist dementsprechend erweitert, um vorzugsweise auf die gesamte konkave Spiegelfläche 14 aufzutreffen. Wenn der Beleuchtungswinkel 9 2Tt Raumwinkeleinheiten überschreitet, konvergiert der zweimal von der konkaven Spiegelfläche 14 reflektierte Teil der Beleuchtungsstrahlung zum zweiten Brennpunkt 18 mit dem fluoreszierenden Licht. Bei Untersuchung einer Querschnittsansicht des auf den zweiten Brennpunkt 18 fokussierten fluoreszierenden Lichts ist zu beachten, dass das Zusammenmischen der Beleuchtungsstrahlung mit dem fluoreszierenden Licht an der Peripherie der Querschnittsansicht des fluoreszierenden Lichts beginnt und sich in steigendem Masse mit Vergrösserung des Beleuchtungswinkels θ über 2ττ Raumwinkeleinheiten hinaus zur Mitte hin erstreckt. Die peripheren Teile mit zusammengemischter Beleuchtungsstrahlung können daher vermieden werden, indem nur vorbestimmte Mittelteile des auf den zweiten Brennpunkt 18 fokussierten fluoreszierenden Lichts gesammelt werden. Dadurch wird gestattet, dass der Beleuchtungswinkel θ 2 Tt Raumwinkeleinheiten überschreitet, ohne dass die dadurch, durch Ueberschreiten von 2τχ Raumwinkeleinheiten des Beleuchtungswinkels verursachte zusammengemischte Beleuchtungsstrahlung eingesammelt wird. Das Sammeln des oben beschriebenen Mittelteils des von zusammengemischter Beleuchtungsstrahlung relativ freien fluoreszierenden Lichts kann durch eine, in der Technik versierte Person auf verschiedenen Wegen ausgeführt werden. Zum Beispiel könnte der optische Empfänger 34 kooperativ aufgebaut und dimensioniert werden, um nach der Darstellung in FIGUR 3 das fluoreszierende Licht selektiv zu empfangen. Als Alternative kann eine Oeffnung mit vorbestimmten Abmessungen dazwischen geschaltet werden, ehe das fluoreszierende Licht den optischen Empfänger 34 erreicht, so dass nur das gewünschte fluoreszierende Licht durchgelassen wird,

03ÖÖ09/068S - 21-^

oder der dichroitische Reflektor 32 kann so aufgebaut und dimensioniert werden, dass er nur das gewünschte fluoreszierende Licht reflektiert, oder ähnliche derartige Mittel, die für eine in der Technik versierte Person auf der Hand liegen.

In FIGUR 4 ist die konkave' Spiegelfläche 14 wie in FIGUR 3 erweitert, um einen am ersten Brennpunkt 16 gebildeten Raumwinkel zu definieren, der grosser als der Raumwinkel von 2ΤΓ Raumwinkeleinheiten ist. In dieser Ausführung ist der Beleuchtungswinkel θ verkleinert, mit einer entsprechenden Vergrösserung im Fluoreszenzsammelwinkel φ. Es ist dabei zu beachten, dass der Fluoreszenzsammelwinkelφ diejenige Menge fluoreszierenden Lichts darstellt, die gesammelt werden kann, ohne dass die Beleuchtungsstrahlung soweit überlappt, dass sie zweimal von der konkaven Spiegelfläche 14 reflektiert wird und zum zweiten Brennpunkt 18 konvergiert. Er stellt in andern Worten nicht unbedingt das Ganze von der konkave Spiegelfläche 14 reflektierte fluoreszierende Licht dar. Die Spezifikation, dass die Beleuchtungsstrahlung auf den vorgewählten Bereich der konkaven Spiegelfläche 14 auftreffen soll, kann durch zahlreiche Mittel erfüllt werden, die für eine in der Technik versierte Person auf der Hand liegen, wie z.B. durch Ausstattung mit der Quelle 30 mit vorbestimmter Ausbildung und Abmessungen, wie in FIGUR 4, oder durch Anwendung einer begrenzenden Oe ff nung, die dazwischen geschaltet wird, um die Beleuchtungsstrahlung vor Auftreffen auf die konkave Spiegelfläche 14 zu begrenzen, oder indem ein dichroitischer Reflektor 32 mit vorbestimmter begrenzter Grosse vorgesehen wird, oder durch ähnliche gleichwertige Mittel.

Nach der Darstellung in den FIGUREN 3 und 4 kann es je nach der Art der untersuchten Zellen oder Teilchen wünschenswert sein, den Beleuchtungswinkel θ im Bezug auf den in FIGUR 2 dargestellten Raumwinkel von 2TT Raumwinkeleinheiten zu

* * η - 22 -

030009/0688

ORIGINAL INSPECTED

2930592$°

verringern oder zu vergrössern, bei einer dementsprechenden gleichwertigen Vergrösserung bzw. Verringerung des Fluoreszenzsammeiwinkels φ . - Bei einer Höchstmenge von, von einem relativ dunklen Feld gesammeltem fluoreszierenden Licht besteht folgende Beziehung zwischen der Sammlung und der Beleuchtung:

θ + φ = 4ττ
wobei O < Q < 4τΐ.

Das setzt voraus, dass die konkave Spiegelfläche 14 wo nötig erweitert wird, um je nach den Geboten der obigen Beziehung ausreichend fluoreszierendes Licht bzw. ausreichende einfallende Beleuchtungsstrahlung zu reflektieren. Es ist dabei jedoch zu beachten, dass eine geringfügige Ueberdeckung tragbar sein kann (d.h. θ + φ> 4ir Raumwinkeleinheiten), und in manchen Einsatzgebieten kann es wünschenswert sein, zwischen den Beleuchtungs- und Sammelwinkeln Zwischenräume zu besitzen (d.h. θ + $< 4n Raumwinkeleinheiten) .

Die Beziehung zwischem dem Beleuchtungswinkel θ und dem Fluoreszenzsammeiwinkel φ in den FIGUREN 2, 3 und 4 wird teilweise durch das Ausmass der Erweiterung der konkaven Spiegelfläche 14 bestimmt.

In der in FIGUR 5 dargestellten Abweichung von der ersten Ausführung kann sich die konkave Spiegelfläche 14 an den äusseren Enden des Fluoreszenzsammelwinkels φ und des Beleuchtungswinkels O vorbei ohne Beeinflussung der Wechselbeziehung zwischen den beiden erstrecken. In der Abänderung der FIGUR 5 ist eine erste lichtundurchlässige Sperre 41 mit einer ersten Oeffnung 42 und eine zweite lichtundurchlässige Sperre 43 mit einer zweiten Oeffnung 44 enthalten, um die Durchmesser des gesammelten fluoreszierenden Lichts bzw. der Beleuchtungsstrahlung zu regeln. Nach der Dar-

030009/0 8.8 8 - 23 - _

stellung in FIGUR 5 ergibt sich aus einer Durchmesservergrösserung 46 des Beleuchtungsstrahls eine entsprechende Durchmesserverkleinerung 48 in der verfügbaren fluoreszierenden Lichtsammlung, mit der keine Beleuchtungsstrahlung zusammengemischt ist. In FIGUR 5 ist die Durchmesservergrösserung 46 eine Vergrösserung, die den Strahldurchmesser überschreitet, bei dem der Beleuchtungswinkel θ 2ττ Raumwinkeleinheiten beträgt. Es wurde durch die Erfinder festgestellt, dass durch die Durchmesservergrösserung 46 eine Raumwinkelvergrösserung der Beleuchtung geschaffen wurde, die der durch die Durchmesserverkleinerung 48 verursachte Raumwinkelverkleinerung in der Fluoreszenzsammlung gleichwertig ist, und umgekehrt. Darüberhinaus behält dieses Kompromissverhältnis entsprechend der vorangegangenen Erläuterung über den gesamten Bereich der Kombinationen von Sammelwinkeln φ und Beleuchtungswinkeln O, die bei maximaler Sammlung von fluoreszierendem Licht ohne Ueberdeckung von einem Dunkelfeld insgesamt 4 Tr Raumwinkeleinheiten betragen, seine Gültigkeit. Diese Anordnung besitzt die Eigenschaft, dass man den Kompromiss zwischen den zwei Winkeln für verschiedene Teilchenarten und verschiedenartige Untersuchungen einstellen kann. Zum Beispiel können auswechselbare Paare der ersten und zweiten lichtundurchlässigen Sperren 41 bzw. 43 zur Einstellung der Sammel- und Beleuchtungswinkel benutzt werden. Derartige Paare von Sperren 41 und 43 würden so aufgebaut, dimensioniert und ausgerichtet werden, dass sie die Beleuchtungsstrahlung und das reflektierte fluoreszierende Licht mit dem vorangehend beschriebenen Kompromissverhältnis in Einklang bringen. Als Alternative können die lichtundurchlässigen Sperren 41 und 43 mit Oeffnungen 42 bzw. 44, z.B. Irisblenden, mit stufenlos veränderlichen Durchmessern versehen werden. Genauer gesagt könnten die Durchmesser jeder Oeffnung 42 und 44 individuell auf den gewünschten Wert eingestellt werden. Als Alternative könnte die Einstellung der beiden Durchmesser durch übliche, durch die Ziffer 50 gekennzeichnete Regel-

- 24 030009/0683

293Q593

mittel zur automatischen Aufrechterhaltung des gewünschten Kompromissverhältnisses zusammengekuppelt werden.

In FIGUR 6 wird eine zweite Ausführung der Sammelvorrichtung 10 dargestellt. In der zweiten Ausführung werden denen der ersten Ausführung ähnliche Elemente mit denselben Bezugsziffern gekennzeichnet. In dieser Ausführung besitzt der Sammelspiegel 12 eine konkave Paraboloidspiegelflache 52, deren Ausbildung einem Teil eines Rotationsparaboloids entspricht. Die Quelle 30 liefert auf einer optischen Achse 53 zentriertes kollimiertes Licht zur Reflektion von der Spiegelfläche 52, woraus sich die auf einen ersten Brennpunkt 54 fokussierte konvergierende Strahlung ergibt. Für diese Ausführung enthält die Vorrichtung 10 vorzugsweise ein Paar Linsen 55 und 56, obgleich anstelle der Linsen Reflektoren benutzt werden könnten. Bei dieser Ausführung ist ein zweiter (nicht dargesteller) Brennpunkt der konkaven Spiegelfläche 52 auf Unendlich eingestellt. Das führt bei Abgang des reflektierten fluoreszierenden Lichts von der konkaven Spiegelfläche 52 zur Kollimierung desselben. Daher sind idealerweise, aber nicht unbedingt, die Linsen 55 und 56 vorgesehen, um das fluoreszierende Licht zu einem dritten Brennpunkt 58 zu konvergieren. Dadurch wird vorzugsweise, aber nicht unbedingt, eine Positionierung der Lochöffnung 40 der lichtundurchlässigen Sperre 38 am dritten Brennpunkt 58 gestattet. Darüberhinaus wird durch Einbringen mindestens einer Linse im Strahlengang des fluoreszierenden Lichts Beleuchtungsstrahlung eliminiert, die normalerweise aus dem ersten Brennpunkt 54 ausstrahlen und auf den dichroitischen Reflektor 32 auftreffen würde. In dieser Ausführung ist der dichroitische Reflektor 32 idealerweise, aber nicht unbedingt, so vor den Linsen 55 und 56 angebracht, dass diese Linsen keine achromatischen Linsen zu sein brauchen. Es ist dabei zu verstehen, dass keine Absicht besteht, die vorliegende Erfindung auf irgendeine bestimmte Linsen- oder Reflek-

0300 09/0688 - 25 -

toranordnung oder eine beliebige Kombination derselben zur Handhabung des reflektierten fluoreszierenden Lichts oder Fokussierung der Beleuchtungsstrahlung zu beschränken, insofern, dass derartige Anordnungen viele unterschiedliche Gestaltungen annehmen können, die in der Technik versierten Personen bekannt sind. Der Beleuchtungswinkel θ und der Fluoreszenzsammlungswinkel φ sind beide, wie bei der ersten Ausführung, als gleich 2Tr angegeben. Genau wie bei der ersten Ausführung kann jedoch der Beleuchtungswinkel Θ, bei einer entsprechenden Vergrösserung bzw. Verkleinerung in dem Fluoreszenzsammelwinkel φ, verkleinert oder vergrössert werden, wobei angenommen wird, dass die konkave Spiegelfläche 52 erweitert ist. Ebenso liegt.eine geringe Ueberdeckuhg der Beleuchtung und der Fluoreszenzsammlung oder die Zwischenraumbildung im Rahmen der dargestellten Ausführungen. Auch können in dieser Ausführung wahlweise die lichtundurchlässigen Sperren 41 und 43 mit Oeffnungen 42 bzw. 44 nach Darstellung in FIGUR 5 enthalten sein.

In FIGUR 7 wird eine dritte Ausführung der Vorrichtung 10 dargestellt. Für die dritte Ausführung werden denen der ersten und zweiten Ausführungen ähnliche Elemente mit denselben Namen und Bezugsziffern gekennzeichnet. In dieser Ausführung enthält der Sammelspiegel 12 eine konkave Hyperboloidspiegelfläche 60, deren Ausbildung einem Teil eines Rotationshyperboloids entspricht. Dementsprechend wird um eine optische Achse 62 konvergierende Beleuchtungsstrahlung geliefert, die von der konkaven Spiegelfläche 60 reflektiert wird und danach auf einen ersten Brennpunkt 64 konvergiert. Ein zweiter Brennpunkt 66 der konkaven Spiegelfläche 60 ist ein virtueller Brennpunkt, und das reflektierte fluoreszierende Licht kommt daher auf divergierende Weise von der konkaven Spiegelfläche 60. Die als Beispiel angeführte Linsenanordnung der FIGUR 7 enthält die Linsen 68 und 70. Diese Linsen 68 und 70 haben den Doppelzweck, kollimierte Beleuchtungsstrahlung der Beleuchtungs-

030009/0 68 8 - ²⁶ -

quelle 30 zu entnehmen und sie dann in die zum Brennpunkt 66 konvergierende Beleuchtungsstrahlung zu formen und gleichzeitig einen dritten Brennpunkt 72 zu liefern. Wie vorangehend in der Besprechung der anderen Ausführungen beschrieben, gestattet diese Art Linsenanordnung, dass das fluoreszierende Licht zum dritten Brennpunkt 72 konvergiert wird, um durch die in der lichtundurchlässigen Sperre 38 gebildete Lochöffnung 40 gefiltert zu werden. Auch besteht für die Zwecke der Fluoreszenzlichtsammlung ein nachträglicher Vorteil darin, dass die Beleuchtungsstrahlung, die am ersten Brennpunkt 64 vorbeigelangt, nicht die Oeffnung 40 durchläuft, wodurch zerstreute Beleuchtungsstrahlung, die sonst auf den dichroitischen Reflektor 32 hätte auftreffen können, eliminiert wird. ' Die in dieser Ausführung verkörperte vorliegende Erfindung kann wie bei den anderen Ausführungen mit anderen Linsen- oder gleichwertigen Reflektoranordnungen benutzt werden, die für eine in der Technik versierte Person auf der Hand liegen wurden. Wie bei den anderen beiden Ausführungen besitzt diese in der Zeichnung dargestellte Ausführung einen Beleuchtungswinkel θ von 2ΤΓ Raumwinkeleinheiten und einen gleichgrossen Fluoreszenzsammelwinkel φ von 2ir Raumwinkeleinheiten. Auch kann wie bei allen Ausführungen die konkave Spiegelfläche 60 erweitert werden, damit der Beleuchtungswinkel bei einer entsprechenden Verkleinerung oder Vergrösserung des Fluoreszenzsammelwinkels vergrössert bzw. verkleinert werden kann. Ebenso liegt eine geringe Ueberdeckung der Beleuchtung und der FluoreszenzSammlung oder der Zwischenraumbildung im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Gleicherweise können in dieser Ausführung wahlweise die lichtundurchlässigen Sperren 41 und 43 mit Oeffnungen 42 bzw. nach Darstellung in FIGUR 5 enthalten sein.

Unter Bezugnahme auf die Zeichnungen im allgemeinen, stellen die Figuren eine dreidimensionale Vorrichtung in Querschnitten dar, die die Schnittstellen der Vorrichtung 10 mit einer

- 27 030009/0688

die optische Achse 20, 53 oder 62 durchlaufenden Ebene darstellen. Man kann daraus schliessen, dass die Vorrichtung 10 Rotationssymetrie besitzt. Das ist u.U. im allgemeinen nicht der Fall. In der Tat können die, in den Figuren zweidimensional erscheinenden Winkel θ und φ aus Funktionen eines Winkels zwischen der Ebene der Figuren und einer, der optischen Achse entlang blickenden Bezugslage ausgelegt werden, so dass ihre Summe bei Rotierung dieses dritten Winkels von Null Grad bis 360 Grad konstant bleibt. Natürlich sind die bei Rotierung dieses dritten Winkels bis 36O Grad von θ und φ durchstrichenen Raumwinkel die Raumwinkel, auf die bislang Bezug genommen worden ist. Die optischen Oeffnungen 42 und 44 brauchen daher nicht kreisförmig zu sein und können beispielsweise (entlang der optischen Achse gesehen) elliptisch oder rechteckig ausgebildet sein, um die gewünschte Funktion von θ im Bezug auf z.B. den dritten Winkel zu erzeugen und ihr zu entsprechen. Die Vorrichtung wird so lange der Beschreibung entsprechend funktionieren, wie alle Abschnitte einschliesslich der optischen Achse einer der Figuren entsprechende Erscheinungsform besitzen.

Zwecks gattungsmässiger Zusammenfassung der Strahlungsilluminator- und Sammlungsvorrichtung 10 wird die Vorrichtung 10 funktions- und strukturmässig in groben Umrissen in einem Blockschema in FIGUR 8 dargestellt. Die Vorrichtung 10 besteht aus dem Sammelspiegel 12 mit einer konkaven Spiegelfläche, die vorstehend als eine von mehreren möglichen konischen Rotationsprofilen oder gleichwertige mit dem ersten Brennpunkt und dem zweiten Brennpunkt beschrieben worden ist. Nach der Darstellung der FIGUR 8 liefert eine Teilchenquelle 74 einen Strom von Teilchen die durch (als I gekennzeichnete) Beleuchtungsstrahlung am ersten Brennpunkt illuminiertwerden, wobei diese Teilchen danach weiter zum Teilchenausgang 76 gelangen. Beleuchtungsmittel liefern und lenken geordnete Beleuchtungsstrahlung

030009/0888

auf den Sammelspiegel 12 zu. Je nach der vorstehend beschriebenen Ausführung können die Beleuchtungsmittel die entsprechende Strahlung entweder konvergieren, divergieren oder kollimiert liefern, die am ersten Brennpunkt nach Reflektion vom Sammelspiegel 12 konvergiert. Die Organisationsart hängt eindeutig von der benutzten Art des Sammelspiegels 12 ab, da die Kombination der beiden eine Strahlung hervorruft, die am ersten Brennpunkt konvergiert. Auf Grund dieser konvergierenden Strahlung wird der Teilchenstrom am ersten Brennpunkt illuminiert, um die resultierende fluoreszierende Strahlung einschliesslich von Licht (als F gekennzeichnet) hervorzurufen, die aus dem ersten Brennpunkt ausstrahlt. Obwohl das stimulierte fluoreszierende Signal hier als "fluoreszierendes Licht"'beschrieben wurde, kann das fluoreszierende Signal in der Form anderer Arten strahlender Energie oder Strahlung erscheinen. Die Beleuchtungsmittel bestehen aus der Quelle 30 einer Beleuchtungjdie durch ein Fokussiersyst em 78 gelangt, wobei dieses Fokussiersystem 78 die auf den Sammelspiegel 12 gerichtete, auf der optischen Achse des Sammelspiegels 12 angeordnete geordnete Strahlung liefert. Das Fokussiersystem 78 enthält vorangehend beschriebene übliche Linsen- oder Reflektoranordnungen, die zahlreiche, in der Technik bekannte Ausbildungsformen besitzen können. Die Beleuchtungsquelle 30 kann die üblichen Formen kohärenter und inkohärenter, zur Teilchenbestrahlung benutzter Strahlung liefern, wie z.B. Laser oder eine Quecksilberhochdrucklampe, und kann Farbfilter enthalten. Die Beleuchtungsstrahlung divergiert hinter dem ersten Brennpunkt, während das resultierende fluoreszierende Licht vom Sammelspiegel 12 reflektiert und auf den zweiten Brennpunkt, der entweder wie in den ersten und zweiten Ausführungen reell oder wie in der dritten Ausführung virtuell ist, fokussiert wird. Dieses vom Sammelspiegel 12 kommende fluoreszierende Licht wird durch Strahlungstrennungsmittel 80 von der auf den Sammelspiegel 12 zulaufenden Beleuchtungsstrahlung abgetrennt, wodurch das fluores-

- 29 030OÖ9/0888

zierende Licht vom optischen Empfänger ~$k eingesammelt werden kann. Das Fokus si er sy stern 78 kann wahlweise Mittel enthalten, die verhindern, dass ein Teil der divergierenden, auf den optischen Empfänger 34 zulaufenden Beleuchtungsstrahlung diesen erreicht. Die Trennnungsmittel 80 können das fluoreszierende Licht reflektieren oder ablenken und die Beleuchtungsstrahlung durchlassen, oder umgekehrt, und werden daher allein für Darstellungszwecke in den verschiedenen Zeichnungen unterschiedlich dargestellt.

In der praktischen Anwendungsform des StrahlungsSammlers sind die hier beschriebenen Brennpunkte wie z.B. 16 und 18 in Wirklichkeit Brennzonen und nicht theoretische Punkte. In den bevorzugten Ausführungen kann die Schnittstelle des korpuskularen Stoffes, die mehrere Teilchen breit sein kann, mit der Beleuchtungsstrahlung am ersten Brennpunkt 16 eine "Erfassungszone" für die Strahlung schaffen, die in den bevorzugten Ausführungen einen Raum von typisch 10 000 \p einnimmt. Genauer gesagt entsteht diese "Erfassungszone" durch die endlichen Abmessungen und die etwas zerstreute (z.B. Gaußsche), mit dem Weg der korpuskularen Suspension zusammengerollte Verteilung der Strahlung. Diese Zone am ersten Brennpunkt ist um einen mathematischen, infinitesimal kleinen Brennpunkt zentriert und wird in den Zeichnungen als einzelner Punkt dargestellt. Es ist in der Technik wohlbekannt, dass eine am ersten Brennpunkt eines Ellipsoids zum Beispiel zentrierte Zone eine entsprechende, am zweiten Brennpunkt des Ellipsoids zentrierte Strahlungszone hervorruft. Obwohl der Begriff "Brennpunkt" für Darstellungszwecke in den Zeichnungen als geometrischer Punkt gekennzeichnet worden ist, bezieht er sich auf eine allgemein um einen infinitesimal kleinen Brennpunkt zentrierte Brennzone.

Patentanwälte Dipl.-Ing. E. Edor ffng. K. Sch

8 Manchen 40,γ:ϊ. -.

030009/0888

Claims

PatentwwrlH·

Dipl.-Ing. E. Eder ο η r> η C Q 3

Dlpl-lng. K. Schleschke * 3 >5 U 0 3 0

Minchen 40, ElisabetfwtraBeM

COULTER ELECTRONICS, INC. Hialeah/Plorida
U.S.A.

Illuminator- und Sammelvorrichtung für Fluoreszenzanalyse

Patentanspruch :

Illuminator- und Sammelvorrichtung (10) für Fluoreszenzanalyse, in der Beleuchtungsmittel (30) durch Bestrahlung eines Teilchenstroms mit Beleuchtungsstrahlung eine fluoreszierende Strahlung erregen und Strahlungstrennungsmittel (32) die fluoreszierende Strahlung von der Beleuchtungsstrahlung abtrennen, gekennzeichnet durch: einen Sammelspiegel (12) mit einer konkaven Spiegelfläche (14; 52; 60) mit einem ersten Brennpunkt (16; 54; 64) und einem zweiten Brennpunkt (18; 66), wobei der besagte erste Brennpunkt (16; 54; 64) im schneidenden Verhältnis zum Teilchenstrom angeordnet ist; die besagten Beleuchtungsmittel (30) die geordnete Beleuchtungsstrahlung so auf die konkave Spiegelfläche (14; 52; 60) auftreffen lassen, dass die Beleuchtungsstrahlung nach Reflektion von der besagten konkaven Spiegelfläche (14; 52; 60) auf den besagten ersten Brennpunkt (16; 54; 64) konvergiert, wodurch

030009/0688

-Z-

die Teilchen am ersten Brennpunkt (16; 54; 64) durch die van der besagten kcnkaven Spiegelfläche (14; 52; 60) kommenden Beleuchtungsstrahlung aus verschiedenen Richtungen illuminiert werden; und wobei die besagten Strahlungstrennungsmittel (32) die von der besagten konkaven Spiegelfläche (14; 52; 60) reflektierte fluoreszierende Strahlung von der auf die besagte konkave Spiegelfläche (14; 52; 60) gerichteten Beleuchtungsstrahlung abtrennen können, wodurch die fluoreszierende Strahlung aus dem besagten ersten Brennpunkt (16; 54; 64) austritt, von der besagten konkaven Spiegelfläche (14; 52; 60) so reflektiert wird, dass sie auf den besagten zweiten Brennpunkt (18; 66) fokussiert wird und von der Beleuchtungsstrahlung zwecks nachfolgender Erfassung abgetrennt wird.
2. Illuminator- und Sammelvorrichtung (10) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die besagte konkave Spiegelfläche 0-4; 52; 60) eine im wesentlichen ellipsoidförmige Gestaltung (14) besitzt.
3. Illuminator- und Sammelvorrichtung (10) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die besagte konkave Spiegelfläche (14; 52; 60) eine im wesentlichen paraboloidförmige Gestaltung (52) besitzt, wobei der besagte zweite Brennpunkt auf Unendlich angeordnet ist.
4. Illuminator- und Sammelvorrichtung (10) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die besagte konkave Spiegelfläche (14; 52; 60) eine im wesentlichen hyperboloidförmige Gestaltung (60) besitzt, wobei der besagte zweite Brennpunkt ein virtueller Brennpunkt ist.

030009/0688

OFUQiNAL INSPECTED
5. Illuminator-· und Sammelvorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der besagte erste Brennpunkt (16; 54; 64) und der besagte zweite Brennpunkt (18; 66) in der besagten konkaven Spiegelfläche (14; 52; 60) eine optische Achse (20; 53; 52) definieren und die besagten Strahlungstrennungsmittel (32) auf der besagten optischen Achse (20; 53; 62) angeordnet sind.
6. Illuminator- und Sammelvorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 5, weiterhin gekennzeichnet durch eine, in einer ersten im Fluoreszenzlicht-Empfangsverhältnis zur besagten konkaven Spiegelfläche (14; 52; 60) angeordneten Sperre (41) gebildete erste Oeffnung (42).
7. Illuminator- und Sammelvorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 6, weiterhin gekennzeichnet durch eine, in einer zweiten zum Empfangen der Beleuchtungsstrahlung vor Ankunft der Beleuchtungsstrahlung an der besagten konkaven Spiegelfläche (14; 52; 60) angeordneten Sperre (43) gebildete zweite Oeffnung (44),
8. Illuminator- und Sammelvorrichtung (10) nach Anspruch 6 oder 7, weiterhin gekennzeichnet durch Mittel (50) zur Veränderung der Grosse mindestens einer der besagten ersten und zweiten Oeffnungen (42, 44).
9. Illuminator- und Sammelvorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 5, weiterhin gekennzeichnet durch Mittel (43; 44) zum Begrenzen der auf die besagte konkave Spiegelfläche (14; 52; 60) gerichteten geordneten Beleuchtungsstrahlung auf einen vorbestimmten, mit dem besagten

- 4 03000Ö/0688

ersten Brennpunkt (16; 54; 64) gebildeten räumlichen Beleuchtungswinkel .
10. Illuminator- und Sammelvorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 5, weiterhin gekennzeichnet durch Mittel (41; 42) zum Begrenzen der, von der besagten konkaven Spiegelfläche (14; 52; 60) reflektierten fluoreszierenden Strahlung auf einen vorbestimmten, mit dem besagten ersten Brennpunkt (16; 54; 64) gebildeten räumlichen Sammelwinkel.
11. Illuminator- und Sammelvorrichtung- (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 5, weiterhin gekennzeichnet durch Mittel (41; 42) zum Begrenzen der, von der besagten konkaven Spiegelfläche reflektierten fluoreszierenden Strahlung auf einen, mit dem besagten ersten Brennpunkt gebildeten räumlichen Sammelwinkel, der im wesentlichen gleich 4"TT Raumwinkeleinheiten weniger den besagten räumlichen Beleuchtungswinkel beträgt.
12. Illuminator- und Sammelvorrichtung (10) nach einem der Ansprüche 1 bis 11, weiterhin gekennzeichnet durch Mittel (38; 40) zum Abtrennen der vom ersten Brennpunkt (16;54;64) dieser divergierenden Beleuchtungsstrahlung von der von der konkaven Spiegelfläche (14; 52; 60) reflektierten fluoreszierenden Strahlung.
13. Verfahren zur Beleuchtung eines Teilchenstroms zum Stimulieren der Ausstrahlung einer fluoreszierenden Strahlung, dadurch gekennzeichnet, dass die einen ersten Brennpunkt einer konkaven Spiegelfläche durchlaufenden Teilchen durch Reflektion einer geordneten Beleuchtungs- ·

- 5 03000970688

strahlung von der konkaven Spiegelfläche so beleuchtet werden, dass die Beleuchtungsstrahlung auf den ersten Brennpunkt konvergiert, dass die von der konkaven Spiegelfläche reflektierte fluoreszierende Strahlung von der aus dem ersten Brennpunkt divergierendaiBeleuchtungsstrahlung abgetrennt wird, und dass die von der konkaven Spiegelfläche reflektierte und auf einen zweiten Brennpunkt der konkaven Spiegelfläche fokussierte fluoreszierende Strahlung eingesammelt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchen) im Bezug auf den ersten Brennpunkt über einen vorbestimmten räumlichen Beleuchtungswinkel illuminiert v/erden, und dass das fluoreszierende Licht im Bezug auf den ersten Brennpunkt über einen räumlichen Sammelwinkel eingesammelt wird, der im wesentlichen gleich 4-<. Raumwinkeleinheiten weniger den räumlichen Beleuchtungswinkel beträgt.
15. Verfahren nach Anspruch 14, weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass der räumliche Beleuchtungswinkel bei entsprechender Verkleinerung des räumlichen Fluoreszenzsammelwinkels vergrössert wird, bis die für verlässliche Fluoreszenzsignale benötigte Beleuchtung erreicht ist.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass der Querschnittsbereich der auf die konkave Spiegelfläche gerichteten Beleuchtungsstrahlung eingestellt wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass der Querschnittsbereich der

- 6 030009/0688

~⁶~

von der konkaven Spiegelfläche reflektierten fluoreszierenden Strahlung eingestellt wird.

030009/0688