DE2924249C2 - Spezifische bindungs-untersuchungsmethode zur bestimmung eines liganden in einem fluessigen medium und reagentien zur durchfuehrung dieser methode - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Bestimmungsmethode vom homo­ genen spezifischen Bindungstyp zur qualitativen oder quantitativen Bestimmung eines Liganden in einem flüssigen Medium und Reagentien dazu. Die Erfindung betrifft insbe­ sondere spezifische Bindungs-Untersuchungsmethoden unter Anwendung von nicht-radioisotopischen Markierungen und zwar durch FAD. Weiterhin werden beschrieben nicht-radioisotop markierte Konjugate für die Verwendung bei solchen Bestimmun­ gen und Verfahren zu deren Herstellung.

Bei üblichen spezifischen Bindungs-Untersuchungsmethoden wird die Testprobe mit einem Reagenz unterschiedlicher Zusammensetzung vereint, wobei das Reagenz ein Konjugat mit einer nachweisbaren Markierungskomponente und einer Bindungskomponente, die mit gegebenenfalls vorhandenen anderen Bestandteilen des Reagenzes unter Bildung eines Bindungsreaktionssystems reagiert, unter Ausbildung von zwei Spezies oder Formen des markierten Konjugats, nämlich einer gebundenen Spezies und einer freien Spezies ist. Die relativen Mengen oder Anteile des markierten Konjugats in der gebundenen Spezies, verglichen zu denen in der freien Spezies sind eine Funktion der Anwesenheit (oder der Menge) des in der Probe nachzuweisenden Liganden.

Zur Erläuterung soll eine übliche kompetitive Bindungs- Untersuchungsmethode nachfolgend beschrieben werden. Bei einer solchen Methode besteht das Reagenz aus (1) einem markierten Konjugat in Form des nachzuweisenden Liganden (z. B. einem Antigen oder Hapten), wobei dieser Ligand die Bindungskomponente des Konjugats darstellt, chemisch verknüpft an eine Markierungskomponente, und (2) einem spezifischen Bindungspartner für den Liganden (z. B. einem Antikörper). Bei Vereinigung der Probe und des Reagenzes würde der nachzuweisende Ligand und die Bin­ dungskomponente des markierten Konjugats in einer im we­ sentlichen nicht diskriminierenden Weise im Wettbewerb um eine nicht kovalente Bindung an den spezifischen Bin­ dungspartner stehen. Als Ergebnis kann entweder die Menge des markierten Konjugats, die an den Bindungspartner ge­ bunden würde (d. h. die Ergebnisse mit der gebundenen Spe­ zies) oder die Menge die frei bleibt (d. h. die nicht an den Bindungspartner gebunden ist und somit die freie Spe­ zies ergibt) als Funktion der Menge der im Wettbewerb stehenden vorhandenen Liganden gemessen werden. Die Menge an mar­ kiertem Konjugat, die sich aus einer der beiden Spezies ergibt, wird durch Messung, z. B. durch Überwachung der da­ rin vorhandenen markierten Komponente, bestimmt.

Wenn das markierte Konjugat in der gebundenen Spezies und das in der freien Spezies im wesentlichen durch die Mittel, die beim Überwachen der Markierungskomponente verwendet werden, nicht unterscheidbar sind, müssen die gebundene Spezies und die freie Spezies physikalisch voneinander ge­ trennt werden, um die Bestimmungsmethode durchzuführen. Diese Art der Untersuchung wird als "heterogen" bezeich­ net. Kann man die gebundene Spezies und die freie Spezies des markierten Konjugats unterscheiden, so erfolgt eine "homogene" Bestimmung, wobei die Trennstufe vermieden wird.

Die erste entdeckte Art einer hochempfindlichen spezifi­ schen Bindungs-Untersuchungsmethode war die Radioimmunoassay, bei welcher radioaktive Isotopen als Markierungskomponente verwendet werden. Eine solche Untersuchungsmethode muß zwangsläufig die heterogene Methode anwenden, weil der nachweisbare Charakter der Markierung qualitativ in der freien und in der gebundenen Spezies unverändert bleibt. Wegen der Unbequemlichkeit und der Schwierigkeit bei der Handhabung von radioaktiven Stoffen sind viele neue Unter­ suchungssysteme entwickelt worden, bei welchen man keine Radioisotopen für die Markierungskomponente verwendet, ein­ schließlich Enzyme, Fluoreszenzmoleküle, Baktereophage, Metall- und Organometallkomplex, Coenzyme, Enzymsubstrate, Enzyminhibitoren, cyclische Reaktanten und chemilumineszente Reaktanten.

Nachfolgend wird eine Reihe von heterogenen Bindungsreak­ tionssystemen beschrieben, bei denen man ein Enzym als Markierungskomponente anwendet: US-Patentschriften 36 54 090, 37 91 932, 38 39 153, 38 50 752 und 38 79 262, J. Immunol. Methods 1 : 247 (1972) und J. Immunol. 109 : 129 (1972). In der US-PS 38 80 934 wird eine heterogene Bin­ dungs-Untersuchungsmethode beschrieben, bei welcher ein nicht-aktiver Vorläufer einer spektrofotometrisch nachweisbaren Substanz als Markierungssubstanz verwendet wird. Weitere Informationen hinsichtlich heterogener Un­ tersuchungsmethoden finden sich in Principles of Competi­ tive Protein-Binding Assays von Odell und Daughaday (J. B. Lippincott Co., Philadelphia (1972)).

Ein enzymmarkiertes Immunoassay vom homogenen Typ wird in US-PS 38 17 834 beschrieben, wobei man ein Ligand- Enzym-Konjugat verwendet. Die enzymatische Aktivität des Konjugats bei der gebundenen Spezies ist meßbar geringer als in der freien Spezies und dadurch läßt sich eine homogene Analyse durchführen. Die Verwendung von ganz besonders eigenartigen Materialien als Markierungssubstan­ zen, einschließlich Coenzyme, chemilumineszente Moleküle, cyclische Reaktanten und spaltbare Fluoreszent-Enzymsub­ strate bei sowohl homogenen als auch heterogenen Verfahren, wird in den DE-OS 26 18 419 und 26 18 511 beschrieben.

Obwohl eine Reihe von durchführbaren Lösungen bei der Suche nach nicht-radioisotopen Markierungen in Bindungs- Untersuchungsmethoden gefunden wurden, bleibt doch noch Raum für weitere Verbesserungen. Die enzymmarkierten Vorschläge schienen zunächst am vielversprechendsten zu sein, jedoch ist in der Praxis eine Reihe von Schwierig­ keiten aufgetaucht. Das hohe Molekulargewicht und die he­ terologe Art von Enzymen ergibt Probleme bei der Charakte­ risierung, Stabilisierung und Reproduzierbarkeit der Herstellung der markierten Konjugate. Diese Probleme wur­ den überwunden durch den Einsatz der Enzymmarkierungen durch Markierungen mit niedrigem Molekulargewicht, die durch ihre Reaktantaktivität überwachbar sind. Diese neuen Markierungen, einschließlich Coenzyme, Enzymkon­ zentrate, cyclische Reaktanten und chemilumineszente Reak­ tanten können in Untersuchungsmethoden mit hoher Empfind­ lichkeit und Vielseitigkeit angewendet werden. Aber der Nachweis dieser Markierungen macht häufig besondere Geräte erforderlich, wie man sie nicht allgemein in klini­ schen Laboratorien findet.

Es ist ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung, eine nicht-radioisotope Bindungs-Untersuchungsmethode zu zei­ gen, bei der eine neue Markierung angewendet wird, die nach­ gewiesen werden kann mit den Laboratoriumsausrüstungen in üblichen Krankenhäusern, wobei aber die Vorteile und die Empfindlichkeit der Reaktantmarkierung und auch die Vielseitigkeit und Leichtigkeit der Synthese und der Charakterisierung der markierten Konjugate beibehalten wird.

Es wurde gefunden, daß eine verbesserte spezifische Bin­ dungs-Untersuchungsmethode vorliegt, wenn man einen orga­ nischen prosthetischen Gruppenrest als Markierungskomponen­ te in dem markierten Konjugat verwendet, und zwar im vor­ liegenden Fall das Flavin-adenin-dinukleotid (FAD). Prosthetische Gruppen sind eine bekannte Klasse von Enzymcofaktoren. Ein Enzymcofaktor ist eine nicht-proteinische Substanz, deren Gegenwart von einem Enzym benötigt wird, damit die­ ses seine katalytische Aktivität entwickeln kann und wel­ ches während des katalytischen Zyklus des in betracht kommenden Enzyms (als Eltern-Enzym bezeichnet) eine chemi­ sche Veränderung erfährt. Ein Coenzym ist ein Typ eines Enzymcofaktors, welcher chemisch modifiziert wird im Laufe der durch das Eltern-Enzym katalysierten Reaktion. Die Regenerierung der ursprünglichen Form des Cofaktors macht dessen Teilnahme in einer getrennten Reaktion, die von einem Enzym, welches von dem Eltern-Enzym unter­ schiedlich ist, katalysiert wird, erforderlich. Dagegen ist eine prosthetische Gruppe ein Enzymcofaktor, der chemisch modifiziert wird im Laufe der Reaktion, welche durch das Eltern-Enzym katalysiert wird und der regene­ riert wird, z. B. in seine ursprüngliche Form durch eine zweite Reaktion, die durch das gleiche Eltern-Enzym ka­ talysiert wird.

Prosthetische Gruppen sind im allgemeinen dadurch gekenn­ zeichnet, daß sie relativ fest an den Proteinteil des Eltern-Enzyms gebunden sind, wobei der Proteinteil als Apoenzym bezeichnet wird und das katalytisch aktive El­ tern-Enzym als Holoenzym bezeichnet wird. Die Gleich­ gewichtsreaktion für die Reaktion zwischen einer prosthe­ tischen Gruppe und einem Apoenzym läßt sich wie folgt ausdrücken:

Nachfolgend bedeutet der Ausdruck "konjugiertes Enzym" einen Komplex, der durch Kombination der prosthetischen Gruppe FAD mit dem Apoenzym Apoglucoseoxidase gebildet wird, unabhängig davon, ob ein solcher Komplex eine katalytische Aktivität auf­ weist oder nicht, und der Ausdruck "Holoenzym" bedeutet nur ein katalytisch aktives, konjugiertes Enzym. Weitere Informationen hinsichtlich der prosthetischen Gruppen, deren Eigenschaften und deren Reaktionen mit Apoenzymen können aus der Literaturstelle Dixon und Webb, Enzymes, 1. Ausgabe, Longmans, Green (London 1958) entnommen werden.

Erfindungsgemäß wird die organische prosthetische Gruppe FAD an eine Bindungskomponente gekuppelt unter Bildung eines markierten Konjugats für die Verwendung in Bindungs-Unter­ suchungsmethoden. Ein bestimmendes Merkmal der Erfindung liegt in der eintretenden Reaktion zwischen der konjugier­ ten prosthetischen Gruppe und dem Apoenzym Apoglucoseoxidase, die wie folgt gekennzeichnet werden kann:

Es gibt eine Reihe von möglichen Markierungs-Nachweis­ schemen, von denen einige nachfolgend beschrieben wer­ den und die verschiedenen homogene und heterogene Bin­ dungsreaktionen anwenden. In allen Fällen besteht jedoch die Markierungskomponente des markierten Konjugats, welches an der Bindungsreaktion teilnimmt, aus einem organischen prosthetischen Gruppenrest, und das Nachweisschema besteht darin, daß man die Markierungskomponente in der gebun­ denen Spezies oder in der freien Spezies oder in beiden, je nach Fall, nachweist, basierend auf Messung der Holo­ enzymaktivität.

Prosthetischer Gruppenrest, der erfindungsgemäß als Rest verwendet wird, ist das Flavin-adenin-dinukleotid. Prosthe­ tischer Gruppenrest/Apoenzym-Paar ist das Flavin-adenin- dinukleotid/Apoglucoseoxidase. Das jeweils aus diesem Paar gebildete Holoenzym läßt sich leicht durch bekannte Wasserstoffperoxidmessungsverfahren, einschließlich colo­ rimetischer und fluorimetrischer Methoden, nachweisen. Aufgrund der katalytischen Art in dem überwachten Holo­ enzym wird die Gegenwart der Markierungskomponente um ein Vielfaches bei der Überwachungsreaktion verstärkt und ermöglicht dadurch einen hochempfindlichen Nachweis des Liganden bei der Untersuchung (z. B. in Mengen von ng/ml), unter Anwendung von verhältnismäßig unempfindlichen aber leicht verfügbaren und einfachen Geräten, wie Spektrofoto­ metern. Die Kombination der Fähigkeit, prosthetische Grup­ pen mit niedrigem Molekulargewicht als Komponente zu ver­ wenden, durch welche die Markierung an die Bindungskompo­ nente in dem markierten Konjugat gekuppelt wird und der Fähigkeit, einen hochempfindlichen Nachweis spektrofoto­ metrisch, insbesondere colorimetrisch durchzuführen, er­ gibt ganz besondere Vorteile bei diesem spezifischen Bin­ dungsverfahren.

Die vorliegende Nachweiseinrichtung und das Verfahren sind dadurch gekennzeichnet, daß sie hochempfindliche Nachweisgrenzen haben, die man leicht automatisch überwa­ chen kann, indem man die Markierung mit solchen Instru­ menten überwacht, wie sie üblicherweise in klinischen Laboratories vorhanden sind und wobei man die markierten Konjugate anwendet, die leicht reproduzierbar und leicht synthetisierbar sind.

In der vorliegenden Beschreibung haben die nachfolgenden Ausdrücke, wenn nicht anders angegeben, die folgende Be­ deutung: "Ligand" ist die Substanz oder eine Klasse von verwandten Substanzen, deren Gegenwart oder deren Menge in einem flüssigen Medium bestimmt werden soll; "spezifi­ scher Bindungspartner des Liganden" sind alle Substanzen oder alle Substanzklassen, die eine spezifische Bindungs­ affinität an den Liganden unter Ausschluß an andere Sub­ stanzen haben; "spezifisches Bindungsanalog des Liganden" sind alle Substanzen oder Substanzklassen, die sich im wesentlichen wie der Ligand selbst verhalten, hinsichtlich der Bindungsaffinität des spezifischen Bindungspartners für den Liganden; "Rest" steht für FAD (in einem FAD-Ligand-markierten Konjugat bedeutet FAD den Rest des prosthetischen Gruppen- Flavin-adenin-dinukleotids); "Reagenz" ist eine Zusammen­ setzung, eine Vorrichtung oder eine Untersuchungsein­ richtung, welche die Reagentien zur Durchführung des Nachweisverfahrens enthält; "Nachweisreaktion" ist die Reaktion, mittels welcher die markierte Komponente des markierten Konjugats durch Messung der Holoenzymakti­ vität bestimmt wird; "Niedrigalkyl" ist eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen einschließlich, wie eine Methyl-, Ethyl-, Isopropyl- oder Hexylgruppe.

Das vorliegende Nachweisverfahren kann zum Bestimmen eines jeden Liganden verwendet werden, für welches es einen spezifischen Bindungspartner gibt. Der Ligand ist üblicherweise ein Peptid, Protein, Kohlenwasserstoff, Glycoprotein, Steroid oder ein anderes organisches Mole­ kül, für das in einem biologischen System ein spezifischer Bindungspartner existiert oder synthetisiert werden kann. Der Ligand ist, funktionell ausgedrückt, im all­ gemeinen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Antigenen und Antikörpern dazu, Haptenen und Antikörpern dazu und Hormonen, Vitaminen, Metaboliten und pharmazeutischen Arzneimitteln und deren Rezeptoren und Bindungssubstanzen; spezifische Beispiele für solche Liganden, die gemäß der Erfindung nachgewiesen werden können, sind Hormone, wie Insulin, chorionisches Gonadotropin, Thyroidhormone und Östriol; Antigene und Haptene, wie Ferritin, Bradykinin, Prostaglandine und tumorspezifische Antigene; Vitamine, wie Biotin, Vitamin B₁₂, Folsäure, Vitamin E, Vitamin A und Ascorbinsäure; Metabiliten, wie 3′,5′-Adenosinmono­ phosphat und 3′,5′-Guanosinmonophosphat; pharmazeutische Mittel und Arzneimittel, wie Anticonvulsantien, Broncho­ dilatoren, cardiovaskuläre Mittel und Drogen; Antikörper, wie mikrosomische Antikörper und Antikörper gegenüber Hepatitis und Allergenen; und spezifische Bindungsrezep­ toren, wie thyroxinbindendes Globulin, Avidin, intrinsi­ scher Faktor und Transcobalamin. Der vorliegende Nach­ weis ist besonders geeignet zum Nachweis von Haptenen und deren Analogen mit einem Molekulargewicht zwischen 100 und 1000, insbesondere der Jodothyroninthyroidhormone Thyroxin und Liothyronin.

Das zu untersuchende flüssige Medium kann eine natür­ lich vorkommende oder eine künstlich gebildete Flüssigkeit sein, von der man annimmt, daß sie den Liganden ent­ hält, und ist im allgemeinen eine biologische Flüssigkeit oder eine Flüssigkeit, die durch Verdünnung oder eine andere Behandlung daraus gebildet wird. Biologische Flüssigkeiten, die erfindungsgemäß untersucht werden können schließen Serum, Plasma, Urin, Saliva und amniotische und cerobrospinale Flüssigkeiten ein. Andere Stoffe, wie feste Stoffe, z. B. Gewebe, können nachgewiesen wer­ den, indem man sie in eine flüssige Form bringt, z. B. durch Auflösen dieses Feststoffs in einer Flüssigkeit oder durch Flüssigextraktion des Feststoffs.

Markierte Konjugate

Die markierten Konjugate der vorliegenden Erfindung enthalten den organischen prosthetischen Gruppenrest FAD als Markierungskomponente und können in den beiden Grundformen, die schematisch angegeben sind, vorkommen:

schematische Formel
Markierungskomponente
Pr-R-L
prosthetische Gruppenreste (Pr-)
Apo-Pr-R-L	Holoenzym- oder konjugierter Enzymrest (Apo-Pr-)

worin Pr den prosthetischen Gruppenrest FAD und Apo das Apo­ enzym Apoglucoseoxidase, R eine Verbindungsgruppe und L die Bindungskompo­ nente des markierten Konjugats, im allgemeinen den Ligan­ den oder ein Bindungsanalog davon, bedeuten. Im allge­ meinen wird die Bindungskomponente und der prosthetische Gruppenrest durch eine Bindungsgruppe an einer Stelle der ersteren, die von deren spezifischem Bindungsort (z. B. dem Ort an der Bindungskomponente, die an der Unter­ suchungs-Bindungsreaktion teilnimmt, wie einer immunochemi­ schen Bindungsstelle, wo die Bindungskomponente ein Anti­ gen, Hapten oder ein Antikörper dazu ist) erfaßt ist und an einer Stelle der letzteren, die von deren aktiven Bindungsstelle für das Apoenzym entfernt ist, gekuppelt.

Nachweisverfahren

Es gibt verschiedene mögliche Verfahren zum Nachweis der neuen markierten Konjugate gemäß der Erfindung. In jedem Falle ist der prosthetische Gruppenrest kovalent an die Bindungskomponente in der Markierungskomponente ge­ kuppelt, und die Nachweisreaktion besteht aus einem Messen der Holoenzymaktivität in der gebundenen Spezies, der freien Spezies oder gegebenenfalls bei beiden.

Nur zum Zwecke der Beschreibung werden nachfolgend ver­ schiedene Nachweisschemata, die auf homogenen, kompetitiven Bindungstechniken beruhen, ange­ geben, jedoch ist es klar, daß andere homogene Techniken in der Praxis durchgeführt werden können.

In der nachfolgenden Beschreibung werden die folgenden Abkürzungen verwendet:

Beispielhaftes Nachweisschema Nr. 1 Homogene kompetitive Bindungsmethode Apoenzym, eingeführt nach Einleitung der Bindungsreaktion

In diesem Schema wird der prosthetische Gruppenrest als Markierungskomponente dadurch nachgewiesen, daß man gleich­ zeitig mit oder nach Einleiten der Bindungsreaktion ein Apoenzym zugibt, d. h. während der Bindungsreaktion oder nachdem die Bindungsreaktion ihr Gleichgewicht erreicht hat, und daß man die Holoenzymaktivität in der fertigen Reaktionsmischung mißt. Die Nachweismethode ist homogen, indem man die Bedingungen so wählt, daß die Bindung des Apoenzyms mit dem prosthetischen Gruppenrest für die prosthetische Gruppe in der gebundenen Spezies inhibiert ist. Man kann aber auch Bedingungen derartig auswählen, daß das Apoenzym die gebundene Spezies in Form des mar­ kierten Konjugats bindet, wobei der erhaltene konjugierte Enzymkomplex dann keine enzymatische Aktivität entwickelt, wegen der Inhibierung der Zwischenwirkung des Enzymsub­ strats (diese Situation wird in dem obigen Schema nicht gezeigt). In jedem Fall ist die Gesamtsumme der in dem System gemessenen Enzymaktivität das Ergebnis der uninhibierten Bindung des Apoenzyms an das freie markierte Konjugat und ist infolgedessen eine direkte Funktion des in der Probe zur Verfügung stehenden Liganden, im Wettbewerb mit der Bindung des Bindungspartners. Es kann auch der Fall auf­ treten (der hier nicht gezeigt wird), daß im Gegensatz zu den obigen Schemen das markierte Konjugat (Pr-R-L) so gebildet wird, daß die Bindung mit dem Apoenzym inhibiert wird, daß aber beim Binden des markierten Konjugats durch den Bindungspartner eine solche Inhibierung aufge­ hoben wird und das Apoenzym in der Lage ist, sich mit der gebundenen Spezies des markierten Konjugats unter Bildung eines aktiven Holoenzymkomplexes zu binden. In diesem Falle ist die Menge der in dem System entstehenden Holo­ enzymaktivität eine umgekehrte Funktion der Menge des in der Probe vorliegenden Liganden.

Beispielhaftes Nachweisschema Nr. 2 Homogene kompetitive Bindungsmethode Apoenzym, eingeführt vor der Einleitung der Bindungsreaktion

In diesem Schema befindet sich der prosthetische Gruppen­ rest in der Markierungskomponente durch Kupplung an den Liganden und kombinierend mit dem Apoenzym in Form eines aktiven Holoenzymproduktes. Der prosthetische Gruppenrest wird nachgewiesen durch Messung der Holoenzymaktivität in der endgültigen Reaktionsmischung. Die Analysenmethode ist homogen, indem man die Bindungen so wählt, daß beim Binden des Bindungspartners an den aktiven Holoenzym­ komplex die gebundene Spezies, die sich dabei ergibt, eine inhibierte Enzymaktivität zeigt, wie in der Inhibierung der Enzym-Substrat-Zwischenreaktion. Die Gesamtmenge der in dem System gemessenen Enzymaktivität ist das Ergebnis des ungebundenen aktiven Holoenzymkomplexes, d. h. der freien Speziesform und infolgedessen eine direkte Funktion der Menge des in der Probe vorliegenden Liganden.

Es kann auch vorkommen (jedoch wird dies nicht gezeigt), daß im Gegensatz zu dem obigen Schema das markierte Kon­ jugat wenig oder gar keine Enzymaktivität zeigt, jedoch beim Binden des Bindungspartners an die gebundene Spezies tatsächlich eine meßbare oder vergrößerte Enzymaktivi­ tat aufweist. In einem solchen Falle ist die Menge der sich ergebenden Holoenzymaktivität in dem System eine umge­ kehrte Funktion der Menge des in der Probe vorliegenden Liganden.

Das Schema Nr. 2 ist im wesentlichen eine enzymmarkierte Untersuchungsmethode, mit der Ausnahme, daß, im Gegensatz zum Stand der Technik, das Enzym als solches an die Bindungs­ komponente in dem markierten Konjugat durch einen prostheti­ schen Gruppenrest gebunden ist. In dieser Hinsicht ergibt die vorliegende Erfindung ein neues Verfahren zur Herstellung eines enzymmarkierten Konjugats, das durch die folgenden Stufen beschrieben werden kann:

(a) kovalentes Kuppeln der Bindungskomponentengruppe (d. h. des nachzuweisenden Liganden oder eines Bindungsanalogen oder eines Partners davon) an eine organische prosthetische Gruppe, die in der Lage ist, sich mit einem Apoenzym unter Ausbildung eines konjugierten Enzyms zu vereinen, z. B. zu einem aktiven Holoenzym; (b) Vereinigen des er­ haltenen prosthetischen gruppenmarkierten Konjugats mit dem Apoenzym; und (c) Isolieren des erhaltenen konjugier­ ten enzymmarkierten Konjugates. Es ist ersichtlich, daß ein solches Verfahren äußerst wertvoll ist zur Herstel­ lung von enzymmarkierten Konjugaten, die für Nachweismetho­ den verwendet werden können wegen der kontrollierten Art und Weise, in welcher die prosthetische Gruppe mit einem niedrigen Molekulargewicht, die genau charakterisiert ist, an die Bindungskomponente gekuppelt werden kann.

Aus der vorherigen Diskussion ist es ersichtlich, daß für gewisse markierte Konjugate und Ligand/Bindungspartner- Paare eines oder beide vorerwähnten homogenen Schemata geeignet sind, in Abhängigkeit von mehreren Faktoren, einschließlich der Fähigkeit des Apoenzyms, die gebundene Spezies des markierten Konjugats zu binden und das Binden des Bindungspartners an den konjugierten Enzymkomplex zu beeinflussen. Wenn die gebundene Spezies und die freie Spezies in dem markierten Konjugat eine nicht-unterscheidungsfähige Aktivität entwickelt, so kann eine heterogene Verfahrensweise gewählt werden, um eine brauchbare Nachweismethode zu haben. Obwohl die einzelnen Umstände maßgeblich sind, welche jeweiligen manipulativen Schematas angewendet werden, ist die vor­ liegende Nachweismethode doch im allgemeinen für alle üblichen homogenen und heterogenen Methoden anwendbar.

Homogene Methoden

Eine homogene Methode, d. h. eine solche, bei der keine physikalische Trennung der gebundenen Spezies von der freien Spezies erforderlich ist, steht zur Verfügung, wenn durch die Reaktion zwischen der Bindungskomponente des markierten Konjugats und einem entsprechenden Bindungs­ partner eine meßbare Veränderung, entweder im positiven oder im negativen Sinne in der Fähigkeit der Markierungs­ komponente des markierten Konjugats an der Nachweis­ reaktion teilzunehmen, d. h. in der Fähigkeit des markier­ ten Konjugats, sich mit dem Apoenzym zu vereinen und/ oder Holoenzymaktivität zu zeigen, verursacht wird. In einem solchen Falle kann die Verteilung der Markierungs­ komponente zwischen der gebundenen Spezies und der freien Spezies ohne Trennung der Spezies bestimmt werden. Die Holoenzymaktivität im Reaktionsgemisch wird dann bestimmt, indem man in wenigstens einem Teil des Gemisches die durch ein solches Enzym katalysierte Reaktion bildet, z. B. durch Zugabe eines Substrats, und daß man nach irgendeiner be­ kannten Methode den Grad oder die aggregierte Menge der Produktbildung oder des Verbrauchs des Reaktanten mißt. Bei der qualitativen Bestimmung des Liganden in dem flüssi­ gen Medium vergleicht man die gemessene Menge mit der einer Nachweisreaktion in einem flüssigen Medium, wel­ ches keinen Liganden enthält, und jeder Unterschied, der dabei gefunden wird, ist ein Anzeichen für die Gegenwart des Liganden in der zu untersuchenden Flüssigkeit. Bei der quantitativen Bestimmung des Liganden in dem flüssigen Me­ dium vergleicht man die gemessene Menge mit der einer Nachweisreaktion in einem flüssigen Medium, welches unterschiedliche bekannte Mengen des Liganden enthält, z. B. indem man einen Vergleich gegenüber einer Standardprobe macht.

Im allgemeinen kann man bei der Durchführung einer homo­ genen Untersuchungsmethode die Komponenten der spezifi­ schen Bindungsreaktion, d. h. das flüssige Medium, von dem man annimmt, daß es den Liganden enthält, das markier­ te Konjugat und, bei einigen Systemen (z. B. einem kompeti­ tiven Bindungssystem) einen spezifischen Bindungspartner des Liganden in allen Mengen und in jeder Art und Reihen­ folge anwenden, unter der Voraussetzung, daß die Aktivi­ tät der Markierungskomponente des markierten Konjugats meßbar verändert wird, wenn das flüssige Medium den Ligan­ den in einer Menge oder einer Konzentration, wie sie für den Zweck des Nachweises von Bedeutung ist, enthält. Vor­ zugsweise sind alle Komponenten in der spezifischen Bin­ dungsreaktion in dem flüssigen Medium löslich.

Bekannte Variationen der vorher kurz beschriebenen homo­ genen Methode und weitere Details hinsichtlich des spezi­ fischen besprochenen Verfahren, einschließlich der alter­ nativen Methode, die als direkte Bindungsmethode bekannt ist, sind in der Literatur beschrieben, z. B. in der DE-OS 26 18 511 der Anmelderin.

Verknüpfungsgruppen

Zahlreiche Verfahren stehen zur Verfügung, um die Bindungs­ komponente des markierten Konjugats, z. B. des nachzuweisenden Liganden, eines Bindungsanalogs davon oder eines Partners davon, mit der prosthetischen Gruppe zu verknüpfen. Der jeweilige chemische Charakter der Verknüpfungsgruppe hängt von der Art der jeweils verfügbaren Verknüpfungs­ stellen an der Bindungskomponenten der prosthetischen Gruppe ab. Die wesentlichen Überlegungen bei der Auswahl der Verknüpfungsstellen sind im allgemeinen (1) die Bei­ behaltung der Fähigkeit der verknüpften Bindungskomponente, wirksam in dem ausgewählten Bindungsnachweissystem teilzu­ nehmen, (2) die Bewahrung der Fähigkeit des verknüpften prosthetischen Gruppenrestes mit einem Apoenzym verbunden zu werden (oder die Inhibierung einer solchen Bindungsfähig­ keit, sofern solche beim Binden des markierten Konjugats durch einen Bindungspartner aufgehoben wird - siehe bei­ spielhaftes Überwachungsschema 1), wobei in beiden Fällen das Ausmaß derart ist, daß eine wirksame Nachweismethode sich für den jeweils in der Versuchsanordnung nachzuwei­ senden speziellen Liganden ergibt und auch in Abhängigkeit von den jeweiligen Konzentrationen und Mengen in denen der nachzuweisende Ligand vorkommt. Im allgemeinen umfaßt die Verknüpfungsgruppe eine chemische Bindung, gewöhnlich eine Einfach- jedoch manchmal auch eine Doppelbindung, oder eine Kette mit 1 bis 14 und meistens 1 bis 6 Kohlenstoff­ atomen und 0 bis 5 und meistens 1 bis 3 Heteroatomen, aus­ gewählt aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel.

Sowohl die prosthetische Gruppe als auch die Bindungskom­ ponente bieten eine große Vielfalt von möglichen Funktio­ nalitäten für die Bindung der Verknüpfungsgruppe. Funk­ tionalitäten, die man normalerweise für die Verknüpfungs­ gruppe als verfügbar erwarten kann, sind Amino, im all­ gemeinen primäres Amin; Hydroxyl; Halogen, wie Chlor oder Brom; Carbonsäure; Aldehyd; Keto; Isothiocyanat; Iso­ cyanat und dergleichen. Die chemische Struktur der Ver­ knüpfungsgruppe selbst kann stark variieren, hinsicht­ lich der Endgruppen in Abhängigkeit von den an der pro­ sthetischen Gruppe und der Bindungskomponente vorhande­ nen Funktionalitäten und auch hinsichtlich der Gesamt­ länge, wobei dies eine Frage der Wahl ist, wie man die Eigenschaften in dem sich ergebenden Konjugat aus der prosthetischen Gruppe und der Bindungskomponente gestal­ ten will. Hinsichtlich der Länge der Verküpfungsgruppe bei der Herstellung des Konjugats für eine homogene Nach­ weisreaktion ist es im allgemeinen wünschenswert, Gruppen, die so kurz wie möglich sind, auszuwählen, ohne daß bei der entstehenden Bindungskomponente in dem Konjugat eine merkliche Wechselwirkung zwischen der prosthetischen Grup­ penaktivität des Konjugats verursacht wird. Wenn die Bin­ dungskomponente ein niedriges Molekulargewicht hat (z. B. ein Hapten mit einem Molekulargewicht zwischen 100 und 1000 ist) dann ist die Verknüpfungsgruppe vorzugsweise eine chemische Bindung mit 1 bis 6 Atomen in der Kette, wie Niedrigalkyl, Carbonyl, Alkylcarbonyl, Amido, Alkylamid und dergleichen. Unter anderen Umständen, z. B. wenn die Bindungskomponente in dem Konjugat ein verhältnismäßig hohes Molekulargewicht hat, wie bei einem Polypeptid oder Protein (z. B. bei einem Antikörper) ist es im allgemeinen wünschenswert, längere Verknüpfungsgruppen zu haben, um eine sterische Hinderung an den Apoenzym-Kombinations­ stellen in dem Konjugat zu verhindern. In diesen Fällen kann die Verknüpfungsgruppe im allgemeinen 1 bis 14 Kohlen­ stoffatome und 0 bis 5 Heteroatome, wie vorher erwähnt, haben. Ketten von merklich größeren Längen ergeben manch­ mal Konjugate, bei denen die Bindungskomponente dazu neigt, sich zu den Apoenzym-Kombinationsstellen zurückzufalten. Unter Berücksichtigung dieser Überlegungen sind Beispiele für Verknüpfungsgruppen in der nachfolgenden Tabelle 1 ange­ geben. Spezielle Beispiele von Verknüpfungsgruppen wer­ den anschließend gezeigt, und weitere Änderungen können als Stand der Technik ohne weiteres vorgenommen werden.

Tabelle 1

worin X Imino, Schwefel oder vorzugsweise Sauerstoff bedeutet; R¹ und R² unabhängig voneinander Niedrigalky­ lene mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie Methylen, Ethylen, Isopropylen, Butylen oder Hexylen bedeuten.

Das Apoenzym

Das Apoenzym oder der Proteinteil in dem Holoenzym, ohne die prosthetische Gruppe, wird hergestellt, indem man das konjugierte Enzym spaltet und das freigewordene Apoenzym­ protein isoliert. Das Spalten des konjugierten Enzyms kann durchgeführt werden in bekannter Weise, indem man z. B. das Enzym in eine hochsaure Lösung, z. B. bei einem pH von weniger als 2, gibt. In ähnlicher Weise kann man das Apoenzym gewinnen, indem man es einer Vielzahl von möglichen Methoden unterwirft, einschließlich einer selektiven Ausfällung des Proteins oder einer selektiven Absorption der freigewordenen prosthetischen Gruppe mit niedrigem Molekulargewicht.

Wie bereits vorher dargelegt, ist die Apoglucoseoxidase das Apoenzym für die vorliegende Erfindung, weil dieses Holoenzym bei den analytisch vorteilhaften Wasserstoffperoxidreaktionen teilnimmt. Bekannte Verfahren zum Isolieren von Apoenzymen sind bekannt, insbesondere für Apoglucoseoxidase, siehe Biochem. Biophys. 175 : 365 (1969) und für Apoperoxidase J. Biol. Chem. 206 : 109 (1953) und Arkiv. Kemi. Min. O. Geol. 148 : 1 (1940).

Sollte sich eine Wechselwirkung bei dem Nachweisverfah­ ren aufgrund der Gegenwart von endogenen prosthetischen Gruppen in der Probe ergeben oder in irgendeinem der Rea­ gentien oder aufgrund von Verunreinigungen mit prostheti­ schen Gruppen der Laborausrüstung, Glasgeräte oder Plastik­ stoffe, können solche störenden prosthetischen Gruppen durch verfügbare Inaktivierungsverfahren eliminiert wer­ den. Zum Beispiel kann eine FAD-Störung dadurch elimi­ niert werden, daß man nacheinander mit Perjodat und Ethylenglykol-Lösungen behandelt, oder mittels anderer FAD-Inaktivierungsverfahren.

Beispiel 1 Homogene Bindungs-Untersuchungsmethode für N-2′,4′-Dinitro­ phenyl-6-aminocaproat A. Herstellung des markierten Konjugats N⁶-(6-amino­ hexyl)-dinitrophenyl-flavin-adenin-dinukleotid

Flavin-N⁶-aminohexyl-adenin-dinucleotid

N⁶-Trifluoracetamidohexyl-adenosin-5′-monophosphat wurde nach dem Verfahren von Trayer et al., Biochem. J. 139 : 609 (1974) synthetisiert.

56 mg N⁶-Trifluoracetamidohexyl-adenosin-5′-monophosphat (0,1 mmol) wurden in etwa 10 ml Wasser gelöst, und dazu wurden 25 µl Tri-n-butylamin (0,1 mmol) gegeben. Das Was­ ser wurde im Vakuum abgezogen, und der Rückstand wurde in 10 ml trockenem Dimethylformamid (DMF) gelöst, das dann im Vakuum abgedampft wurde. Der Rückstand wurde drei weitere Male aus trockenem DMF eingedampft. Der letzte Rückstand wurde in 10 ml trockenem DMF gelöst. Dazu wurden 80 mg N,N′-Carbonyldiimidazol gegeben, und das Ganze wurde 1,5 h reagieren gelassen. Dann wurden 15 µl Wasser dazugegeben, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum ent­ fernt. Der Rückstand (N⁶-Trifluoracetamidohexyl-adenosin- 5′-monophosphatimidazolid) wurde in 10 ml DMF gelöst.

47 mg Riboflavin-5′-monophosphat (0,1 mmol) wurden in etwa 10 ml Wasser gelöst und tropfenweise zu 20 ml Aceton, enthaltend 43 µl Tri-n-octylamin (0,1 mmol), gegeben. Bevor die Zugabe beendet war, bildete sich ein Nieder­ schlag. Das Lösungsmittel wurde auf einem Drehverdampfer entfernt, bis sich das Riboflavin-5′-monophosphat löste. Dann wurden 5 ml Aceton und 5 bis 10 ml DMF zugegeben, und die Mischung wurde zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in 15 bis 20 ml trockenem DMF gelöst und nochmals zur Trockne eingedampft, und dieses Verfah­ ren wurde dreimal wiederholt. Dann wurde der Rückstand in 5 ml DMF gelöst und mit der vorerwähnten 10 ml Lösung Imidazolid in DMF vereint.

Man ließ die Reaktionsmischung über Nacht bei Raumtempe­ ratur stehen und entfernte dann das Lösungsmittel. Der Rückstand wurde in 50 ml Wasser aufgenommen und auf eine 2,5×25 cm Säule aus DEAE-Zellulose in der Bicarbonat­ form (Whatman DE23® Reeve Angel, Clifton, N. J., USA) ge­ geben. Das Chromatogramm wurde mit einem Lineargradienten entwickelt, wobei der Gradient erzeugt wurde mit 2 l Wasser und 2 l 0,3 mol/l Ammoniumbicarbonat. (Es wurden 23 ml Fraktionen gesammelt.) Dünnschichtchromatografie über Kieselgel 60 F254® (E. Merck, Darmstadt) unter Verwendung einer 7 : 3 Volumen/Volumen (V : V) Mischung von Ethanol-1 mol/l Triethylammoniumbicarbonat (pH 7,5) zeigte, daß die Fraktion Nr. 68 bis 73 größere (Rf=0,75) und kleinere (Rf=0,36) gelbe Verbindungen enthielten. Diese Fraktionen wurden zusammengegeben, und das optische Absorptionsspektrum zeigte Maxima bei 267, 373 und 450 nm.

Aus dem vereinten Material wurde das Lösungsmittel ent­ fernt, und der Rückstand wurde in etwa 5 ml Wasser gelöst.

Diese Lösung wurde mit 5 mol/l Natriumhydroxid auf pH 11,0 eingestellt und 9 h bei Raumtemperatur stehen ge­ lassen. Dünnschichtchromatografie zeigte, daß die Kompo­ nente mit Rf=0,75 verschwand, während ein neues gel­ bes Material mit Rf=0,37 erschien. Das Reaktionsgemisch wurde mit Chlorwasserstoffsäure auf pH 8,0 eingestellt und auf eine 2,5×20 cm Säule aus DEAE-Zellulose in der Bicarbonatform gegeben. Das Chromatogramm wurde mit einem Lineargradienten, der aus 1 l Wasser und 1 l 0,2 mol/l Ammo­ niumbicarbonat gebildet wurde, entwickelt. Der gelbe Ab­ fluß aus der Säule wurde zusammengegeben und das Lösungs­ mittel wurde entfernt. Der Rückstand wurde auf 2 g Kie­ selgel adsorbiert, und diese wurden dann auf eine 50 g Kieselgelsäule gegeben, die mit einer 9 : 2 (V : V) Mischung aus Ethanol-1 mol/l Triethylammoniumbicarbonat (pH 7,5) ins Gleichgewicht gebracht worden war. Die Säule wurde mit einer 8 : 2 (V : V) Mischung aus Ethanol-1 mol/l Triethylamminium­ bicarbonat (pH 7,5) eluiert und die gelbe Komponente mit Rf=0,37 wurde gesammelt, und das Lösungsmittel wurde entfernt. Die Ausbeute, bezogen auf eine Absorption bei 450 nm, betrug etwa 10%.

N⁶-(6-Aminohexyl)-dinitrophenyl-flavin-adenin-dinukleotid

Der obige Rückstand, enthaltend Flavin-N⁶-aminohexyl­ adenin-dinukleotid, wurde chromatografisch über Sephadex® G-10 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden) ge­ reinigt. Auf eine 0,9×30 cm Säule, die ins Gleichgewicht gebracht worden war mit 25 µmol/l Natriumbicarbonat (pH 7,5) bei Raumtemperatur, wurde 1 ml einer annähernd 10 mmol/l Lösung des N⁶-FAD-Derivats in Wasser gegeben. Das erste eluierte Materialpeak, das bei 450 nm absorbierte, wurde gesammelt und nochmals über Sephadex® G-10 chromatogra­ fiert, und das erste Elutionspeak wurde nochmals gesammelt.

0,5 ml (0,63 µmol) des gereinigten N⁶-FAD-Derivats in 25 mmol/l Natriumbicarbonat (pH 7,5), wurden mit 2 ml Ethanol vermischt, und 10 µl ³H-Dinitrofluorbenzol (6,3 µmol, 50 µCi) in Ethanol wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde kon­ tinuierlich über Nacht in der Dunkelheit bei Raumtempera­ tur geschüttelt und dann auf eine 0,9×30 cm Kolonne aus Sephadex® G-10, die mit 0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7,0 enthaltend 0,1% Natriumazid) ins Gleichgewicht gebracht worden war, gegeben. Das bei einem Einzelpeak bei 450 nm absorbierende Material wurde gesammelt, wobei man fest­ stellte, daß es 8% der radioaktiven Markierung enthielt.

B. Herstellung von Apoglucoseoxidase

Gereinigte Glucoseoxidase mit einer niedrigen Katalase­ aktivität wurde zweimal 12 h gegen 0,5 Gewicht : Volumen (W : V) Mannit 30 Volumen jeweils) dialysiert. Aliquote der Dialysate, enthaltend 100 mg Glucoseoxidase, wurden jeweils liophyli­ siert und bei -20°C aufbewahrt.

Rinderserumalbumin (200 mg) wurde in 12 l Wasser, einge­ stellt auf pH 1,6 mit konzentrierter Schwefelsäure, gelöst, mit 150 mg Aktivkohle (RIA-Grad) vermischt und auf 0°C gekühlt. Lyophili­ sierte Glucoseoxidase (100 mg) wurde wieder in 3,1 ml Was­ ser gelöst, und 3 ml wurden zu der gerührten Albumin- Aktivkohle-Suspension gegeben, und das Rühren wurde weite­ re 3 min fortgesetzt. Dann wurde die Suspension durch ein 0,8 µm, 25 mm Durchmesser-Filter (einer Filtervorrichtung auf einer 50 ml Plastikabsaug­ flasche) filtriert. Das Filtrat wurde schnell auf pH 7,0 durch Zugabe von 2 ml 0,4 mol/l Phosphatpuffer (pH 7,6) und anschließend 5 mol/l Natriumhydroxid neutralisiert. Trockene Aktivkohle (150 mg) wurde zugegeben, und es wurde 1 h bei 0°C gerührt. Die erhaltene Suspension wurde zunächst durch ein 0,8 µm Filter und dann durch ein 0,22 µm Filter filtriert. Zu dem Filtrat wurde Glycerin auf 25% (V : V) gegeben, und die stabilisierte Apo­ glucoseoxidase-Zubereitung wurde bei 4°C gelagert.

C. Untersuchungsreagentien

(1) Markiertes Konjugat:
N⁶-(6-aminohexyl)-DNP-FAD wurde in 0,05 mol/l Phosphatpuffer (pH 7,0) auf eine Konzentration von 119 nmol/l verdünnt.

(2) Apoenzym:
Apoglucoseoxidase wurde mit 0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 0,1% Rin­ derserumalbumin, auf eine Konzentration von 958 nmol/l FAD-Bindungsstellen verdünnt. Die FAD- Bindungsstellenkonzentration in der Apoenzym­ zubereitung wurde experimentell bestimmt, indem man die minimale Menge an FAD maß, die er­ forderlich war, um eine maximale Glucoseoxida­ seaktivität beim Inkubieren mit dem Apoenzym zu ergeben.

(3) Antiserum:
Das Antiserum gegen ein Nitrophenyl- Rinderserumalbumin-Konjugat wurde um das 31fache in 0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin, verdünnt.

(4) Standards:
Die Standardlösungen enthielten be­ kannte Konzentrationen an N-2′,4′-dinitrophenyl- 6-aminocaproat, hergestellt in 0,05 mol/l Phophat­ puffer (pH 7,0).

(5) Nachweisreagenz:
Ein Glucoseoxidasereagenz wurde hergestellt durch Vermischen von 45 ml 0,1 mol/l Phosphatpuffer pH 7,0, enthaltend 15 mmol Ethylendiamintetraessigsäure, 9 ml 11,5 mmol/l 3,5 Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonat in Wasser, eingestellt auf pH 7 mit Natriumhydroxid, 9 ml 11,5 mmol/l 4-Aminoantipyrin in Wasser, enthaltend 1,25 mg/ml Peroxidase, und 6 ml 1,0 mol/l Glucose in wäßriger gesättigter Benzoesäurelösung.

D. Nachweisverfahren (1) Zugabe des Apoenzyms vor der Einleitung der Bindungsreaktion

Methode Nr. 1:
Die folgenden Bestandteile wurden hintereinander in getrennte Reaktions­ küvetten gegeben: 0,1 ml der markierten konju­ gierten Lösung, 0,05 ml einer ausgewählten Standardlösung, 0,1 ml einer Antiserumlösung, 2,0 ml des Nachweisreagenzes und 0,1 ml der Apoenzymlösung. Jede Reaktionsmischung wurde 30 min bei 30°C inkubiert, und die Absorption bei 520 nm wurde gemessen.

Methode Nr. 2:
Die folgenden Substanzen wur­ den nacheinander in getrennte Reaktionsküvetten gegeben: 0,1 ml der markierten Konjugatlösung, 0,05 ml einer ausgewählten Standardlösung, 0,1 ml der Antiserumlösung und 0,1 ml der Apoenzym­ lösung. Jede Reaktionslösung wurde 20 min bei Raumtemperatur inkubiert, und dann wurden je­ weils 2,0 ml des Nachweisreagenzes zugegeben. Nach weiterer Inkubierung während 15 min bei 30°C wurde die Absorption bei 520 nm in je­ der Küvette gemessen.

(2) Zugabe des Apoenzyms nach der Einleitung der Bindungsreaktion

Methode Nr. 3:
Die folgenden Substanzen wurden nacheinander in getrennte Reaktionsküvetten ge­ geben: 0,1 ml der markierten Konjugatlösung, 0,05 ml einer ausgewählten Standardlösung und 0,1 ml der Antiserumlösung. Jede Reaktionsmischung wurde 20 min bei Raumtemperatur inkubiert, und dann wurden 2,0 ml des Nachweisreagenz und 0,1 ml der Apoenzymlösung jeweils zugegeben. Nach weiterer 30minütiger Inkubierung bei 30°C wurde die Absorption bei 520 nm in jeder Küvette gemessen.

Methode Nr. 4:
Die folgenden Bestandteile wurden nacheinander in getrennte Reaktionsküvetten ge­ geben: 0,1 ml der markierten Konjugatlösung, 0,05 ml einer ausgewählten Standardlösung und 0,1 ml der Antiserumlösung. Jedes Reaktionsge­ misch wurde 20 min bei Raumtemperatur inku­ biert, und dann wurden jeweils 0,1 ml der Apo­ enzymlösung zugegeben. Nach weiterer 20minüti­ ger Inkubierung wurden zu jeder Küvette je­ weils 2,0 ml des Nachweisreagenz gegeben. Dann wurde jede Reaktionsmischung 15 min bei 30°C inkubiert, und die Absorption bei 520 nm wurde in jeder Küvette gemessen.

E. Ergebnisse

In der folgenden Tabelle 2 werden die Ergebnisse der vier Untersuchungsverfahren beim Messen von N-2′,4′-Dinitro­ phenyl-6-aminocaproat gezeigt. Die Konzentrationen an N-2′,4′-Dinitrophenyl-6-aminocaproat werden ausgedrückt als Konzentrationen in den endgültigen 2,35 ml Reaktionsmi­ schungen-Volumina. Die Absorptionsergebnisse werden als Durchschnitt von doppelten Ansätzen, die um die Resten­ zymaktivität die Hintergrundabsorption der Reagentien korrigiert waren, ausgedrückt. Der Korrekturfaktor wird für jede Nachweismethode am Ende der Tabelle 2 angegeben und wurde experimentell bestimmt durch Ansätze, bei denen man 0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7,0) anstelle der markierten Konjugatlösungen, der Standardlösungen und der Antiserum­ lösungen verwendet hatte.

Tabelle 2

Diese Ergebnisse zeigen, daß die vorliegende Erfindung eine spezifische Bindungs-Untersuchungsmethode zur Ver­ fügung stellt vom homogenen Typ, bei dem das Apoenzym ent­ weder vor oder nach der Einleitung der Bindungsreaktion zugegeben wird.

Beispiel 2 Homogener Bindungsversuch für Thyroxin A. Herstellung des markierten Konjugat-N⁶-(6-Amino­ hexyl)-thyroxin-flavin-adenin-dinukleotid

6-(6-Aminohexyl)-amino-9-(2′,3′-0-isopropyliden-β-D-ribo­ furanosyl)-purin

16,0 g (50 mmol) 6-Chlor-9-(2′,3′-0-isopropyliden-b-D- ribofuranosyl)-purin (Hampton et al., J. Am. Chem. Soc. 83 : 1501 (1961)) wurde unter Rühren zu einer geschmolzenen Probe (70°C) von frisch destilliertem 1,6-Diaminohexan (58 g, 500 mmol) gegeben. Die erhaltene Mischung wurde unter Argon bei 40°C 18 h gerührt. Das überschüssige Diamin wurde durch Destillation unter vermindertem Druck (60°C, 0,013 mbar) abdestilliert. Der zurückbleibende schwach-gelbe Rückstand wurde auf 150 g Kieselgel 60 absorbiert und zu einer chromatografischen 9 : 1 (V : V) Mischung aus absolutem Ethylalkohol und Triethylaminobicarbonat (pH 7,5, 1 mol/l) gegeben. Die Säule wurde mit der obigen 9 : 1 (V : V) Lösungs­ mittelmischung eluiert, und es wurden 920 ml Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen wurden durch Dünnschichtchromato­ grafie (TLC) über Kieselgel 60 durch Eluieren mit einer 7 : 3 (V : V) Mischung aus absolutem Ethylalkohol und Diethyl­ aluminiumbicarbonat (pH 7,5, 1 mol/l) eluiert. Die Fraktionen Nr. 391 bis 900 aus der Säulenchromatografie wurden ver­ eint und im Vakuum eingedampft, wobei 15,0 g eines glasarti­ gen Rückstandes (74%ige Ausbeute) zurückblieben. Eine 1 g Probe dieses glasartigen Rückstandes wurde in einem kleinen Volumen an Methylalkohol gelöst und auf eine Säule aus 80 g Sephadex®LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden), vorgequollen in Methylalkohol, gegeben. Die Säule wurde mit Methylalkohol eluiert. Insgesamt wurden 90 8 ml Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen wurden durch TLC über Kieselgel 60 unter Eluierung mit einer 7 : 3 (V : V) Mi­ schung aus absolutem Ethylalkohol und Triethylammoniumbi­ carbonat (pH 7,5, 1 mol/l). Die Fraktionen 19 bis 27 aus der Säulenchromatografie wurden vereint und im Vakuum einge­ dampft, wobei 910 mg (91% Rückgewinnung) eines weißen, glasartigen Stoffes zurückblieben.

Analyse für C₁₉H₃₀N₆O₄:
Berechnet: C 56,14, H 7,44, N 20,68
Gefunden: C 53,91, H 7,33, N 19,18

NMR (60 MHz, CDCl₃) δ 1,40 (s, 3H, Isopropyliden), 1,63 (s, 3H, Isopropyliden), 5,98 (d, 1H, 1′-Ribose), 7,92 (s, 1H, Purin), 8,36 (s, 1H, Purin)

Optische Drehung [α] = -50,11° (c 1,0, Methylalkohol)

N-{6-[N-Trifluoracetyl)-3,3′,5,5′-tetrajodothyronyl]-amino­ hexyl}-2′,3′-O-isopropyliden-adenosin

Eine Lösung aus 4,36 g (5,0 mmol) α-(N-Trifluoracetyl)- amino-β-[3,5-dÿodo-4-(3′,5′-dÿodo-4′-hydroxyphenoxy)- phenyl]-propansäure und 2,24 g (5,5 mmol) 6-(6-Aminohexyl)-amino-9-(2′,3′-O- isopropyliden-β-D-ribofuranosyl)-purin in 100 ml trockenem Dimethylformamid wurde unter einer trockenen Ar­ gonatmosphäre bei -20°C hergestellt. Zu dieser kalt ge­ rührten Lösung wurde eine Lösung aus 1,52 g (5,5 mmol) Di­ phenylphosphorylazid in 50 ml trockenem Dimethylformamid gegeben, und anschließend wurden 0,8 mg (5,5 mmol) trockenes Triäthylamin zugegeben. Die Lösung wurde 22 h bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wurde die Lösung tropfen­ weise zu 600 ml kaltem (0°C) Wasser unter Rühren gegeben. Der erhaltene weiße Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt und im Vakuum (60°C) getrocknet, wobei man 4,90 g (78%ige Ausbeute) eines weißen Feststoffs erhielt. Eine Probe dieses Feststoffes wurde aus einer Mischung aus Aceton und Wasser umkristallisiert und ergab einen weißen Feststoff, F 205 bis 207°C (Zersetzung).
Analyse für C₃₆H₃₈F₃J₄N₇O₈:
Berechnet: C 34,28, H 3,04, N 7,77
Gefunden: C 34,22, H 2,99, N 7,41

Massenspektrum (20 ma) m/e: 1262 [H⁺], 1164 [⁺ minus COCF_3^- ]

Optische Drehung [a] = -21,89° (c 1,0, Pyridin)

N-{6-[N-(Trifluoracetyl)-3,3′,5,5′-tetrajodothyronyl]-amino­ hexyl}-2′,3′-O-isopropyliden-5-adenylsäure-monotriethyl­ aminsalz-monohydrat

Eine Lösung aus 1,89 g (1,5 mmol) N-{6-[N-(Trifluoracetyl)- 3,3′,5,5′-tetrajodothyronyl]-aminohexyl}-2′-3′-O-isopropyli­ denadenosin in 15 ml trockenem Triethylphosphat wurde in einer trockenen Argonatmosphäre bei -10°C hergestellt. Zu der kalt gerührten Lösung wurden 0,68 ml (7,5 mmol) Phosphoroxychlorid gegeben. Die erhaltene Lösung wurde 18 h bei -15°C gehalten und dann tropfenweise unter Rühren zu 1,5 l Eiswasser gegeben. Der Niederschlag wurde durch Filtrieren gesammelt und im Vakuum getrocknet, wobei man 1,9 g (87%ige Ausbeute) eines weißen Feststoffs erhielt. Der Feststoff wurde in 10 ml Methylalkohol gelöst, und dazu wurden 0,38 ml (2,6 mmol) Triethylamin gegeben. Diese Lösung wurde im Vakuum eingedampft, und der erhaltene Rück­ stand wurde aus einer Mischung aus Methylalkohol und Ethylether umkristallisiert, wobei man 720 mg (33%ige Ausbeute) eines weißen Feststoffs, F 151 bis 154°C (Zer­ setzung) erhielt.

Analyse für C₄₂H₅₆F₃J₄N₈O₁₂P
Berechnet: C 34,54, H 3,86, N 7,67
Gefunden: C 35,24, H 3,88, N 7,75

Massenspektrum (20 ma) m/e: 1342 [MH⁺], 1244 [M⁺ minus COCF₃]

Optische Drehung [α] = -17,20° (c 1,0, CH₃OH)

N-{6-[N-(Trifluoracetyl)-3,3′,5,5′-tetrajodothyronyl]-amino­ hexyl}-5′-adenylsäure

600 mg (0,41 mmol) N-{6-[N-(Trifluoracetyl)-3,3′,5,5′- tetrajodothyronyl]-aminohexyl}-2′,3′-O-isopropyliden-5′- adenylsäure-monotriethylaminsalz-monohydrat wurden in 0,6 ml Wasser (0°C) suspendiert, und dazu wurden 6 ml Tri­ fluoressigsäure tropfenweise unter Rühren zugegeben. Nach 50 min erhielt man eine klare Lösung. Die Lösung wurde bei 0°C weitere 15 h gehalten und dann im Va­ kuum bei 30°C eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde im Vakuum fünfmal aus 20 ml Volumina an wasserfreiem Me­ thylalkohol eingedampft und dann mit 30 ml Wasser trituriert und mit einem geringen Volumen Methylalkohol gewaschen. Der erhaltene weiße Feststoff (430 mg) wurde aus Methyl­ alkohol umkristallisiert, wobei man 290 mg (54,6%ige Ausbeute) als weißen Feststoff, F 180 bis 183°C (Zer­ setzung) erhielt.

Analyse für C₃₃H₃₅F₃J₄N₇O₁₁P
Berechnet: C 30,46, H 2,71, N 7,54
Gefunden: C 30,77, H 2,55, N 7,29

Massenspektrum (20 ma) m/e: 1302 [MH⁺], 1204 [M⁺ minus COCF₃]

Flavin-adenin-dinukleotid-Thyroxin-Konjugat

130,13 mg (0,1 mmol) N-{6-[N-(Trifluoracetyl)-3,3′,5,5′- tetrajodothyronyl]-aminohexyl}-5′-adenylsäure wurden in eine Argonatmosphäre gebracht. Zu dieser Probe wurde eine Lösung aus 14 µl (0,1 mmol) Triethylamin in 1 ml trockenem Dimethylformamid gegeben, und anschließend wurde eine Lösung aus 16,2 mg (0,1 mmol) 1,1′-Carbonyldiimidazol in 1 ml trockenem Dimethylformamid gegeben. Nach 24 h wurde ein zweites Äquivalent an 1,1′-Carbonyldiimidazol (16,2 mg) in 1 ml trockenem Dimethylformamid zugegeben. Diese Reaktionsmischung ließ man insgesamt 48 h unter Aus­ schluß von Feuchtigkeit bei Raumtemperatur reagieren. Eine Probe aus 47,3 mg (0,1 mmol) des Ammoniumsalzes von Riboflavin-5′-monophosphat wurde in das entsprechende Tri-n-octylaminsalz über­ führt. Dieses Salz wurde in 3 ml trockenem Dimethylformamid gelöst und der obigen Lösung, enthaltend das Phosphorimida­ zolidat des Adenylsäure-Zwischenproduktes, zugegeben.

Die erhaltene Lösung ließ man in der Dunkelheit bei Raumtemperatur unter Ausschluß von Feuchtigkeit 24 h stehen. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgedampft, und der erhaltene Rückstand wurde über einer Säule (2,5×78 cm), hergestellt aus 100 g Sephadex®LH-20, das zuvor 18 h vorgequollen worden war, in einer 19 : 1 (V : V) Mi­ schung aus Dimethylformamid und Trimethylammoniumbicarbo­ nat (1 mol/l, pH 7,5) chromatographiert. Die Säule wurde mit der obigen 19 : 1 (V : V) Mischung eluiert, und es wurden 5 ml Fraktionen gesammelt. Der Abfluß aus der Säule wurde über­ wacht durch Elution über Kieselgel 60-silanisierten RP-2® TLC-Platten (E. Merck, Darmstadt). Die TLC-Platten wurden entwickelt unter Verwendung einer 40 : 40 : 25 : 1 : 1 (V : V) Mischung aus Aceton, Chloroform, Methylalkohol, Was­ ser und Triethylamin.

Die Fraktionen 24 bis 38 aus der Säulenchromatografie wur­ den vereint und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde über einer Säule (2,5×85 cm), hergestellt aus 125 g Se­ phadex LH-20®, die zuvor 18 h in 0,1 mol/l Ammoniumbicar­ bonat vorgequollen worden war, chromatografiert. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten, erzeugt aus 2 l 0,1 mol/l Ammoniumbicarbonat und 2 l Wasser, eluiert, und es wurden 23 ml Fraktionen gesammelt. Der Abfluß wurde durch Ultra­ violettabsorption (244 nm) überwacht. Die Elution wurde fort­ gesetzt mit 2 l 0,2 mol/l Ammoniumbicarbonat, und es wurden ins­ gesamt 23 ml Fraktionen gesammelt. Insgesamt wurden 257 Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 70 bis 110 wurden ver­ eint und im Vakuum eingedampft, wobei man das markierte Konjugat (8) als gelb-orangen Rückstand erhielt. Eine alka­ lische wäßrige Lösung aus diesem Rückstand zeigte Ultra­ violettabsorptionsmaxima bei den folgenden Wellenlängen: 270 nm, 345 nm und 450 nm. Die Ausbeute, geschätzt für die Absorption bei 450 nm, betrug etwa 5%.

Eine Phosphodiesterase-Zubereitung, isoliert aus Schlangengift (Crotalus Adamanteus), hydrolysierte das obige Produkt zu Riboflavin-5′-monophosphat und die Thyroxin-substituierte 5′-Adenylsäure (7), in welcher die Trifluoracetylblockierungs­ gruppe entfernt worden war.

Eine weitere Beschreibung der Herstellung der markierten Konjugate dieser Art findet sich in der DE-OS 29 24 332.

B. Herstellung von Apoglucoseoxidase

Glucoseoxidase wurde wie in Teil B von Beispiel 1 dialy­ siert und lyophilisiert. Ein Teil der lyophilisierten Glu­ coseoxidase (80 mg) wurde in 20 ml 30% (V : V) Glycerin bei 4°C gelöst, und die Lösung wurde durch Zugabe von kon­ zentrierter Schwefelsäure (H₂SO₄) auf pH 1,4 eingestellt. Die Lösung wurde 2 h bei 4°C inkubiert und dann über eine Säule aus Sephadex® G-50 bei 4°C, ins Gleichgewicht ge­ bracht mit 30% (V : V) Glycerin, das auf pH 1,4 mit konzen­ trierter H₂SO₄ eingestellt worden war, gegeben. Der eluierte Proteinpeak wurde gesammelt (27 ml, enthaltend 74 Gew.-% des der Säule zugeführten Materials) und in dem gesammel­ ten Eluat wurden 200 mg Rinderserumalbumin gelöst. Aktiv­ kohle (600 mg; RIA-Grad) wurde hinzugegeben, und zu der Mischung wurden 4,0 ml eines 0,4 mol/l Phosphatpuffers (pH 8,0) zur Neutra­ lisierung gegeben und eine ausreichende Menge an 2 mol/l Na­ triumhydroxid zur Einstellung des pH-Wertes auf 7,0. Die Mischung wurde 60 min bei 4°C gerührt und dann hintereinander durch 0,8 µm und 0,22 µm Filter filtriert. Dann wurde Natriumazid (10% W : V) bis zu einer Endkonzentration in der Mischung von 0,1% zugegeben.

Versuchsreagentien

(1) Markiertes Konjugat:
N⁶-(6-Aminohexyl)-thyroxin- FAD wurde in 0,1 mol/l Phosphatpuffer, enthaltend 0,1% (W : V) Rinderserumalbumin (pH 7,0) in einer Konzentration von 400 nmol/l verdünnt.

(2) Apoenzym:
Apoglucoseoxidase wurde in 0,1 mol/l Phosphatpuffer, enthaltend 0,1% (W : V) Rinder­ serumalbumin (pH 7,0), bis zu einer Konzentra­ tion von 4,0 nmol/l FAD-Bindungsstellen (siehe Teil C(2) vom Beispiel 1) verdünnt.

(3) Antiserum:
Gesättigte Ammoniumsulfatlösung (7,5 ml) wurde bei Raumtemperatur zu 15 ml Ka­ ninchenantithyroxin-Antiserum (0,1 ml/min) ge­ geben, wobei auf einem Eisbad gerührt wurde. Die erhaltene Suspension wurde 2 h bei 4°C ohne Rühren stehen gelassen. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt, in 3 ml eiskaltem 50 mmol/l Boratpuffer (pH 8,6) gelöst und über Nacht gegen 1 l 50 mmol/l Boratpuffer (pH 8,6) dialysiert. Die Immunoglobulin-Lösung wurde dann auf das ursprüngliche Antiserumvolumen durch Zugabe von 50 mmol/l Boratpuffer (pH 8,6) aufgefüllt. Dann wurde die Immunoglobulin- Lösung weiter mit 0,1 mol/l Phosphatpuffer enthaltend 0,1% (W : V) Rinderserumalbumin (pH 7,0), verdünnt, um in dem Untersuchungsverfahren, das nachfolgend beschrieben wird, in den ange­ gebenen Anteilen verwendet zu werden.

(4) Standard:
Thyroxin-natriumsalz wurde als 1 mg/ml Vorratslösung verwendet, die zu einer Lösung in destilliertem Wasser mit 2 mol/l Natriumhydroxid bis zu einem End-pH von 10,2 titriert wurde. Standards wurden hergestellt durch Verdünnung dieser Vorratslösung in 0,1 mol/l Phosphatpuffer, enthal­ tend 0,1% (W : V) Rinderserumalbumin (pH 7,0).

(5) Nachweisreagenz:
Ein Glucoseoxidase-Unter­ suchungsreagenz wurde hergestellt durch Vermi­ schen von 11 Teilen 0,15 mol/l Phosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 1,8% (W : V) Rinderserumalbumin, 2 Teile 2,0 mmol/l 4-Aminoantipyrin, enthaltend 0,6 mg/ml Peroxidase, 2 Teile 20 mmol/l 3,5-Dichlor- 2-hydroxybenzolsulfonat in 0,1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7,0) und 2 Teile 1,0 mol/l Glucose in wäßriger gesättigter Benzoesäurelösung.

D. Untersuchungsverfahren

(1) Untersuchung aller Reagentien ohne Vorinkubie­ rungsstufe
Die folgenden Komponenten wurden nacheinander getrennten Reaktionsküvetten zugegeben: 0,05 ml der markierten Konju­ gatlösung, 0,05 ml einer ausgewählten Standardlösung, 0,1 ml einer 1 : 4 Verdünnung der Antiserumlösung in dem Phosphatpuffer, 1,7 ml des Nachweisreagenz und 0,1 ml der Apoenzymlösung. Jede Reaktionsmischung wurde 30 min bei 20°C inkubiert, und dann wurde die Absorption bei 520 nm gemessen.

(2) Vorinkubierung mit Antiserum
Die folgenden Substanzen wurden nacheinander in getrennte Reaktionsküvetten gegeben: 0,05 ml der markierten Konjugat­ lösung, 0,05 ml einer ausgewählten Standardlösung und 0,1 ml einer 1 : 16 Verdünnung der Antiserumlösung in dem Phos­ phatpuffer. Jede Reaktionsmischung wurde 20 min bei 20°C inkubiert, und dann wurden nacheinander 1,7 ml des Nachweisreagenz und 0,1 ml der Apoenzymlösung zu jeder Lösung zugegeben. Nach weiterem Inkubieren während 30 min bei 20°C wurde die Absorption bei 520 nm in jeder Küvette gemessen.

(3) Vorinkubierung mit Apoenzym
Die folgenden Substanzen wurden hintereinander in getrenn­ te Reaktionsküvetten gegeben: 0,05 ml der markierten Konjugatlösung, 0,05 ml einer ausgewählten Standardlösung und 0,1 ml der Apoenzymlösung. Jede Reaktionsmischung wur­ de 20 min bei 20°C inkubiert, und dann wurden 0,1 ml einer 1 : 2 Verdünnung der Antiserumlösung in dem Phosphat­ puffer und 1,7 ml des Nachweisreagenz nacheinander jeweils zugegeben. Nach weiterer Inkubierung während 30 min bei 20°C wurde die Absorption in jeder Küvette bei 520 nm gemessen.

(4) Aufeinanderfolgende Vorinkubierung mit zuerst Antiserum und dann Apoenzym
Die folgenden Substanzen wurden nacheinander in getrennte Reaktionsküvetten gegeben: 0,05 ml der markierten Konju­ gatlösung, 0,05 ml einer ausgewählten Standardlösung und 0,1 ml einer 1 : 32 Verdünnung der Antiserumlösung in dem Phosphatpuffer. Jede Reaktionsmischung wurde 20 min bei 20°C inkubiert, und dann wurden zu jeder Lösung 0,1 ml der Apoenzymlösung gegeben. Nach weiterem Inkubieren bei 20°C während 20 min wurden zu jeder Küvette 1,7 ml des Nachweisreagenz gegeben, und in jeder Küvette wurde nach 30minütiger Inkubierung bei 20°C die Absorption bei 520 nm gemessen.

(5) Aufeinanderfolgende Vorinkubierung mit zuerst Apoenzym und dann Antiserum
Die folgenden Substanzen wurden hintereinander in getrennte Reaktionsküvetten gegeben: 0,05 ml der markierten Konju­ gatlösung, 0,05 ml einer ausgewählten Standardlösung und 0,1 ml der Apoenzymlösung. Jede Reaktionsmischung wurde 20 min bei 20°C inkubiert, und dann wurden 0,1 ml einer 1 : 32 Verdünnung der Antiserumlösung in dem Phosphatpuffer zu jeder Mischung gegeben. Nach weiterer Inkubierung während 20 min bei 20°C wurden 1,7 ml des Nachweis­ reagenzes zu jeder Küvette zugegeben, und nach 30minü­ tiger Inkubierung bei 20°C wurde in jeder Küvette die Absorption bei 520 nm gemessen.

(6) Vorinkubierung mit sowohl Antiserum als auch Apoenzym
Die folgenden Substanzen wurden nacheinander in getrennte Reaktionsküvetten gegeben: 0,05 ml der markierten Konju­ gatlösung, 0,05 ml einer ausgewählten Standardlösung, 0,1 ml der Apoenzymlösung und 0,1 ml einer 1 : 32 Verdünnung der Antiserumlösung in dem Phosphatpuffer. Jede Reaktions­ mischung wurde während 20 min bei 20°C inkubiert, und dann wurden zu jeder Mischung 1,7 ml des Nachweis­ reagenzes gegeben. Nach einer weiteren Inkubierung während 30 min bei 20°C wurde die Absorption bei 520 nm in jeder Küvette gemessen.

E. Ergebnisse
Die Untersuchungen wurden jeweils doppelt ausgeführt und auch Blindproben. Es wurde festgestellt, daß bei den Methoden 1 bis 3 die Konzentration an Thyroxin in der Standardlösung in direkter Beziehung zur Glucoseoxidase­ aktivität stand, während bei den Methoden 4 bis 6 die Thyroxinkonzentration im umgekehrten Verhältnis zu der Enzymaktivität stand. Bei den Methoden 1 bis 3 in Abwesen­ heit von Thyroxin, wurde die Enzymaktivierung inhibiert, während bei den Methoden 4 bis 6 die Enzymaktivierung verstärkt wurde. Es wurde festgestellt, daß die Methoden 4 bis 6 etwas empfindlicher für den Thyroxinnachweis wa­ ren als die anderen Methoden. Der oder die Gründe, warum die Enzymaktivierung unterschiedlich inhibiert oder ver­ größert wurde, in Abhängigkeit von der Reaktionsfolge, ist noch nicht ganz klar, jedoch zeigen die Ergebnisse, daß die vorliegende Erfindung eine homogene spezifische Bin­ dungs-Untersuchungsmethode zum Nachweis von Thyroxin unter Verwendung einer großen Vielzahl von Reaktionssequenzen ermöglicht.

Beispiel 3 Homogene Bindungs-Untersuchung für Theopyllin A. Herstellung des markierten Konjugat-Theophyllin- FAD

Zu einer Lösung aus 2,4 µmol Flavin-N⁶-aminohexyl-adenin- dinukleotid, hergestellt gemäß A von Beispiel 1, wurden 200 µl Dimethylsulfoxid unter Argongas, 0,9 mg 1,3-Dimethyl- 5,6,7,8-tetrahydropyrido[1,2-e]-purin-2,4,9(3H)-trion (3,62 µmol), hergestellt nach dem Verfahren von Cook et al., Res. Comm. in Chem. Pathol. and Pharm. 13 : 497 (1976), ge­ geben, und 4 h nach der Zugabe wurden weitere 1,8 mg (7,3 µmol) der gleichen Verbindung zugegeben. Dann wurde über Nacht gerührt und das Lösungsmittel im Vakuum (0,13 mbar) abgedampft und der Rückstand chromatografisch über eine 2,5×90 cm LH-20 Sephadex®-Säule chromatografiert und mit 0,3 mol/l Triethylammoniumbicarbonatpuffer (pH 7,8) eluiert. Das zwischen 210 und 246 ml eluierte Rohprodukt wurde ge­ sammelt und auf eine 20×20 cm×1000 µm Kieselgelplatte gegeben und mit einer 8 : 2 Ethanol : 1 mol/l Triethylamminium­ bicarbonatpuffer (pH 7,8)-Mischung eluiert. Die das ge­ wünschte Produkt (Rf=0,77) enthaltende Bande wurde von der Platte abgeschraubt, mit 1 mol/l Triethylammoniumbicarbonat­ puffer (pH 7,8) extrahiert, filtriert und konzentriert. Die Endreinigung erfolgte durch nochmalige Chromatografie über einer LH-20 Sephadex®-Säule und Eluieren mit dem Puffer bei 0,3 mol/l und ergab 1,26 µmol des markierten Konjugats, wie durch Absorptionsmessung bei 450 nm festgestellt wur­ de. Die Ausbeute betrug 53%.

B. Antikörper-Bindungsreaktion

Ein Antikörper wurde in Kaninchen gegen Immunogen-8- (3-carboxypropyl)-1,3-dimethylxanthin-BSA nach dem Verfah­ ren von Cook et al., Res. Comm. in Chem. Pathol. Pharm. 13 : 497 (1976) entwickelt. Die Antikörper-Bindungsreaktion wurde bei Raumtemperatur in 0,1 mol/l Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) durchgeführt, und die Messung der Glucoseoxidase­ aktivität wurde im gleichen Puffer bei 20°C vorgenommen.

Die bei diesem Versuch verwendeten Reagentien waren die folgenden:

Reagenz
Zusammensetzung
A
0,1 mol/l Natriumphosphatpuffer (pH 7,0)
B	565 Theophyllin-FAD₆-markiertes Konjugat oder 160 nmol/l N⁶-(6-Aminohexyl)-FAD (das FAD-Derivat)
C	Antiserum gegenüber Theophyllin (10fach verdünnt in Reagenz A)
D	Apoglucoseoxidase (50 nmol FAD-Bindungsstellen pro ml)
E	Nachweisreagenz: 200 µg Peroxidase/ml; 0,71 mmol/l 4-Aminoantipyrin; 7,1 mmol/l 3,5-Dichlor-2-hydroxybenzolsulfonat; 353 mmol/l Glucose und 35 mg BSA/ml

Die Reagentien A, B und C wurden in getrennten Reaktions­ küvetten in den in Tabelle 4 angegebenen Anteilen vereint. Dann wurde Reagenz D (100 µl) und Reagenz E (283 µl) schnell und nacheinander zu jeder Reaktionsmischung zu­ gegeben, und dann wurde 30 min bei 20°C inkubiert. In jeder Küvette wurde die Absorption bei 520 nm gemessen. Die in Tabelle 4 gezeigten Ergebnisse sind die Durchschnitt­ werte aus Doppelansätzen.

Tabelle 3

Die Ergebnisse der Reaktionen 2 bis 5 zeigen, daß das Antiserum die Aktivität des FAD-Derivats (d. h. des nicht an Theophyllin gekuppelten) nicht beeinflußte. Die Reak­ tionen 6 bis 11 zeigen, daß ansteigende Mengen an Theo­ phyllin-Antiserum die Aktivität des markierten Konjugats im Hinblick auf seine Fähigkeit, sich mit dem Apoenzym zu vereinen, verminderten.

C. Kompetitive Bindungs-Untersuchungen

Diese Reaktionen wurden gemäß Teil B durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die angegebenen Mengen an Theophyllin mit den Reagentien A und B vor der Zugabe von Reagenz C vereint wurden und daß anstelle von Reagenz C eine 100fache Verdünnung des Antiserums verwendet wurde. Die Er­ gebnisse werden in der Tabelle 5 gezeigt.

Reaktionen 1 bis 3 waren Kontrollversuche, die zeigten, daß der Antikörper zu Theophyllin die Fähigkeit des mar­ kierten Konjugats, sich mit dem Apoenzym zu vereinen, ver­ minderte. Reaktionen 4 bis 9 zeigen, daß die FAD-Aktivi­ tät im Verhältnis zu dem Theophyllinniveau in der Reak­ tionsmischung ansteigt.

Tabelle 4

Beispiel 4 Homogene Bindungs-Untersuchung für humanes IgG A. Herstellung des markierten Konjugats IgG-FAD

Zu 4,24 mg Flavin-N⁶-aminohexyl-adenin-dinukleotid, her­ gestellt gemäß Teil A von Beispiel 1, wurden 2,5 mg Dimethyladipimidat-dihydrochlorid in 1 ml Wasser, und 5 µl Triethylamin gegeben. Das Gemisch wurde bei Raum­ temperatur 10 min gerührt, und dann wurden 40 mg Human-Immunoglobulin (IgG) in 1 ml 0,1 mol/l Natriumpyrophos­ phatpuffer (pH 8,5), zugegeben. Nach weiterem 3stündigen Rühren bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung auf eine 2,5×50 cm G-25 Sephadex®-Säule, die mit 0,1 mol/l Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) ins Gleichgewicht gebracht und eluiert worden war, gegeben. Die Fraktionen aus dem ersten Eluierungspeak mit einer Absorption von 450 nm wurden gesammelt und hintereinander gegen 4 l 0,1 mol/l Na­ triumphosphatpuffer (pH 7,0) während 16 h, 4 l 0,1 mol/l Natriumphosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 1 mol/l Natriumchlorid, während 24 h, und 0,1 mol/l Natrium­ phophatpuffer (pH 7,0) während 48 h dialysiert. Dann wurde Natriumazid bis zu 0,1% (W : V) zugegeben. Das Reak­ tionsmaterial wurde durch einen 0,22 µm-Filter filtriert und gelagert.

B. Antikörper-Bindungsreaktionen

Die bei dieser Untersuchung verwendeten Reagentien waren die folgenden:

Reagenz
Zusammensetzung
A
0,1 mol/l Natriumphosphatpuffer (pH 7,0)
B	10 mmol/l 4-Aminoantipyrin
C	1,0 mol/l Glucose
D	25 mmol/l 3,5-Dichlor-4-hydroxybenzolsulfonat in Reagenz A
E	1,2 mg/ml Meerrettichperoxidase in Reagenz A
F	30% (W : V) Rinderserumalbumin
G	IgG-FAD-markiertes Konjugat in Lösung gelagert, wie vorher angegeben
H	Apoglucoseoxidase
I	Kaninchen-Antiserum gegen Human-IgG
J	Standard: Human-IgG in Reagenz A in vorbestimmten Mengen

Reagenzmischungen wurden wie folgt hergestellt:

Mischung Nr. 1:
180 µl Reagenz A, 20 µl Reagenz B, 100 µl Reagenz D und 5 µl Reagenz G (5,4 µmol)

Mischung Nr. 2:

0,3 ml Gesamtvolumen von verschiedenen Anteilen, enthaltend das Volumen von Rea­ genz I, wie in Tabelle 6 nachfolgend angegeben, wobei das Restvolumen mit dem Reagenz A aufgefüllt wurde.

Mischung Nr. 3:
80 µl Reagenz D, 50 µl Reagenz E, 33 µl Reagenz F, 137 µl Reagenz A und 1,6 µl Reagenz H (4,2 µmol/l FAD-Bindungsstellen)

Zu 300 µl von Mischung Nr. 1 wurden 300 µl der Mischung Nr. 2 und 300 µl von Reagenz A in einzelnen Reagenzkü­ vetten zugegeben. Nach einer wenigstens 10minütigen In­ kubation bei Raumtemperatur wurden zu jeder Mischung 300 µl der Mischung Nr. 3 gegeben. Nach einer weiteren Inkubierung während 30 min bie 20°C wurde die Absorp­ tion bei 520 nm in jeder Küvette gemessen. Folgende Er­ gebnisse wurden erzielt:

Volumen an Antiserum, das zur Herstellung von Mischung Nr. 2 zugegeben wurde
Absorption bei 520 nm
0
0,859
2	0,750
4	0,602
6	0,494
8	0,443
10	0,415
12	0,408
14	0,392
16	0,375

Die Ergebnisse zeigen, daß mit zunehmender Menge an Antikörper die Glucoseoxidaseaktivität, die durch das FAD-markierte Konjugat an IgG erzeugt wurde, abnahm.

C. Kompetitive Bindungs-Untersuchung

Diese Reaktionen wurden unter Verwendung der in Teil B angegebenen Reagentien durchgeführt. Vorbestimmte Mengen an Human-IgG in 300 µl Volumina von Reagenz A wurden mit Mischung Nr. 1 in getrennten Reaktionsküvetten ver­ mischt. Dann wurde eine Mischung aus 12 µl von Reagenz I und 288 µl von Reagenz A zu jeder Mischung zugegeben. Nach 10 min wurden 300 µl von Mischung Nr. 3 zugege­ ben und die Reaktionsmischungen wurden 30 min bei 20°C inkubiert. Nach dieser Zeit wurde die Absorption bei 520 nm in jeder Küvette gemessen. Folgende Ergebnisse wurden erzielt.

Menge an zugegebenem Human-IgG (µg)
Absorption (520 nm)
0
0,579
4	0,653
8	0,751
12	0,844
16	0,986
24	1,06

Es wurde gezeigt, daß die vorliegende Erfindung eine spezifische Bindungs-Untersuchung ermöglicht, zur Be­ stimmung von hochmolekulargewichtigen Liganden, Human- IgG, in flüssigen Medien.

Reagenzvorrichtungen

Wie für den auf diesem Gebiet arbeitenden Fachmann aus der Beschreibung und den Beispielen ersichtlich ist, können die Reagenzvorrichtungen zur Durchführung der vor­ liegenden Erfindung in verschiedener Form vorliegen. Insbesondere können solche Reagenzvorrichtungen in Form von einheitlichen Testzusammensetzungen, wie geeigne­ ten Feststoffzusammensetzungen oder flüssigen Formulie­ rungen, vorliegen. Ein Beispiel hierfür ist eine Test­ zusammensetzung zur Bestimmung eines Liganden gemäß der vorliegenden Erfindung aus (a) einem markierten Kon­ jugat, das eine organische prosthetische Gruppe, ge­ kuppelt an den Liganden oder ein Bindungsanalog davon enthält, (b) einem spezifischen Bindungspartner an dem Liganden, und (c) einem Apoenzym, das sich mit der pro­ sthetischen Gruppe unter Ausbildung eines Holoenzyms ver­ einigen kann. Eine solche Testzusammensetzung kann auch Reagentien zum Messen der Aktivität des Holoenzyms ent­ halten, und unter gewissen Umständen können das markierte Konjugat und das Apoenzym auch in Form eines konjugierten Enzymkomplexes angewendet werden. Selbstverständlich können übliche Verdünnungsmittel, Pufferstoffe, Stabilisa­ toren und dergleichen in den Testzusammensetzungen ent­ halten sein.

Die Reagenzvorrichtungen können auch in Form eines Test­ kits vorliegen, z. B. in einer Verpackungskombination aus Behältern, in denen die erforderlichen Reagentien vor­ handen sind. Als Beispiel kann ein solcher Testkit zur Bestimmung eines Liganden gemäß der vorliegenden Erfin­ dung aus einem oder mehreren Behältern bestehen, wie (a) einem markierten Konjugat aus einer organischen pro­ sthetischen Gruppe, gekuppelt an den Liganden oder ein Bindungsanalog davon, (b) einem spezifischen Bindungs­ partner an den Liganden und (c) einem Apoenzym, das fähig ist, sich mit der prosthetischen Gruppe unter Aus­ bildung eines Holoenzyms zu verbinden. Ein solcher Test­ kit kann auch in einem oder mehreren gleichen oder ver­ schiedenen Behältern Reagentien zum Messen der Aktivität des Holoenzyms enthalten, und gewünschtenfalls kann auch das markierte Konjugat und das Apoenzym in Form eines konjugierten Enzymkomplexes vorliegen. Gemäß einer Ausführungsform besteht das Testkit aus wenigstens zwei getrennten Behältern, von denen der eine das markierte Konjugat und gewünschtenfalls Reagentien zum Messen der Holoenzymaktivität enthält und der andere den Bin­ dungspartner und das Apoenzym. Natürlich können in dem Testkit auch weitere Reagentien bekannter Art enthalten sein, wie sie für den Verbraucher aus praktischem Interesse wünschenswert sind, wie Puffer, Verdünnungsmittel, Stan­ dards und dergleichen.

Claims (6)

1. Spezifische, homogene Bindungs-Untersuchungsmethode zur Bestimmung einer chemischen Substanz (Ligand) in einem flüssigen Medium, durch

• a) Inberührungbringen des flüssigen Mediums mit einem Apo­ enzym und einem markierten Konjugat, bestehend aus einem an den Liganden oder einen Bindungs-Analogen des Liganden oder an einen spezifischen Bindungspartner des Liganden gekuppelten Rest eines Coenzyms als Markierungskomponente und, wenn das markierte Konjugat den Liganden oder das Analoge des Liganden enthält, auch mit dem spezifischen Bindungspartner des Liganden, wobei durch den Kontakt ein Bindungs-Reaktionssystem erzeugt wird, in welchem eine gebundene Spezies und eine freie Spezies des markierten Konjugates gebildet werden, und das Verhältnis des mar­ kierten Konjugats in den beiden gebildeten Spezies eine Funktion der Gegenwart des Liganden in dem flüssigen Medium ist, und
• b) Bestimmung des Anteils der markierten Komponente in den beiden ge­ bildeten Spezies,

dadurch gekennzeichnet, daß als Markierungskomponente ein Rest des Flavin-adenin-dinukleotids und als Apoenzym Apoglucoseoxidase verwendet werden und das Verhältnis des markierten Konjugats in den beiden gebildeten Spezies durch Messung der Glucoseoxidase-Aktivität im Reaktions­ gemisch bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der zu bestimmende Ligand ein Immunoglobulin oder ein Antikörper ist.

3. Reagenz zur Ausführung der Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es

• a) ein markiertes Konjugat bestehend aus einem an den Liganden oder Analogen des Liganden oder einen spezifischen Bin­ dungspartner des Liganden gekuppelten Rest eines Flavin- adenin-dinucleotids als Markierungskomponente,
• b) wenn das markierte Konjugat den Liganden oder Analogen des Liganden enthält, den spezifischen Bindungspartner des Li­ ganden und
• c) Apoglucoseoxidase

enthält.

4. N⁶-(6-Aminohexyl)-dinitrophenyl-flavin-adenin-dinukleotid.