DE2828982C2 - Vorrichtung zur Durchführung von Tests mit Mikroorganismen - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung von Tests mit Mikroorganismen entweder mit Luftzutritt oder gleichzeitig mit oder nur unter Luftabschluß, wobei eine Pipette zur Aufnahme von Testmedium dient

Organismen, die ein Substrat bzw. Testmedium nur unter aerobisohen Bedingungen verwerten können, werden obligat Aerobe genan> .. Obligataerobe Bakterien können festgestellt werden, wenn sie auf einem verwertbaren Medium wachse oder nachweisbare Metaboliten ausscheiden, jedoch nur wenn genügend Sauerstoff vorhanden ist. Einige Arten der Genera Pseudomonas, Xanihomonas und Agrobacterium können Säure aus Glukose bilden unter aerobischen Bedingungen. *o

Andere Bakterien können Substrate sowohl unter aerobischen als unter anaerobischen Bedingungen verwerten (fakultative Anaerobe). Vorausgesetzt, cfaß Glukose als Substrat in Hugh und Leifson Medium dient, können die Enterobacteriaceae Säure aus Glukose unter aerobischen und anaerobischen Bedingungen bilden. Der Abbau der Glukose erfolgt meistens zusammen mit Gasbildung, wie bei z. B. Escherichia. Edwardsieila, Citrobacter und Enterobacter. Bei anderen Arten wird Gas nicht immer gebildet, z. B. einige Arten von Salmonella, Proteus und Erwinia. Auch andere, nicht zur Enterobacteriaceae gehörende Bakterien können Glukose aerobisch und anaerobisch abbauen. Dies geichieht bei Bacillus polymixa, B. macerans und Aeromonas hydrophila mit Gasbildung und bei Bacillus ccagulans ohne Gasbildung.

Bestimmte Kohlenstoffquellen können für die Identifizierung bestimmter Bakteriengruppen eingesetzt werden. Typisch für die Coliformbakterien ist, daß sie Säure und Gas aus Laktose in MacConkey Bouillin bei 37⁰C bilden. Die Bildung von Gas aus Laktose bei 44⁰C kann als spezifisches Merkmal von EsGherichia coli betrachtet v/erden.

Die Bildung von Gas aus anderen Substanzen, wie z. B, Nitrat, kann auch als Iderttifikatiorismerkmal benutzt werden. Pseudomonas stutzen und Alcalige· nes sp* können Stickstoffgas aus Nitrat bilder!,

Um die unterschiedlichen Kulturen von Algen und Bakterien testen zu können, werden viele Untersuchungen notwendig. Es hat sich herausgestellt, daß Tests wie die von Hugh und Leifson (Journal of Bacteriology, 66, Seilen 24 bis 26) zur Bestimmung oxidativer oder fermentativer Stoffwechsel unpraktisch sind für Routinetests, da eine große Menge in Röhrchen abgefüllter Testmedien benötigt werden. Die Tests sind außerdem zeitaufwendig, da zwei Röhrchen mit Testmedium geimpft werden müssen. Eines der Röhrchen wird anschließend mit Paraffin überklebt, damit ein Luftabschluß gewährleistet ist. Die Bedingungen für ein anaerobisches Wachstum der Bakterien können nur in tiefem Agar erhalten werden.

Die Aufgabe, webhe der Erfindung gestellt ist, besteht nunmehr darin, eine Vorrichtung zu schaffen, mit der gleichzeitig ein aerobischer und ein anaerobischer Test durchgeführt werden kann.

Die Lösung dieser Aufgabe besteht erfindungsgemäß darin, daß in die Pipette ein Rohr eingelegt ist, dessen dem Hals der Pipette zugewandte Stirnseite einen Außendurchmesser aufweist, der gleich oder größer dem Innendurchmesser des Halses ist und daß die Länge des Rohres derart bemessen ist, daß die andere Stirnseite mit der Oberfläche des Testmediums abschließt oder über sie hinausragt.

Eine Weiterführung der Erfindung sieht vor. daß die Pipette mit eine·: Verengung versehen ist, die ein Entfernen des Rohres aus der Pipette verhindert.

Der besondere Vorteil der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht darin, daß z. B. eine Pasteurpipette benutzt werden kann, in die ein Kapillarröhrchen hineingesetzt ist. Die in der Pipette befindlichen Medien können direkt aus einer Bakterienkolonie geimpft werden und sind daher außerordentlich gut für schnelle Routinetests von einfachen Bakterienkolonien verwendbar, wobei gleichzeitig in einer einzigen Pipette der Test unter Luftabschluß und mit Luftzutritt erfolgen kann. Das Testmedium kann beliebig ausgewählt werden. Der schmale Durchhang zwischen dem eingesetzten Kapillarröhrchen und dem Pipettenhals gestattet insbesondere den zu untersuchenden Bakterien bzw. Organismen den Zutritt zu dem Testmedium, während ein Auslaufen des Testmediums aus der Pipette aufgrund von Adhäsionskräften an diesem engen Durchtritt verhindert wird.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen mittels der Fig. 1 bis 7 näher erläutert. Getestet wurden folgende Bakterienstämme: Acinetobacter calcoaceticus 34, 37; Aeromonas hydrophila 29; Alcaligenes eutrophus DSM 531; A. faecalis DSM 30 030; Alcaligenes sp. 50; Citrobacter sp. 020; Enterobacter cloacae 23; E. aerogenes 26; Escherichia coli 001, 002; Pseudomonas aeruginosa 009; Zoogloea ramigera DSM 287.

Als Testmedium wurde unter anderem das von Hugh und Leifson beschriebene benutzt, welches 0,3% Agar beinhaltet. Die Glukose-Lösung wurde sterilisiert und zu dem Testmedium hinzugefügt, nachdem es im Autoklav behandelt wurde, um eine Konzentration von 1 Gew.-% zu erhalten. Die endgültige Farbe des Testmediums 7 (siehe F i g, 1 bis 7) wurde so abgestimmt, daß sie grün war; die Abstimmung könnte durch Veränderung des pH^Wertes von 6,6 bis 6,7 erreicht werden*

Die Nitratreduktion wurde in einem Testmedium 7 nachgewiesen, wobei als Testmedium das Von Lelliott et al. (Journal of Applied Bacteriology, 29, 1966, Seiten 470 bis 489) benutzt wurde und auch 0,3% Agar enthält.

Paraffinwachs, welches zum Versiegeln der Pipetten 1 benutzt wurde, bestand aus 75% Paraffinwachs (Verfestigungspunkt 51 bis 53⁰C) und 25% viskosem Paraffin, welche beide zusammengeschmolzen und im Autoklav sterilisiert wurden. Die verwendeten Pipetten wurden vor Aufnahme von Testmedium 7 bzw. Bakteriensuspension 9 (siehe Fig.2, 3, 5, 6 und 7) gewaschen und getrocknet. Das gleiche erfolgte mit dem Kapillarröhrchen 2, das in die Pipette 1 hineingesetzt wird und dessen dem Hals 3 der Pipette zugewandte Stirnseite 4 einen Außendurchmesser aufweist, der mindestens gleich dem Innendurchmesser des Halses 3 ist. Er ist in bevorzugter Weise etwas größer, damit das Kapillarröhrchen 2 nicht zu tief in den Hals 3 der Pipette 1 hineinrutscht. Die Länge des Röhrchens 2 wird so bemessen, daß der Höhenstand des Testmediums 7 ausreicht, um aerobische und anaerobische Versuche ausführen zu können. Hierzu muß die Stirnseite 5 des Röhrchens 2 mit der Oberfläche 6 des Testmediums 7 abschließen oder etwas über sie hinausragen. Zusätzlich kann die Pipette 1 mit einem Wattestopfen 10 verschlossen werden. Au~h kann eine Verengung 8 des Querschnitts der Pipette 1 am oberen Ende der Pipette vorgesehen werden, die dazu dient, daß das Kapillarröhrchen 2 nicht aus der Pipette 1 entfernt werden kann. Die Befüllung der Pipetten 1 erfolgt z. B. mit geschmolzenem Agarmedium, welches in die Pipette 1 durch den Hals 3 hineingesaugt werden kann. Der Höhenstand wird durch die Länge des Kapiilarröhrchens 2 bestimmt, da überstehendes flüssiges Medium 7 durch das Kapillarröhrchen 2 abfließt. An der schmalen Berührungsstelle von Kapillarröhrchen 2 und Hals 3 kann jedoch das Testmedium 7 nicht ablaufen, da Adhäsionskräfte dies verhindern bzw. das Testmedium erstarrt. Anschließend kann die Pipette 1 an ihrer Spitze 12 zugeschmolzen und mittels des Stopfens 10 luftdurchlässig und steril verschlossen werden. Die Pipette 1 mit Testmedium 7 ist somit vorbereitet und transportfähig.

Zur Durchführung von Tests wird die Spitze 12 der Pipette 1 (siehe Fi g. 2) z. B. mechanisch geöffnet. Dann wird der Hals 3 und das Kapillarröhrchen 2 mit Suspension gefüllt bzw. die Oberfläche 6 des Testmediums 7 überdeckt. Dies kann in zwei Schritten erfolgen:

Die Spitze bzw. der Hals 3 der Pipette 1 wird in ein Gefäß H mit Roger's Lösung eilgetaucht, die mittels eines Unterdrucks aus dem Gefäß 14 hochgesaugt wild. Anschließend kann diese Lösung 13 von einer Bakterienkolonie 15 (siehe Fig. 3) durchsetzt werden und ergibt die Suspeni'on 9. Der Schritt von F i g. 2 nach F i g 3 muß derart erfolgen, daß die Lösung 13 nicht aus dem Kapillarröhrchen 2 bzw. dem Hals 3 der Pipette herausläuft, d. h.. der Unterdruck muß in der Pipette 1 bestehen bleiben.

Damit sich die Lösung 13 und die Bakterien auch gut durchmischen und die !suspension 9 ergeben, wird die gesamte im Hals 3 und dem Kapillarröhrchen befindliche Flüssigkeit in den Raum 16 der Pipette 1 oberhalb der Oberfläche 6 des Testmediums 7 hineingesaugt (siehe Fig.4). Anschließend wird die Suspension 9 über das Kapillarröhrchen 2 und den Hals 3 der Pipette 1 v/ieder ausgespritzt (siehe F i g. 5), damit keinerlei Gasblasen sich mehr im Kapillarröhrchen 2 befinden. Es wird aber wiederum verhindert, daß sämtliche Suspension 9 durch das Kapillarröhrchen 2 abfließt, d. h., bleibt ein Teil 17 der Suspension 9 über der Oberfläche 6 des Testmediums 7 stehen.

Über die Testdauer wird die Spitze 12 der Pipette 1 anschließend in ein Behältnis 81 mit Paraffinwachs gesteckt (Fig.6), damit der Hals 3 an seinem Ende 12 abgedichtet wird. Es bildet sich somit im Hals 3 der Pipette 1 ein Wachsstopfen 19, der den Pipetteninnenraum bzw. die Suspension 9 vor Luftrutritt durch den Hals 3 schützt (siehe F i g. 7).

Aeruoisehe Bedingungen bestehen nunmehr an der Oberfläche 6 des Testmediums ', .m Suspensionsteil 17 bzw. dem angrepzenden Teil des Tesirnediums 7. Da das Kapillarröhrchen 2 an der Berührungsstelle 4 mit der Pipette 1 bzw. 3 keine ganz dichte Verbindi-ng bildet, können dort auch Bakterien bzw. Mikroorganismen aus der Suspension 9 in das Testmedium 7 gelangen. Für diese bestehen hier anaerobische Bedingungen, d. h„ es ist ein absoluter Luftabschluß gewährleistet. Es Kann also an dem einen Ende des Testmediums 7 ein aerobischer Test und gleichzeitig am anderen Ende (Berührungsstelle 4) ein anaerobischer Test erfolgen.

Eine Reduktion von Nitrat kann in der Pipette 1 dadurch bestimmt werden, daß in die Pipette ein bekanntes Reagenz eingefüllt wird. Dies ist z. B. 0.8% sulfanilic acid in 5N acetic acid oder 0,5% naphthylamine in 5N acetic acid. Eine Rotfärbung bestätigt die Anwesenheit von Nitrit.

Das Testmedium 7 wird durch die Tests gelb gefärbt. Erfolgt innerhalb von 24 Stunden eine Gelbfärbung des gesamten Testmediums, d. h. über seine gesamte Länge, so ist das ein Indiz für einen fermentativen Stoffwechsel. Erfolgt die Gelbfärbung nur in den oberen paar Millimetern des Testmediums 7 (Teilmediurn 17. welches der Luft zugewandt ist), dann ist e!n oxidativer Stoffwechsel erfolgt.

Eine Gaserzeugung, die z. B. dann erfolgt, wenn in der Suspension 9 Coliform-Bakterien enthalten sind, zeigt sich dadurch, daß in dem Testmedium 7 Gasblasen sich bilden. Dies wird dadurch begünstigt, weil das Testmedium 7 viskos ist und 0,3% Agar enthält.

Die Erfindung ist nicht auf die in den Ausführungsbeispielen aufgeführten Testmedien 7 bzw. Bakteriell bzw. Suspensionen beschränkt. Sie kann auch für andere Tests Verwendung finden, wo gleichzeitig mit Luftzufuhr und unter Luftabschluß getestet we^rden soll.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

1. Patentansprüche:

   1, Vorrichtung zur Durchführung von Tests mit Mikroorganismen, wobei gleichzeitig ein aerobischer und ein anaerobischer Test durchgeführt werden kann, bestehend aus einer Pipette zur Aufnahme von Testmedium, dadurch gekennzeichnet, daß in die Pipette (1) ein Rohr (2) eingelegt ist, dessen dem Hals (3) der Pipette (1) zugewandte Stirnseite (4) einen Außendurchmesser aufweist, der gleich oder größer dem Innendurchmesser des Halses (3) ist, und daß die Länge des Rohres (2) derart bemessen ist, daß die andere Stirnseite (5) mit der Oberfläche (6) des Testmedi- ß ums (7) abschließt oder über sie hinausragt.
2. 2. Vorrichtung zur Durchführung von Tests mit Mikroorganismen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Pipette (1) mit einer Verengung (8) versehen ist, die ein Entfernen des Rohres (2>aus der Pipette (1) verhindert.