DE2828433C2

DE2828433C2 -

Info

Publication number: DE2828433C2
Application number: DE2828433A
Authority: DE
Inventors: Guido Anton Dr. Reinach Ch Schoenenberger
Original assignee: F HOFFMANN-LA ROCHE and Co AG BASEL CH
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1977-06-30
Filing date: 1978-06-28
Publication date: 1988-01-21
Also published as: FR2396016B1; GB2000511B; JPS5439050A; CH634331A5; US4165312A; DE2828433A1; GB2000511A; JPS6317840B2; FR2396016A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft phosphorylierte Nonapeptide, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende pharmazeutische Präparate gemäß den voranstehenden Patentansprüchen.

Bei den Verbindungen handelt es sich um phosphorylierte Nonapeptide mit wertvollen biologischen und pharmakodynamischen Eigenschaften der allgemeinen Formel

worin
R¹ und R² Wasserstoff oder Alkyl mit 1-3 Kohlenstoffatomen darstellen.

Ein Nonapeptid der Sequenz L-Trp-L-Ala-Gly-Gly-L-Asp- L-Ala-L-Ser-Gly-L-Glu (MG = 849), in der Folge DSIP (Delta-Sleep-Inducing Peptide) genannt, wurde 1971-1977 als humoraler Schlaffaktor aus dem Blut von Kaninchen isoliert, gereinigt, charakterisiert und schließlich strukturell aufgeklärt (Pflügers Arch. 369, 99-101, 1977). Biologische Tests mit synthetischem DSIP ergaben im Vergleich mit natürlichem, aus dem Kaninchenblut isolierten DSIP bei intra-cerebro-ventrikulärer Applikation am Kaninchen identische Resultate (Experientia 33, 548, 1977). Intra- cerebro-ventrikuläre Dosen von 6 nMol DSIP/kg induzieren beim Kaninchen physiologische Effekte, die sich im EEG als äquivalent zu den beim natürlichen orthodoxen Tiefschlaf gefundenen Phänomen manifestierten (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 1282-1286, 1977). Synthetisches DSIP bewirkt auch nach intravenöser Gabe von 30 nMol/kg bei der Katze und bei der Ratte eine sowohl im EEG als auch im klassischen Verhaltenstest feststellbare signifikante Vermehrung des Tief- und Paradoxalschlafs. Am isolierten, arteriell perfundierten Rattenkopf sind nach Zugabe von synthetischem DSIP ebenfalls schlafäquivalente EEG-Effekte zu beobachten. Im Tierversuch wurden also auch in der Humanmedizin in Frage kommender Applikationsart lang anhaltende physiologische Effekte im Sinne einer Induktion eines natürlichen Schlafzustandes beobachtet.

Es erwies sich jedoch in einer Reihe von Experimenten, daß die Induktion von Schlaf durch Gaben von DSIP innerhalb einer Variation von nur ±20 nMol/kg Körpergewicht bei der Dosierung als ein Alles- oder Nichts-Effekt, d. h. nur eine quantitativ sehr genaue Dosierung von DSIP bewirkte den gewünschten Effekt. Ferner war bei der intravenösen Gabe eine verglichen mit der intra-cerebro-ventrikulär notwendigen Dosis von 6 nMol/kg wesentlich höhere Dosierung zur Induktion eines Schlafeffektes notwendig und schließlich wurde bei der intravenösen Applikation eine Verzögerung der Schlafinduktion beobachtet.

Diese Unterschiede in der Wirkung bei beiden Applikationsarten überrascht nicht, da Oligopeptide vom Typ des DSIP erfahrungsgemäß bei intravenöser (sub- oder perkutaner) Applikation dem schnellen enzymatischen Abbau unterworfen sind und zudem die Blut-Hirn-Schranke nur schwer zu penetrieren vermögen.

Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, enzymatischem Abbau gegenüber stabilere, die Blut-Hirn-Schranke leichter passierende und biologisch sowie pharmakodynamisch besser wirksame Verbindungen vom Typ des DSIP herzustellen.

In der Folge zeigten Vergleichsversuche, daß sowohl durch an der OH-Gruppe des Serins phosphoryliertes DSIP als auch durch entsprechende Derivate von DSIP-Analoga in denen der zweite, dritte, vierte und/oder achte Aminosäurerest der Sequenz ein D-Alaninrest darstellt, bei intravenöser Applikation an der Ratte nicht nur eine Reduktion der notwendigen Dosis im Vergleich zu DSIP erreicht, sondern auch eine akzentuierte, schneller einsetzende und länger, d. h. über mehrere Stunden anhaltende Wirkung ausgelöst wird. Diese protrahierte und akzentuierte Wirkung bei niedrigerer Dosierung ist ein bedeutender therapeutischer Vorteil.

Bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sind die Verbindungen der Formeln

und

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können dadurch hergestellt werden, daß man jeweils in an sich bekannter Weise ein Nonapeptid der Formel

L-Trp-L-Ala-Gly-Gly-L-Asp-L-Ala-L-Ser-Gly-L-Glu (II)

phosphoryliert oder aus einer, an mindestens einer funktionellen Gruppe geschützten Verbindung I die Schutzgruppe(n) abspaltet.

Die einzelnen Umsetzungen, die zu den erfindungsgemäßen Endprodukten führen und deren Reindarstellung sowie die Herstellung der Ausgangsverbindungen können in an sich bekannter Weise, d. h. unter Anwendung von Methoden, die aus der Peptidchemie wohlbekannt sind, durchgeführt werden [siehe z. B. "Methoden der Organischen Chemie" (Houben-Weyl), Bd. XV, Teile 1 und 2, Georg Thieme Verlag Stuttgart, 1974].

So kann beispielsweise ausgegangen werden von synthetisch hergestelltem DSIP, d. h. einer Verbindung II, deren funktionelle Gruppen mit Ausnahme der zu phosphorylierenden OH-Gruppe des Serins geschützt sind. Die Phosphorylierung kann durchgeführt werden durch Reaktion mit monofunktionellen Derivaten der Phosphorsäure wie Dibenzylphosphorylchlorid oder Diphenylphosphorylchlorid. Die Schutzgruppen werden so gewählt, daß sie unter milden, die Peptidsequenz nicht modifizierenden Bedingungen entfernt werden können. N-Benzyloxycarbonyl-, N-Benzyl-, Benzylester- und Äthergruppen eignen sich besonders als Schutzgruppen, weil sie ohne weiteres durch katalytische Hydrogenolyse entfernt werden können. Die geschützten Serin-Peptide werden in wasserfreiem Pyridin mittels Dibenzylphosphorylchlorid phosphoryliert. Die entstehenden Phosphatderivate werden gewaschen, mit wäßriger Säure oder Basen gereinigt und in einer t-Butanol-Lösung der Hydrogenolyse unterworfen. Die erhaltenen Phosphorpeptide werden mittels DC oder Anionenaustausch-Chromatographie gereinigt. Die Phosphorylierung von Serin-enthaltenden Peptiden mit Diphenylphosphorylchlorid ist bei einer gewünschten selektiven Abspaltung von N-Benzyloxycarbonyl- und Benzylester-Gruppen durch eine Palladium-katalysierte Hydrogenolyse von Vorteil. Für die Entfernung einer oder beider Phenylgruppen kann dann ein Platinkatalysator verwendet werden (Acta Chem. Scan. 13, 1407 und 1422, (1959)).

Andererseits kann von einer ungeschützten DSIP-Sequenz ausgegangen werden, die mit einer Monohalogenphosphorsäure (z. B. ClPO(OH)₂ oder einem Monohalogenphosphorsäureester (z. B. mit Diisopropylfluorophosphat, FPO[OCH(CH₃)₂]₂) phosphoryliert wird.

Nachweis der biologischen Wirkung im Aufrichtetest

In randomisierten Doppelblindstudien wurden an je acht Versuchsratten und acht Kontrolltieren simultan die Virgilanzzustände quantifiziert. Im Aufrichtetest wurde jedes Aufrichten der Versuchstiere als ein Punkt gezählt. Das Experiment wurde 90 Minuten nach intravenöser Injektion von Substanz (Versuch, V) in 0,2 ml NaCl-Lösung oder von 0,2 ml NaCl-Lösung allein (Kontrolle, K) während drei Stunden in der vormitternächtlichen Wachphase der Ratten durchgeführt. Die Zählung erfolgte durch drei neutrale Personen, wiederum unter randomisierten Doppelblindbedingungen. Die Häufigkeit des Aufrichtens der Kontrolltiere wurde als 100% angesetzt und die Reduktion des gezählten Aufrichtens der Versuchstiere errechnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als pharmazeutische Präparate mit direkter oder verzögerter Freigabe des Wirkstoffs in Mischung mit einem für die enterale oder parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen inerten Trägermaterial, wie z. B. Wasser, Gelatine, Gummi arabicum, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, pflanzlichen Ölen, Polyalkylenglykolen oder Vaseline, in fester Form, z. B. als Tabletten, Drag´es, Kapseln oder in flüssiger Form, z. B. als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen, verwendet werden. Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten weitere Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel, Mittel zur geschmacklichen Verbesserung, Salze zur Veränderung des osmotischen Druckes oder Puffersubstanzen. Die Herstellung der pharmazeutischen Präparate kann in der jedem Fachmann geläufigen Weise erfolgen.

Beispiel 1 Phosphorylierung von N-Benzyloxycarbonyl-DSIP-benzylester

Eine Lösung von N-Benzyloxycarbonyl-DSIP-benzylester (5 nmol) in 10 ml über Bariumoxid getrocknetem Pyridin wurde bis fast zum Gefrierpunkt abgekühlt. Frisch aus Dibenzyl hergestelltes Dibenzylphosphorylchlorid wurde dazugegeben, wobei die Mischung durchgeschüttelt und über Nacht bei 4°C stehengelassen wurde. Nach Vermischen mit kaltem Äthylacetat (75 ml) und kaltem Wasser (75 ml) wurde zentrifugiert und die überstehende Phase sukzessive mit kaltem Wasser, 1 M H₂SO₄, H₂O, gesättigter NaHCO₃-Lösung und Wasser gewaschen und über wasserfreiem Na₂SO₄ getrocknet. Der Phosphatester des geschützten Peptids wurde nach Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum in fester Form erhalten, in t-Butanol/Wasser gelöst und mit 10%igem Pd/C hydrogenolysiert. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, der Katalysator mit Wasser gewaschen und das mit dem Waschwasser vereinigte Filtrat unter Vakuum bis zur Trockne eingeengt. Das so erhaltene, an der Hydroxygruppe des Serins phosphorylierte DSIP,

wurde mittels DC oder über einen Anionen-Austauscher gereinigt (Acta Chem. Scan. 15, 163, 1961).

Beispiel 2 Phosphorylierung von DSIP

5 mg DSIP und 1 mg L-Tryptophan wurden mit 1 ml Phosphoroxytrichlorid bei 5°C gemischt, anschließend in 100 µl konz. Ameisensäure gelöst, acht Stunden bei 0°C unter Feuchtigkeitsausschluß gerührt und dann über NaOH im Hochvakuum lyophilisiert. Nach Zugabe von 2 ml Eiswasser wurde die Lösung bei 0°C mit 1 NaOH auf pH 8 eingestellt und das pH während zwei Stunden konstant gehalten. Die Lösung wurde wiederum lyophilisiert und das Lyophilisat in 0,5 ml Wasser gelöst. Je 100 µl dieser Lösung wurden auf eine Kieselgelplatte (Schichtdicke 2 mm, frei von Bindemitteln) strichförmig aufgetragen und während acht Stunden bei Raumtemperatur mit Aceton/Wasser (7 : 3, v/v) entwickelt. Die Platten wurden bis auf einen Randstreifen mit Alufolie abgedeckt, der mit Fluorescamin-Lösung (0,2% in Aceton) angesprüht wurde. Unter UV-Licht konnte so die Lage der Bande mit dem gewünschten Material festgestellt werden (Rf 0,47). Sie wurde abgekratzt und mit Wasser eluiert. Der Überstand des bei 25 000 g zentrifugierten Eluates wurde lyophilisiert. Das erhaltene Material wurde in 0,5 ml H₂O gelöst und auf eine Sephadex-G-15-Säule (145 ml) aufgebracht, die dann mit Wasser eluiert wurde, wobei Fraktionen von 1 ml gesammelt wurden. Die Fraktionen mit einer UV-Absorption bei 280 nm wurden zusammengefaßt und lyophilisiert. Das so gereinigte und lyophilisierte Material

wurde für den Aufrichtetest bei Ratten verwendet (J. Biol. Chem. 202, 67 (1953)).

Beispiel 3 Phosphorylierung von DSIP

10 mg DSIP wurden in 0,5 ml Wasser und 0,1 ml 1 M Phosphatpuffer (pH 7,3) gelöst. Zu dieser Lösung wurde ein 20molarer Überschuß an Diisopropylfluorophosphat zugegeben und bei Raumtemperatur während 30 Minuten gut verrührt. Der Mischung wurden erneut 100 µl 1 M Phosphatpuffer (pH 7,3) zugegeben und das Gemisch wurde weitere vier Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen, bei Raumtemperatur auf eine Sephadex-G-15-Säule (145 ml) gegeben und mit Wasser eluiert. Es wurden 100 Fraktionen zu je 1,5 ml gesammelt. Die Fraktionen, die das phosphorylierte DSIP

enthielten, wurden vereinigt und lyophilisiert. Das Material wurde direkt für den Aufrichtetest an Ratten verwendet.

Beispiel 4

20 mg DSIP (23,5 µMol) wurden in 3 ml Phosphoroxitrichlorid bei 0°C in 500 µl Ameisensäure gelöst. Unter absolutem Feuchtigkeitsausschluß wurde das Reaktionsgemisch 200 Stunden bei 0°C gerührt und anschließend im Hochvakuum von überschüssigem Phosphoroxitrichlorid und Ameisensäure befreit. Zur Entfernung der Chloratome des Phosphatesterrestes wurde in 5 ml Eiswasser gelöst und bei 0-4°C während 2 Stunden bei pH 8 gerührt und schließlich wieder lyophilisiert.

Das lyophilisierte rohe Produkt wurde dann in 1,2 ml Wasser gelöst und auf 6 Platten für präparative Dünnschichtchromatographie (Kieselgel) je 2 cm vom Rand der Platte aufgetragen. Es wurde 8 Stunden bei Raumtemperatur mit Aceton/Wasser (7 : 3, v/v) entwickelt. Die Platten wurden mit Alufolie bis auf einen Randstreifen von 3 cm abgedeckt, der mit Fluorescamin-Lösung (0,2% in Aceton) besprüht wurde. Aufgrund des im UV bei 350 nm sichtbar gewordenen Randflecks wurde die Bande mit dem R_f-Wert 0,6 angezeichnet, abgekratzt und mit Wasser eluiert. Das Eluat wurde 10 Minuten mit 20 000 g zentrifugiert und der Überstand lyphilisiert.

Das lyophilisierte Peptid wurde in 2 ml Wasser gelöst, auf eine Sephadex-G-15-Säule (120 ml) aufgegeben und mit Wasser eluiert. Die Auswertung der Fraktionen erfolgte im UV bei 280 nm und zeigte einen Peak mit flach auslaufender Schulter. Die zu dem Peak gehörenden Fraktionen wurden in drei Pools aufgeteilt und getrennt lyophilisiert. Die Subtanzen aus Pool 1 und 2 wurden an Sephadex- G-15 mit Wasser chromatographiert und wieder lyophilisiert. Das aus Pool 1 erhaltene Material wurde als praktisch zu 100% an der OH-Gruppe des Serins phosphoryliertes DSIP identifiziert, mit einem R_f-Wert auf Kieselgelplatten im System Wasser/Aceton (7 : 3, v/v) von 0,42. Das nicht- phosphorylierte Ausgangsmaterial weist unter gleichen Bedingungen einen R_f-Wert von 0,87 auf. Ausbeute 26%.

Claims

1. Phosphorylierte Nonapeptide der allgemeinen Formel worin
R¹ und R² Wasserstoff oder Alkyl mit 1-3 Kohlenstoffatomen darstellen.

2.

3.

4. Verfahren zur Herstellung der phosphorylierten Nonapeptide der allgemeinen Formel (I) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man jeweils in an sich bekannter Weise ein Nonapeptid der Formel L-Trp-L-Ala-Gly-Gly-L-Asp-L-Ala-L-Ser-Gly-L-Glu (II)phosphoryliert oder aus einer, an mindestens einer funktionellen Gruppe geschützten Verbindung I die Schutzgruppe(n) abspaltet.

5. Pharmazeutische Präparate enthaltend ein phosphoryliertes Nonapeptid gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 neben üblichen Trägerstoffen.