DE2805607B2 - Herstellung von Bio-Katalysatoren durch Polymereinschluß von Mikroorganismen - Google Patents

Description

Erfindungsgegenstand ist das im Patentanspruch 1 angegebene Verfahren. Die Ansprüche 2 bis 11 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.

Enzyme und Enzymsysteme sind von Bedeutung für industrielle, biokatalytische Produktionsverfahren sowie für Analytik, Diagnostik und medizinisch-technische Anwendung. Die Gewinnung reiner Enzyme erfordert erheblichen Aufwand und hohe Kosten durch zahlreiche und aufwendige Verfahrensschritte.

Eine praktische Nutzung dieser Verfahren ist im allgemeinen nur dann möglich, wenn das Enzym an einen makroskopischen Träger fixiert wird und dadurch mehrfach zum Einsatz gelangen kann. Die Herstellung eines Biokatalysators vom Typ »trägergebundenes Enzym« erfolgt üblicherweise in einem 3-Schritt-Verfahren:

a. Gewinnung des Enzyms,

b. Herstellung der Trägermatrix,

c. Fixierung des Enzyms in der Matrix.

Jede Stufe ist dabei mit Aufwand, Kosten und teilweisen hohen Verlusten verbunden. So haben sich bisher nur wenige dieser Prozesse technisch durchsetzen können.

Es wurden deshalb schon früher, wie weiter unten ausgeführt, Vorschläge zur Fixierung von Mikroorganismen als Träger von Enzymen gemacht Ein besonderer Vorteil der Fixierung von ganzzelligen Mikroorganismen besteht aber auch darin, daß auch gesamte Enzymsysteme in einem Arbeitsgang fixiert werden können, so daß auch biokatalytische Verfahren für komplexe Reaktionsfolgen erschlossen werden. Der Stand der Technik ist in zwei kürzlich erschienenen Übersichtsartikeln referiert worden: T. R. Jack, J. E. Zajic, Adv. Biochem. Eng, Vol. 5 (1977), S. 125-145 und I. Chibata, T. Tosa, Adv. Appl. Microbiol, Vol. 22 (1977), S. 1-27.

Es wird die adsorptive Bindung von Mikroorganismen an »DEAE-Cellulose« und Anionenaustauschern von Johnson und Ciegler in Arch. Biochem. Biophys. 130 (1969), 384-388 beschrieben. Scott und Hancher berichten in Biotechn. and Bioeng. 18 (1976), 1393 über Mikroorganismen, die an Anthrazit adsorbiert sind.

Im allgemeinen werden jedoch Einschlußverfahren zur Fixierung von Mikroorganismen angewendet Es wurde vorgeschlagen, Mikroorganismen in Cellulosetriacetat-Fasern einzuschließen. Dazu wird auf Dinelli, Processes Biochem. Nr. 7 (1972), S. 9-12 verwiesen. Bei dieser Arbeitsweise sind stark toxisch wirkende Lösungsmittel wie Toluol oder Methylenchlorid erforderlich. Eine Regeneration der Mikroorganismen durch Wachstum innerhalb der Trägermatrix ist deshalb kaum möglich. Biopolymere wie Gelatine, Agar, Collagen werden ebenfalls zur Fixierung von Mikroorganismen vorgeschlagen. Aus Collagen werden dabei Membranen hergestellt Nach partieller Trocknung wird diese Membran mit Glutardialdehyd vernetzt und damit stabilisiert Es ist jedoch nicht bekannt, ob die Zellen nach der Fixierung noch fähig sind zum Wachstum. Dazu wird auf Venkatasubramanian et al, J. Ferm. Techn. 52 (1974), S. 268—278 und auf Biotechn. und Bioeng. 15 (1973), S. 565-569 verwiesen.

Das am häufigsten angewendete Verfahren zur Fixierung von Mikroorganismen ist der Einschluß in

ίο PolyacrylamidgeL

In den Offenlegungsschriften 22 52 815,24 14 128 und 24 20102 werden diese Verfahren beschrieben. Danach soll zunächst ein weicher Polyacrylamidgel-Block hergestellt werden.

is Die Formgebung des Katalysators erfolgt mittels Pressung durch ein Sieb, wobei sehr unregelmäßig geformte, stark kantige Granulate von 2J5 bis 5 mm 0 erhalten werden. Solche Polyacrylamid-Gele sind jedoch sehr weich und kompressibel und deshalb für größere Festbettreaktoren nicht gut geeignet In einem fluidisierten oder gerührten Reaktor wird durch die Scharfkantigkeit unter der Einwirkung von Scherkräften sehr schnell ein hoher Abrieb erzeugt Hält man an Acrylamid als wesentlicher Monomerkomponente fest, so würden sich brauchbare mechanische Eigenschaften der Polyacrylamid-Gele erst bei hohen Polymerkonzentrationen von etwa 40% erreichen lassen. Es entstehen jedoch bei so hohen Polymerkonzentrationen im Gel wegen der Toxizität der Monomeren hohe Ve»luste an

jo Enzymaktivität Es tritt außerdem eine starke Erniedrigung des effektiven Diffusionskoeffizienten ein, da dieser exponentiell mit der Polymerkonzentration abnimmt
Derartige Vorschläge haben sich deshalb nicht

J5 bewährt Dieser Stand der Technik wird durch das Verfahren der Erfindung überwunden, welches diese Nachteile bei der Herstellung von Enzymträgern vermeidet

Es ist eine Aufgabe der Erfindung, zur Herstellung perlförmiger Biokatalysatoren durch Einschluß von Mikroorganismen an Stelle von Acrylamid Methacrylamid zu verwenden, und den Katalysator aus der Polymerisationsreaktion in direkt verwendbare Perlform zu bringen.

In der Offenlegungsschrift 22 60 184 wird die Polymerisation von Acrylamid und Methacrylamid in einem »Molekularsieb-Material« — das auch ein Polymerisat sein kann — beschrieben. Es soll durch diesen Vorschlag ein stabileres Granulat erzeugt werden. Dieses soll anschließend zur kovalenten Fixierung von Enzymen und anderen Proteinen in einem weiteren Arbeitsgang verwendet werden. Dieses Verfahren bietet nicht die Möglichkeit, Mikroorganismen einzuschließen.

In der Offenlegungsschrift 23 43 633 wird die Herstellung eines perlförmigen Enzymträgers durch Copolymerisation von Acrylamid oder Methacrylamid vorgeschlagen. Die Polymerisation soll jedoch nicht in wäßriger Lösung und in Gegenwart eines Enzyms

bo erfolgen. Auch hier ist die Herstellung der Matrix ein von der anschließenden kovalenten Enzymfixierung getrennter Arbeitsgang.

Nach dem Stand der Technik gelingt der Einschluß ganzer Mikroorganismen, jedoch sind Form und

b5 Stabilität der auf Acrylamid basierenden Polymerisate unzureichend. Zur Vermehrungsfähigkeit der fixierten Mikroorganismen liegt bisher kein eindeutiges Ergebnis vor (siehe Jack et al, 1977); in der Technik wurde durch

Zerstörung der Zellen sogar bewußt darauf verzichtet (s. Chibata etaL, 1977) und somit ein anderer Weg eingeschlagen, der komplexe Reaktionsfolgen ausschließt

Polymerisationsverfahren unter Mitverwendung von Methacrylamid liefern hinsichtlich Form und Stabilität gute Produkte, sie sind jedoch in der bisher beschriebenen Form nicht zum direkten Einschluß von Mikroorganismen in einem Arbeitsgang anwendbar, sondern auch ihrer erklärten Zielsetzung nach lediglich als Vorstufe in ι ο zwingender Kombination mit einer nachfolgenden kovalenten Anbindung von Enzymen.

Das Verfahren der Erfindung überwindet diesen Stand der Technik nun dadurch, daß zur Herstellung perlförmiger Biokatalysatoren unter Direkteinschluß von Mikroorganismen in einem Arbeitsgang Methacrylamid als einzige Monovinylverbindung verwendet wird, wogegen nach dem Stand der Technik offenbar ein technisches Vorurteil bestand.

Es ist überraschend, daß schon »Gele« mit 20 Gew.-% Polymergehalt praktisch brauchbare mechanische Eigenschaften aufweisen. Es ist weiter überraschend, daß die unter »Auswahl« von Methacrylamid hergestellten Blockpolymerisate wesentlich weniger kompressibel sind. Auch eine Rißbildung oder Bruch tritt bei Verwendung von Methacrylamid erst bei höherer Belastung auf.

Es ist weiter Aufgabe der Erfindung, perlförmige Biokatalysatoren herzustellen, die eine ausreichende bis hohe Aktivität der fixierten Zellen gegenüber der Aktivität freier suspendierter Zellen aufweisen. Nach dem Verfahren der Erfindung können Mikroorganismen im vermehrungsfähigen Zustand, d. h. als lebende Zelle, fixiert werden. Dies kann für eine spätere Reaktivierung von Bedeutung sein.

Das Vorurteil der Fachwelt gegen die alleinige Verwendung von Methacrylamid kann auch darin begründet sein, daß MAAm langsamer polymerisiert als AAm. Der längere Kontakt der Mikroorganismen mit dem Monomeren könnte zu hohe Mobilitätsveriuste bewirken. Weiterhin ist bekannt, daß höhermolekulare lineare PMAAm in Wasser nicht mehr löslich sind und daß diese schlechteren Löslichkeitseigenschaften im Rahmen einer vernetzenden Polymerisation zu einer unregelmäßigen Struktur mit geringerer Festigkeit führen könnte.

In der Überwindung dieser Vorurteile wird nun durch das Verfahren der Erfindung überraschend der technische Vorteil erreicht, daß KataJysatorperlen von hoher Festigkeit bei alleiniger Verwendung von MAAm auch bei Monomerkonzentrationen erhalten werden, die relativ zu AAm so niedrig sind, daß eine befriedigende Aktivitätsausbeute unter Erhalt vermehrungsfähiger Zellen gewährleistet ist.

Daten zur mechanischen Festigkeit von Polymerisaten auf der Basis von MAAm im Vergleich zu AAm sind in folgender Tabelle dargestellt

Tabelle 1

Relative Maßzahlen zur Frage der mechanischen Festigkeit von vernetzten Polymerisaten

Nr.	Monomersystem	4% BisAAm	0,4% MAS	A	B
		6% BisAAm	0,8% MAS	(kg)	(kg)
1	14% AAm	4% BisAAm		6,3	2
2	24% AAm	4% BisAAm		—	4
3	16% MAAm	4% BisAAm	10,6	7,5
4	15,6% MAAm	4% BisAAm	10,3	6,0
5	15,2% MAAm	Füllstoff)	9,8	5,0
6	24,0% MAAm		10,9	8,5
7	Nr. 4 + 25%		14,2	15,4

*) Vernetztes Polymer aus 35% AAm, 40% AN, 25% BisAAm.

Die in Tab. 1 enthaltenen Meßwerte sind — in Spalte A: mit dem »Pfizer Hardness Tester« und in Spalte B: mit dem »Stokes Monsanto Hardness Tester« (beide Geräte sind beschrieben in: R. Voigt, Lehrbuch der pharmazeutischen Technologie VEB-VIg. Volk und Gesundheit Berlin 1974, S. 195) ermittelt worden.

Es handelt sich um die Auflagegewichte in kg, bei denen die Probekörper (A: Blöcke 5x5x5 mm, B: 10x10x10 mm) zerbrachen.

Der Vergleich von Reihe 3 und 6 mit Reihe 1 und 2 eo zeigt die Überlegenheit der MAAm-Polymerisate bei gleicher Monomerkonzentration. Durch die Zugabe eines Comonomeren MAS in geringen Anteilen wird die Kompressibilität erniedrigt, ohne daß die Druckfestigkeit in Spalte A und B zu stark gesenkt wird.

Die Zugabe eines feinkörnigen Granulats eines polymeren Füllstoffes — bestehend aus MAAm, AN und Bis-AAm — ist nach dem Verfahren der Erfindung nicht zwingend, kann jedoch nach Reihe 7 zu guten Druckfestigkeiten führen. Es ergibt sich damit die Möglichkeit die im Herstellungsprozeß der Katalysatorperlen noch notwendige Monomerkonzentration und damit auch toxische Nebenwirkungen gezielt zu senken.

Durch den Zusatz von Comonomeren und/oder von geeeigneten Füllstoffen können aber nicht nur die Kompressibilität und Toxizität sondern auch die Löslichkeitseigenschaften im Innern des Katalysatorkornes sowie die Transporteigenschaften der Reaktanden gezielt beeinflußt werden.

Es wurde gefunden, daß die Polymerisationsgeschwindigkeit bei Verwendung des MAAm langsamer ist als mit AAm. Dies bedingt eine höhere Expositionsdauer der Mikroorganismen mit der toxischen Monomerlösung. Es ist deshalb für eine schonende Fixierung vorteilhaft, wenn die Expositionsdauer da-

durch vermindert wird, daß der Mikroorganismus erst nach Polymerisationsbeginn, und zwar möglichst kurz vor dem Gelpunkt zur Monomerlösung gegeben wird, so daß eine gleichmäßige Dispergierung der Mikroorganismen ermöglicht wird. Der genaue Gelpunkt einer radikalisch initiierten Polymerisation hängt nicht nur von den Konzentrationen, der Temperatur und dem Lösungsmittel ab, sondern wird auch stark durch geringfügige Verunreinigungen im Sinne einer Inhibierung beeinflußt.

Der Gelpunkt wird daher nach dem Verfahren der Erfindung für das jeweilige System durch eine zeitlich leicht vorgezogene parallele Polymerisation der gleichen Stammlösungen bestimmt, wodurch unabhängig von absoluten kinetischen Daten eine »Uhr« für den Reaktionsablauf des jeweiligen Ansatzes besteht.

Wird ein Polyacrylamidgel nach dem Stand der Technik dadurch zerkleinert, daß es durch ein Sieb gedrückt wird, so entstehen unregelmäßig geformte Teilchen (Granulate), die im Festbett hohen Druckverlust und im Wirbelbett hohen Abrieb verursachen. Durch Suspensionspolymerisation der wäßrigen Monomerlösung in einer organischen Phase wird nach dem Verfahren der Erfindung erreicht, daß die Vorteile der guten mechanischen Eigenschaften und der schonenden Fixierung mit der direkten Formgebung zu Katalysatorperlen kombiniert werden. Das bedeutet einen technischen Fortschritt hinsichtlich optimaler Reaktionsbedingungen (Verhältnis Volumen zu Oberfläche), guter Packungseigenschaften und Vermeidung von Abrieb.

Im Gegensatz zu Suspensionspolymerisationen »öl in Wasser« sind solche des Typs »Wasser in öl« vergleichsweise wenig durchgeführt worden. Unter Verwendung von Acrylamid ist der Einschluß von Enzymen durchgeführt worden, dazu wird auf die obengenannte Literatur verwiesen. Dieser Stand der Technik hat den Nachteil, daß durch die Verwendung von Polyacrylamid Produkte mit unbefriedigender mechanischer Stabilität entstehen und die genannten Suspensionsmittel hinsichtlich Dichte und Toxizität für den Einschluß von lebensfähigen Mikroorganismen in Methacrylamid ungeeignet sind. Das Verfahren der Erfindung verwendet dagegen Di-Ester der Phthalsäure wie z. B. Dibutylphthalat, die vorzugsweise geeignet sind. Diese sind gegenüber Mikroorganismen physiologisch nahezu inert und sind in der Dichte (DBPh = 1,047 g/cm³ Temp. 20⁰C) soweit der Wasserphase

ίο ähnlich, daß eine gleichmäßige Dispersion — ohne Sedimentation oder Flotation — erhalten werden kann. Als Suspensionsstabilisator hat sich ein Blockpolymerisat aus Propylenoxid und Äthylenoxid bewährt, aber auch andere Polymere mit geeigneter hydrophober/hydrophiler Balance sind einsetzbar. Neben dem Suspensionsstabilisator zur Zurückdrängung bzw. Vermeidung der Agglomeration kann auch Tensid zugesetzt werden. Ein derartiger Zusatz wie z. B. 0,03% Cetylalkohol kann zusammen mit der Einstellung entsprechender Rührbedingungen die Perlgröße des Biokatalysators kontrollieren und steuern. Findet gegen Ende der Polymerisation eine Agglomeration der Perlen statt, die das Abtrennen der organischen Phase durchaus erleichtert, so können diese Agglomerate mit einem Sieb in Verbindung mit einer Größenklassierung wieder leicht getrennt werden. Bei dem Einschluß von Mikroorganismen in Polyacrylamid ist bekannt, daß mit Senkung der Polymerisationstemperatur die Aktivitätsausbeute steigt (Chibata u. Tosa, Appl. Microbiol. 27 [19741 878), (Shimizu et al., J.

Ferment Technol. 53 [1975177).

Dies gilt nach eigenen Untersuchungen auch für PMAAm. Es wurde für ein Polymerisat aus 20% MAAm in Fixierungsversuchen mit Candida tropicalis bei einer Polymerisationstemperatur von +22⁰C eine Aktivitätsausbe Aktivitätsausbeute von 23%, bei +5⁰C jedoch von 44% gefunden.

Nach dem Verfahren der Erfindung wird in den einzelnen Stufen des Verfahrens die Kontaktzeit

A b b. 1 Reaktivierung der fixierten Mikroorganismen

Katal. Akt.

Reinkubationszeit (h)

Monomer/Mikroorganismus minimiert und außerdem wird durch variable Temperaturführung in den Verfahrensstufen 3 bis 5 eine möglichst hohe Aktivitätsausbeute erzielt, ohne daß die Zeit zur Herstellung des Biokatalysators mehr als technisch erforderlich verlängert wird.

Für den Fall, daß die Aktivität direkt nach dem Fixierungsschritt dennoch zu niedrig ist, bietet die Fixierung lebender Mikroorganismen den erheblichen Vorteil, daß durch Reinkubation mit Nährmedium im Innern des Biokatalysators eine Zellvermehrung erfolgt, welche die Aktivität eines desaktivierten Katalysators wieder erhöht.

Die Aktivitätszunahme in Abhängigkeit von der Expositionszeit der fixierten Mikroorganismen in der Nährlösung ist in A b b. 1 dargestellt.

Zur Bestätigung, daß die Zunahme der Aktivität durch Zellvermehrung im Innern des Katalysators erreicht wird, wurde jeweils eine Analyse auf Phosphor durchgeführt. Tabelle 3 bestätigt die Zunahme der »Biomasse« im Polymerisat

Tabelle 3

Phosphorgehalt des Biokatalysators in verschiedenen Stadien der Reinkubation

Mikroorganismus

Reak-

tivie-

rungs-

dauer

(h)

PoIy-MAAm Candida tropicalis 5 0,002

PoIy-MAAm Candida tropicalis 12 0,008

PoIy-MAAm Candida tropicalis 27 0,10

PoIy-MAAm Candida tropicalis 55 0,18

*) Analytisches Laboratorium Ilse Beetz, 8640 Kronach.

Unter Abkürzungen werden folgende Stoffe verstanden:

AAm Acrylamid

AN Acrylnitril

6-APA 6-Aminopenicillansäure

BisAAm N,N'-Methylenbisacrylamid

BFM Biofeuchtmasse

BTM Biotrockenmasse

DBPh Dibutylphthalat

DMAEMA Dimethylaminoäthylmethacrylat

MAAm Methacrylamid

MAS Methacrylsäure

PMAAm Polymethacrylamid

TEMED Tetramethyläthylendiamin

Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan.

Das Verfahren der Erfindung wird nachstehend beispielhaft beschrieben.

20

25

30

35

Beispiel 1

Mischung A:

2,5 g abzentrifugierte feuchte Zellmasse von Candida tropicalis wurden in 5 ml 0,9%-NaCl-Lösung suspendiert.

Mischung E	t:
8,0 g	Methacrylamid
2,0 g	Bisacrylamid
0,2 ml	Methacrylsäure
0,4 ml	Dimethylaminoäthylmethacrylat
	(Coinitiator)
20 ml	H2Odest.
20 ml	Phosphatpuffer pH 9,0 (0,1 molar)
0,04 ml Thioäthanol.

Wachstum neuer Zellen im Katalysator durch Reinkubation ist jedoch nicht nur auf frisch fixierte Zellen beschränkt So konnten ruhende Zellen von Candida tropicalis, die 14 Tage lang kontinuierlich Phenol oxidiert hatten, wieder zum Wachstum gebracht werden, wodurch die Aktivität wieder ihren ursprünglichen Wert erreichte. Die Reinkubation kann auch mehrmals angewendet werden, wie ein 40 Tage dauernder Versuch bestätigt Nach durchschnittlich 8tägigem Einsatz als Katalysator wurde die Aktivität durch Reinkubation wieder erhöht, so daß insgesamt 5mal reinkubiert werden konnte und über 40 Tage eine im Mittel konstante Aktivität aufrechterhalten werden konnte.

Das Verfahren der Erfindung ist allgemein auf die verschiedensten Mikroorganismen anwendbar, auch wenn sich die Beispiele nur auf eine Auswahl beschränken. Das Verfahren der Erfindung zur Herstellung perlförmiger Biokatalysatorträger ist in den Patentansprüchen definiert

Unter »Gelpunkt« wird nach dem Verfahren der Erfindung der Zeitpunkt verstanden, zu dem in dem Polymerisationsansatz innerhalb einiger Sekunden der Übergang von einer zunächst niedrig viskosen Flüssigkeit zu einem nicht mehr fließfähigem Gelblock stattfindet Es ist in der Praxis ausreichend, den Gelpunkt durch Schütteln des vorgezogenen Parallelansatzes visuell festzustellen.

Mischung C:

5 ml 10%ige wäßrige Lösung von (NH

Mischung D:

300 ml Dibutylphthalat

des am Anmeldetag unter der
Handelsbezeichnung »Pluronic L 61«
bekannten Propylenoxid/Äthylenoxid/Blockcopolymers.

Es wird bei 22° C 30 Min. mit N₂ entlüftet und danach die Polymerisation durch Zugabe der Lösung C zur Lösung B eingeleitet In einem Parallelversuch wird festgestellt, daß der Gelpunkt 10 Min. nach Beginn der Polymerisation bei einer Temperatur von etwa 22° C eintritt Es wird dann nach 9 Min. die Lösung A zur Lösung B gegeben und in dieser gleichmäßig verteilt Danach wird diese Mischung in die Lösung D, die sich in einem 1-1-Rundkolben befindet, eingeführt, in welcher die wäßrige Phase mit einem Propellerrührer bei etwa 150 U/Min, verteilt wird. Nach 20 Μία sind bereits agglomerierte Perlen entstanden, und nach weiteren 30 Min. ist die Polymerisation beendet Diese Perlen werden vom Dibutylphthalat abfi'triert

Es lassen sich durch leichtes Verreiben der agglomerierten Perlen auf einem 0,75-mm-Sieb Gel-Perlen folgender Siebfraktionen erhalten:

03-0,75 mm: 32,4 g(54%)
0,4-0^ mm: 20,4 g(34%)
0,25-0,4 mm: 6,8g(12%).

Es werden 10 g dieser Perlen entsprechend 10 cm³ in 400 ml 2,5 10-³M Phenollösung mit Luft begast und gerührt. Die Abnahme der Phenolkonzentration wird mittels Extinktion bei 270 nm verfolgt Diese beträgt 7,7-|0-⁵Mol/h.

Die Zellkonzentration im Bio-Katalysator beträgt 0,04 g/cm³; die Aktivität von 1 g frei suspendierter Zellmasse beträgt 7 -10-⁴ Mol/h. Die Aktivität der fixierten Zellen beträgt 28% der Aktivität frei suspendierter Zellen.

Beispiel 2

Mischung A:

1,25 g Candida tropicalis in 4 ml 0,9%-NaCl-Lösung.

Mischung B:

8 g Methacrylamid

2 g Bisacrylamid 20 ml H₂O dest

20 ml Phosphatpuffer pH 6,7 (0,1 molar) 0,05 ml Tetramethyläthylendiamin (TEMED) als Coinitiator.

Mischung C:

2 ml (NH₄J₂S₂O₈; 10%ige wäßrige Lösung.

Mischung D:

300 ml Dibutylphthalat so

0,15 g des am Anmeldetag unter der Handelsbezeichnung »Pluronic L 61« bekannten Produkts.

Es wird in einem Versuch festgestellt, daß der Gelpunkt 9 Min. nach Beginn der Polymerisation bei einer Temperatur von etwa 22° C eintritt Die Herstellung der Gelperlen erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.

Die Ausbeute an Gelperlen beträgt 50 g, entsprechend 88%.

Die Gelperlen werden mit folgenden Fraktionen erhalten:

0,5-0,75 mm: 24 g(48%) 0,4-0,5 mm: 18,5 g (37%) 0,25-0,4 mm: 7g(14%).

45

Die Aktivität von 1 g Katalysatorperlen der Fraktion 0,4—0,5 mm bei 30⁰C und einem pH-Wert von 6,7 beträgt 3,64-10~⁶ Mol/h. Die Aktivität der Fixierten Zellen beträgt somit bei einer Zellkonzentration von 0,02 g/cm³ 23% der Aktivität der frei suspendierten Zellen.

Die nach Größe fraktionierten Perlen wurden 12 h lang bei 4° C mit sieriler 0,9%iger NaCl-Lösung gewaschen, um an der Oberfläche haftende Zellen zu entfernen und dann jeweils 0,5 g = 0,5 cm³ in 100 ml sterilem Nährmedium (1 g Phenol, 1 g Hefeextrakt, 2 g NH₄NO₃, 2 g (Nm)₂SO₄, Ig KH₂PO₄, 2 g K2HPO4 · 2 H₂O, 1 g Na₂HPO₄ - 2 H₂O, 0,2 g MgSO₄-7 HA 0,2 g KCl, 11mg ZnSO₄, 6 mg MnSO₄ - HA 1 mg FeSO₄ · 7 HA, 0,3 mg CoSO₄ · 7 H₂O, 0,04 mg CuSO₄ · 5 HA, 0,001 mg kj und 1 mg Äthylendiamintetraessigsäure gelöst in 1000 ml destilliertem HA) in einem 1000 ml Erlenmeyerkolben mit 2 Schikanen- suspendiert und auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 100 U/min und +30⁰C inkubiert Die Reinkubation wurde chargenweise zu verschiedenen Zeiten abgebrochen und nach erneutem sorgfältigen 12stündigem Waschen (0,9%-NaCl-Lösung) der Perlen wurde deren Aktivität, wie im Beispiel 1 beschrieben, bestimmt. Sie betrug nach einer Reinkubationsdauer von 5 h 2-10-⁵Mol/h (pro g Katalysatorperlen) entsprechend 126%; nach einer Reinkubationsdauer von 13—55 h 5-10~⁵ Mol/h entsprechend 316%.

Beispiel 3

Mischung A:

10 g Candida tropicalis in 5 ml 0,9%-NaCl-Lösung.

Mischung B:

83 ml folgender Mischung:

16 g Methacrylamid

4 g Bisacryiamid

0,5 ml Methacrylsäure

40 ml Phosphat-Puffer pH 9,0 (0,1 molar) 40 ml H₂O dest.

0,1 ml TEMED.

Mischung C:

2 ml (NH₄J₂S₂O₈; 10%ige wäßrige Lösung.

Mischung D:

400 ml Dibutylphthalat

0,4 g des am Anmeldetag unter der Handelsbezeichnung »Pluronic L 61« bekannten Produkts.

Es werden die Lösungen A, B, D mit Eiswasser auf 0-5⁰C gekühlt.

Es wird in einem Versuch festgestellt, daß der Gelpunkt bei 0—5°C 45 Min. nach Beginn der Polymerisation eintritt.

Die Herstellung der Gel-Perlen erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.

Es wurde die Zellsuspensicn nach 35 Min. zur Monomerlösung B zugegeben. Nach Zugabe der Lösung B zur Lösung Ö wird die Kühlung von der Lösung D entfernt Diese steigt danach auf etwa 20⁰C an. Nach 3 h werden die Gel-Perlen vom Dibutylphthalat abfiltriert Die Herstellung der Siebfraktionen erfolgt gemäß Beispiel 1. Die Aktivität von 1 g Katalysator-Perlen beträgt 2,19 · IO-⁵ Mol/h bei einer Zellkonzentration von 0,1 g/cm³. Da die Aktivität der frei suspendierten Zellen 5 10-⁴MoUh beträgt, liegt die relative Aktivität der fixierten Zellen bei 44%.

Beispiel 4

Dieses wird wie Beispiel 2 durchgeführt, jedoch mit dem Unterschied, daß

Mischung A:

2J5g Escherichia coli in 5 ml 0,9%-NaCl-Lösung enthält

Die Herstellung der Gel-Perlen erfolgt nach Beispiel 1. Die Aktivität der fixierten Mikroorganismen, Penkilinamidase, wird bei 37° C und einem pH-Wert von 8,0 in einem Festbettreaktor mit Rührkessel-Charakteristik (Umlauf) verfolgt Die Konzentration der gebildeten 6-Aminopenicillansäure «r>d nach der Methode von Balasingham et al. photometrisch bei 415 nm bestimmt (E = 100). Dazu wird auf Biochem. et Biophys. Acta 276 (1972), 250—256 verwiesen.

Es werden 0,5 ml Reaktorinhalt mit 3,5 ml Reagenzlösung versetzt Es wird danach die Extinktion nach 15 Min. bestimmt

Die Reagenzlösung hat folgende Zusammensetzung:

0,5 ml Dirne thy laminobenzaldehyd; 0,5% (w/v) in Methanol 2,0 ml Eisessig; 20%ige Lösung 1,0 ml NaOH; 0,5 M.

Die Aktivität der Penicillinamidase von 2,5 g frei suspendierten Escherichia coli Zellen beträgt 1,25 mMol 6-APA/h.

Die Aktivität der gesamten fixierten Zellmenge beträgt 03 mMol 6-APA/h, entsprechend 73% der Aktivität der frei suspendierten Zellen.

Beispiel 5

Mischung A:

10 g E. coli Biofeuchtmasse 5 ml 0,9%-NaCl-Lösung.

Mischung B:

8 g Methacrylamid

2 g Ν,Ν'-Methylendiacrylamid

20 ml Phosphat-Puffer pH 6,7 (0,1 molar) 10 ml H₂OdCSt

03 ml TEMED.

Mischung C:

4 ml (NH₄J₂S₂O₈; 10%ige wäßrige Lösung.

Mischung D:

300 ml Dibutylphthalat

03 g des am Anmeldetag unter der Handelsbezeichnung »PluronicL61« bekannten Produkts.

Zur Lösung B wird als Initiator die Lösung C gegeben. In diesen Polymerisationsansatz wird kurz vor Erreichen des Gel-Punktes die Lösung A eingerührt, dann wird die Mischung aus A, B und C in D suspendiert Nach einer Stunde Rühren werden die erhaltenen Polymerisatperlen durch Filtrieren abgetrennt und durch Waschen mit 0,9%iger NaCl-Lösung vom anhaftenden Dibutylphthalat befreit

Sowohl die Reaktoren als auch die Monomeren müssen vorher durch Stickstoff sorgfältig sauerstofffrei gemacht werden. Bis zum Gelpunkt wird die Temperatur auf 0°C gehalten, dann vollzieht sich die Polymerisation bei Raumtemperatur. Der zeitliche Eintritt des Gelpunktes wird an einem Parallelversuch (Monomere + Initiator) — der unter den oben angegebenen Bedingungen stattfindet — festgestellt Die Ausbeute beträgt 51 g Katalysatorfeuchtmasse (Perldurchmesser 0,25 -0,75 mm).

Die fixierten Mikroorganismen besitzen noch 57% der Aktivität frei suspendierter Zellen.

Beispiel 6

Mischung A:

2,5 g BFM Bovista plumbea = 300 mg Bio-Trokkenmasse (BTM) (bereits zerkleinert) wur

den in 10 ml Phosphat-Puffer 0,1 M pH 6,7 suspendiert.

Mischung B:

is 16 mg Methacrylamid

4 g N.N'-Methylenbisacrylamid

25 ml Phosphat-Puffer pH 6,7 (0,1 molar)

55 ml H₂OdCSt

0,2 ml TEMED = 0,2%.

Mischung C:

4 ml 10%ige wäßrige Lösung von (NH₄J₂S₂O₈.

Mischung D:

250 ml Dibutylphthalat

0,125 g des am Anmeldetag unter der Handelsbezeichnung »Pluronic L 61« bekannten Produkts.

A und D wurden mit Eiswasser gekühlt. 25 ml von B und 1 ml von C wurden im vorgezogenen Parallelversuch zur Bestimmung des Gelpunktes abgezweigt.

Drei Min. danach wurde C zu B zugegeben und damit auch dort die Polymerisation gestartet. Der Gelpunkt trat nach 8 Min. auf, eine Minute später, also 2 Min. vor dem erwarteten Gelpunkt, wurde A zu B gegeben und dort durch Schütteln des Gefäßes gut verteilt und dann sofort zu D gegeben und mit einem Propellerrührer bei 150 U/Min, suspendiert Die Kühlung von D wurde nun entfernt, um eine schnellere und bessere Aushärtung der Perlen zu erreichen. Nach 1 h wurde die Polymerisation beendet, die entstandenen Perlagglomerate mit einem Sieb vom Dibutylphthalat abgetrennt und mit Wasser gewaschen. Ober eine Siebfraktionierung wurden die Katalysatorperlen gewonnen, die im Korngrößenbereich d = 0,25—0,75 mm 65% der Masse des Biokatalysators darstellen.

Messung der Reaktionsgeschwindigkeit der Spaltung von Penicillin V zu 6-Aminopenicillansäure: Die Perlen wurden bei 37° C in 80 ml einer 0,05molaren Lösung von Penicillin V in 0,1 molarem Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) 2 h lang geschüttelt Die Aktivität dieser Perlen betrug 41 % bezogen auf die Aktivität der eingesetzten freien Zellmasse.

Claims (11)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Biokatalysatortn durch Polymereinschluß von Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 1 die Mischungen

A. bestehend aus den Komponenten:

a) der Feucht- oder Trocken-Zellmasse von vermehrungsfähigen oder toten Mikroorganismen und

b) einer eventuell erforderlichen physiologischen wäßrigen Salzlösung zur Erreichung der Fließfähigkeit von A,

B. bestehend aus der Lösung oder Dispersion der Komponenten:

c) Methacrylamid in einer Menge von 60 bis 90 Gew.-%, bezogen auf die Summe der Komponenten c) und d),

d) einer wasserlöslichen Divinylverbindung wie Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid als Vernetzungsmittel in einer Menge von 10 bis 30 Gew.-%, bezogen auf die Gesamt-Monomer-Menge c) und d), in

e) Wasser, dem zur Einstellung eines pH-Wertes von 7 bis 9 in der Mischung B Säuren, Laugen oder Puffersubstanzen zugesetzt werden,

C. bestehend aus:

f) einem wasserlöslichen Radikalinitiator wie Peroxodisulfat in einer Menge von 0,05 bis 2,0 Gew.-%, bezogen auf die Summe der Komponenten b) bis g), und

g) Wasser im Verhältnis f) zu g) bis 30 :100,

D. bestehend aus:

h) einer nicht mit Wasser mischbaren Suspensionsflüssigkeit und einem
i) Suspensionsstabilisator im Verhältnis von h) zu i) = 10 000 :1 bis 1000 Gewichtsteilen,

so hergestellt werden, daß zur Erreichung einer hohen mechanischen Stabilität die Summe der Komponenten c) bis d) 10 bis 50 Gew.-% der Summe der Komponenten b) bis g) beträgt, die Komponente a) bis zu 40 Gew.-°/o, bezogen auf die Summe der Mischungen A-I-B+ C, ausmacht, das Volumenverhältnis der Mischung D zur Summe der Mischungen A + B + C mindestens oder größer 2 :1 ist,
danach in Stufe 2 die Polymerisation durch Herstellung einer Mischung aus B und C der Stufe 1, und zwar in einem derartigen Verhältnis, daß in dem System aus den Komponenten b) bis g) eine Konzentration von f) im Bereich von 0,05 bis 2,0 Gew.-% eingestellt wird, bei einer Temperatur zwischen -5° C und +8O⁰C unter Rühren eingeleitet wird bo und in Stufe 3 kurz vor Eintritt des Gelpunktes aus Mischung A aus Stufe 1 und der Mischung aus Stufe 2 durch Rühren eine gleichmäßige Verteilung herbeigeführt wird, und zwar derart, daß in dem System aus den Komponenten a) bis g) die Summe b5 der Komponenten c) bis d) 0 bis 50 Gew.-% beträgt und die Menge der Komponenten a) bis 40 Gew.-% der Mischung a) bis g) ausmacht,

danach in Stufe 4 das System aus Stufe 3 in die Mischung D aus Stufe 1 unter Rühren zur Herstellung einer perlförmigen Flüssig-Flüssig-Suspension im Volumenverhältnis des Systems aus Stufe 3 zur Mischung D mindestens von 2 :1 eingeführt wird, so daß eine Suspension der wäßrigen in der nichtwäßrigen Phase erreicht und die Suspensions-Polymerisation bei einer Temperatur zwischen —5°C und +8O⁰C bis zur Beendigung durchgeführt wird,

danach in Stufe 5 der erzeugte perlförmige Bio-Katalysator von der flüssigen Suspensions-Phase abgetrennt und mit physiologischer Salzlösung gewaschen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 1 Comonomere zur Einstellung bestimmter Netzwerkeigenschaften in einer Menge bis zu 30 Gew.-%, bezogen auf c) bis d), zugesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 1 als Comonomere Methacrylsäure und/oder Dimethylaminoäthylmethacrylat in einer Menge bis zu 30 Gew.-%, bezogen auf die Komponenten c) bis d), zugesetzt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 1 zur Beschleunigung des Initiatorzerfalles ein Coinitiator in einer Menge von 0,05 bis 2,0 Gew.-%, bezogen auf die Summe der Komponenten b) bis g), zugesetzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe 1 zur Beschleunigung des Initiatorzerfalles als Coinitiator Tetramethyläthylendiamin oder Dimethylaminoäthylmethacrylat in einer Menge von 0,05 bis 2,0 Gew.-%, bezogen auf die Summe der Komponenten b) bis g), zugesetzt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Stufe 1 zur Erhöhung der Druckfestigkeit des Bio-Katalysators bei Reaktionen in wäßrigen Systemen ein wasserunlöslicher polymerer Füllstoff in fein verteilter Form eingesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß als wasserunlöslicher polymerer Füllstoff in fein verteilter Form ein hydrophiler, wasserunlöslicher polymerer Füllstoff eingesetzt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß als hydrophiler, wasserunlöslicher polymerer Füllstoff ein Polymerisat aus Bisacrylamid oder ein Terpolymerisat aus N,N--Methylenbisacrylamid, Methacrylamid und Acrylamid eingesetzt wird.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß zur Herstellung eines Bio-Katalysators, der vermehrungsfähige Mikroorganismen enthält, in Stufe 4 ein Diester aus Phthalsäure mit Alkanolen von Ci bis C10 als Suspensions-Flüssigkeit verwendet wird.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Suspensionsstabilisator in Stufe 4 Blockcopolymere des Propylenoxids mit Äthylenoxid mit überwiegendem Propylenoxidanteil und mit einem Molekulargewicht über 1000 oder statistische Copolymere aus Methylmethacrylat und Acrylamid im Verhältnis 4 bis 9:1 in einer Konzentration von 0,05 bis 5 Gew.-%, bezogen auf die Komponente 1, verwendet werden.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzeugung eines Bio-Katalysators, der vermehrungsfähige Mikroorganismen enthält, in

den Stufen 3 und 4 eine Temperatur von —5° C bis + 10°C und in der Stufe 5 eine Temperatur von 0⁰C bis +30° C eingestellt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man im Bio-Katalysator sich befindende Mikroorganismen zusätzlich in einem für das Wachstum erforderlichen Nährmedium für einen bestimmten Zeitraum ein- oder mehrmals reinkubiert