DE2752380A1

DE2752380A1 - Verfahren zur herstellung von auf chemischem wege schwer zugaenglichen organischen verbindungsspecies

Info

Publication number: DE2752380A1
Application number: DE19772752380
Authority: DE
Inventors: Manfred Hellwig; Hans-Joachim Prof Dr Knackmuss
Original assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 1975-10-29
Filing date: 1977-11-24
Publication date: 1979-05-31

Description

Verfahren zur Herstellung von auf chemischem
Wege schwer zugänglichen, organischen Verbindungsspecies Zusatz zu Patent .......
Patentanmeldung P 25 48 454. 2-42 Beschreibung: Die Erfindung betrifft ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu schaffen, mit welchem auf chemischen Wege schwer zugängliche organische Verbindungen, wie sie im Oberbegriff des Patentanspruchs erwähnt werden, in einfacher Weise, in reinem Zustand (ohne nichtisomere Nebenprodukte) und mit verhältnismäßig hoher Ausbeute hergestellt werden können. VerhåtnismäBig hohe Ausbeuten bedeuten in diesem Falle Ausbeuten von mehr als 50 7o.
Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch die Verfahrensschritte: a) Anzucht einer biologisch aktiven Suspension von Pseudomas-Bakterien des Stammes B 13 auf einer 3-Chlor-benzoat als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle (Wachstumssubstrat) enthaltenden Mineralsalzlösung; b) Adaptation des Bakterienstanimes an 4-Chlorphenol durch kontinuierliches Ersetzen des 3-Chlor-benzoats nach einem linearen Gradienten durch eine äquimolare Konzentration von 4-Chlor-phenol bis eine konstante Zelldichte von E564 = 1, 8 erreicht ist; c) Zugabe eines Kresols und Cooxidation desselben, ,im Falle von o-Kresol zu (+) -2, 5-Dihydro-4-methyl-5-oxo-furan-2-essigsäure in praktisch quantitativer Ausbeute, im Falle von p-Kresol zu der isomeren (+)-2, 5-Dihydro-2-methyl 5-oxo-furan-2-essigs.iure in 95% ige r Ausbeute, im Falle von m-Kresol zu einem Gemisch 73%iger respektive 14% iger Ausbeute der genannten Isomeren; d) Gewinnung des oder der in der Kulturflüssigkeit gelösten Metabolite durch Abtrennen der Bakterienzellen wie ip Patent .......
(Patentanmeldung P 25 48 454. 2-42) beschrieben oder durch präparative ChromatogrtpJic.
Die Erfindung wird anhand des folgenden Beispiels näher erläutert: Beispiel: Herstellung von (+)-2, 5-Dihydro-4-methyl- und (+)-2, 5-Dihydro-2-methyl-5-oxo-furan-2-essigsäure durch Cooxidation von Kresolen.
Zur Anzucht von Pseudomonos-Bakterien des Stammes B 13 wurden zunSchst folgende Stammlösungen erstellt: Stammlösung 1: 70 g Na2HPO4 x 12 H2O 10 g KH2PO4 in 1000 ml Wasser Stammlösung 2: 100 g (NH4)2SO4 5, 0 g Ca(NO3)2 x4H2O 1, 0 g Fe(III)-Amonlumcitrat 20 g MgSO4x 7H20 100 ml Spurenelementlösung nach N.Pfennig und K. D. Lippert (Arch. Mikrobiol., Vol. 55 (1966), S. 245-256), allerdings ohne Eisensalze und Äthylendiamintetraessigsäure in 1000 ml wäßriger Lösung.
Stammlösung 3:156,6 g 3-Chlorbentoesäure in 1000 ml wäßriger Lösung, mit NaOH auf PH 7, 5 eingestellt.
Das komplette Mineralsalz -Chlorb.anzoat-medium enthielt im Liter 100 ml der Stammlösung 1 und jeweils 10 ml der Stammlösungen 2 und 3.
einem Die Pseudomonas-Bakterien wurden in/200 ml Chemostaten kultiviert.
Die Verdünnungsrate wurde auf 0, 4 x 10 h eingestellt und das 3-Chlorbenzoat innerhalb von 10 Tagen nach einem linearen Gradienten durch eine äquimolare Konzentration an4-Chlorphenol O-910 mM ersetzt. Bei weiterer kontinuierlicher Kultivierung auf 50 mM 4-Chlor-phenol wurde schließlich eine konstante Zelldichte von E564= 1,8 erreicht.
Mit 100 ml dieser kontinuierlichen Kultur wurde ein 5 1 Fermenter mit 0, 9 1 Mineralmedium der o. g. Art beimpft. Frisches Mineralmedium, welches 100 mM 4-Chlorphenol und 100 mM NaOH enthielt, wurde mittels einer Schlauchpumpe zugespeist. Die Konzentration an 4-Chlorphenol wurde ständig kontrolliert und im Bereich von 0, 01 bis 0, 15 mM gehalten.
Die auf 4-Chlorphenol angezogenen Zellen cooxidierten leicht o-, m- oder p-Kresol. Aus o-Kresol entstand praktisch quantitativ (+)-2, 5-Dihydro-4-methyl-5-oxo-furan-2-essigsäure, aus p-Kresol die isomere (+)-2, 5-Dihydro- 2 -methyl- 5-oxo-furan-2 -e s sig säure in 957ciger Ausbeute.
Mit m-Kresol als Substrat entstand ein Gemisch der beiden genannten Verbindungen in 737ciger respektive l47ciger Ausbeute. Bei einer Zellkonzentration entsprechend 4, 1 g Protein pro Liter wurden etwa 6 m mol Kresol/hx Ltr. umgesetzt. Bis zu einer Produktkonzentration von etwa 10 g pro Liter verlief die Cooxidation der Kresole ungehemmt.
Die Produkte wurden wie beschrieben aus den Kulturflüssigkeiten isoliert, bei Vorliegen eines Isomeren-Gemisches durch präparative Chromatographie getrennt und mit den ahentischen Proben aus der Cooxidation von Methylbrenzcatechinen identifiziert (Schmelzpunkte und Mischproben, UV- und IR-Spektren).

Claims

Patentanspruch: Verfahren zur Herstellung von auf chemischewn Wege schwer zugänglichen, organischen Verbindungsspecies bzw. reinen optischen Isomeren aus den Gruppen ungesättigte, zyklische α-ß -ß -Dihydroxy monoc arbonsäuren substituierte, ungesättigte, aliphatische Dicarbonsäuren substituierte, ungesättigte, aliphatische Monohydroxy-dicarbon säuren und deren Lactone, wobei in einem ersten Verfahrens abschnitt ein Bakterienstamm auf einem Wachstums substrat angezogen wird, das eine mit einem unphysiologischen Substituenten versehene, aromatische Verbindung als Kohlenstoff- und Energiequelle enthält und während der Verwertung des Wachtumssubstrates (Vermehrung der Bakterienzellen) der unphysiologische Substituent durch eine anionische Eliminierungsreaktion aus der aromatischen Verbindung abgetrennt wird, und in einem zweiten Verfahrensabschnitt eine zum Wachstums substrat strukturanaloge Verbindung oder deren Isomeresizugegeben und metabolosiert wird, die im Gegensatz zum Wachstums substrat ein Strukturelement (einen Substituenten) enthält, das (der) aufgrund seiner unterschiedlichen Polarität, es (er) ist gegenüber dem eliminierbaren Substituenten im Wachstums substrat nichtisoelektronisch, während der Cooxidation der beiden aromatischen Verbindungen nicht entsprechend eliminiert werden kann, und daß der Metabolit der nicht vollständig abbaubaren, strukturanalogen Verbindung im Substrat akkumulieren gelassen wird nach Patent .. .. ... (Patentanmeldung P 25 48 454. 2-42), gekennzeichnet durch die Verfahrensschritte a) Anzucht einer biologisch aktiven Suspension von Pseudomonas-Bakterien des Stammes B 13 auf einer 3-Chlor-benzoat als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle (Wachstumssubstrat) enthaltenden Mineralsalzlösung; b) Adaptation des Bakterienstammes an 4-Chlorphenol durch kontinuierliches Ersetzen des 3-Chlor-benzoats nach einem linearen Gradienten durch eine äquimolare Konzentration von 4-Chlor-phenol bis eine konstante Zelldichte von E564 = 1, 8 erreicht ist; c) Zugabe eines Kresols und Cooxidation desselben, im Falle von o-Kresol zu (+) -2, 5-Dihydro-4-methyl-5-oxo-furan-2-essigsäure in praktisch quantitativer Ausbeute, im Falle von p-Kresol zu der isomeren (+)-2, 5-Dihydro-Z-methyl-5-oxo-furan-2-essigsäure in 95%iger Ausbeute, im Falle von m-Kresol zu einem Gemisch in 73%iger respektive 14%iger Ausbeute der genannten Isomeren; d) Gewinnung des oder der in der Kulturflüssigkeit gelösten Metabolite durch Abtrennen der Bakterienzellen wie in Patent ....

(Patentanmeldung P 25 48 454. 2-42) beschrieben oder durch präparative Chromatographie.