DE2746942A1 - Neue psoralenderivate - Google Patents
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Description
DlPL-ING. (1934-1974)
DlPL-CHEM.
27A69A2
DlPL-ING.
8000 MÜNCHEN 80
LUCILE-GRAHN-STRASSE
TELEFON: (089) 472947 TELEX: S24624 LEOER O
TELEGR.: LEDERERPATENT
19. Oktober 1977 UN 4051/6
THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CALIFORNIA, 2200 University Avenue, Berkeley, Kalif., USA
Neue Psoralenderivate
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Psoralenderivate, insbesondere Derivate des 4,5',8-Trimethylpsoralens (Trioxsalen)
mit einem organischen funktioneilen Substituenten am 4-Kohlenstoffatom.
Die neuen Psoralenderivate besitzen die allgemeine Formel
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27Λ6942
1 worin X einen Substituenten, wie Halogenalkylgruppen,
Alkoholgruppen, Aethergruppen und Aminoalkylgruppen darstellt.
Der Ausdruck Alkyl bezeichnet vorzugsweise niedere Alkylgruppen
mit bis zu 7 C-Atomen wie Methyl, Aethyl und Propyl, wobei Methyl bevorzugt ist. Ein Alkohol-Substituent ist vorzugsweise
ein aliphatischer Kohlenwasserstoff mit einer oder mehreren Hydroxygruppen, z.B. Hydroxy-nieder-alkyl. Ein Aether-Substituent
ist vorzugsweise ein nieder-Alkoxy-nieder-alkylrest.
Beispiele von erfindungsgemässen Psoralenderivaten sind
15 4'-Chlormethyl-4,5',8-trimethylpsoralen,
4'-Hydroxymethyl-4, 5 ' ,8-trimethylpsoralen,
4'-Methoxymethyl-4,5',8-trimethylpsoralen,
4'-Phthalimidomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen und
4'-Aminomethyl-4, 5 ' ,e-trimethylpsoralen-hydrochlorid.
In anderer Beziehung betrifft die Erfindung Deoxyribonucleinsäure oder Ribonucleinsäure, an welche an mindestens
einer Bindungsstelle ein 4'-Derivat des 4,5',8-Trimethylpsoralens covalent gebunden ist.
einer Bindungsstelle ein 4'-Derivat des 4,5',8-Trimethylpsoralens covalent gebunden ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung batrifft ein Verfahren zum Eingreifen in die Replikation von Nucleinsäuren, welches
dadurch gekennzeichnet ist, dass man Nucleinsäuren mit einem 4'-Derivat des 4,5',8-Trimethylpsoralens zusammenbringt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Inaktivierung von Viren, welches dadurch gekennzeichnet ist,
dass man Viren mit einem 4'-Derivat des 4,5',8-Trimethylpsoralens
zusammenbringt und diese dann einer Energiestrahlung
35 aussetzt.
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•j Psoralene sind lineare Isomere der Furocumarinfamilie
und kommen in der Natur in gewissen Früchten und Samen, z.B. Ammi majus und psoralea corylifolia vor. Extrakte dieser
Früchte und Samen sind seit alter Zeit als Hautsensibilisierungsmlttel bei der Behandlung von Vitiligo in Gebrauch. Die
topische Anwendung von Psoralenextrakten und anschliessende Bestrahlung mit Licht resultiert in einer Stimulierung der
Melaninproduktion und bewirkt so einen Hautgerbungseffekt.
In den vergangenen Jahren sind Psoralene in der Photochemotherapie
von Psoriasis verwendet worden. Bei dieser Behandlung werden Psoralene dem Patienten oral oder topisch
verabreicht. Danach wird die Haut einer Ultraviolett-Bestrahlung ausgesetzt.
Mit zunehmendem Interesse an der Molekularbiologie und deren Studium sind Psoralene in bezug auf ihre Fähigkeit,
covalente Bindungen mit Nucleinsäuren zu bilden, untersucht worden. Infolge ihrer planaren Struktur können sich Psoralene
zwischen die Basenpaare der Doppelhelix-Molekularstruktur von Nucleinsäuren einlagern. Auf Bestrahlung mit Licht geeigneter
Wellenlänge können die Psoralene covalente Bindungen mit den Pyrimidinnucleotiden, welche als integrale Bestandteile
der Nucleinsäurestränge auftreten, bilden. Das Zustandebringen covalent gebundener Psoralenbrücken oder Querverbindungen
zwischen Nucleinsäuresträngen der Doppelhelix stellt ein weiteres Werkzeug bei in vivo-Studien der Sekundärstruktur
von Nucleinsäuren dar. Zusätzlich sind die Psoralene ein Mittel zur Inaktivierung von Viren bei der Vaccineproduktion
und sie sind auch potentielle chemotherapeutische Mittel.
Die covalent gebundenen Psoralene wirken als Hemmer der DNS-Replikation
und haben somit die Fähigkeit, den Replikationsprozess zu verlangsamen oder zu stoppen. Die covalente Bindung
kann nur in einem Zweistufenverfahren hergestellt werden, indem zuerst das Psoralen sich in die Nucleinsäurehelix einlagert
und sodann jene Stellen der elektromagnetischen Strahlung
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ausgesetzt werden. Man erkennt somit sofort, dass der Vorgang der covalenten Bindung sowohl zeitlich als auch räumlich
kontrolliert werden kann.
Es ist auch ersichtlich, dass Querverbindungen nur bei solchen Psoralenmolekülen auftreten können, die zur richtigen
Zeit am richtigen Platz sind, d.h. ein Psoralenmolekül muss sich in der richtigen Stellung in genau dem Moment eingelagert
haben, in dem die Strahlungsenergie an dieser Stelle auftrifft.
10 Die Anwesenheit eines Psoralenmoleküls an der richtigen
Position hängt von der Löslichkeit des Psoralens in wässriger Lösung und von der Dissoziationskonstante für die nicht-covalente
Bindung des Psoralens zu Nucleinsäuren ab. Je höher somit die Löslichkeit ist, desto grosser ist die Anzahl der Moleküle
in dem umgebenden flüssigen Medium, die für die Bindungsstellen verfügbar sind. In ähnlicher Weise ist die Zahl der Psoralene
die eine potentielle Bindungsstelle irgendwann zur richtigen Zeit besetzen umso grosser, je niedriger die Dissoziationskonstante ist. Die Dissoziationskonstante K für die nicht-
covalente Bindung des Psoralens an die Nucleinsäure wird durch den Ausdruck
ν -
D "
definiert. Dabei ist (P) die Konzentration des freien Psoralens, (S) die Konzentration der nicht besetzten Bindungsstellen, wobei
jedes Basenpaar an einer Nucleinsäure als Bindungsstelle betrachtet wird, und (PS) die Konzentration von Psoralen-gebundenen
Stellen.
Die neuen Psoralenderivate können im wesentlichen in der gleichen Weise wie bekannte Psoralene verwendet werden,
d.h. als Hautsensibilisierungsmittel, z.B. in der Behandlung von Vitiligo und Psoriasis; und als Mittel zur Inaktivierung
35 von Viren.
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Die neuen, oben definierten Psoralenderivate sind bekannten Psoralenen in bezug auf die Monoaddition an Nucleinsäuren
überlegen. Die Ueberlegenheit bezieht sich auf die resultierende Dichte covalent gebundenen Psoralens an der
Nucleinsäure, ohne dass an der allgemeinen Eingangskonzentration an Bindungsstellen und der totalen Psoralenkonzentration
etwas geändert wird.
Die neuen Psoralene haben zwei Vorteile, d.h. sie zeigen verbesserte Löslichkeit in Wasser und/oder besitzen eine
niedrige Dissoziationskonstante von DNS und/oder RNS.
Das 4'-Chlormethyl-4,5',8-trimethylpsoralen und das
4'-N-Phthalimidomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen kann als
Zwischenprodukt bei der Herstellung der übrigen erfindungsgemässen
Psoralene verwendet werden. Es gibt Anhaltspunkte, dass diese Psoralene auf den gleichen Gebieten wie andere
Psoralene Verwendung finden können. Im Falle des 4-Chlormethylpsoralens
wird der Chlormethylsubstituent in wässriger Lösung leicht hydrolysiert und es ist infolgedessen schwierig, dessen
spezifische Aktivität in bezug auf die Bindung an DNS oder RNS festzustellen. Auf jeden Fall wird die Rolle der beiden
Verbindungen aus der nachfolgenden Beschreibung ersichtlich werden.
Das 4'-Hydroxymethy1-4,5',8-trimethylpsoralen, das 41-Methoxymethyl-4,5',8-trimethylpsoralen
und das 4'-Aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen
zeigen alle ausgezeichnete Reaktivität mit DNS, wie man nachfolgend sehen wird.
Alle erfindungsgemässen Psoralene lassen sich bequem
aus 4,5',8-Trimethylpsoralen (Trioxsalen) herstellen, obschon
auch andere bekannte Synthesemethoden verwendet werden können.
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Die erfindungsgemässen Psoralene können dadurch hergestellt
werden, dass man Trioxsalen mit einem halogenierten Alkyl, Alkohol, Aether oder Aminoalkyl in einer Halomethylierungsreaktion
oder einer Friedel-Crafts-Reaktion umsetzt. Beispielsweise wird Trioxsalen mit einem halogenierten (vorzugsweise
chlorierten) Methylalkyläther oder Methylbenzyläther bei Raumtemperatur während einer ausreichenden Zeit behandelt,
worauf das erhaltene 4'-substituierte Trioxsalen aus dem
Reaktionsgemisch durch Kühlen und Ausfällen abgetrennt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen
Verfahrens wird das Trioxsalen vor oder während der HaIomethylierung
in konzentrierter Essigsäure gelöst.
Die Halomethylgruppe am Kohlenstoffatom 41 des Trioxsalenmoleküls
kann dadurch modifiziert werden, dass man das 41-Halomethyl-trioxsalen
mit Wasser oder einem geeigneten Alkohol zum Rückfluss erhitzt, um das Halogen durch einen Hydroxy-
oder Alkoxy-Substituenten zu ersetzen.
Die Halomethylgruppe kann auch dadurch modifiziert werden, dass man das 4'-Halomethyl-trioxsalen mit einem Phthalimidalkalimetallsalz
in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels wie Dimethylformamid zu 4'-Phthalimidomethyl-trioxsalen umsetzt
und gewünschtenfalls das 4■-Phthalimidomethyl-trioxsalen
mit Hydrazinhydrat und Aethanol zum Rückfluss erhitzt und danach das gebildete 4'-Aminomethyl-trioxsalen aus dem Reaktionsgemisch abtrennt.
Beispiel I 30
659 mg Trioxsalen wurden in 75 ml Eisessig unter schwachem Erwärmen gelöst. Die Lösung wnrde auf Raumtemperatur abgekühlt
und mit 5 ml Chlormethyl-Methyläther versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden stehen gelassen und danach ein zweites
Mal mit 5 ml Chlormethyläther versetzt. Nach 48 Stunden wurde das Reaktionsgefäss eisgekühlt und nach weiteren 12 Stunden
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wurde der weisse Niederschlag abgetrennt, ümkristallisation
aus Acetonitril lieferte 435 mg reines 4·-Chlormethyl-4,5·,8-trimethylpsoralen.
Eine weitere Fraktion wurde aus dem Filtrat isoliert, so dass insgesamt 499 mg erhalten wurden. Schmelzpunkt
215-217°, NMR (CDCl3) 62,6-2,7 (9 H, m) 4,8 (2 H, s)
6,3 (1 H, s), 7,6 (1 H, s); Massenspektrum m/e (relative
Intensität) 276 (m+, 48), 278 (m+ 2, 15).
53 mg 4 *-Chlormethyl-4,5 *,8-trimethylpsoralen wurden
in 50 ml destilliertem Wasser 7 Stunden zum Rückfluss erhitzt. Danach wurde 2 Stunden eisgekühlt, das Produkt abfiltriert
und getrocknet. Man erhielt 25 mg (50,5%) 4'-Hydroxymethyl-
4,5',8-trimethylpsoralen vom Schmelzpunkt 221 - 224°,
NMR (DMSO-d6) 6 2,5-2,7 (9 H, m) , 4,5-4,7 (2 H, m) , 5,O-5,2
(1 H, bs), 6,3 (1 H, s), 7,8 (1 H, s), Massenspektrum m/e (relative Intensität) 258 (M+, 100) 241 (17) .
20 Beispiel III
78 mg 4'-Chlormethyl-4,5',8-trimethylpsoralen wurden
in 30 ml Methanol 5 Stunden zum Rückfluss erhitzt. Nach Entfernung des Lösungsmittels durch Eindampfen wurden 74 mg
(97,2%) 4'-Methoxymethyl-4,5f,8-trimethylpsoralen vom Schmelzpunkt
171-174° erhalten. NMR (CDCl3) £2,4-2,6 (9 H, m), 3,4
(3 H, s), 4,6 (2 H, s), 6,3 (1 H, s), Massenspektrum m/e (relative Intensität) 272 (M+, 93), 241 (10O).
30 Beispiel IV
200 mg 4·-Chlormethyl-4,5",8-trimethylpsoralen, 165 mg
Phthalimid-Kalium und 20 ml Ν,Ν-Dimethylformamid wurden
6 Stunden unter konstantem Rühren auf lOO erhitzt. Das Lösungsmittel wurde auf dem Wasserbad und unter vermindertem
Druck abgedampft und man erhielt eine gelbe Paste, die in Chloroform aufgenommen und dreimal mit Wasser gewaschen wurde.
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- JlT-
Die Chloroformlösung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet,
filtriert und eingedampft und lieferte 222 mg (79,3%) 4'-N-Phthalimidomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen
vom Schmelzpunkt 267-274°, NMR (CDCl3) 6*2,5-2,8 (9 H, m), 5,0 (2 H, s),
6,3 (IH, s), 7,7-7,8 (7 H, d), 8,0 (1 H, s), Massenspektrum m/e
(relative Intensität) 387 (m+, 80), 241 (20), 240 (75).
848 mg 4•-N-Phthalimidomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen,
0,5 ml Hydrazinhydrat (85% in Wasser) und 100 ml 95%iges Aethanol wurden 4 Stunden zum Rückfluss erhitzt und danach
noch einmal mit 0,5 ml Hydrazinhydratlösung versetzt. Nach 2 Stunden Rückflusserhitzen war mit Dünnschichtchromatographie
kein Ausgangsmaterial mehr nachzuweisen. Das Aethanol wurde abgedampft und der Rückstand in 200 ml 0,1 η-Natronlauge aufgenommen,
und die Lösung mit 53 ml Portionen Chloroform extrahiert. Man erhielt 193 mg rohtis 4 '-Aminomethy 1-4 ,5 ', 8-trimethylpsoralen.
Zur Herstellung des Hydrochlorids wurde das Amin in 100 ml 1,2 η Salzsäure aufgenommen und die Lösung dreimal
mit 30 ml Portionen Chloroform extrahiert um Verunreinigungen zu entfernen. Eindampfen unter vermindertem Druck lieferte
das rohe Hydrochlorid, das in 175 ml absolutem Aethanol gelöst und durch Zusatz eines gleichen Volumens Diäthyläther ausgefällt
wurde. Nach Kühlen über Nacht (7 ) wurden 161 mg reines Hydrochlorid erhalten, Schmelzpunkt 260 - 269°, NMR-Spektrum des
Amins (CDCl3) 6 1,4-1,6 (2H, s), 2,6-2,7 (9 H, m), 4,1 (2 H, s),
6,3 (1 H, s), 7,7 (1 H, s), Massenspektrum m/e (relative
Intensität) 257 (M+, 36), 240 (100).
Verwandte Derivate können in der gleichen Weise hergestellt werden. Für die erfindungsgemässen Zwecke sind jedoch
die wichtigen Eigenschaften solcher Derivate hohe Löslichkeit in wässriger Lösung und niedrige Dxssoziationskonstante von
DNS und/oder RNS.
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Für das Studium der Löslichkeit und der Dissoziationskonstanten ist es am bequemsten, tritiierte Derivate der
Psoralene herzustellen. Sodann können bekannte Zählverfahren angewandt werden, um die Anwesenheit von Psoralen in Lösung
5 oder in Nucleinsäuren zu verfolgen.
Die Tritium-markierten Psoralene können aus Tritiummarkiertem Trioxsalen hergestellt werden. Tritiiertes Wasser
wird mit normalem Trioxsalen zum Rückfluss erhitzt, wobei ein Austausch des Tritiums mit Trioxsalen-Wasserstoff eintritt,
Das tritiierte Trioxsalen wird abgetrennt und zur Herstellung der Psoralene gemäss den vorstehend beschriebenen Beispielen
verwendet. Das folgende Beispiel illustriert ein spezifisches Verfahren zur Herstellung von tritiiertem Trioxsalen.
1153 mg 4,5',8-Trimethylpsoralen, T-O (wässrig, 100 Curie
in 4 ml) 67,5 ml Dioxan und 7,5 ml rauchende Schwefelsäure
(30% SO3) wurden unter konstantem Rühren 2 Stunden zum Rückfluss
erhitzt und danach auf Raumtemperatur abgekühlt. Danach wurden 125 ml Eis zugesetzt und das Gemisch 1 Stunde eisgekühlt.
Der Niederschlag wurde abfiltriert, luftgetrocknet und lieferte 900 mg (78%) rohes, tritiiertes 4,5',8-Trimethylpsoralen.
30 mg Rohprodukt wurden in 75 ml 100%igem Aethanol gelöst und mit 2 g Kohle versetzt. Das Gemisch wurde 10 Minuten
zum Rückfluss erhitzt, heiss über ein gesintertes Glasfilter filtriert und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wurde
aus Methanol/Wasser (90:10) kristallisiert. Durch analytische Dünnschichtchromatographie (Chloroform/Methanol 98:2) wurden
mehr als 95% der Zählimpulse im Trimethylpsoralen gefunden.
Die spezifische Aktivität wurde bestimmt durch Auszählung eines Aliquots in absolut äthanolischer Lösung bekannter
Konzentration in Toluol-Omnifluor. Die spezifische Aktivität
war 6,7 χ 10 Imp/min. Von diesem Psoralen wurden tritiierte Produkte gemäss Beispiel I - V hergestellt. Diese wurden
verwendet, um ihre Bindungseffektivität mit Nucleinsäure zu
studieren. Die Untersuchungen waren darauf gerichtet, Daten
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über die die Löslichkeiten und die Dissoziationskonstanten sowohl mit DNS als auch RNS zu erhalten. Weiterhin wurde die
Fähigkeit der Psoralene untersucht, covalente Bindungen mit DNS und RNS einzugehen. Diese Untersuchungen wurden wie
5 folgt durchgeführt:
Zur Feststellung der Dissoziationskonstanten mit DNS und RNS wurde die nicht-covalente Bindung ermittelt. Sie bestimmt
die Gegenwart des Psoralens innerhalb der Nucleinsäurehelix und wird in Abwesenheit von Energiestrahlung ermittelt,
Wie erwähnt, ist Energiestrahlung erforderlich, um das Psoralen zur covalenten Bindung mit den Nucleinsäurebasen-Paaren zu
bringen.
■|5 Zur Bestimmung der nicht-covalenten Bindung, wurde Kalbsthymus-DNS
(Sigma Typ I) in einem 0,01 m-Tris, 0,001 m-Aethylendiamin-tetraessigsäurepuffer
von pH 8,5 in einer Konzentration von 25μg pro ml gelöst. Ein Quantum dieser DNS-Lösung wurde
in einem Dialysesack (vorbehandelt durch Kochen in NaHCO.,) gebracht und die verschiedenen tritiierten Derivate wurden
in der Hälfte der Fälle in den Dialysesack gegeben und in der anderen Hälfte der Fälle der Aussenlösung zugesetzt. Das
molare Verhältnis von Psoralenmolekülen zu Basenpaaren war etwa 1:25. Die Dialysesäckchen wurden in Röhrchen gegeben,
die mit 18 ml Puffer gefüllt waren und 48-60 Stunden geschüttelt wurden. Danach wurde die Radioaktivität innerhalb und ausserhalb
des Dialysesacks und die optische Dichte der DNS-Lösung gemessen. Aus diesen Messwerten und der spezifischen Aktivität
jedes Derivates wurde die Menge des nicht-covalent an die DNS gebundenen Präparate bestimmt. In genau der gleichen
Weise wurde die Bindung der Derivate an Drosophila melanogaster
Ribosomen-RNS gemessen.
Die Resultate aus den Messungen der Dialysegleichgewichte sind in Tabelle I angegeben. Die Einheiten für die Dissoziationskonstante sind Mol/Liter. Löslichkeiten und molare Extinktionskoeffizienten (£") wurden in reinem Wasser, die Gleichgewichtskonstanten
(Kß) in 0,01 m Tris-Puffer aufgenommen.
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Extinktionskoeffizienten, Löslichkeiten, Dissoziationskonstanten
und Konzentrationsverhältnisse von besetzten zu unbesetzten Bindungsstellen in gesättigten Lösungen von Psoralenderivaten
09 O (O CO
1. | 2. | 3. | Mol/A | 4. | 5. | 6. | 7. | |
Verbindung | 250 run ε Ä/Mol cm |
Löslichkeit | l,7xio"4 | K0DNA MoI/£ |
Kolonne 3/ Kolonne 4 (PS) / (S) für DNS in gesättigter Lösung |
K0RNA Mol/1 |
Kolonne 3/ Kolonne 6 (PS) / (S) für RNS in gesättigter Losung |
|
8-Methoxypsoralen | l,9xlO4 | yg/mi | 2,6xl0"6 | 2,5xio"3 | 0,068 | 1,7x10*2 | 0,010 | |
4,5',8-Trimethyl- psoralen |
1,8xlO4 | 36 | 3,7xl0"5 | 5,6xlO~5 | 0,046 | ίο'4 | 0,026 | |
4-Me thoxymethy1- 4,5',8-trimethyl- psoralen |
2,IxIO4 | 0,6 | l,6xio'4 | 9,4xlO~5 | 0,39 | Kf3 | 0,037 | |
4'-Hydroxymethyl- 4,5',8-trimethyl- psoralen |
2,5xlO4 | 10 | 3,4xlO~2 | 2,9xio"4 | 0,55 | ίο"3 | 0,16 | |
4·-Arainomethyl- 4,5',8-trimethyl- psoralen- hydrochlorid |
2,5xlO4 | 41 | 6,6xl0"6 | 5000 | 2xl0"5 | 1700 | ||
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ro -«α
an
Die Daten für 8-Methoxypsoralen in den Kolonnen 2-7 in der Tabelle I wurden aus in der Literatur vorliegenden
Daten berechnet. Die anderen Daten wurden im Rahmen der Erfindung ermittelt.
8-Methoxypsoralen und 4,5',8-Trimethylpsoralen sind in
der Tabelle I als Vergleichssubstanzen mit den erfindungsgemässen Psoralenen aufgeführt.
Es wurde die covalente Bindung der Psoralene an DNS und RNS untersucht. Um covalente Bindung herzustellen, ist es
erforderlich, Strahlungsenergie (Licht) an den Bindungsstellen einwirken zu lassen. Diese Untersuchungen wurden wie folgt
ausgeführt:
Die in den Untersuchungen für die covalente Bindung verwendete DNS und RNS wurde bereits beschrieben. Proben
jeder Nucleinsäure wurden in Konzentrationen von 25 Mg pro ml
in 0,Ol m Tris und 0,001 m Aethylendiamintettaessigsäurepuffer
bereitet. Die radioaktiven Psoralenderivate wurden im
Verhältnis 1 Psoralen auf 3 Basenpaare zugesetzt. Die Bestrahlung wurde mit einer der beiden nachstehend beschriebenen
Vorrichtungen durchgeführt.
Bestrahlungen mit niederer Intensität wurden mit einem modifizierten Diapositiv-Projektor durchgeführt, der mit einer
400 Watt-Quecksilberdampflampe ausgerüstet war. Das Licht wurde durch eine Kobaltnitratlösung gefiltert; die auf die
Probe eingestrahlte Intensität betrug 4-6 mW/cm . Die Bestrahlungen mit hoher Intensität wurden in einer Vorriciitung vorgenommen,
bei der zwei 400 Watt-Quecksilberdampflampen beidseitig
von der Probe in einem Abstand von 4 cm angebracht waren. Der Probenbehälter wurde durch zirkulierende Kobaltnitratlösung
(40 Gewichtsprozent) auf 10° gekühlt. Die Kobaltlösung diente als Ultraviolettfilter, das einen Durchlässigkeits-
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bereich von 340-380 nm mit einer maximalen Durchlässigkeit bei 365 nm aufwies. Die Lichtintensität an der Oberfläche
2 im Inneren der Bestrahlungskammer betrug etwa 100 mW/cm .
Das Nucleinsäure-Psoralengemisch wurde in die Probenkammer gegeben und während der Bestrahlung dauernd gerührt. Teile
der Lösung wurden nach 20, 40 und 60 Minuten entnommen, zweimal mit Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert, um nicht
umgesetztes Psoralen zu entfernen, und anschliessend erschöpfend gegen O,01 m Tris, Ο,ΟΟΙ m Aethylendiamintetraessigsäurepuffer
dialysiert. Für eine erfolgreiche Extraktion nicht gebundenen Psoralens durch Chloroform/Tsoamylalkohol war es erforderlich,
dass die wässrige Phase mindestens 0,15 molar an Kochsalz war. Schliesslich wurde die optische Dichte des Nucleinsäurepsoralengemisches
und dessen Radioaktivität bestimmt, woraus sich die Menge des covalent an DNS oder RNS gebundenen Derivats
ergab. Die Probenentnahme erlaubte auch eine Verfolgung der Kinetik der covalenten Bindung.
Die Tabelle II enthält die Ergebnisse dieser Untersuchungen in bezug auf DNS.
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"ft
Photoaddition von Psoralenderivaten bei niederer Intensität in einer Lösung mit 25 pg/ml DNS und einen molaren Psoralen;
Basenpaar-Verhältnis von 1:3.
Bestrahlungs- Zeit (Min.) |
Trioxsalen | 15,5 | 4'-Hydroxymethy1 trioxsalen |
B | 4'-Aminomethy1 trioxsalen hydrochlorid |
Λ1 | 19,7 | A | 3,0 | A B | |
5 | 19,7 | 22,1 | 89,0 | 4,6 | 15,0 19,3 |
10 | 15,5 | 23,6 | 59,6 | 10,3 | 10,5 27,4 |
30 | 13,7 | 28,5 | 26,0 | 13,8 | 6,9 41,8 |
60 | 12,8 | 19,5 | 15,7 | 5,9 48,7 | |
90 | 10,6 | 17,2 | 5,5 52,4 | ||
1 _ Mol Basenpaare 15 Mol gebundenes Psoralen
B = Prozent des covalent gebundenen zugesetzten Psoralens
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Aus den in Tabelle II wiedergegebenen Daten wird ersichtlich, dass 4-Aminomethyltrioxsalen mit DNS viel schneller als
Trioxsalen reagiert, welches wiederum eine grössere Anfangsrate der photochemischen Bindung besitzt als 4-Hydroxymethyl-trioxsalen.
Bei einer Bestrahlungszeit von 90 Minuten beträgt die Anzahl der gebundenen Mole Psoralen pro Mol Basenpaar
0,18 für die Aminomethylverbindung, während die Werte für Trioxsalen und die Hydroxymethylverbindung 0,09 bzw. 0,06 sind.
Die Tabelle II zeigt auch, dass nach 90 Minuten Bestrahlung über die Hälfte der Moleküle des 4-Aminomethyl-trioxsalens
in Lösung covalent an DNS gebunden sind, während mehr als 80% des 4-Hydroxymethyl-trioxsalens frei in Lösung bleibt.
Diese Unterschiede resultieren sehr wahrscheinlich aus dem Einfluss der Molekularstruktur der verschiedenen Psoralene
auf ihre Löslichkeiten, photochemische Reaktivität und auf die Photodestruktion der Verbindungen selbst.
Die Tabelle III gibt die Resultate der Hochenergie-Bestrahlung auf die covalente Bindung von Psoralen und DNS
wieder:
20 Tabelle III
Photoaddition von Psoralenderivaten bei hoher Intensität in Lösung mit 25 yg/ml DNS und einem Psoralen: Basenpaar-Verhältnis
von 1:3.
Bestrahlungs- Trioxsalen 4'-Hydro- 4'-Methoxy- 4'-Aminomethyl
zeit methyl methyl trioxsalen
(Min.) triox- triox- hydrochlorid
salen salen
AB AB AB AB
20 11.6 25,9 9,1 33,0 14,1 21,3 4,7 63,8
4O 1Ο.6 28,3 9,2 32,6 14,3 21,0 4,8 62,5
6O 12,2 24,6 9,1 33,0 13,8 21,7 4,8 62,5
1 _ Mol Basenpaare
Mol covalent gebundenes Psoralen
B = Prozentsatz von covalent gebundenem zugesetzten Psoralen
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~M '
Die Tabelle IV gibt die Resultate der covalenten Bindung der Psoralene mit RNS bei Bestrahlung mit hoher Intensität
wider:
Photoaddition von Psoralenderivaten mit hoher Intensität in einer Lösung mit 25 yg/ml RNS und einem Psoralen: Basenpaar-Verhältnis
von 1:3.
Bestrahlungs zeit (Min.) |
2O | Trioxsalen A B |
1 | 13 | ,0 | 41 A |
-Hydro- me thyl triox salen B |
4 ■ Methoxy- methyl t riox- salen A B |
4 | 1 Ami nome thyI trioxsalen hydrochloric! A B |
40 | 23, | 6 | 13 | ,9 | 26 | ,3 11,5 | 264,2 1,2 | 5,1 59,4 | ||
6O | 21, | 6 | 14 | ,8 | 24 | ,8 12,1 | 216,8 1,4 | 5,3 57,2 | ||
2O, | Mol Basenpaare | 23 | ,5 13,O | 183,4 1,6 | 5,3 57,3 | |||||
1 |
Mol covalent gebundenes Psoralen
B = Prozentsatz von covalent gebundenem zugesetzten Psoralen
Aus den in den Tabellen I, II, III und IV enthaltenen Daten können die folgenden Schlussfolgerungen gezogen werden:
Die Tabelle I mit den Dissoziationskonstanten für die Gleichgewichtsbindung
an DNS zeigt, dass 4'-Aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen
etwa 8 mal stärker an DNS gebunden wird als Trioxsalen. Die Bindung von Trioxsalen ist 5 mal stärker als
4'-Hydroxymethyl- und 2 mal stärker als 4^Methoxymethyl-trioxsalen,
Diese beiden neuen Derivate werden aber noch 10 mal stärker an DNS gebunden als Methoxsalen, das andere kommerziell
verfügbare Psoralen.
Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass die relativen Löslichkeiten der Psoralene in der Reihenfolge 4'-AminomethyI-trioxsalen,41-Hydroxymethyl-trioxsalen,
4'-Methoxymethyl-triox-
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salen, Methoxsalen, und Trioxsalen etwa 10,000:68:17:80:1 sind.
Wenn man die molare Löslichkeit durch die Dissoziationskonstante teilt, wird ersichtlich, dass es beim Gleichgewicht in einer
mit dem entsprechenden Psoralen gesättigten Lösung nicht möglich ist, die DNS-B indungr.stel lon mit Trioxsalen oder Methoxsalen
mit dem entsprechenden Psoralen gesättigten Lösung nicht möglich ist, die DNS-B indungr.stel lon mit Trioxsalen oder Methoxsalen
abzusättigen. Bestenfalls kommt etwa ein Psoralen auf 20 Basenpaare.
Die Kolonne 5 in Tabelle I gibt das Verhältnis von gebundenen zu freien Stellen in einer mit dem entsprechenden
Psoralen gesättigten DNS-Lösung wieder. Es kann davon ausgegangen werden, dass das 4' -Hydroxyinethyl- trioxsalen und das
Psoralen gesättigten DNS-Lösung wieder. Es kann davon ausgegangen werden, dass das 4' -Hydroxyinethyl- trioxsalen und das
4'-Methoxyniethy 1-tr Loxsalen die Bindungsstellen an der DNS nahezu
sättigt, wobei ein Psoralen auf 3 Basenpaare [(PS) / (S) =
0,5] kommt, v/ährend sich für das 4'-Aminoäthyl-trioxsalen eine
4
10 fach stärkere Effektivität für die Erreichung dieses Sätti-
10 fach stärkere Effektivität für die Erreichung dieses Sätti-
Ib gungszustandes berechnet (es ist 150 mal löslicher als 41-
Hydroxymethyl-trioxsalen und wird etwa 100 mal stärker gebunden).
üie erfindungsgemässen Psoralene sind auch bei der Inaktivierung
von RlE Viren verwendbar. In dieser Beziehung zeigen
sie eine Aktivität, die signifikant höher ist als die anderer
sie eine Aktivität, die signifikant höher ist als die anderer
bekannter Psoralene. Bei hohen Dosierungen, z.B. 30 yg/ml, sind
das 4'-Hydroxymethyl-4,5',8-trimethyl-psoralen, das 4'-Methoxymethyl-4,5',8-trimethyl-psoralen
und das 4'-Aminomethyl-4,5',8-trimethyl-psoralen
alle beinahe 1000 mal wirksamer als das
kommerziell verfügbare 4,5',8-Trimethy1-psoralen bei der Inaktivierung des Vesicular-Stomatitis-Virus, eines menschlichen RNS-Virus.
kommerziell verfügbare 4,5',8-Trimethy1-psoralen bei der Inaktivierung des Vesicular-Stomatitis-Virus, eines menschlichen RNS-Virus.
Diese hervorragende Wirksamkeit ergibt sich aus der Fig. 1 der Zeichnungen, wobei die Kurven das Ueberleben von plaquebiidenden
Einheiten von Vesicular-Stomatitis-Virus als Funktion der Bestrahlungszeit mit langwelligem UV in Gegenwart des angegebenen
Psoralens widergeben. Bei den angegebenen Dosierungsraten (etwa 20-30 yg/ml) wird die enorme Ueberlegenheit der
erfindungsgemässen Psoralene über Trioxsalen ohne weiteres ersichtlich. Alle drei erfindungsgemässen Psoralene sind bei diesen hohen Dosierungen im wesentlichen äquivalent. Dies lässt
erfindungsgemässen Psoralene über Trioxsalen ohne weiteres ersichtlich. Alle drei erfindungsgemässen Psoralene sind bei diesen hohen Dosierungen im wesentlichen äquivalent. Dies lässt
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sich aus ihren Dissoziationskonstanten K , die in Tabelle I angegeben sind, voraussagen und aus ihren hohen Löslichkeiten,
die früher erwähnt wurden (im Falle des 4'-Methoxymethyl-trioxsalens
ist die Lösung übersättigt). Bei den wiedergegebenen Dosierungsraten ist die RNS mit nicht-covalent gebundenen, eingelagerten
Psoralenen fast gesättigt. Somit dürfen alle drei Psoralene in der Aktivität äquivalent sein. Das Trioxsalen ist
jedoch nur bis zu 0,6 yg/ml löslich und eine Steigerung seiner
Konzentration von 10 yg/ml auf 30 pg/ml hat keine Wirkung auf
seine Fähigkeit, das Virus zu inaktivieren
Fig. 2 der Zeichnungen gibt ähnliche Kurven wie in Fig. 1 wieder, jedoch resultieren die Werte von wesentlich geringeren
Konzentrationen an Psoralen, d.h. 1-3 pg/ml. Fig. 2 zeigt auch
die unbestrittene Ueberlegenheit des 4'-Aminomethyl-4,5',8-trimethyl-psoralens
über alle anderen Psoralene, sowohl d:.e erfindungsgemässen
als auch das kommerzielle Trioxsalen. Diese Ueberlegenheit des 41-Aminomethyl-Derivats ergibt sich aus
seiner stärkeren Bindung an die Nucleinsäuren, was auch aus der Dissoziationskonstante K (siehe Tabelle I) ersichtlich
20 wird.
Die in Fig. 1 und 2 wiedergegebenen Daten wurden unter Verwendung
folgender Verfahren erhalten:
4 500 μΐ-phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit 5 χ 10
Virus-plaque-bildenden Einheiten wurden in Petrischalen von
3,5 cm Durchmesser gegeben und in Gegenwart oder Abwesenheit des Psoralens mit langwelligem UV bestrahlt. Nach verschiedenen
Zeirinterve.llen wurden 50 μΙ-Proben entnommen und die Menge der
Virus-plaque-bildenden Einheiten titriert. Verdünnte Lösungen der Proben wurden auf in Plasticschalen gezogene primäre
Hühner-Fibroblasten gebracht. Nach Absorption des Virus wurden die Kulturen mit Nährmedium, das 20% Kalbsserum und 3% Methylcellulose
enthielt, überdeckt. Nach 2 bis 4 Tagen Inkubation bei 35 C wurde Neutralrot zugegeben. Das Virus war Vesicular-Stomatitis-Virus
Indiana.
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af
In Fig. 1 bezeichnen die vollen Punkte (·) nur Licht, Kreise (o) 30 yg/ml Trioxsalen, die Quadrate (α) 30 yg/ml 4'-Hydroxymethyltrioxsalen,
die offenen Dreiecke (A) 30 yg/ml 4'-Trioxsalen
und die vollen Dreiecke (A) 20 yg/ml 4'-Aminomethyltrioxsalen. In Fig. 2 bezeichnen die vollen Punkte (·) nur Licht,
die Kreise (o) 10 yg/ml Trioxsalen, die Quadrate (α) 1 yg/ml 4'-Hydroxymethy1-trioxsalen, die offenen Dreiecke (a) 3 yg/ml
4'-Methoxymethyl-trioxsalen und die vollen Dreiecke (*) 2 yg/ml
4'-Aminomethy 1- trioxsalen.
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Claims (15)
1. Verfahren zur Herstellung von Derivaten des 4,5',8-Trimethyl-psoralens
mit einem funktionellen organischen Substituenten am Kohlenstoffatom 41, dadurch gekennzeichnet/ dass man
Trioxsalen mit einem halogenierten Alkyl, Alkohol, Aether oder
Aminoalkyl in einer Halomethylierungsreaktion oder einer
Friedel-Crafts-Reaktion umsetzt.
Aminoalkyl in einer Halomethylierungsreaktion oder einer
Friedel-Crafts-Reaktion umsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Trioxsalen mit einem Halogenmethyl-alkylather oder Halogenmethylbenzyläther
umsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man das Trioxsalen vor oder während der Halomethylierung in
konzentrierter Essigsäure löst.
konzentrierter Essigsäure löst.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Halogen Chlor ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet,
dass man das erhaltene 4'-Halomethy1-trioxsalen mit Wasser oder einem entsprechenden Alkohol zwecks Austausch des Halogens
gegen eine Hydroxy- oder Alkoxy-Gruppe umsetzt.
dass man das erhaltene 4'-Halomethy1-trioxsalen mit Wasser oder einem entsprechenden Alkohol zwecks Austausch des Halogens
gegen eine Hydroxy- oder Alkoxy-Gruppe umsetzt.
6. Verfahren nach Anspruch 1-4, dadurch gekennzeichnet,
dass man ein erhaltenes 4'-Halomethyl-trioxsalen mit einem
Phthalimidalkalisalz in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels zu 4'-Phthalomidomethyl-Trioxsalen umsetzt und letzteres gewünschtenfalls durch Behandlung mit Hydrazinhydrat und Aethanol in 4' Aminomethvl-trioxsalen überführt.
dass man ein erhaltenes 4'-Halomethyl-trioxsalen mit einem
Phthalimidalkalisalz in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels zu 4'-Phthalomidomethyl-Trioxsalen umsetzt und letzteres gewünschtenfalls durch Behandlung mit Hydrazinhydrat und Aethanol in 4' Aminomethvl-trioxsalen überführt.
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ORIGINAL INSPECTED
7. Verwendung von 4'-substituiertem 4, 5',8-Trimethylpsoralen
zur Herstellung von Deoxyribonucleinsäuren oder Ribonucleinsäuren mit covalent gebundenen 4'-substituiertem
4,5',8-Trimethyl-psoralen, wobei man Deoxyribonucleinsäure oder
Ribonucleinsäure mit einer Lösung eines 4·-substituierten
4/5'-8-Trimethyl-psoralens behandelt und die Lösung bestrahlt.
8. Verwendung von 4■-substituierten 4,5',8-Trimethylpsoralen
zur Inaktivierung von Viren, wobei man Viren mit einem 4'-substituierten 4,5',8-Trimethyl-psoralen in
Kontakt bringt und dann bestrahlt.
9. 4,5',8-Trimethyl-psoralen-Derivate mit einem organischen
funktioneilen Substituenten am 4'-Kohlenstoffatom.
10. Psoralen-Derivate gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
dass der organische funktioneile Substituent ein halogeniertes Alkyl, eine Alkohol-, Aether-, oder Aminoalkyl-Gruppe
ist.
11. 4'-Chlormethyl-4,5',8-trimethyl-psoralen.
12. 4·-Hydroxymethyl-4,5·,8-trimethyl-psoralen.
13. 4'-Methoxymethyl-4,5l,8-trimethyl-psoralen.
14. 4'-N-Phtalomidomethyl-4,5·,8-trimethyl-psoralen.
15. 4I-Aminomethyl-4,5I ,8-trimethyl-psoralen-hydrochlorid.
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