DE2736223C2 - Modifizierte Allergenderivate - Google Patents

Modifizierte Allergenderivate

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Description

  • Die Erfindung betrifft modifizierte Allergenderivate zur Verwendung als immunologisch spezifische Hemmer der Bildung von Reaginen der IGE-Klasse, die auf das fragliche Allergen gerichtet sind. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung dieser modifizierten Allergenderivate als immunologisch spezifische Hemmer der Produktion von Reaginen, die auf das fragliche Allergen gerichtet sind, bei Säugetieren mit Einschluß des Menschen, wobei die Substanzen den Säugetieren in pharmazeutisch annehmbarer Weise in einer therapeutisch wirksamen Dosis injiziert werden.
  • Etwa 15% der Bevölkerung von entwickelten Ländern leiden an Allergien gegenüber offenbar unschädlichen Substanzen in der Umgebung, beispielsweise Inhalationsstoffen (z. B. Pollen, Stäube und Federn, die für von außen hervorgerufenes Asthma und Heufieber verantwortlich sind), verschiedene Nahrungsmitteln, Wolle, Arzneimitteln usw. Allergische Patienten erzeugen im Gegensatz zu normalen Individuen Reagine gegen die antigenen (allergenen) Bestandteile, die in diesen Substanzen vorhanden sind.
  • Im allgemeinen soll die Bezeichnung "Antigen" eine Substanz bezeichnen, die dazu imstande ist, eine Immunantwort hervorzurufen. Üblicherweise handelt es sich hierbei auch um die Substanz, die zum Nachweis der entsprechenden Antikörper durch eines der vielen in vitro und in vivo durchgeführten immunologischen Verfahren verwendet wird, welche zum Nachweis von Antigen-Antikörper-Reaktionen verfügbar sind. In ähnlicher Weise wird die Bezeichnung "Allergen" dazu verwendet, um ein Antigen zu bezeichnen, das die Fähigkeit hat, Reagine zu induzieren und sich damit zu kombinieren. Diese Definition schließt jedoch nicht die Möglichkeit aus, daß Allergene auch Antikörper von anderen Klassen als IgE induzieren können. Die hierin verwendete Bezeichnung "Antigenizität" ist als die Fähigkeit eines Antigens oder Allergens, sich in vitro mit den entsprechenden Antikörpern zu kombinieren, definiert. Die Bezeichnung "Allergenizität" oder Hautaktivität ist als die Fähigkeit eines Allergens, sich in vivo mit homologen Reaginen zu kombinieren, definiert, wodurch entweder beim direkten Hauttest oder bei passiven kutanen anaphylaktischen (PCA) Reaktionen eine systemische Anaphylaxie oder lokale Hautreaktionen ausgelöst werden. Die Bezeichnung "Immunogenizität" ist in einem beschränkten Sinne als die Fähigkeit eines Antigens oder Allergens, die entsprechende spezifische Antikörper-Antwort in vivo zu induzieren, definiert. Die hierin verwendete Bezeichnung "Tolerogenizität" soll die Fähigkeit einer allergenhaltigen Substanz, in vivo in spezifischer Weise die Immunantwort des entsprechenden nichtmodifizierten ursprünglichen Allergens im wesentlichen zu hemmen, bezeichnen. Hierin wird die Bezeichnung "tolerogen" synonym mit der Bezeichnung "immunohemmend" bzw. "immunosuppressiv" verwendet.
  • Reagine Antikörper haben unter allen Klassen von Immunoglobulinen die ausgeprägte Eigenschaft, an Gewebemastzellen und Basophilen von Individuen, die diese Antikörper aktiv erzeugen, oder von Individuen, denen ein allergenisches Serum injiziert wird, fixiert zu werden. Die Vernetzung der IgE-Antikörpermoleküle, die an diese Zellen fixiert sind, durch das geeignete Allergen löst die Degranulierung dieser Zellen aus, woran sich die Freisetzung von pharmakologisch vasoaktiven Mitteln aus den Granulaten, z. B. Histamin, Bradykinin, der "slow reacting substance" der Anaphylaxie (SRS-A), des eosinophilen chemotaktischen Faktors der Anaphylaxie (ECF-A) und eines plättchenaktivierenden Faktors anschließt. Diese Verbindungen führen zu allergischen Symptomen, d. h. zu systemischen oder lokalen entzündlichen Reaktionen, indem sie auf die Blutgefäße und das glatte Muskelgewebe einwirken. In schweren Fällen können diese Reaktionen zu einer Anaphylaxie führen.
  • Bei der derzeit angewendeten Therapie erfolgt eine langandauernde Injektionsreihe des angreifenden Allergens im Verlauf von vielen Jahren. Dieses muß aufgrund der inhärenten Allergenizität der Naturprodukte und der damit verbundenen Gefahr, daß sie systematische anaphylaktische Reaktionen auslösen, in kleinsten Dosen erfolgen.
  • Für eine sichere und wirksame Therapie ist es daher wesentlich, Derivate von natürlichen Allergenen zu bilden, die dazu imstande sein sollten, als Tolerogene zu wirken, indem sie die IgE-Antikörper-Antwort in immunologisch spezifischer Weise ausgeprägt hemmen, wenn nicht überhaupt beseitigen. Diese tolerogenen Derivate sollten weiterhin zwei zusätzliche Eigenschaften besitzen, nämlich (1) sie sollten nicht allergen sein, d. h. sie sollten nicht dazu imstande sein, sich in vivo mit den an die Mastzellen und Basophilen fixierten IgE-Antikörpern zu kombinieren, und sie sollten folglich nicht dazu imstande sein, anaphylaktische Reaktionen auszulösen, und (2) sie sollten nicht immunogen sein, d. h. sie sollten nicht dazu imstande sein, bei wiederholten Injektionen eine Immunantwort gegenüber ihnen selbst zu induzieren.
  • Es wurde nun gefunden, daß dies in der Weise erreicht werden kann, daß man immunogene Allergene (z. B. Ovalbumin (OA) und die nichtdialysierbaren Bestandteile des wäßrigen Extrakts von Ambrosiapflanzenpollen (RAG) und Hundealbumin) in tolerogene Derivate, die (bei Verabreichung ohne ein Adjuvans) gleichfalls praktisch nicht immunogen und nicht allergen sind, umwandelt, indem man nichtimmunogene wasserlösliche Polymere kovalent an diese Allergene kuppelt.
  • Aus der DE-AS 12 12 680, der FR-OS 21 45 376, der GB-PS 12 82 163 und der US-PS 38 69 546 ist es bereits bekannt, Allergene in modifizierter oder nichtmodifizierter Form an Proteine oder Polymere anzulagern. Insbesondere nach der GB-PS 12 82 163 wird ein Allergen mit einem Polyaldehyd vernetzt, und entsprechend der DE-OS 19 42 161 wird ein Allergen an Aluminiumhydroxidgel adsorptiv gebunden.
  • Demgegenüber werden erfindungsgemäß die Allergene durch kovalente Kupplung an lösliche Polymere chemisch modifiziert, wodurch sie unter anderem wasserlöslich und nichtimmunogen werden.
  • Gegenstand der Erfindung sind daher modifizierte Allergenderivate der eingangs erwähnten Art, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie erhalten werden durch kovalente Kupplung eines natürlichen Allergens an ein nichtimmunogenes wasserlösliches Polymeres, ausgewählt aus der Gruppe Polyethylenglykol, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylamid oder einem Homopolymeren von Aminosäuren mit einem Konjugationsgrad, der gewährleistet, daß die Konjugate sowohl tolerogen als auch nichtallergen und nichtimmunogen sind.
  • Als nichtimmunogene wasserlösliche Polymere, die zur Herstellung der obengenannten Allergen enthaltenden Substanzen verwendet werden können, werden Polyäthylenglykole mit einem Molekulargewicht von etwa 2000 bis 35 000 bevorzugt. Die hierin verwendete Bezeichnung "Polyäthylenglykole" soll auch physiologisch annehmbare Derivate davon, z. B. die Mononiedrigalkyläther, vorzugsweise den Monomethyläther, umfassen, wobei geeigneterweise die Hydroxylgruppen am Ende der Moleküle in Verbindung mit der Kupplung verwendet werden.
  • Zur kovalenten Kupplung von solchen Polymeren an die Allergenmoleküle können alle Kupplungsmethoden angewendet werden, die normalerweise dazu eingesetzt werden, um biologisch aktive Materialien mit inerten Polymeren zu kuppeln. Solche Methoden sind z. B. die Kupplung mittels eines gemischten Anhydrids, Cyanurchlorid, Isothiocyanat, oder Umsetzung zwischen -SH-Derivaten und -CH&sub2;J-Derivaten. Für den Fachmann liegen andere Verfahren, die die gewünschte Kupplung ergeben, auf der Hand.
  • Die Kupplungsreaktion erfolgt zwischen aktiven Gruppen in den Allergenmolekülen und in den Polymermolekülen. Erforderlichenfalls müssen solche Gruppen in die Moleküle vor der Kupplungsreaktion eingeführt werden. Solche aktiven Gruppen sind z. B. -NH&sub2;, -NCS, -SH, -OH, -CH&sub2;J und -COOH. Sie können nach bekannten Methoden eingeführt werden, wenn sie in den Molekülen nicht von Anfang an vorhanden sind. Die Kupplung der Polymeren mit dem Allergen soll, wie oben ausgeführt, bis zu einem solchen Ausmaß durchgeführt werden, daß die resultierenden Substanzen sowohl tolerogen (immunohemmend bzw. immunosuppressiv) als auch im wesentlichen nichtallergen und nichtimmunogen sind. Der Konjugationsgrad der Polymermoleküle mit dem Allergenmolekül, der dieses Ergebnis ergibt, kann von Allergen zu Allergen variieren. Für den Fachmann ist es offensichtlich, wie im Einzelfall die notwendige Konjugation erhalten werden kann. Dies kann beispielsweise anhand von einigen orientierenden Vorversuchen durchgeführt werden, wobei man Reihen von Konjugaten mit unterschiedlichen Konjugationsgraden herstellt und den speziellen Bereich festlegt, in dem die obengenannten Erfordernisse erfüllt werden. Zu niedrige Konjugationsgrade führen zu allergenen und immunogenen Konjugaten. Andererseits ergeben zu hohe Konjugationsgrade Konjugate, die nichttolerogen sind.
  • Erfindungsgemäß können tolerogene Derivate von prinzipiell allen Allergenen hergestellt werden, die für die üblichen Allergieformen beim Menschen und bei Säugetieren verantwortlich sind. Solche Allergene leiten sich z. B. von Tieren (insbesondere Haustieren, wie Hunden, Katzen, Kühen, Pferden usw.), Pollen von verschiedenen Gräsern und Bäumen, Insektengiften, Nahrungsmitteln, Hausstäuben, Milben und Schimmelorganismen ab.
  • Die erfindungsgemäßen Allergen enthaltenden Substanzen werden vorzugsweise in Form von Lösungen in einer Kochsalzlösung oder in einem physiologisch annehmbaren Puffer verwendet. Solche Lösungen können parenteral verabreicht werden. Vorzugsweise werden sie intravenös oder intramuskulär verabreicht. Die Verabreichungen können in geeigneten Intervallen wiederholt werden.
  • Die Allergen enthaltenden Substanzen können in gefriergetrockneter Form gelagert werden.
  • Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Die Fig. 1 und 2 zeigen Diagramme, welche Testergebnisse beschreiben, die gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurden.
    • Materialien und Methoden
  • Tiere: Durch Inzucht hervorgebrachte 8 bis 12 Wochen alte (C&sub5;&sub7;BL/6 × DBA/2)F&sub1;-Mäuse (als B&sub6;D&sub2;F&sub1; bezeichnet) und willkürlich gezüchtete Haubenratten wurden von North American Laboratories Supply Company, Gunton, Manitoba, gekauft.
  • Herstellung von Hapten-Protein-Konjugaten: Ovalbumin (OA) und Rinder-γ-globuline (BGG) wurden zur Synthese von DNP&sub3;-OA- und DNP&sub1;&sub8;-BGG-Konjugaten durch Reaktion mit Natrium-2,4-dinitrobenzolsulfonat (DNBS) in 0,2M-NA&sub2;CO&sub3;-Lösung verwendet. Der 2,4-dinitrophenylierte Extrakt von Ascaris suum (DNP-Asc), der 6,5×10-8 M DNP pro mg Asc enthielt, wurde in der Weise hergestellt, daß 46 mg Asc mit 24 mg DNBS in Gegenwart von 46 mg NA&sub2;CO&sub3; im Gesamtvolumen von 5,5 ml destilliertem Wasser bei 37°C 2 h lang umgesetzt wurden. Das nichtumgesetzte Hapten wurde durch Gelfiltration durch eine Säule aus Sephadex G-25 (Dextran, vernetzt mit Epichlorhydrin) entfernt.
    • Immunisierung und Messung der Immunantworten
  • Für optimale Anti-DNP- und Anti-OA-IgE-Antworten wurden den Mäusen i.p. mit dem Standard eine niedrige Dosis von 1 µg DNP&sub3;-OA, suspendiert mit 1 mg frisch hergestellten Aluminiumhydroxids in 0,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), injiziert. Diese Dosis, wenn sie auf dem i.p.-Weg verabreicht wird, wird nachstehend als "Sensibilisierungsdosis" bezeichnet.
  • Die optimale IgE-Antwort, die für Ambrosiapflanzen (RAG-) Pollenallergene spezifisch war, wurde bei den Mäusen durch i.p.-Injektion in Gegenwart von 1 mg Al(OH)&sub3; von 10 µg entweder RAG oder von AgE, das eine der gereinigten Komponenten von RAG darstellt, induziert. Die Mäuse wurden auch mit 10 µg von DNP-Asc, vorgemisht mit 1 mg Al(OH)&sub3; in 0,5 ml PBS, zur Induktion der Anti-DNP- und Anti-Asc-IgE-Antikörper sensibilisiert. Gruppen von 5 Mäusen wurden in identischer Weise behandelt. Die Seren der Mäuse jeder Gruppe wurden zur Bestimmung des durchschnittlichen Reagintiters durch passive kutane Anaphylaxie-(PCA-) Bestimmung gesamelt. Der Endpunkt der Titration wurde als reziproker Wert der höchsten Verdünnung jedes Serums, die eine Reaktion mit einem Durchmesser von 5 mm ergab, genommen. Die PCA-Titer für ein und dasselbe Reaginserum, die bei verschiedenen Ratten bestimmt worden waren, waren innerhalb eines Faktors von 2 reproduzierbar. Alle PCA-Titer wurden als Mittelwert von zwei Bestimmungen angegeben. Das gemeinsame Vorliegen von Antikörpern von anderen Immunoglobulinklassen als den Reaginen in den Seren von immunisierten Mäusen wurde durch einen passiven Hämaglutinations-(HA-)Test ermittelt.
  • Die Empfindlichkeit dieses Test wurde als für diese Untersuchung angemessenen angesehen, da dieser einen HA-Titer in der Größenordnung von 1000 mit einem Standard-Kaninchen- Anti-DNP-Serum, das als Kontrolle für jeden HA-Test verwendet wurde, ergab.
  • Zur Induzierung von optimalen Anti-DNP- und Anti-OA-Antworten bei Chester-Beatty-Ratten wurden den Tieren i.p. 1 µg von DNP&sub3;-OA in 0,5 ml PBS, suspendiert mit 1 mg frisch hergestellten Al(OH)&sub3; und 10¹º Organismen von Bordetella-pertussis- Vaccin, injiziert. Die Titer der bei Mäusen und Ratten erzeugten IgE-Antikörper wurden durch einen passiven kutanen Anaphylaxie-(PCA-)Test bei willkürlich gezüchteten Ratten mit ausdehnbarem Hals bestimmt.
    • Adoptive Zellübertragung
  • Bei diesem Verfahren wurden die Milzzellen von sensibilisierten und tolerisierten Mäusen in röntgenbestrahlte (550 R) syngeneische Aufnehmer übertragen. Den Aufnehmern wurde die standardsensibilisierende Dosis des Antigens in Gegenwart von Al(OH)&sub3; innerhalb von 4 h nach der Zellübertragung injiziert.
    • Beispiele 1 und 2
  • Zwei Ansätze Polyäthylenglykol mit durchschnittlichen Molekulargewichten von 6000 und 20 000, nachstehend als PEG&sub6; bzw. PEG&sub2;&sub0; bezeichnet, wurden an OA und RAG unter Verwendung von Cyanurchlorid als Kupplungsmittel nach einer Methode gekuppelt, die ähnlich der von R. Sharon et al. in J. Immunol. 114:1585 (1975) beschriebenen Methode war.
  • Die OA-PEG&sub6;- und OA-PEG&sub2;&sub0;-Konjugate wurden wie folgt hergestellt: jedes PEG (0,4 g), gelöst in 6 ml 0,5N-NaOH, wurde mit 0,1 g OA in 5 ml PBS vermischt und zu diesem Gemisch wurde tropfenweise unter konstantem Rühren eine Lösung von Cyanurchlorid (0,2 g in 3 ml N,N&min;-Dimethylformamid) gegeben. Es wurde unter Rühren 2 h bei Raumtemperatur und weitere 24 h bei 4°C umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde sodann gegen PBS dialysiert, um nichtumgesetztes Cyanurchlorid zu entfernen. Es wurde unter vermindertem Druck zu einem Volumen von 5 bis 7 ml eingeengt. Die Konjugate wurden sodann aus freiem PEG und OA durch Filtration durch eine Sepharose- 4B-Säule isoliert, wobei boratgepufferte Kochsalzlösung (BBS) als Eluierungsmittel verwendet wurde. Die OA-PEG-Konjugate waren hauptsächlich in den Fraktionen vorhanden, die dem Hohlraumvolumen der Säule entsprachen. Diese Fraktionen wurden gesammelt und konzentriert.
  • Die Herstellung von RAG-PEG&sub6; und RAG-PEG&sub2;&sub0; erfolgte ähnlich wie die Herstellung der OA-PEG-Konjugate. Das Reaktionsgemisch bestand aus 0,1 g PEG&sub6; oder PEG&sub2;&sub0; in 2 ml 0,5N-NaOH, 40 mg RAG in 5 ml PBS und 80 mg Cyanurchlorid in 1 ml N,N&min;- Dimethylformamid. Die RAG-PEG-Konjugate wurden ebenfalls, wie oben beschrieben, durch Filtration durch eine Sepharose- 4B-Säule isoliert.
    • Biologische Versuche I. DNP-OA-System (A) Hemmung der Reaginantwort mit OA-PEG-Konjugaten
  • Um die Aktivität des OA-PEG&sub6;-Konjugats gegenüber der Bildung von Reagin zu testen, wurde 1 mg OA-PEG&sub6; i.v. Mäusen 4 h injiziert, bevor diese mit einer Standardsensibilisierungsdosis von 1 µg DNP&sub3;-OA in Al(OH)&sub3; am Tag 0 immunisiert wurden. Die Mäuse erhielten i.p. eine zweite Injektion des immunisierenden Antigens am Tag 28 ohne eine weitere Verabreichung des Konjugats. Eine Kontrollgruppe der Mäuse erhielt PBS anstelle des Konjugats. Die Reaginantworten, die für das Hapten und den Träger spezifisch sind, sind in dem Diagramm der Fig. 1 dargestellt. In diesem Diagramm sind die PCA-Titer auf der vertikalen Achse gegenüber dem in Wochen ausgedrückten Zeitraum auf der horizontalen Achse dargestellt. Die zwei oberen Kurven beziehen sich auf die Kontrollgruppe, während sich die zwei unteren Kurven auf die Testgruppe beziehen. Die voll ausgezogenen Linien zeigen Anti-DNP an, während die strichgepunkteten Kurven Anti-OA darstellen.
  • Wie aus Fig. 1 ersichtlich wird, erreichte die Kontrollgruppe maximale primäre IgE-Antworten sowohl gegenüber dem Hapten als auch gegenüber dem Träger 14 Tage nach der Sensibilisierung. Ausgeprägt verstärkte sekundäre Anti-DNP- und Anti-OA-IgE-Antworten wurden 7 Tage nach der zweiten Injektion der sensibilisierenden Dosis von DNP-OA ausgelöst, welche 4 Wochen nach der primären Immunisierung verabreicht wurde. Andererseits führte die Behandlung der Mäuse mit einer einzigen Injektion von OA-PEG&sub6; am Tag 0 zu einer vollständigen Hemmung der primären IgE-Antworten sowohl gegenüber DNP als auch OA. Die sekundäre Immunisierung dieser Mäuse löste nur niedrige IgE-Antworten aus, die etwa 10% derjenigen entsprachen, welche bei den Kontrolltieren festgestellt wurden. Es wird daher ersichtlich, daß die Behandlung der Mäuse mit OA-PEG&sub6; zu einer verlängerten Hemmung von OA-spezifischen T-Helferzellen führt, die bei der Antwort auf DNP-OA beteiligt sind.
  • Zur Untersuchung der Frage, ob der beobachtete Hemmeffekt auf OA-PEG&sub6; immunologisch spezifisch war, wurden den Mäusen 1 mg PEG&sub6; i.v. 4 h injiziert, bevor sie die sensibilisierende Dosis von DNP-OA erhielten. Bei einer anderen Gruppe von Mäusen wurden PEG&sub2;&sub0; anstelle von PEG&sub6; verwendet. Wie üblich enthielten die Kontrollmäuse nur die sensibilisierende Dosis von DNP-OA. Alle Mäuse erhielten am Tag 20 eine zweite sensibilisierende Dosis von DNP-OA. Aus den in Tabelle I aufgeführten Ergebnissen wird ersichtlich, daß keines der freien PEG&sub6; oder PEG&sub2;&sub0; die Fähigkeit der Tiere, Reaginantworten zu erreichen, beeinträchtigte. Es kann daher die Schlußfolgerung gezogen werden, daß die durch OA-PEG&sub6; induzierte Hemmung tatsächlich für das an PEG&sub6; gekuppelte Antigen spezifisch war.
    • (B) Spezifizität der Immunohemmung mit OA-PEG&sub6;
  • Um einen weiteren Beweis für die Spezifizität der beobachteten Hemmung von IgE-Antikörpern zu erbringen, erhielten Mäuse am Tag 0 4 h vor der i.p.-Verabreichung von 1 µg DNP-OA oder 10 µg DNP-Asc in Al(OH)&sub3; eine i.v.-Injektion von 0,8 mg OA-PEG&sub6;. Am Tag 28 erhielten diese Tiere eine zweite i.p.-Injektion der gleichen Antigene in Al(OH)&sub3;. Bei diesem Versuch wurden auch zwei Kontrollgruppen von Mäusen verwendet, die kein OA-PEG&sub6; erhielten. Bei diesen erhielt eine Gruppe zwei sensibilisierende Dosen von DNP-OA am Tag 0 und am Tag 28 und die andere Gruppe erhielt zwei Dosen von 10 µg DNP-Asc in Al(OH)&sub3; an den gleichen Tagen.
  • Die in Tabelle II zusammengestellten Versuchsergebnisse stützen weiterhin die Spezifizität der Hemmung der IgE-Antworten gegenüber DNP und OA durch i.v.-Verabreichung von OA-PEG&sub6;. Es wird daher ersichtlich, daß Mäuse, die mit OA-PEG&sub6; (Test A) behandelt worden waren, weder gegenüber DNP oder OA eine primäre IgE-Antworten erreichten, wenn sie gegenüber DNP-OA sensibilisiert worden waren, wobei die sekundäre Antwort gegenüber DNP-OA ausgeprägt niedriger war als bei den Kontrolltieren. Andererseits beeinträchtigte die Behandlung der Mäuse mit dem OA-PEG&sub6;-Konjugat nicht ihre Fähigkeit, eine IgE-Antikörperantwort gegenüber dem nichtverwandten Antigen DNP-Asc zu erreichen, d. h. es lag kein signifikanter Unterschied zwischen den IgE-Anti-DNP- und Anti-Asc-Antikörpertitern der Seren der Tiere in den Kontroll-B- und Test-B- Gruppen der Mäuse vor.
    • (C) Fähigkeit der OA-PEG-Konjugate, eine ablaufende Reaginantwort abzubrechen
  • Dieser Versuch war dazu bestimmt, um die Möglichkeit zu untersuchen, durch Verabreichung von OA-PEG-Konjugaten eine ablaufende bzw. stattfindende Reaginantwort abzubrechen bzw. auszuschalten, welche mindestens 5 Wochen vor dem Versuch, sie zu hemmen, ausgebildet worden war. Das Schema der Injektionen und die PCA-Titer der Seren sind in Tabelle III zusammengestellt. Diese Werte zeigen, daß, während eine langandauernde und verstärkte IgE-Antwort gegenüber DNP und OA im Verlauf von 82 Tagen in der Kontrollgruppe der Mäuse aufrechterhalten werden konnte, die eine zweite und dritte Sensibilisierungsdosid von DNP an den Tagen 40 und 68 erhalten hatten, die Verabreichung von drei i.v.-Injektionen täglich mit 0,8 mg OA-PEG&sub6; an den Tagen 37, 38 und 39 an sensibilisierte Tiere eine sehr ausgeprägte Verminderung der Fähigkeit dieser Mäuse ergab, Anti-DNP- und Anti-OA-IgE-Antworten nach der sekundären und tertiären Injektionen zu erreichen.
  • Um zu beweisen, daß OA-PEG&sub2;&sub0; dazu imstande ist, eine ablaufende Reaginantwort gegenüber DNP-OA abzubrechen, erhielten Mäuse, die am Tag 0 gegenüber DNP-OA sensibilisiert worden waren, eine Injektion von 1 mg OA-PEG&sub2;&sub0; am Tag 22 und eine i.p.-Verstärkungsinjektion der sensibilisierenden Dosis von DNP-OA am Tag 28. Die Kontrollgruppe der Mäuse erhielt nur die zwei sensibilisierenden Injektionen von DNP-OA am Tag 0 und 28. Wie aus Tabelle IV ersichtlich wird, ergab die Behandlung der sensibilisierten Mäuse mit OA-PEG&sub2;&sub0; eine sehr ausgeprägte Hemmung der Reaginantworten sowohl gegenüber DNP und OA.
  • Es wird darauf hingewiesen, daß die Anti-OA-IgE-Titer der Mäuse innerhalb von 2 Tagen nach der Verabreichung von OA-PEG&sub6; oder OA-PEG&sub2;&sub0; (d. h. am Tag 24) hinsichtlich des Reaginspiegels in den Seren der Kontrolltiere nicht beeinträchtigt wurde. Dies zeigt, daß die Modifizierung von OA durch Konjugation mit PEG zu einer Maskierung oder radikalen Veränderung der Determinanten von nichtmodifiziertem OA führt, da sonst zu erwarten wäre, daß die Reagine, die in den Seren der Tiere vorhanden waren, die 24 Tage früher sensibilisiert worden waren, durch Injizierung der relativ großen Dosis von OA-PEG-Konjugaten neutralisiert worden wären. Tatsächlich wurde diese Erklärung bei den untenstehend beschriebenen Versuchen bestätigt.
    • (D) Aufrechterhaltung der Nichtempfindlichkeit bei der adoptiven Übertragung
  • Alle Donatoren der Milzzellen waren mit einer sensibilisierenden Dosis von DNP-OA 45 Tage vor dem Töten immunisiert worden. 9 Tage vor der Entfernung der Milze wurden diese Tiere in drei Gruppen aufgeteilt. Jede Gruppe erhielt eiune i.v.-Dosis von 0,2 mg OA-PEG&sub6; in 0,5 ml PBS oder von 0,8 mg OA-PEG&sub6; in 0,5 ml PBS oder nur von 0,5 ml PBS. Alle Tiere wurden sodann getötet. Suspensionen mit 5 10&sup7; Milzzellen jeder der drei Gruppen wurden den aufnehmenden syngeneischen röntgenbestrahlten (550 R) Mäusen übertragen. Innerhalb von weniger als 4 h nach der Zellübertragung erhielten alle Aufnehmer eine i.p.-sensibilisierende Dosis von DNP-OA. Die Anti-DNP- und Anti-OA-IgE-Antikörpertiter wurden über einen Zeitraum von 2 Wochen verfolgt.
  • Wie aus Tabelle 5 ersichtlich wird, waren die Reaginspiegel innerhalb von 5 Tagen nach Injektion von OA-PEG&sub6; in die intakten sensibilisierten Mäuse, die dazu bestimmt waren, zur Zellübertragung getötet zu werden, nur geringfügig vermindert worden. Nach einer adoptiven Übertragung der Milzzellen der Testmäuse, die mit OA-PEG&sub6; behandelt worden waren, antworteten diese jedoch sehr schwach auf eine weitere sensibilisierende Dosis von DNP-OA, die röntgenbestrahlten Aufnehmern verabreicht wurde, im Vergleich zu den Milzzellen der Mäuse der Kontrollgruppe. Es kann daher die Schlußfolgerung gezogen werden, daß die Behandlung der sensibilisierten Mäuse mit OA-PEG&sub6; zu einem Abbruch der Fähigkeit der Milzzellen dieser Tiere führte, eine Reaginantwort beim Wiederaussetzen einer weiteren sensibilisierenden Dosis des Antigens nach einer adoptiven Übertragung zu erreichen.
    • (E) Hemmung der hämagglutinierenden Antikörper mit OA-PEG- Konjugaten
  • Zusätzlich zu den hemmenden Effekten der OA-PEG-Konjugate auf die Bildung der Reagine wurden die Effekte dieser Konjugate auf die Bildung von hämagglutinierenden Antikörpern untersucht. Zu diesem Zweck erhielten die Mäuse eine i.v.- Injektion von 0,2 mg oder 1,0 mg von OA-PEG&sub6; oder OA-PEG&sub2;&sub0; 4 h vor der Verabreichung der sensibilisierenden Dosis von DNP-OA. Alle Mäuse erhielten eine zweite Injektion der sensibilisierenden Dosis 28 Tage später. Wie aus den Ergebnissen der Tabelle VI hervorgeht, hatte keine der zwei OA-PEG-Zubereitungen einen signifikanten Effekt auf die Hämagglutinationstiter bei einer Dosis von 0,2 mg. Jedoch führte die Verabreichung der OA-PEG-Zubereitungen mit einer höheren Dosis von 0,8 mg zu einer niedrigen, aber signifikanten Hemmung der hämagglutinierenden Antikörper. Dieser Effekt war bei Anti-DNP-Antikörpern stärker ausgeprägt als bei Anti-OA- hämagglutinierenden Antikörpern. Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, daß OA-PEG-Konjugate einen ausgeprägten hemmenden Effekt auf die Zellen haben, die bei der Erzeugung von IgE-Antikörpern beteiligt sind, als auf die Bildung von IgM- und/oder IgG-Antikörper.
    • II. Ambrosiapflanzen-Allergensystem (F) Abbruch der Reaginantwort auf RAG
  • Es ist gezeigt worden, daß die optimale Bildung von Reaginen gegenüber RAG bei B&sub6;D&sub2;F&sub1;-Mäusen durch Verabreichung von 10 µg RAG, das mit 1 mg Al(OH)&sub3; in 0,5 ml PBS suspendiert war, hervorgerufen wurde. Bei den unten beschriebenen Versuchen bestand jedoch die Standardsensibilisierungsdosis für die Induzierung der Reagine gegenüber Ambrosiapflanzenallergen aus 10 µg RAG, gemischt mit 1 mg Al(OH)&sub3; in 0,5 ml PBS. Bei einem Vesuch, eine ablaufende Reaginantwort gegenüber RAG abzubrechen, erhielten sensibilisierte Mäuse 0,8 mg RAG- PEG&sub6; oder RAG-PEG&sub2;&sub0; am Tag 15. Die Testergebnisse sind in Fig. 2 zusammengestellt. In dieser ist der Anti-RAG-PCA- Titer auf der vertikalen Achse gegen die in Wochen ausgedrückte Zeit auf der horizontalen Achse aufgetragen. Die ausgezogen dargestellte Kurve bezieht sich auf die Kontrollgruppe. Die gestrichelt gezeichnete Kurve bezieht sich auf die RAG-PEG&sub2;&sub0;-Gruppe und die strichgepunktete Kurve bezieht sich auf die RAG-PEG&sub6;-Gruppe. Wie aus Fig. 2 ersichtlich wird, führte eine Behandlung mit einem dieser zwei RAG-PEG- Konjugate zu einem Rückgehen der Anti-RAG-IgE-Antikörper. Die IgE-Antikörperspiegel fielen weiterhin ab, trotzdem eine zweite sensibilisierende Dosis von RAG am Tag 21 verabreicht wurde. Im Gegensatz dazu erreichten die Kontrolltiere eine typische sekundäre Reaktion.
  • Die Spezifizität des Hemmeffekts der RAG-PEG-Konjugate auf die Anti-RAG-Reaginreaktion wurde in dem in Tabelle VII dargestellten Versuch gezeigt. Während die Verabreichung einer zweiten sensibilisierenden Dosis von RAG am Tag 34 nach der primären Immunisierung an Mäuse, welche am Tag 33 auf dem i.v.-Weg OA-PEG&sub6; oder RAG oder PBS erhalten hatten, eine gesteigerte IgE-Reaktion bzw. IgE-Antwort ergab (d. h. der Anti-RAG-PCA-Titer lag in der Gegend von 500), führte die Verabreichung der zweiten sensibilisierenden Dosis am Tag 34 an Tiere, die am Tag zuvor RAG-PEG&sub6; erhalten hatten, zu einer dramatischen Verminderung des Anti-RAG-Reagin-Titers (d. h. der Anti-RAG-PCA-Titer fiel auf 60 ab). Weiterhin weist die Tatsache, daß die Verabreichung von 500 µg der nichtkonjugierten RAG-Zubereitung ohne Al(OH)&sub3; am Tag 33 die sekundäre Antwort, die am Tag 41 ermittelt wurde, nicht störte (die das Ergebnis der Reinjektion der zweiten sensibilisierenden Dosis von RAG am Tag 34 an die Tiere war), darauf hin, daß der oben beobachtete Abfall des Anti-RAG-IgE-Antikörperspiegels nicht auf eine Neutralisation der IgE-Antikörper durch das injizierte Konjugat, sondern auf eine Modulierung des immunologischen Systems der Tiere zurückzuführen war, die zu einer spezifischen Hemmung der Anti-RAG-IgE-Antwort führte. Es sollte auch beachtet werden, daß die i.v.-Verabreichung von 800 µg RAG am Tag 28 (d. h. am gleichen Tag als die immunisierten Tiere auch eine sekundäre sensibilisierende Dosis des Antigens erhielten) zu einer Verminderung des sekundären Anti-RAG-PCA-Titers am Tag 35 auf etwa 20 führte, was auf die Neutralisation von zirkulierenden IgE- Antikörpern zurückzuführen sein kann. Jedoch zeigten nicht einmal diese Tiere irgendwelche Anzeichen einer Immunhemmung, da eine weitere Immunisierung mit einer dritten sensibilisierenden Dosis von RAG am Tag 56 zu einer normalen anamnestischen IgE-Antwort führte.
    • (G) Unvermögen von OA-PEG und RAG-PEG-Konjugaten, PCA- Reaktionen hervorzurufen
  • Die Allergenizität von OA-PEG-Konjugaten wurde unter Anwendung des PCA-Tests bei Ratten getestet. Zu diesem Zweck wurde 0,1 ml eines Standard-Maus-Reaginserums mit bekanntem PCA-Titer (d. h. 1400), das durch i.p.-Immunisierung mit einer sensibilisierenden Dosis von DNP-OA erzeugt worden war, zweifach serienverdünnt. 50-µl-Volumina dieser verdünnten Lösungen wurden i.d. in die rasierte Haut von willkürlich gezüchteten Haubenratten bzw. Ratten mit verlängerbarem Hals injiziert. 24 h nach der Sensibilisierung der Haut wurden verschiedene Ratten i.v. 1,0-ml-Lösungen injiziert, welche verschiedene Mengen von nichtmodifizierten OA oder OA-PEG&sub6; oder OA-PEG&sub2;&sub0; und 0,5% Evans-Blaufarbstoff enthielten. Die Ratten wurden 30 min später getötet und die PCA-Reaktionen wurden bestimmt.
  • Wie aus Tabelle VIII ersichtlich wird, löste 1 mg von nichtmodifiziertem OA eine starke PCA-Reaktion aus. Die Zugabe von nichtkonjugiertem PEG mit einem Molekulargewicht von entweder 6000 oder 20 000 zu OA störte die auf OA zurückgeführte PCA-Reaktion nicht. Im Gegensatz dazu waren sowohl OA-PEG&sub6; als auch OA-PEG&sub2;&sub0;, selbst wenn sie in erheblich höheren Mengen als das OA injiziert wurden (d. h. 10 bzw. 6 mg), nicht dazu imstande, eine signifikante Reaktion hervorzurufen bzw. auszulösen. Weiterhin zeigen die Versuche 8 und 9, daß Tiere, die keinerlei PCA-Reaktion zeigten, wenn sie entweder mit OA-PEG&sub6; oder OA-PEG&sub2;&sub0; provoziert worden waren, gute Reaktionen bei einer Reinjektion mit 1 mg des nichtmodifizierten OA 20 min nach der primären Provozierung mit diesen Konjugaten zeigten. Diese Ergebnisse zeigen, daß OA- PEG-Konjugate nicht dazu imstande waren, sich mit Anti-OA- IgE-Antikörpern in vivo zu kombinieren und diese zu neutralisieren. Im Lichte dieser Erklärung kann davon ausgegangen werden, daß die minimale PCA-Reaktion (der Titer liegt in der Gegend von 60) im Versuch 5 mit einer Dosis von 10 mg OA-PEG&sub6; beobachtet worden war, auf das Vorhandensein von OA-PEG&sub6;, das für die Provozierung verwendet worden war, von sehr geringen Mengen von nichtmodifiziertem OA oder von einigen OA-PEG-Konjugaten, die sehr wenig PEG-Moleküle pro Molekül OA enthalten und immer noch einige zugängliche antigene Determinanten besitzen, in der Zubereitung zurückzuführen ist. Auf der Grundlage aller dieser Ergebnisse kann gefolgert werden, daß das Unvermögen der PEG-Konjugate von OA, entweder eine PCA-Reaktion auszulösen oder die an die sensibilisierten Hautstellen fixierten Anti-OA-Reagine zu neutralisieren, auf die Tatsache zurückzuführen war, daß die ursprünglichen antigenen Determinanten von OA in den OA- PEG-Konjugaten entweder unzugänglich waren oder radikal verändert worden waren.
  • Die Fähigkeit von RAG-PEG&sub2;&sub0;, PCA-Reaktionen auszulösen, wurde in der oben beschriebenen Weise untersucht, wobei ein Maus-Anti-RAG-Reaginserum zur Sensibilisierung der Haut der Ratten verwendet wurde. Zur Provozierung der sensibilisierten Hautstellen wurde eine Lösung von RAG oder RAG-PEG&sub2;&sub0; (in Gegenwart von Evans-Blaufarbstoff) den Ratten i.v. injiziert. Die Ergebnisse dieser PCA-Tests sind in Tabelle IX zusammengestellt. Daraus kann gefolgert werden, daß, obgleich die nichtmodifizierten RAG-Allergene eine starke PCA-Reaktion auslösen, das RAG-PEG&sub2;&sub0; nicht dazu imstande war, irgendeine PCA-Reaktion auszulösen. Die Ergebnisse dieses letzten Versuchs dieser Tabelle zeigen weiterhin, daß die Verabreichung von RAG-PEG&sub2;&sub0; die Auslösung von PCA-Reaktionen bei der Reinjektion von nichtmodifiziertem RAG 20 min später an die Tiere nicht störte. Es kann daher gefolgert werden, daß das RAG-PEG&sub2;&sub0;-Konjugat keine leicht zugänglichen antigenen Determinanten besitzt, die von den nichtmodifizierten RAG- Allergenen geteilt werden. Dieses Produkt war daher nicht dazu imstande, Mastzellen, die mit Anti-RAG-IgE-Antikörpern beschichtet worden waren, auszulösen.
    • (H) Unvermögen von OA-PEG-Konjugaten, eine Anaphylaxie bei Ratten zu induzieren, die mit OA sensibilisiert worden waren
  • Die unten beschriebenen Versuche waren vorgesehen, um einen weiteren Beweis für das Unvermögen von OA-PEG-Konjugaten zu erbringen, sich in vivo mit Anti-OA-IgE-Antikörpern zu kombinieren. Da Mäuse gegenüber Histamin beständig sind, induziert eine Injektion des sensibilisierenden Antigens in Mäuse, die IgE-Antikörper gegen das entsprechende Antigen besitzen, nicht ohne weiteres eine Anaphylaxie. Es wurden daher Ratten, die gegenüber einer Anaphylaxie anfällig waren, ausgewählt, um zu testen, ob OA-PEG-Konjugate dazu imstande waren, sich in vivo mit Anti-OA-IgE-Antikörpern, die an Mastzellen fixiert waren, zu kombiniern und auf diese Weise eine anaphylaktische Reaktion auszulösen oder nicht. Zu diesem Zweck wurden Chester-Beatty-Ratten systemisch durch Immunisierung mit DNP-OA auf die oben beschriebene Weise sensibilisiert. Für systemische Reaktionen wurden 2 mg nichtmodifiziertes OA oder OA-PEG&sub6; oder OA-PEG&sub2;&sub0; in 1 ml PBS i.v. jedem sensibilisierten Tier (6 h nach dem Blutablassen) verabreicht. Die Tiere wurden sorgfältig auf Effekte dieser Verbindungen beobachtet. Alle sensibilisierten Ratten, die eine i.v.-Injektion von OA erhalten hatten, starben innerhalb von 15 bis 30 min an einem anaphylaktischen Schock. Im Gegensatz dazu waren weder OA-PEG&sub6; noch OA-PEG&sub2;&sub0; dazu imstande, bei Verabreichung an die sensibilisierten Tiere irgendwelche sichtbare Anzeichen von Unbehagen hervorzurufen. Diese Feststellungen, die in Übereinstimmung mit den oben im Abschnitt (G) berichteten Tatsachen stehen, zeigen zweifelsfrei, daß die PEG-modifizierten Antigene nicht dazu imstande waren, sich in vivo mit IgE-Antikörpern von aktiv sensibilisierten Tieren umzusetzen, und daß sie daher nicht dazu imstande waren, eine anaphylaktische Reaktion auszulösen. Tabelle I - Unvermögen von freiem PEG, Reaginantworten zu hemmen &udf53;vu10&udf54;&udf53;vz22&udf54; &udf53;vu10&udf54; Tabelle II - Spezifizität der Immunohemmung mit OA-PEG-Konjugaten &udf53;vu10&udf54;&udf53;vz29&udf54; &udf53;vu10&udf54; Tabelle III - Abbruch einer stattfindenden Reaginantwort mit OA-PEG&sub6; &udf53;vu10&udf54;&udf53;vz27&udf54; &udf53;vu10&udf54; Tabelle IV - Abbruch einer stattfindenden Reaginantwort mit OA-PEG&sub2;&sub0; &udf53;vu10&udf54;&udf53;vz16&udf54; &udf53;vu10&udf54; Tabelle V - Aufrechterhaltung der Nicht-Empfindlichkeit bei der adoptiven Zellübertragung &udf53;vu10&udf54;&udf53;vz32&udf54; &udf53;vu10&udf54; Tabelle VI - Effekt von OA-PEG-Konjugaten auf die hämagglutinierenden Antikörperantworten &udf53;vu10&udf54;&udf53;vz27&udf54; &udf53;vu10&udf54; Tabelle VII - Spezifizität der Immunohemmung mit RAG-PEG&sub6; &udf53;vu10&udf54;&udf53;vz18&udf54; &udf53;vu10&udf54; Tabelle VIII - Unvermögen von OA-PEG-Konjugaten, PCA-Reaktionen auszulösen*) &udf53;vu10&udf54;&udf53;vz31&udf54; &udf53;vu10&udf54; Tabelle IX - Unvermögen von RAG-PEG-Konjugaten, PCA-Reaktionen auszulösen*) &udf53;vu10&udf54;&udf53;vz15&udf54; &udf53;vu10&udf54;
    • Beispiel 3
  • Konjugate von Hundealbumin (DA) mit Monomethoxypolyäthylenglykolen (m.PEG-OH) mit verschiedenen Molekulargewichten wurden nach der Mischanhydridmethode hergestellt. Diese Methode umfaßte drei Stufen:
    • a) Herstellung von °=c:40&udf54;&udf53;vu10&udf54;&udf53;vz3&udf54; &udf53;vu10&udf54;Zu einer Lösung von m.PEG-OH (0,8 mMol) in 20 ml trockenem Pyridin wurden 800 mg (8 mMol) Bernsteinsäureanhydrid gegeben. Die Mischlösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wurde in 15 ml Benzol aufgelöst. Das Produkt wurde durch Zugabe von 20 ml vorgekühlten Hexans ausgefällt. Der Niederschlag wurde sodann durch Filtration gesammelt und in destilliertem Wasser gelöst. Die wäßrige Lösung wurde gegen destilliertes Wasser in Quantipore-gamma-Dialysebeuteln (abgeschnittenes Molekulargewicht: 4000; hergestellt von Quantimetrix Co., Culber City, California) dialysiert. Das Produkt wurde schließlich lyophilisiert.
    • b) Herstellung von °=c:40&udf54;&udf53;vu10&udf54;&udf53;vz3&udf54;&udf53;vu10&udf54;°=c:40&udf54;&udf53;vu10&udf54;&udf53;vz3&udf54; &udf53;vu10&udf54;wurde in 10 ml Chloroform aufgelöst. Die Temperatur wurde bei 0°C mit einem Eisbad gehalten. Trockenes Stickstoffgas wurde durch die Lösung geleitet. Triäthylamin (0,4 mMol) wurde zu der Lösung gegeben und sodann wurde tropfenweise Isobutylchloroformiat (0,4 mMol) zugesetzt.
    • Die Reaktionslösungen wurden 30 min bei 0°C gehalten und sodann unter Vakuum bei Raumtemperatur eingedampft. Der Rückstand wurde mehrmals mit Petroläther gewaschen. Es wurde ein weißes kristallines Produkt erhalten.
    • c) Konjugation von °=c:40&udf54;&udf53;vu10&udf54;&udf53;vz3&udf54; &udf53;vu10&udf54;mit Hundealbumin:
    • Hundealbumin (200 mg) wurde in 30 ml Boratpuffer (pH 9,6) aufgelöst. Die Temperatur wurde mit einem Eisbad bei 0°C gehalten. °=c:40&udf54;&udf53;vu10&udf54;&udf53;vz3&udf54; &udf53;vu10&udf54;(in den in Tabelle X angegebenen Mengen) wurde portionsweise in festem Zustand zugesetzt. Die Reaktionslösung wurde 3 h bei 0°C gerührt und sodann 16 h lang in einem Kühlschrank gelagert. Die Reaktionslösung wurde hierauf durch eine Sepharose-6B-Säule geleitet. Die Fraktionen, die Protein und kein freies m.PEG-Derivat enthielten, wurden gesammelt und lyophilisiert. Freies m.PEG wurde durch Dünnschichtchromatographie festgestellt.
    Tabelle X &udf53;vu10&udf54;&udf53;vz17&udf54; &udf53;vu10&udf54;
  • Der Konjugationsgrad wurde durch Quantitation der Menge der m.PEG-Substituierten in dem modifizierten Hundealbumin durch NMR-Technik bestimmt. Die Anzahl der freien Aminogruppen wurde nach der o-Phthalaldehyd-Methode (A. R. Torres et al., Biochim. Biophys. Acta, Band 434 [1976], Seite 209) bestimmt. In Tabelle X ist der Komjugationsgrad als Anzahl von PEG- Molekülen pro ein Molekül DA angegeben.
  • Die so hergestellten Konjugate wurden auf die Allergenizität, die Tolerogenizität und die Antigenizität getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle XI zusammengestellt.
  • Die Tolerogenizität wurde nach den oben beschriebenen Methoden bestimmt. Der Tolerogenizitätsgrad entspricht der durchschnittlichen Verminderung der IgE-Titer nach der dritten Sensibilisierung, bezogen auf die Titer der Kontrolltiere, die nur die drei sensibilisierenden Dosen von DA erhielten. Eine Verminderung um einen Faktor von 6 bis 100 bedeutet eine gute Tolerogenizität.
  • Die Allergenizität wurde nach zwei Methoden bestimmt, nämlich einer Methode auf RAST-Grundlage und einem PCA-Neutralisationstest.
  • Bei der Methode auf RAST-Grundlage (Ref. Yman et al. Int. Whoiabs Symp. on standardization and control of allergens administered to man, Geneva, 1974; Develop. biol. standard, Band 29, Seiten 151 bis 165 [Karger, Basel, 1975]) setzen sich die modifizierten Allergene mit einem Serum um, das allergenspezifisches IgE enthält. Der Überschuß von IgE setzt sich mit nichtmodifizierten Allergenen um, die kovalent an eine Papierscheibe gekuppelt sind. Radioaktiv markierte Antikörper gegen IgE werden zugesetzt und diese bilden einen Komplex. Die Radioaktivität dieses Komplexes wird in einem gamma-Zähler gemessen. Die Zählung ist direkt dem Überschuß von IgE in dem Serum nach der Reaktion mit dem Extrakt proportional (vgl. die obigen Literaturreferenzen). Die Allergenpotenz des modifizierten Allergens wird als Prozentsatz zu derjenigen des nativen Hundealbumins (=100%) ausgedrückt.
  • Die Antigenizität der modifizierten Allergene wird durch eine umgekehrte Einzelradialimmunodiffusion bestimmt. Antiseren mit hohen Titern gegen die nichtmodifizierten Allergene wurden in Kaninchen gebildet. Die spezifische Präzipitatbildung wurde bei verschiedenen Konzentrationen von Allergenen verglichen, die in Agarose in Petrischalen eingearbeitet waren. Die relative Aktivität wurde aus der niedrigsten Konzentration der modifizierten Allergene errechnet, die ein ausgeprägtes Präzipitat ergaben. Die minimalen präzipitatbildenden Konzentrationen von nichtmodifizierten Allergenen wurden als Standard verwendet. Die Antigenizität des Hundealbumins wurde als eine Aktivität von 100% genommen. Tabelle XI &udf53;vu10&udf54;&udf53;vz18&udf54; &udf53;vu10&udf54;

Claims (2)

1. Modifizierte Allergenderivate zur Verwendung als immunologisch spezifische Hemmer der Bildung von Reaginen der IGE-Klasse, die auf das fragliche Allergen gerichtet sind, dadurch gekennzeichnet, daß sie erhalten werden durch kovalente Kupplung eines natürlichen Allergens an ein an sich nichtimmunogenes wasserlösliches Polymeres, ausgewählt aus der Gruppe Polyethylenglykol, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylamid oder einem Homopolymeren von Aminosäuren mit einem Konjugationsgrad, der gewährleistet, daß die Konjugate sowohl tolerogen als auch nichtallergen und nichtimmunogen sind.
2. Modifizierte Allergenderivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymere ein Polyäthylenglykol mit einem Molekulargewicht von etwa 2000 bis etwa 35 000 ist.
DE2736223A 1976-08-17 1977-08-11 Modifizierte Allergenderivate Expired DE2736223C2 (de)

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