DE2708666B2

DE2708666B2 - Arzneimittel mit immunoregulativer und antiphlogistischer Wirkung

Info

Publication number: DE2708666B2
Application number: DE19772708666
Authority: DE
Inventors: Nakao Ishida; Fumio Kitame; Hiroshi Saitoh
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1977-02-28
Filing date: 1977-02-28
Publication date: 1979-04-19
Also published as: DE2708666C3; DE2708666A1

Description

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in der R eine Hydroxylgruppe oder ein Carbonylsauerstoffatom bedeutet

2. Verwendung eines Choiesterinderivats der allgemeinen Formel 1 als Immunoregulativum und Antiphlogistikum.

Die Erfindung betrifft den im Anspruch gekennzeichneten Gegenstand. Bei den erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen handelt es sich um 7-Hydroxychole- jo sterin und 7-Ketocholesterin. Diese Verbindungen sind bekannt. Sie stellen Katabolismusprodukte des Cholesterins in lebenden Organismen dar. Die Erfindung beruht auf dem Befund, daß die Verbindungen der allgemeinen Formel I den immunoregulativen Faktor r, (IRA) in humanem Serum darstellen.

Der vorliegenden Erfindung gingen folgende Arbeiten voraus. In der JA-OS 33 421/76 ist ein Verfahren zur Herstellung eines peptidähnlichen Präparats mit immunoregulativer Aktivität aus Serum und Plazentarblut w beschrieben. Die Untersuchung dieser immunoregulativen Substanz konnte fortgesetzt werden, da diese Substanz aus Cohn IV-I Paste von humanem Serum isoliert und als eine peptidähnliche Substanz mit einem Molekulargewicht von etwa 5000 identifiziert wurde; v-, vgl. O cc h i η ο u. Mitarb., The Journal of Immunology, Bd. 110 (1973), S. 685. Diese peptidähnliche Substanz wird zur Zeit mit IRA (immunoregulatives α-Globulin) bezeichnet.

Die der vorliegenden Erfindung vorausgehenden w Untersuchungen waren vor allem darauf gerichtet, das aktive Zentrum dieser immunoregulativen Substanz, die in lebenden Organismen vorliegt zu finden und eine chemische Synthese dieser Substanz zu entwickeln, die im Vergleich zu den herkömmlichen Extrakten für die π verschiedensten Zwecke in der Medizin eingesetzt werden kann, beispielsweise zur immunoregulativen Behandlung.

Das aus der Cohn IV-I Paste durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel erhaltene geringfügig bo wasserlösliche Material wurde der Säulenchromatographie unterworfen, um die immunoregulative aktive Substanz abzutrennen. Überraschenderweise wurde nun festgestellt, daß nicht eine peptidähnliche Substanz, sondern ein Cholesterinderivat für die immunregulative μ Aktivität verantwortlich ist. Auf diesem Befund beruht die Erfindung. Ferner wurde festgestellt, daß diese Substanz antiphlogistische Wirkung besitzt.

Zur Gewinnung von 7-Hydroxycholesterin bzw. 7-Ketocholesterin wird die Cohn IV-I Paste einer humanen Serumfraktion mit einem Gemisch aus Chloroform und Metahnol extrahiert. Der erhaltene Extrakt wird an Aluminiumoxid und Kieselsäure sowie an Cellulose der Chromatographie und schließlich der Flüssigkeitschromatographie unterworfen. Hierbei werden die Verbindungen der Formel I abgetrennt. Die Verbindungen werden in kristalliner Form isoliert.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel 1 können auch in an sich bekannter Weise durch Oxidation von Cholesterin hergestellt werden.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I können als immunoregulative Mittel, insbesondere als cytoplasmatische immunoregulative Mittel sowie als Antiphlogistika eingesetzt werden.

Die pharmakodynamischen Wirkungen der Verbindungen der allgemeinen Formel I gehen aus folgenden Versuchen hervor.

(1) Immunoregulative Wirkung in vitro

Die PHA-Reaktion bei 50prozentiger Hemmkonzentration der Verbindungen der allgemeinen Formel I wird nacii der von S. R. Cooperbandu. Mitarb., The Journal of Immunology, Bd. 109 (1972), S. 154, beschriebenen Methode bestimmt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle I zusammengefaßt. Als Vergleichsverbindung wird das nach Occhino u. Mitarb., The Journal of Immunology, Bd. 110 (1973), S. 685, gewonnene IRA verwendet.

Tabelle I

7-Hydroxycholesterin 5 jjLg/ml

7-Ketocholesterin 8 (ig/ml

IRA 20|xg/ml

(2) Immunoregulative Wirkung in vivo

Für die Versuche werden drei Gruppen von jeweils 5 Mäusen verwendet. Eine Gruppe dient als Kontrollgruppe. Jeweils 5 Mäusen wird in einer Dosis von 8 mg/kg/Tag 7-Hydroxycholesterin bzw. 10 mg/kg/Tag 7-Ketodtolesterin intravenös kontinuierlich während eines Zeitraumes von 20 Tagen verabfolgt. Es wird die Wirkung bei der Hautübertragung untersucht.

Zur Verabfolgung wird jede Verbindung mit einem Netzmittel emulgiert und als physiologische isotone Lösung mit einer Endkonzentration von 3,0 Gewichtsprozent hergestellt. Diese Lösung wird jeder Maus der beiden Testgruppen 24 Stunden vor der Hautübertragung injiziert. Danach wird die Lösung einmal täglich während insgesamt 20 Tagen injiziert.

Nach dem 20tägigen Versuch zeigte sich, daß bei beiden Tiergruppen die Hautübertragungsrate bei 80 bis 90% liegt, während sie bei der Kontrollgruppe bei 0% liegt. Dies zeigt die signifikante pharmakodynamische Wirkung der erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen als Immunoregulativa.

(3) Antiphlogistische Wirkung

Für die Versuche werden vier Gruppen von jeweils 5 Mäusen verwendet. Den Mäusen von zwei Versuchsgruppen wird intraabdominal 7-Hydroxycholesterin bzw. 7-Ketocholesterin in einer Dosis von 200 mg/kg in Form einer physiologisch isotonischen 2,0gewichtsprozentigen wäßrigen Lösung gegeben. Eine Stunde später wird in die Hinterpfoten der Mäuse 0,05 ml einer 1 prozentigen Carrageeninlösung subplaniai injiziert.

Das Pfotenvolumen wird volumetrisch vor und nach Ausbildung der entzündlichen Schwellung gemessen. Einer Kontrollgruppe wurde isotone Kochsalzlösung appliziert.

Innerhalb 4 Stunden nach der Injektion von Carrageenin beträgt die Ödemzunahme bei der Kontrollgruppe 82% und bei eine;- mit Cholesterin als Vergleichssubstanz behandetlen Gruppe 70%. Andererseits beträgt bei der mit 7-HydroxychoIesterin behandetlen Gruppe die Ödemzunahme nur etwa 40% innerhalb 5 Stunden nach der Carragenininjektion. Bei der mit 7-Ketocholesterin behandeilen Gruppe beträgt die Ödemzunahme nur etwa 50%. Dies zeigt, daß diese beiden Verbindungen eine signifikante antiphlogistische Wirkung besitzen.

Die Versuchergebnisse sind in F i g. 1 graphisch wiedergegeben. Die Kurven haben folgende Bedeutung:

1 = isotone Kochsalzlösung,

2 = Cholesterin,

3 = 7-Ketocho)esterin,

4 = 7-Hydroxycholesterin.

Das Arzneimittel der Erfindung wird vorzugsweise in Form eines Injektionspräparates hergestellt. Die erfin- 2^r> dungsgemäß verwendeten Verbindungen können jedoch auch oral eingesetzt werden.

Zur Herstellung von Injektionspräparaten werden übliche Verdünnungsmittel verwendet, Vorzugsweise werden die Verbindungen der allgemeinen Formel 1 in so einer physiologisch isotonen wäßrigen Lösung zusammen mit einem üblichen Emulgator emulgiert. Der Emulgator kann in einer Menge von 2 bis 10 Gewichtsprozent verwendet werden. Ferner können wäßrige Lösungen einen üblichen Stabilisator für Steroide r> enthalten, beispielsweise Albumin. Der Stabilisator kann in einer Menge von 0,1 bis 5 Gewichtsprozent verwendet werden.

Arzneimittel zur oralen Verabfolgung können zu üblichen Dosierungsformen konfektioniert werden, w beispielsweise zu Tablemen oder als Sirup. Ferner können die Verbindungen der allgemeinen Formel I in Form von Salben oder Cremes zur äußerlich lokalen Behandlung eingesetzt werden.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel 1 sind 4> praktisch ungiftig, dies haben Versuche zur Bestimmung der akuten Toxizität an Ratten ergeben.

Im Folgenden wird die Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen näher erläutert:

A. 25 g Cholesterin werden in 1 Liter heißem Äthanol w gelöst. Sodann wird die Lösung anteilsweise in eine etwa 7O⁰C warme Lösung von 5 g Natriumstearat in 5 Liter destilliertem Wasser gegossen, deren pH-Wert auf 8,5 ±0,1 eingestellt worden ist. Auf das Reaktionsgefäß wird ein Rückflußkühler aufgesetzt, und die Lösung wird ^r>5 auf 85± I⁰C erhitzt. Sodann wird in die Lösung 5 bis 7 Stunden Luft eingeblasen. Nach beendeter Umsetzung wird das Reaktionsgem'sch mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 4 bis 6 eingestellt. Hierauf wird das Reaktionsgemisch mit Chloroform mehrmals extrahiert. t>o Die Chloroformextrakte werden vereinigt und unter vermindertem Druck bei etwa 45° C eingedampft. Der Rückstand wird in einer geringen Menge Chloroform gelöst und auf eine mit Chloroform äquilibrierte Kieselgelsäule aufgesetzt. Die Kieselgelsäule wird mit b5 Chloroform eluiert. Zunächst wird nicht umgesetztes Cholesterin abgetrennt. Sodann folgt 7-Ketocholesterin, das im UV-Licht erkannt wird. Nach weiterem Eluieren mit einem 5% Methanol enthaltenden Chlorolormgemisch wird auch 7-Hydroxycholesterin eluiert.

Die 7-Ketocholesterin und 7-Hydroxycholesterin enthaltenden Eluate werden eingedampft und nochmals auf eine mit Benzol äquilibrierte Kieselgelsäule aufgesetzt und auf die vorstehend beschriebene Weise chromatographiert.

Die Schmelzpunkte des erhaltenen 7-Ketocholesterins und 7-Hydroxycholesterins stimmen mit den Literaturwerten überein; vgl. The Journal of Biological Chemistry, Bd. 141 (1941), S. 597.

B. 1 kg Paste der bei der Alkoholfraktionierung nach Cohn erhaltenen IV-I Fraktion wird in 4 Liter eines 1 : !-Gemisches von Chloroform und Methanol suspendiert und extrahiert. Der erhaltene Extrakt wird auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule aufgesetzt und mit Chloroform, das eine geringe Menge Methanol enthält, eluiert. Das Eluat wird eingedampft und an Cellulose chromatographiert. Zwei Fraktionen mit Hemmwirkung werden mittels Dünnschichtchromatographie und mit einem 1 :1 Gemisch von η-Hexan und Äthylacetat voneinander getrennt. Die Verbindungen werden in kristalliner Form erhalten. Bei den Verbindungen handelt es sich um 7-Ketocholesterin und 7-Hvdroxycholesterin.

Nachstehend folgen einige Beispiele für das Mittel nach der F.rfindung:

Beispiel 1
Herstellung eines Injektionspräparats

300 g steriles 7-Hydroxycholesterin werden in 9 Liter destilliertem Wasser zusammen mit 300 g eines Polyoxyäthylen-Polyoxypropylen-Copolymers mit einem Durchschnittsmolekulargewicht von 8350 versetzt und emulgiert. Sodann wird das Gemisch durch Zusatz von 1 Liter Milchsäure enthaltender Ringcrlösung isotonisch und physiologisch eingestellt. Es wird eine wäßrige Lösung mit einer Endkonzentration von 3,0 Gewichtsprozent/Volumen erhalten. Die Lösung wird in Ampullen abgefüllt, die jeweils 100 mg 7-Hydroxycholesterin enthalten.

Beispiel 2
Herstellung von Tabletten

Zur Herstellung von Tabletten werden 300 g 7-Hydroxycholesterin, 50 g Calciumphosphat, 600 g Stärke und 150 g flüssige Gelatine unter Zusatz von Wasser verknetet. Das Gemisch wird granuliert und unter vermindertem Druck getrocknet. Es wird ein Granulat mit einer Korngröße von etwa 5 mm erhalten. Das Granulat wird in einer Tablettiermaschine zu Tiibletten von jeweils 500 mg verpreßt.

Beispiel 3
Herstellung eines Injektionspräparats

10 g eines Gemisches von 7-Ketocholesterin und 7-Hydroxycholesterin sowie 10 g eines Phospholipids werden in 100 ml Wasser suspendiert. Die Suspension wird mit Ultraschall behandelt und in Ampullen abgefüllt.

Beispiel 4

Herstellungeines Injektionspräparats

100 g Sojabohnenöl werden mit 10 g Phospholipid sowie 4 g 7-Hydroxycholesterin und 400 ml Wasser

versetzt. Das Gemisch wird durch Ultraschallbehandlung homogenisiert und steril in Ampullen abgefüllt.

Es sind zwar bereits verschiedene immunsuppressive Verbindungen bekannt, beispielsweise Azathioprin, das sich in Kombination mit einem Corticosteroid als Immunsuppressivum bei Nierentransplantationen eignet; vgl. Fortschr. d. Arzneimittelforschung, Bd. 20 (1976), S. 584. Azathioprin ruft verschiedene Nebenwirkungen hervor, z. B. Magen-Darmstörungen wir Anorexie, Brechreiz und Durchfall, ferner Haarausfall, Cholestase, Leberzellschädigung und toxische Thrombozytopenie; vgl. R. Heintz, Erkrankungen durch Arzneimittel, 2. Aufl., 1978, S. 256,293 und 303.

Das Anliphlogistikum Indometacin zeichnet siel bekanntlich ebenfalls durch eine Reihe von Nebenwir kungen aus wie Durchfall, Hepatitis, Leukopenie Markinsuffizienz, Rektumschleimhautblutungen, toxi sehe Thrombozytopenie und Vasculitis allergica; vgl. R Heintz, a. a. O., S. 282, 303, 236, 234, 285 - 286, 256 272 und 48.

Die erfindungsgemäß verwendeten Cholesterinderi vate, nämlich 7-Hydroxy- und 7-Ketocholestcrin, weiset eine sehr geringe akute Toxizität auf. Dies habet folgende Versuche ergeben, die nachstehend in dei Tabelle II zusammengefaßt sind:

Tabelle !!	Ratte	LD₅₀, mg/kg Azathioprin	7-Hydroxy- cholesterin	Indometacin
Art der Verabreichung	männlich weiblich männlich weiblich männlich weiblich	535 560 426 456 1000 1000	25 000 25 000 25 000 25 000 25 000 25 000	21
Oral Intrape itoneal Subkutan

Für Indometacin beträgt die LDw an Ratten bei oraler Verabfolgung 21 mg/kg, vergl. hierzu die DE-AS 16 95 703 und weist somit im Vergleich zum Erfindungsgegenstand eine außerordentlich hohe akute Toxizitä auf.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Arzneimittel zur oralen oder parenteralen Verabfolgung mit immunoregulativer und antiphlogistischer Wirkung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem Cholesterinderivat der allgemeinen Formel I