DE2702699A1 - Neue peptidderivate und verfahren zur messung der collagenaseaktivitaet unter verwendung dieser verbindungen - Google Patents
Neue peptidderivate und verfahren zur messung der collagenaseaktivitaet unter verwendung dieser verbindungenInfo
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Description
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Priorität : 24. Januar 1976, Japan, Nr. 6926/76
30. August 1976, Japan, Nr. 103 505/76 30. August 1976, Japan, Nr. 103 506/76
Neue Peptidderlvate und Verfahren zur Messung der Collagenaseaktivität unter Verwendung dieser Verbindungen
Die Erfindung betrifft neue Peptidderivate und ein Verfahren zur
Messung der Collagenaseaktivität. Die Erfindung umfaßt spezieller neue Peptidderivate, deren eine Gruppe als Substrate, für die
Collagenase spezifisch 1st, geeignet ist und deren andere Gruppe wertvolle Substrate darstellen, die der Einwirkung von nicht spezifischen
Peptidasen, nicht jedoch Collagenase, unterliegen, sowie ein Verfahren zur Bestimmung der Collagenaseaktivität unter
Verwendung dieser Peptidderivate als Substrate.
In jüngerer Zeit wurden in weitem Umfang Untersuchungen über Collagen und Collagenase durchgeführt und es hat sich gezeigt, daß der
Collagenasespiegel in Geweben oder Körperflüssigkeiten in Abhängigkeit
von dem Vorliegen und der Art von Bindegewebeerkrankungen schwankt, beispielsweise in Geweben von Patienten mit verschiedenen
709850/065/,
Hautkrankheiten, wie Wunden und Lupus erythematodes, oder bei
Patienten mit Magengeschwüren, Hornhautgeschwüren (ülcus corneae),
Leberzirrhose oder Bindegewebschondrom, daß außerdem Schwankungen auftreten in den Synovialflüssigkeiten von Patienten mit rheumatoider
Arthritis oder in Granulocyten von Patienten mit essentieller Hypertension, Arteriosklerose oder Diabetes mellitus. Erfindungsgemäß
wurde festgestellt, daß der Collagenasespiegel in Seren von Patienten mit einigen Erkrankungen des Leber-Galle-Bereiches
erhöht sind. Die Messung der Collagenaseaktivität bildet daher ein sehr wertvolles Diagnosehilfsmittel zur Diagnose der
vorstehend erwähnten Krankheiten und damit eng zusammenhängender Erkrankungen.
Die Messung der Collagenaseaktivität wurde bisher durchgeführt,
indem Collagenase enthaltende Proben mit Collagen, das aus Tierhaut oder Tiersehnen extrahiert wurde, in Berührung gehalten
und die Hydrolyserate gemessen wurde. Diese übliche Methode zeigt jedoch folgende Nachteile : (1) Natürliches Collagen hat sehr
hohes Molekulargewicht und eine sehr breite Molekulargewichtsverteilung. Es ist daher sehr schwierig, natürliches Collagen
mit konstantem Molekulargewicht zu erhalten und das Herstellungsverfahren für diese Substanz ist äußerst kompliziert.
(2) Die Eigenschaften von Collagen schwanken in Abhängigkeit von der Art und dem Körperteil des Tiers, aus dem es extrahiert
wird. (3) Es ist normalerweise unerläßlich, daß Collagenase enthaltende Proben, in denen die Aktivität bestimmt werden soll,
mit cc«-Macrόglobulin, einem der Serumproteine, verunreinigt
sind. Dieses ccp-Macroglobulin behindert jedoch die Messung der
Collagenaseaktivität, bei der natürliches Collagen als Substrat verwendet wird. Das übliche Verfahren ist daher als exaktes Meßverfahren
zur Messung der Collagenaseaktivität nicht geeignet. Um den vorstehend erläuterten dritten Nachteil zu beseitigen,
hat man versucht, den Komplex aus Collagenase und inhibierenden Substanzen, wie (x.~~Vte.cT:ogXola\il.in zu behandeln, um die Aktivität
der Collagenase wiederherzustellen. Dieser Versuch ist jedoch fehlgeschlagen, weil Nebenreaktionen auftraten und die erhaltenen
Aktivitäten weitgehend schwankten.
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" * jjT 2 7 Q 2 b b 9
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die vorstehend erläuterten Nachteile der üblichen Methode zu beseitigen und neue
synthetische Peptide als Substrate anstelle von natürlichem Collagen zur Verfügung zu stellen, die eine exakte Messung der
Collagenaseaktivität ermöglichen.Der Erfindung liegen Untersuchungen
im Hinblick auf die spezifische Stelle der Spaltung durch Collagenase und den Zusammenhang zwischen Collagen und Collagenase
zugrunde. Dabei wurden erfindungsgemäß neue Peptidderivate aufgefunden, die hochspezifisch gegenüber Collagenase sind und die
während der Aktivitätsmessung nicht durch eCp-Macroglobulin beeinträchtigt
werden.
Erfindungsgemäße neue Peptidderivate sind Verbindungen der folgenden
allgemeinen Formel :
A-Pro-B-Gly-C-Ala-Gly-E
in der A eine hydrophobe, neutrale oder saure chromophore Gruppe, B einen Aminosäurerest, C He oder Leu (Isoleucin oder Leucin),
E GIn-D-Arg-OH oder D-Arg-OH bedeuten und in der alle Aminosäurereste,
ausgenommen GIy, L-Konfiguration aufweisen, wenn nichts
anderes angegeben ist.
Diese Peptidderivate setzen unter der Einwirkung von Collagenase hydrophobe Tripeptidderivate mit der Sequenz A-Pro-B-Gly-OH frei.
Da diese Tripeptidderivate hydrophob sind und Cbromophore aufweisen,
können diese Tripeptidderivate leicht mit geeigneten organischen Lösungsmitteln, wie Äther, Äthylacetat und n-Butanol,
extrahiert und genau bestimmt werden, indem lediglich der Extrakt der Kolorimetrie unterworfen wird.
Es wurde darüber hinaus gefunden, daß die erfindungsgemäßen neuen Peptidderivate auch andere allgemeine unterschiedliche charakteristische
Eigenschaften aufweisen, die für ein Substrat erforderlich sind, beispielsweise im Hinblick auf die Hydrolyserate,
Stabilität und den linearen Zusammenhang zwischen der Menge des hydrolysieren Substrats und der des Enzyme und zwischen der
Menge des hydrolysierten Substrats und der Inkubationszeit. Da
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- * g 27Q2699
das erfindungsgemäße Verfahren darin besteht, daß Peptidderivate als Substrate verwendet werden und die freigesetzten Tripeptidderivate
extrahiert und kolorimetrisch bestimmt werden, ist es für die Substrate spezifisch erforderlich, daß sie ziemlich gute Löslichkeit
haben und leicht und ausreichend mit organischen Lösungsmitteln extrahiert werden, welche andere in den Proben vorliegende
Substanzen, die ähnliche oder gleiche Absorption wie die Tripeptidderivate haben, praktisch nicht extrahieren, vorzugsweise mit
Äthylacetat. Die erfindungsgemäßen Peptidderivate gentigen außerdem
zufriedenstellend den vorstehend erläuterten spezifischen Anforderungen. Mit Hilfe der Erfindung wird daher ein ausgezeichnetes
Verfahren zur Bestimmung der Collagenaseaktivität zugänglich.
Zu den chromophoren Gruppen, die an die Aminogruppe des N-endständigen
Aminosäurerests (Pro) gebunden sind, gehören beliebige hydrophobe,neutrale oder saure Chromophore, beispielsweise eine
2,4-Dinitrophenyl- t 5-Dimethylamino-l-naphthalinsulfony1-, p-Phenylazobenzyloxycarbonyl-,
p-Nitrobenzyloxycarbonyl-, p-(4-Hydroxyl-naphthylazo)-benzolsulfonyl-
und p-Phenylazobenzoylgruppe. Unter diesen Chromophoren wird die 2,4-Dinitrophenylgruppe im Hinblick
auf die Handhabung am meisten bevorzugt.
Nach den von der Anmelderin durchgeführten Versuchen über die Eigenschaften
von zahlreichen Arten der erfindungsgemäß synthetisierten
Peptidderivate beeinflußt der Teil B der allgemeinen Formel praktisch nicht die sogenannte Substratspezifität (d.h.
die Spezifität gegenüber Collagenase), so daß B beliebige Aminosäurereste umfassen kann. Die in Teil B vorliegende Aminosäure
ist normalerweise eine «,-Aminosäure mit bis zu 15 Kohlenstoffatomen,
die in Proteinen vorkommt, beispielsweise Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Serin, Threonin, Prolin, Phenylalanin, Tyrosin,
Tryptophan, Lysin, Arginin, Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure und Glutamin. Der Anteil B beeinflußt jedoch die Löslichkeit
der Substrate und die Extraktion der freigesetzten Tripeptidderivate. Im Hinblick auf diese Tatsache werden neutrale
Aminosäurereste, insbesondere die Reste von Alanin, Prolin, Leucin und Glutamin, bevorzugt. Unter diesen bevorzugten Aminosäureresten
werden die Reste von Alanin, Leucin und Glutamin mit dem
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grüßten Erfolg eingesetzt. Der Anteil C der allgemeinen Formel
1st ein Leucin- oder Isoleuclnrest und beide Reste verleihen den Peptldderlvaten praktisch die gleichen Eigenschaften. Im Hinblick
auf die Spezlfität gegenüber Collagenase ist jedoch ein
Peptidderivat, welches als Anteil C einen Isoleucinrest aufweist,
vorzuziehen.
Der Anteil E der allgemeinen Formel ist der Rest von D-Arglnin
oder von Glutamyl-D-arginin. Beide Reste verleihen den Peptidderivaten
praktisch gleiche Eigenschaften, jedoch sind Peptldderivate,
die den Rest von Glutamyl-D-arginin aufweisen, im Hinblick auf die Spezifität gegenüber Collagenase besser. Die Peptidderivat
e, die einen leucinrest als Teil C oder einen D-Arginin-Rest
als Teil E aufweisen, werden durch Collagenase in guter Rate hydrolysiert und sind daher besonders gut geeignet als Substrate
für eine rasche Messung der Collagenaseaktivität.
Im Hinblick auf sämtliche Eigenschaften sind als die besten Substrate
unter den erfindungsgemäßen Peptidderivaten die Verbindungen zu bezeichnen, die eine 2,4-Dinitrophenylgruppe als Anteil
A, einen Alanin-, Leucin-, Prolin- oder Glutaminrest, insbesondere einen Alanin-, Leucin- oder Glutaminrest, als Anteil B,
einen Isoleucinrest als Anteil C und einen Rest von Glutamyl-D-arginin
als Anteil E aufweisen.
Die erfindungsgemäßen neuen Peptidderivate lassen sich in einfacher
V/eise mit Hilfe von Methoden, die in der Peptidchemie bekannt sind, synthetisieren. So können sie durch Entfernen der
maskierenden Gruppen aus Verbindungen der Formeln
X A-Pro-B-Gly-C-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OR
A-Pro-B-Gly-C-Ala-Gly-D-Arg-OR
erhalten werden, worin X eine maskierende Gruppe für die Guanidinogruppe
des Argininrests und R eine maskierende Gruppe für die Carboxylgruppe des Argininrests bedeuten. (Die Formeln umfas-
70985U/0S5/,
sen Verbindungen, in denen der Aminosäurerest des Teils B eine oder mehrere funktioneile Seltengruppen aufweist, die mit geeigneten
maskierenden Gruppen maskiert sind.
Die für die Guanidinogruppe geeignete maskierende Gruppe kann unter für diesen Zweck bekannten Gruppen gewählt werden und kann
beispielsweise eine Tosyl-, Nitro-, Benzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl-,
2-(Isopropyloxycarbonyl)-3,4»5,6-tetrachlor-"benzoylgruppe
sein, vorzugsweise eine der drei zuerst genannten Gruppen. Die Carboxylgruppe kann maskiert werden, indem sie in
eine Estergruppe, wie eine Benzyl-, t-Butyl-, p-Nitrobenzyl-
oder p-Methoxybenzylestergruppe, insbesondere eine Benzyl- oder t-Butylestergruppe, übergeführt wird.
Die maskierenden Gruppen werden nach bekannten Methoden, die von der Art der maskierenden Gruppen und, falls solche vorliegen,
von der Art der maskierenden Gruppen der funktioneilen Seitengruppen, abhängen. Es ist wichtig, daß lediglich die maskierenden
Gruppen entfernt werden,ohne daß andere Teile der Verbindung durch
diese Eliminierungsreaktion angegriffen werden. Als Eliminierungsmethode
wird die Behandlung mit Fluorwasserstoff bevorzugt, well dabei beide maskierende Gruppen, X und R, gleichzeitig eliminiert
werden.
Die Behandlung mit Fluorwasserstoff wird gewöhnlich unter wasserfreien
Bedingungen und bei einer Temperatur von -70 bis +20 C, vorzugsweise -10 bis +1O0C, durchgeführt. Die Behandlung erfolgt
in Gegenwart oder in Abwesenheit eines Lösungsmittels, wird jedoch
vorzugsweise in überschüssigem Fluorwasserstoff vorgenommen, der als Lösungsmittel dienen kann. Die Behandlung wird vorzugsweise
in gleichzeitiger Gegenwart einer geringen Menge an Anisol oder Phenol vorgenommen, um Nebenreaktionen zu verhindern. Die Isolierung
des entmaskierten Produkts kann nach üblicher Weise erfolgen.
Die als Ausgangsverbindungen verwendeten maskierten Peptidderivate
können nach in der Peptidchemie bekannten Methoden synthetisiert werden, beispielsweise durch stufenweise Verlängerung, durch
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Kondensation von Bruchstücken und durch eine Kombination dieser
Methoden. Wenn die Aminosäuren, die dem Teil B entsprechen, funktionelle
Seitengruppen aufweisen, so können sie eingesetzt werden, nachdem die funktioneilen Gruppen in Üblicher V/eise maskiert
worden sind. Diese maskierenden Gruppen für die funktioneilen Seitengruppen werden nach, vor oder gleichzeitig mit der Eliminierung
der maskierenden Gruppen für den Argininrest entfernt, was von der Art der maskierenden Gruppen der funktioneilen Seitengruppen
abhängt. Die chomophore Gruppe kann zu Beginn der Peptidsynthese in das N-endständige Prolin eingeführt werden oder sie kann in
das Fragment oder das endgültige Peptid, welches den N-endständigen Prolinrest aufweist, dessen Aminogruppe mit üblichen maskierenden
Gruppen für Aminogruppen maskiert ist, wie einer t-Butyloxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl- oder t-Amyloxycarbonylgruppe,
eingeführt werden, indem die maskierende Gruppe für die Aminogruppe durch das Chromophor ersetzt wird.
Die Collagenaseaktivität kann in gleicher Weise wie bei natürlichem
Collagen ohne jegliche Schwierigkeit unter Verwendung der erfindungsgemäßen Peptidderivate als Substrate gemessen werden. Zuerst
wird eine wässrige Lösung des Peptidderivats mit geeigneter Konzentration hergestellt. Der optimale pH-Wert der Substratlösung
variiert leicht in Abhängigkeit von der Art des verwendeten Substrats und liegt gewöhnlich im Bereich von 6 bis 9, vorzugsweise
7 bis 8.
Die Collagenaseaktivität wird bestimmt, indem das Substrat mit Collagenase oder einer Probe, die Collagenase enthält, in einem
wässrigen Medium, vorzugsweise in einer Pufferlösung, wie Tris-HCl-Puffer,
bei 30 bis 450C, gewöhnlich bei 35 bis 400C, während
einer gewissen Zeit in Berührung gehalten wird und die Collagenase in üblicher Welse desaktiviert wird. Die Inkubationszeit
bestimmt sich in Abhängigkeit von der Menge des Substrats und Enzyms. Die Menge der freigesetzten Verbindung A-Pro-B-Gly-OH
wird in einfacher Weise bestimmt, indem die Verbindung mit einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie Ä'thylacetat, Äther
oder n-Butanol extrahiert und die Absorption des Eluats bzw. Extrakts bei einer für das jeweilige Chromophor geeigneten Wellen-
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länge gemessen wird,"beispielsweise bei 365 nm für 2,4-Dinitrophenyl,
389 nm für die p-(4-Hydroxy-l-naphthylazo)-benzolsulfonyl-
und 325 nm für die p-Phenylazobenzoylgruppe.
Da die erfindungsgemäßen Peptidderivate hochspezifisch gegenüber Collagenase sind, läßt sich die Collagenaseaktivität unter Verwendung
dieser Verbindungen als Substrate in üblichen Collagenase enthaltenden Proben, wie Serum und Synovlalflüssigkeit, genau
messen. Wenn jedoch die Proben andere nicht spezifische Peptidasen in hoher Konzentration enthalten, wie es bei Proben aus dem
Gewebe der Leber oder Niere der Fall ist, so hat sich gezeigt, daß die Substrate durch die anderen nicht spezifischen Peptidasen
partiell hydrolysiert werden und daß die Genauigkeit der Bestimmung
der Collagenaseaktivität nicht immer annehmbar ist. Für diesen Fall werden erfindungsgemäß weitere Peptidderivate zur Verfügung
gestellt, die empfindlich gegenüber nicht spezifischer Peptidase, nicht jedoch empfindlich gegenüber Collagenase sind, so
daß die vorstehend erläuterten Nachteile beseitigt werden, indem diese weiteren Peptidderivate als Vergleichssubstrate eingesetzt
werden.
Die Erfindung betrifft daher neue Peptidderivate der gleichen Struktur der vorstehend erläuterten ersten Peptidderivate, mit
der Abänderung, daß der Prolinrest am N-endständigen Ende fehlt. Diese erfindungsgemäßen Peptidderivate werden durch die allgemeine
Formel
A-B-Gly-C-Ala-Gly-E
dargestellt.
Diese erfindungsgemäßen Peptidderivate der zweiten Gruppe lassen sich ebenfalls in einfacher Weise nach den vorstehend erläuterten
Methoden herstellen.
Bei der Messung der Collagenaseaktivität werden diese Peptidderivate
der zweiten Gruppe als Vergleichssubstrate für die Peptidderivate der ersten Gruppe eingesetzt. Dabei werden diese zweiten
Peptidderivate mit Proben in Berührung gebracht, die Collagenase und nicht spezifische Peptidasen enthalten, die das Chromophor
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enthaltenden Feptldfragmente werden extrahiert und die Absorption
des Extrakts wird gemessen. Das gesamte Bestimmungsverfahren wird unter den gleichen Bedingungen wie im Fall der ersten Peptidderivate durchgeführt. Die exakte Collagenaseaktivität wird dabei
ohne Störung durch nicht spezifische Peptidasen berechnet, indem die unter Verwendung der zweiten Peptidderivate als Substrate
erhaltene Absorption von der Absorption subtrahiert wird, die unter Verwendung der ersten Peptidderivate erhalten wurde.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele ausführlicher erläutert.
In den Beispielen werden folgende Abkürzungen verwendet :
BOC
DNP
PAB
NABS -OBzI -OEt -OSu WSCI DMF THF TosOH
t-Butyloxycarbonyl,
214-Dinitrophenyl,
p-Phenylazobenzoyl,
ρ-(4-Hydroxy-1-naphthylazo)-benzolsulfony1,
1-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodlimid f
p-Toluolsulfonsäure
Die in den Beispielen verwendete Collagenase wurde aus Kulturmedien aus Kaulquappen-Hautexplantaten nach der in"Biochem.
Biophys. Acta,"26£, S. 564 (1972) beschriebenen Methode hergestellt. Nicht spezifische Peptidasen wurden erhalten, indem 5 ml
eines frischen Humanserums von Erwachsenen der Chromatographie an einer kalibrierten Kolonne von superfeinem Gel Sepbadex-G-200
unterworfen wurde,die mit 0,05 m Tris-HCl-Puffer vom pH 7,5 mit
einem Gehalt an 0,15 m NaCl und 5mM CaCl2 kalibriert worden war,
und die Eluatfraktionen aufgefangen wurden, die Molekulargewichten von 100 000 bis 180 000 entsprachen.
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Beispiel 1
(DNP-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)
(DNP-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)
D-Arg(N02) (16,4 g; 0,075 Mol), p-Toluolsulfonsäure (31,4 g;
0,165 Mol) und Benzylalkohol (37 ml) wurden in 150 ml Chloroform suspendiert und die Suspension wurde 5 Stunden bis zur Bildung
einer klaren Lösung gertickflußt.
Diese Lösung wurde mit 100 ml Toluol versetzt und dann das Gemisch
unter vermindertem Druck destilliert. Zu dem Rückstand wurden 150 ml Chloroform gegeben und das Gemisch wurde wieder 5 Stunden
gertickflußt. Zu der erhaltenen Lösung wurden 2 mal 100 ml Toluol zugesetzt, dann wurde sie unter vermindertem Druck destilliert
und der Rückstand wurde durch Zugabe von trockenem Äther verfestigt. Der erhaltene Peststoff wurde abfiltriert, mit trockenem
Äther gewaschen und aus einem Gemisch aus Methanol und trockenem Äther umkristallisiert. Die Kristalle wurden 12 Stunden über
Phosphorpentoxid getrocknet.
Ausbeute : 42 g (86
- 12,0° (c=3, Pyridin)
P. : 132° - 1350C
Boc-Gln (5,0 g; 20 mMol) und D-ATg(NO2)-OBzI.2TosOH (13,1 g;
20 mMol) wurden in einem Gemisch aus 5 ml DMF und 20 ml TBZF suspendiert und zu der Suspension wurden bei -100C 2,8 ml Triäthylamin
(20 mMol), 2,7 g (20 mMol) 1-Hydroxybenztriazol und
3,6 ml (20 mMol) WSCI gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde
bei -100C und danach 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Das in dem Reaktionsgemisch vorliegende Tetrahydrofuran wurde unter vermindertem Druck verdampft und das erhaltene Gemisch
wurde in 300 ml Chloroform gelöst und die erhaltene Lösung wurde nacheinander mit 1 η Chlorwasserstoff säure (3 x 100 ml), 100 ml
Wasser und 3 χ 100 ml einer 10 #igen Natriumcarbonatlösung und
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2 χ mit 100 ml Wasser gewaschen. Das in dem gewaschenen Gemisch
vorliegende Chloroform wurde unter vermindertem Druck verdampft und der Rückstand wurde durch Zugabe von Äther kristallisiert.
Die Kristalle wurden abfiltriert, mit V/asser und Äther gewaschen,
aus einem Methanol-Äther-Gemisch umkristallisiert und 12 Stunden über Phosphorpentoxid getrocknet.
Ausbeute : 8,5 g (78 f*)
F. : 147° - 1540C (Zersetzung)
° + 5'3° ( C=1' DMF)
Elementaranalyse C H
Berechnet für C25H35O8N7 · 1/2 HgO : 50,54 6,64 17,94
Gefunden : 50,67 6,56 17,91
50 ml einer 25 #igen Lösung von Bromwasserstoff in Essigsäure
wurden unter Kühlen zu 12,4 g (40 mMol) Z-Ala-Gly-OEt gegeben
und die erhaltene Lösung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt.
Äther wurde der Lösung zugesetzt, um einen Niederschlag zu erzeu gen. Dieser wurde mit Äther gewaschen und über Natriumhydroxid
getrocknet. Der so erhaltene Peststoff wurde in 30 ml DMP gelöst und die erhaltene Lösung wurde mit Triäthylamin auf einen pH-Wert
von 7 bis 7,5 eingestellt, mit 14,4 g (44 mMol) Boc-Ile-OSu versetzt und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Dem Reaktionsgemisch wurden 200 ml Wasser zugesetzt und die erhaltene
Lösung wurde 3 mal mit Äthylacetat (200 ml, 150 ml, ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde nacheinander mit
1 η Chlorwasserstoffsäure, Wasser, 5 #iger Natriumhydrogencarbonatlösung
gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck verdampft
und der Rückstand wurde durch Zugabe von Äther kristallisiert, aus einem Äthylacetat-Äther-Gemisch umkristallisiert und
7098S0/065/,
bei Raumtemperatur 12 Stunden über Phosphorpentoxid getrocknet.
Ausbeute : 13,0 g (84 ?°)
| P. : | 148, | 5° | - 1490C | Äthanol) | 8 | H | N | \% |
| -50, | 9° | (C=2,2, | C | 8 | ,58 | 10, | 85 | |
| Elementaranalyse | : 55,79 | ,74 | 10, | 80 | ||||
| Berechnet für C1 | 8H, | 55O6N5 | : 55,54 | |||||
| Gefunden | ||||||||
Boc-Ile-Ala-Gly-OEt (3,9 g; 10 mllol) wurde in 20 ml Dioxan gelöst
und eine 1 η Natriumhydroxidlösung (11 ml; 11 mMol) wurde tropfenweise
unter Rühren und unter Kühlung zu der Lösung zugefügt. Die erhaltene Lösung wurde noch 1 Stunde gerührt und mit 1 η Chlorwasserstoffsäure
neutralisiert und das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck verdampft. Die erhaltene wässrige Schicht
wurde mit 1 η Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und 2 mal mit Äthylacetat (100 ml, 50 ml) extrahiert.
Die abgetrennte organische Schicht wurde mit einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet. Das Lösungsmittel der getrockneten Lösung wurde unter vermindertem Druck verdampft und der Rückstand wurde durch
Zugabe von Äther kristallisiert.Die Kristalle wurde abfiltriert, aus Äthylacetat-Äther umkristallisiert und 12 Stunden bei Raumtemperatur
über Phosphorpentoxid getrocknet.
Ausbeute : 3,0 g (84 $>)
| P. : | 156° - | für Cie | 1580C | Äthanol) | 52 | C | 8 | H | N# |
| -42,3° | (C=I,6, | 52 | ,15 | 8 | ,21 | 11,40 | |||
| Elementaranalyse | •1/2 H2O : | ,06 | ,14 | 11,52 | |||||
| Berechnet | -,H29O6N5 | • • |
|||||||
| Gefunden | |||||||||
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27ü2blJ9
BOc-GIn-D-ATg(NOp)-OBzI (5,5 g; 10 mMol) wurde unter Kühlung
zu 20 ml Trifluoressigsäure gegeben und die erhaltene Lösung wurde 5 Stunden unter Kühlung gerührt und danach v/eitere 45 Minuten
bei Raumtemperatur gerührt. Eine 6 η Lösung von Chlorwasserstoffsäure in Dioxan (1,7 ml; 10 mMol) wurde zu dem Reaktion3gemisch
gegeben und überschüssige Trifluoressigsäure wurde unter vermindertem
Druck verdampft. Der Rückstand wurde durch Zugabe von Äther verfestigt, mit Äther gewaschen und über Natriumhydroxid unter
vermindertem Druck getrocknet.
Der erhaltene Feststoff wurde in einem Gemisch aus DMP und THP
(10 ml/30 ml) gelöst und die Lösung wurde bei -1O0C mit N-He thyI-morpholin
auf einen pH-Wert von 5 eingestellt. 3,6 g (10 mMol) Boc-He-Ala-Gly-OH, 2 g (15 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol und 2,7 ml
(15 mMol) WSCI wurden dem vorstehend beschriebenen Gemisch nacheinander zugesetzt. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei -10 C und
danach 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck verdampft und zu dem Rückstand
wurden 100 ml 1 η Chlorwasserstoffsäure zugesetzt. Der ausgefällte
Peststoff wurde abfiltriert, mit Wasser, 5 #igem Natriumhydrogencarbonat
gewaschen und unter Erwärmen In einem DMF-Methanol-Gemisch
suspendiert. Zu der Suspension wurde Äthylacetat zugesetzt und der ausgefällte Peststoff wurde abfiltriert und 12 Stunden
über Phosphorpentoxid getrocknet.
Ausbeute : 6,8 g (86 %)
P. : 217° - 2210C (Zersetzung)
ßxj^ + 7,7° (C=O, 3, Hexame thy lphosphory ltriamid)
Elementaranalyse C H N£
Berechnet für C54H54 0H11Io ' 1^2 H2° : 51»85 7'04 17 »78
Gefunden : 51,68 6,98 17,73
H-Pro-Gln-Gly-OH (2,7 g; 9 mMol) wurde unter Eiskühlung in 50 ml
709850/0664
einer 5 #igen Natriumhydrogencarbonatlösung gelöst und zu der
Lösung wurden 2,4 g (13 mMol) Dinitrofluorbenzol in Aceton
(20 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde unter Eiskühlung gerührt und danach über Nacht bei Raumtemperatur gerührt.
Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck verdampft, der Rückstand mit 6 η Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-V/ert von
2 eingestellt und mit 200 ml Wasser verdünnt. Die Lösung wurde durch eine mit einem hochporösen Harz (Diaion HP-20) gefüllte
Säule geleitet, die dann mit Wasser gewaschen und mit Methanol eluiert wurde. Die erhaltene methanolische Lösung wurde unter
vermindertem Druck konzentriert und zu dem Rückstand wurde Äther gegeben. Der ausgefällte Feststoff wurde abfiltriert, aus einem
Methanol-Äther-Gemisch umkristallisiert und 12 Stunden über Phosphorpentoxid getrocknet.
| Ausbeute : | 3,0 g | für C | (71 *) | (Zersetzung) | C | 4 | H | H | 1% |
| F. : | 205° - | He-Al | 2O7°C | 0, DMF) | N6 : 46,35 | 4 3zl |
,75 | 18, | 02 |
| -292,4 | ° (C=I, | : 46,20 | ,94 | 18, | 13 | ||||
| Elementaranalyse | |||||||||
| Berechnet | I8H22O9 | ||||||||
| Gefunden | |||||||||
BoC-IIe-AIa-GIy-GIn-D-ATg(NO2)-OBzI (1 g; 1,3 mMol) wurde unter
Kühlen zu 5 ml Trifluoressigsäure gegeben und die Lösung wurde 10 Minuten unter Kühlen und danach 50 Minuten bei Raumtemperatur
gerührt. Zu dem Reaktionsgemisch wurde 0,5 ml (3 mMol) 6 η Chlorwasserstoffsäure
in Dioxan gegeben und die überschüssige Trifluoressigsäure wurde unter vermindertem Druck verdampft. Der Rückstand
wurde durch Zugabe von Äther verfestigt, mit Äther gewaschen und über Natriumhydroxid getrocknet.
Der erhaltene Feststoff wurde in 20 ml DMF gelöst und 0,6 g (1,3 mMol) DNP-Pro-Gln-Gly-OH, 2,10 mg (1,6 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol
709850/0654
und 0,29 ml (1,6 mMol) WSCI wurden nacheinander bei -100C zugesetzt.
Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei -1O0C gerührt und
schließlich über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurde 1 η Chlorwasserstoffsäure zugesetzt, um einen Niederschlag auszufällen.
Der Niederschlag wurde abfiltriert und 12 Stunden bei Raumtemperatur über Phosphorpentoxid getrocknet.
Ausbeute : 1,3 g (89 SO
P. : 247° - 2500C (Zersetzung)
0 -68,3° (C=O,5, Hexamethylphosphoryltriamid)
Elementaranalyse n „
Berechnet für C47H66°17N16 : 5O»08 5,90 19,88
Gefunden : 50,08 6,12 19,52
DNP-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg(N02)-OBzl (1,3 g; 1,2 mMol)
wurde in Gegenwart von 2 ml Anisol in 30 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff gelöst und die Lösung wurde 1 Stunde bei O0C gerührt.
Nach dem Entfernen des überschüssigen Fluorwasserstoffs durch Verdampfen unter vermindertem Druck wurde der Rückstand durch Zugabe
von Äther verfestigt.
Der Feststoff wurde mit Äther gewaschen und in Essigsäure gelöst
und die Lösung wurde durch eine mit stark basischem Anionenaustauscherharz (Dowex 1x2, Acetatform) gefüllte Säule geleitet.
Nach dem Verdampfen der Essigsäure aus der abströmenden Lösung wurde der Rückstand mit Äther verfestigt. Der Feststoff wurde abfiltriert,
aus Essigsäure-Äther umkristallisiert und 24 Stunden bei Raumtemperatur über Phosphorpentoxid getrocknet.
Ausbeute : 1,0 g (81 #)
F. : 230° - 233,50C (Zersetzung)
20 _233,2°C (C=O,6, 50 # Essigsäure)
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Elementaranalyse C H
Berechnet für C40H61O15 · CH5COOH.HgO : 47,14 6,31 19,64
Gefunden : 46,90 6,64 19,40
(NABS-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)
18,5 g (55 mMol) Gly-OBzl.TosOH wurden in gleicher Weise wie in Beispiel
1, Absatz 2 neutralisiert und mit Boc-Gln (12,3 g; 50 mMol)
gekuppelt.
Ausbeute : 15,7 g (80 56) P. : 126° - 1270C
f -9,6° (C=I, DMF)
11,8 g (0,03 Mol) Boc-Gln-Gly-OBzl wurden von der N-maskierenden
Gruppe befreit und in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 5 mit 6,5 g (0,03 Mol) Boc-Pro-OH gekuppelt.
| Ausbeute : F. : |
8,0 152 -41 |
g (54 %) ° - 154°C ,1° (C=O,5, |
DMF) | C ,22 |
7 | ,02 | 11, | 32 |
| ementaranal Berechnet |
Lyse für |
C24H54O7N4 | • 1/4 H2O | ,14 | 6 | ,73 | 11, | 30 |
| Gefunden | ||||||||
| ι : 58 | ||||||||
| : 58 | ||||||||
4,0 g (8,2 mMol) Boc-Pro-Gln-Gly-OBzl wurden in 60 ml 90 #igem
Methanol gelöst und in Gegenwart einer geringen Menge Pd-C (entsprechend einer Löffelfüllung) wurde während 6 Stunden gasförmiger
Wasserstoff durch die Lösung geleitet. Nach dem Entfernen des
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Katalysators durch Filtration wurde das Piltrat unter vermindertem
Druck konzentriert und der Rückstand wurde durch Zugabe von Äther verfestigt und· aus Methanol-Äther umkristallisiert.
Ausbeute : 2,9 g (91 %).
1,2 g (1,5 mMol) BoC-IIe-AIa-GIy-GIn-D-ATg(NO2)-OBzI wurden in
gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 5 von der N-maskierenden Gruppe befreit und mit Boc-Pro-Gln-Gly-OH (0,6 g; 1,5 mMol)
gekuppelt.
| Ausbeute : | 1,1 | t Für | g (69 1>) | c | I | 76 | 6 | H | H | 02 |
| F. : | 224° | - 2290C (Zersetzung) | 50, | 55 | 6 | ,95 | 18, | 85 | ||
| -6,8 | 0 (0=0,3, DMP) | 50, | ,55 | 17. | ||||||
| Elementaranalyse | ||||||||||
| Berechnei | C46H72015N14'3/2N2° * | |||||||||
| Gefunden | • • |
|||||||||
300 mg (0,28 mMol) BOc-PrO-GIn-GIy-IIe-AIa-GIy-GIn-D-ATg(NO2)-OBzI
wurden 1 Stunde bei O0C in Gegenwart von 0,5 ml Anisol mit 7 ml
Fluorwasserstoff behandelt. Das Reaktionsgemische wurde wie in Beispiel
1,Abschnitt 8 aufgearbeitet, wobei ein H-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH
enthaltender Rückstand gebildet wurde. Der Rückstand wurde in 5 ml Wasser gelöst und 110 mg (1,3 mMol)
Natriumhydrogencarbonat und 240 mg (0,7 mMol) p-(4-Hydroxy-lnaphthylazo)-benzolsulfonylchlorid
in 5 ml Tetrahydrofuran wurden unter Kühlen zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden bei
Raumtemperatur gerührt. Nach dem Entfernen des THP durch Verdampfen unter vermindertem Druck wurde das Reaktionsgemisch mit
Äthylacetat extrahiert. Die verbliebene Wasserschicht wurde mit einer großen Menge an V/asser verdünnt und durch eine mit hochporösem
Harz (Diaion HP-20) gefüllte Säule geleitet, die mit Wasser gewaschen und mit 90 tigern Methanol eluiert wurde.
709850/0654
Das Eluat wurde zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde
in 50 #iger Essigsäure gelöst und durch eine mit stark basischem Anionenaustauscherharz (Dowex 1x2, Acetatform) gefüllte Säule
geleitet, die mit 50 #iger Essigsäure eluiert wurde.
Ausbeute : 190 mg (57 $>)
P. : 230° - 2390C (Zersetzung)
°8 -84,2° (C=O,5, 50 # Essigsäure)
Elementaranalyse C H NSi
Berechnet für C50H69O14N15S.CH5COOH.4H2O : 49,24 6,44 16,57
Gefunden : 49,11 6,34 16,77
Beispiel 3
(PAB-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)
(PAB-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)
400 mg (1,3 mMol) H-Pro-Gln-Gly-OH wurden in 5 ml Wasser gelöst
und dazu wurden 220 mg (2,6 mMol) Natriumhydrogencarbonat und 320 mg (1,3 mMol) p-Phenylazobenzoylchlorid in 5 ml THP unter
Kühlung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden bei Raumtem
peratur gerührt. Das in dem Gemisch vorliegende Tetrahydrofuran wurde unter vermindertem Druck verdampft und die erhaltene wässri
ge Lösung wurde mit 1 η Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetat
schicht wurde mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene konzentriert.
Der Rückstand wurde aus einem Methanol-Äther-Gemisch umkristallisiert.
Ausbeute : 360 mg (53 $>)
F. : 189° - 1940C (Zersetzung)
^ -2,0° (C=O,5, DMP)
7O9850/0S54
Gefunden : 55,61 5,48 15,33
200 mg (0,26 mMol) BoC-IIe-AIa-GIy-GIn-D-ATg(NO2)-OBzI wurden
wie in Beispiel 1, Abschnitt 5 von der N-maskierenden Gruppe befreit
und mit 130 mg (0,26 mMol) PAB-Pro-Gln-Gly-OH gekuppelt.
Ausbeute : 230 mg (75 #)
200 mg (0,17 mMol) PAB-PrO-GIn-GIy-IIe-AIa-GIy-GIn-D-ATg(NO2)-OBzI
wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 8 mit Fluorwasserstoff
behandelt.
Ausbeute : 150 mg (80 #)
P. : 196° - 2050C (Zersetzung)
? +34,9° (C=O,4, 50 £ Essigsäure)
Beispiel 4
(DNP-Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)
(DNP-Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)
6,2 g (0,02 Mol) Z-Ala-Gly-OEt wurden in gleicher Weise wie in
Beispiel 1, Abschnitt 3 von der maskierenden Gruppe befreit und mit Boc-Leu-OSu (6,6 g; 0,02 Mol) gekuppelt.
Ausbeute : 4,7 g (61
-21,6° (C=O,8, DMP)
P. : 139° - 1420C
7098B0/0654
Elementaranalyse Berechnet für Gefunden
| 55 | ,79 | 8, | 58 | 10, | 85 |
| 55 | ,41 | 8, | 73 | 11, | 01 |
4,5 g (0,012 Mol) Boc-Leu-Ala-Gly-OEt wurden in 20 ml Methanol
gelöst und in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 4 mit Natriumhydroxid behandelt.
Ausbeute : 4,0 g (92 #)
Ausbeute : 4,0 g (92 #)
2,0 g (3,7 mMol) Boc-Gln-L-Arg(NO2)-OBzI wurden in gleicher
Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 5 von der N-maskierenden Gruppe
befreit und mit 1,3 g (3,7 mMol) Boc-Leu-Ala-Gly-OH gekuppelt.
| Ausbeute : 2,0 g | (70 %) | (Zersetzung) | C | 24 | 7 | H | 17 | N* |
| P. : 213 - | 2180C | DMP) | 51, | 25 | 6 5l |
,08 | 17 | .58 |
| ^7D8 +°.5 I | [C=O,4, | 51, [NO0) |
,91 | ,80 | ||||
| Elementaranalyse | O11N10-H2O : | |||||||
| Berechnet für | C34H54 | • • |
||||||
| Gefunden | ||||||||
350 mg (0,45 mMol) Boc-Leu-Ala-Gly-Gln-D-Arg(N02)-0Bzl wurden
in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 7 von der N-maskierenden Gruppe befreit und mit 210 mg (0,45 mMol) DNP-Pro-Gln-GIy-OH
gekuppelt.
Ausbeute : 450 mg (89 #)
Ausbeute : 450 mg (89 #)
709850/0654
300 mg (0,27 mMol) DNP-Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly-Gln-D-Arg(NO2)-OBzI
wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 8 mit Fluorwasserstoff behandelt.
Ausbeute : 250 mg (85 #)
F. : 221° - 2260C (Zersetzung)
*8 -256,5° (C=O,5, 50 % Essigsäure)
Elementaranalyse c H
Berechnet für C40H61O15N15-2CH3COOH-3,5H2O: 44,97 6,52
17,88
Gefunden : 45,21 6,24
17,62
Beispiel 5
(DNP-Pro-Ala-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)
(DNP-Pro-Ala-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)
630 mg (2,6 mMol) H-Pro-Ala-Gly-OH wurden in gleicher Weise wie
in Beispiel 1, Abschnitt 6 mit 600 mg (3,1 mMol) Dinitrofluorbenzol umgesetzt.
Ausbeute : 710 mg (67 #)
P. : 187 - 19O0C (Zersetzung)
ZS -423,1° (C=O,4, DMF)
480 mg (0,61 mMol) Boc-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg(NOg)-OBzI wurden
in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 7 von der N-maskierenden Gruppe befreit und mit 250 mg (0,61 mMol) DNP-Pro-Ala-Gly-OH
gekuppelt.
709850/0854
Ausbeute : 540 mg (83
270 mg (0,25 mMol) DNP-PrO-AIa-GIy-IIe-AIa-GIy-GIn-D-ATg(NO2)-OBzI
wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 8 mit Fluorwasserstoff behandelt.
Ausbeute : 220 mg (88 %)
F. : 228° - 2350C (Zersetzung)
1^ -287,5° (0=0,5, 50 £ Essigsäure)
Elementaranalyse c „
Berechnet für C38H58O14N14 .7/2 HgO : 45,73 6,56 19,65
Gefunden ' : 46,03 6,25 19,48
Beispiel 6
(DNP-Pro-Ala-Gly-Ieu-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)
(DNP-Pro-Ala-Gly-Ieu-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)
490 mg (0,63 mMol) Boc-Ieu-Ala-Gly-Gln-D-Arg(N02)-OBzl wurden in
gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 7 von der N-maskierenden Gruppe befreit und mit 260 mg (0,63 mMol) DNP-Pro-Ala-Gly-OH
gekuppelt.
Ausbeute : 590 mg (72 #)
Ausbeute : 590 mg (72 #)
250 mg (0,23 mMol) DFP-Pro-Ala-Gly-Ieu-Ala-Gly-Gln-D-ArgiNOg)-OBzI
wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 8 mit Fluorwasserstoff behandelt.
Ausbeute : 190 mg (83 #) F. : 219° - 2270C (Zersetzung)
*8 -274,7° (C=O,5, 50 % Essigsäure)
709850/0654
Elementaranalyse c „
Berechnet für C38H58O14N14-2CH3COOH-5/2H2O : 45,85 6,51
17,83
Gefunden : 46,04 6,23
17,61
Beispiel 7
(DNP-Pro-Pro-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)
(DNP-Pro-Pro-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)
670 mg (2,5 mMol) H-Pro-Pro-Gly-OH wurden in gleicher Weise wie
in Beispiel 6, Abschnitt 6 mit 560 mg (3,0 mMol) Dinitrofluorbenzol
umgesetzt.
Ausbeute : 520 mg (48 #)
P. : 155° - 1650C (Zersetzung) ^e -413,0° (C=O,4, DMP)
500 mg (0,64 mMol) BOC-IIe-AIa-GIy-GIn-D-ATg(NO2)-OBzI wurden in
gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 7 von der N-maskierenden
Gruppe befreit und mit 280 mg (0,64 mMol) DNP-Pro-Pro-GIy-OH
gekuppelt.
Ausbeute : 510 mg (73 50
Ausbeute : 510 mg (73 50
DNP-Pro-Pro-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg(NO2)-OBzI wurde in gleicher
Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 8 mit Fluorwasserstoff behandelt.
Ausbeute : 200 mg (85 %) ' J. : 233° - 2380C (Zersetzung)
/pt/28. -325,2° (C=O,5, 50 # Essigsäure)
3 709850/06S4
Elementaranalyse c „
Berechnet für C40H60O14N14^CH3COOHOH2O : 46,55 6,57
17,28
Gefunden : 46,80 6,53
17,16
Beispiel 8
(DNP-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-D-Arg-OH)
(DNP-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-D-Arg-OH)
5,5 g (8,4 mMol) D-Arg(N02)-0Bzl*2Tos0H wurde in gleicher Weise
wie in Beispiel 1, Abschnitt 2 neutralisiert und mit 5,0 g (8,4 mMol) Boc-Ile-Ala-Gly-OH gekuppelt.
Ausbeute : 4,3 g (79 #)
Ausbeute : 4,3 g (79 #)
900 mg (1,4 mMol) Boc-Ile-Ala-Gly-D-Arg(N02)-OBzl wurden in
gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 7 von der N-maskierenden Gruppe befreit und mit 580 mg (1,4 mMol) DNP-Pro-Gln-Gly-OH gekuppelt.
Ausbeute : 1,1 g (79 #)
gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 7 von der N-maskierenden Gruppe befreit und mit 580 mg (1,4 mMol) DNP-Pro-Gln-Gly-OH gekuppelt.
Ausbeute : 1,1 g (79 #)
3) DNP-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-D-Arg-OH
300 mg (0,03 mMol) DNP-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-D-Arg(N02)-0Bzl wurden
in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 8 mit Fluorwasserstoff behandelt.
Ausbeute : 160 mg (59 f°) F; : 250° - 2540C (Zersetzung)
-258,0° (C=O,5, 50 fo Essigsäure)
709850/0654
Elementaranalyse c H
Berechnet für C55H53O13N15*2CH3COOH.3/2H2O : 46,32 6,38
18,01
Gefunden : 46,21 6,22
18,35
(DNP-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)
IfO g (1,3 mMol) BoC-IIe-AIa-GIy-GIn-D-ATg(NO2)-OBzI wurden in
gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 7 von der N-maskierenden
Gruppe befreit und mit 0,6 g (1,3 mMol) DNP-Pro-Leu-Gly-OH gekuppelt.
Ausbeute : 1,35 g (93 Jl)
Ausbeute : 1,35 g (93 Jl)
1,0 g (0,9 mMol) DNP-PrO-LeU-GIy-IIe-AIa-GIy-GIn-D-ATg(NO2)-OBzI
wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 8 mit Fluorwasserstoff
behandelt.
Ausbeute : 0,75 g (79 #)
P.n : 238° - 2460C (Zersetzung)
n° -272,5° (C=O,6, 50 $ Essigsäure)
| Elementaranalyse | L14N14-4H2O : | C | m H |
NJl |
| Berechnet für ^at^qa^ | • • |
46,94 | 6,92 | 18,70 |
| Gefunden | 47,12 | 6,74 | 18,80 | |
Beispiel 10
(DNP-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)
(DNP-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)
709850/0654 ORIOINAL INSPECTED
3,1 g (8 mMol) Boc-Gln-Gly-OBzl wurden in gleicher Weise wie in
Beispiel 2, Abschnitt 3 von der Estergruppe befreit.
Ausbeute : 2,0 g (83
-7,8° (C=O,7, DMP)
F. : 114° - 1160C
3,2 g (5 mMol) Boc-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg (NO2)-OBzI wurden in gleicher
Weise v/ie in Beispiel 1, Abschnitt 7 von der N-maskierenden Gruppe befreit und mit 1,7 g (5,5 mMol) Boc-Gln-Gly-OH gekuppelt.
Ausbeute : 3,4 g (71 $>)
F. : 235° - 237,50C (Zersetzung)
^° -13,5 (C=O,5, Hexamethylphosphoryltriamid)
1,2 g (1,2 mMol) BoC-GIn-GIy-IIe-AIa-GIy-GIn-D-ATg(NO2)-OBzI wur
den in gleicher V/eise wie in Beispiel 1, Abschnitt 6 von der N-maskierenden Gruppe befreit und mit 0,4 g (2,2 mMol) Dinitrofluorbenzol
umgesetzt.
Ausbeute : 900 mg (73 #)
Ausbeute : 900 mg (73 #)
0,9 g (0,9 mMol) DNP-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg(NO2)-OBzl
wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 8 mit Fluorwasserstoff behandelt.
Ausbeute : 0,7 g (83 ^)
F. : 210° - 217° (Zersetzung) 0 -10,8° (C=O,3, 50 # Essigsäure)
709850/0654
Elementaranalyse c „
Berechnet für C,,-H1.„Ο, .Ν, , 'CHxCOOH-H0O : 45,67 6,22
J? 54 J-4 14 ί 2 ' '
20,16
Gefunden : 45,85 6,53
20,00
Beispiel 11
(DNP-Ala-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)
(DNP-Ala-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH)
1,5 g (5,4 mMol) Z-Ala-Gly-OH wurden in gleicher V/eise wie in
Beispiel 1, Abschnitt 3 mit Bromwasserstoff in Essigsäure von der maskierenden Gruppe befreit, wobei ein Niederschlag erhalten
wurde.
Der Niederschlag wurde mit 1,2 g (6,5 mMol) Dlnitrofluorbenzol in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 6 umgesetzt.
Ausbeute : 1,1 g (65 $>)
F. : 170° - 1750C (Zersetzung)
^ +78,9° (C=I,0, DMP)
400 mg (0,5 mMol) Boc-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg(NO2)-OBzI wurden
in gleicher V/eise wie in Beispiel I1 Abschnitt 7 von der N-maskierenden
Gruppe befreit und mit DNP-Ala-Gly-OH (160 mg; 0,5 mMol)
gekuppelt.
Ausbeute : 290 mg (60 #)
P. : 219° - 2280C (Zersetzung)
^ +39,4° (C=0,5, DMF)
200 mg (0,2 mMol) DNP-Ala-Gly-Ile-üla-Gly-Gln-D-Arg(N02)-0Bzl
709850/0654
wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1, Abschnitt 8 mit Fluorwasserstoff behandelt.
Ausbeute : 150 mg (85 %)
F. : 214° - 2250C (Zersetzung)
£o7p8 + 35,5° (C=O,5, 50 # Essigsäure)
4,96 mg DNP-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH·CH3COOH.HgO
wurden mit 0,1 η Natriumhydroxid neutralisiert und in 0,05 m Tris-HCl-Pufferlösung vom pH 7,5, die 0,15 m NaCl und 5 m M
enthielt, gelöst,wobei 10 ml der Substratlösung (a) einer Konzentration
von 5x10 molar gebildet wurde. Eine entsprechende Substratlösung (b) wurde in gleicher Weise unter Verwendung von
DNP-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH.CH5COOH.H2O (4,48 mg) hergestellt.
0,9 ml ^eäer der Substratlösungen wurde mit 0,88 ml einer 0,05 m
Tris-HCl-Pufferlösung vom pH 7,5, die 0,15 m NaCl und 5 m MCaCl2
enthielt, verdünnt. Die erhaltene Lösung wurde mit 0,02 ml gereinigter Collagenase vermischt und bebrütet. 0,2 ml-Anteile
des Reaktionsgemisches wurden nach 0, 10, 20, 40, 60 bzw. 120 Minuten entnommen und mit 0,5 ml 1 m Chlorwasserstoffsäure vermischt,
um die Enzymreaktion zu unterbrechen.
Die freigesetzten DNP-Peptidfragmente wurden durch kräftiges Schütteln mit 1 ml Äthylacetat-n-Butanol (1:0,15, Volumen/Volumen)
extrahiert, wonach bei 5000 bis 5000 Upm und Raumtemperatur 10 Minuten zentrifugiert wurde, um die beiden Schichten vollständig
zu trennen. Der Hydrolysegrad wurde durch Messung der Absorption der organischen Schicht bei 365 nm bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 1 aufgeführt.
709850/0684
Inkubationszeit
IO 20 40 60 120
| - 2* - 33 |
Δ | 27 | 02699 | Δ |
| TABELLE 1 | - | - | ||
| 0,018 | Substratlösung (b) | O | ||
| 0,038 | OD365 | O | ||
| Substratlösung (a) | 0,079 | 0,027 | 0,003 | |
| 0D365 | 0,107 | 0,027 | 0,002 | |
| 0,033 | 0,184 | 0,027 | O | |
| 0,051 | 0,030 | |||
| 0,071 | 0,029 | |||
| 0,112 | 0,027 | |||
| 0,140 | ||||
| 0,217 |
1 ml der in Beispiel 12 hergestellten Substratlösung (a) wurde
mit 1,0 ml einer nicht spezifischen Peptidase vermischt und die erhaltene Lösung wurde wie in Beispiel 12 aufgearbeitet. Die
Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 gezeigt.
| TABELLE 2 | Δ | |
| Inkubationszeit £i | Qin2 OD365 | — |
| 0 | 0,053 | 0,001 |
| 10 | 0,054 | 0,002 |
| 20 | 0,056 | 0,004 |
| 40 | 0,058 | 0,007 |
| 60 | 0,060 | 0,010 |
| 120 | 0,063 | |
7098B0/0854
Je 0,2 ml der Substratlösungen (a) und (b), die in Beispiel 12
hergestellt worden waren, wurden mit 0,1 ml der Synovialflüssigkeiten
von Patienten mit Osteoarthritis und rheumatoider Arthritis vermischt und 2 Stunden bei 570C inkubiert. Nach dem Unterbrechen
der Enzymreaktion durch Zugabe von 0,5 ml einer 1 m Chlorwasserstoffsäure wurden die freigesetzten DlJP-Pept idf ragmen te durch
kräftiges Schütteln mit 2 ml Äthylacetat-n-Butanol (1:0,15, Volumen/Volumen)
extrahiert und wie in Beispiel 12 aufgearbeitet und die Collagenaseaktivität bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 3 zusammengefaßt.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 3 zusammengefaßt.
709850/0654
| Diagnose | Substratlösung | 2 Std. | TABELLE | Δ | 3 | 2 Std. | 0 | Collagenaseaktivität gegen über |
Δ' | syntheti schem Sub- |
4O -markier tem ^ ' Col |
|
| OD365/O.1 ml | 0,041 | 0 | 0,041 | 0 | 0 | O Ι/Γα U | lagen (Ein heiten/ml) |
|||||
| OA | 0 Std. | 0,045 | (a) | 0,003 | 0,040 | ,002 | 0 | 0,00 | ||||
| Bezeich nung des |
OA | 0,045 | 0,043 | 0 | Substratlösung (b) | 0,038 | 0 | ,003 | neg(2) | 0,00 ' | ||
| Falls | OA | 0,042 | 0,058 | 0,017 | OD365/O.1 ml | 0,046 | 0 | 0 | 0 | 0,00 o^ | ||
| S.N. | RA | 0,045 | 0,591 | 0,546 | 0 Std. | 0,045 | ,000 | 0,09 | 0,00 I | |||
| M.M. | RA | 0,041 | 0,695 | 0,646 | 0,050 | 0,051 | ,001 | 2,73 | 2,73 | |||
| S.O. | RA | 0,045 | 0,038 | 3,23 | 2,11 | |||||||
| M.T. | 0,049 | 0,035 | ||||||||||
| M.N. | 0,049 | |||||||||||
| T.O. | 0,045 | |||||||||||
| 0,050 | ||||||||||||
OA: Osteoarthritis; RA : Rheumatoide Arthritis
(1) Die Collagenaseaktivität wurde unter Verwendung von ^C markierten rekonstituierten Meerschwein·-
chenhaut-Collagenfibrillen gemessen, nach der in Biochem. Biophys. Acta 263, 564 (1972) beschriebenen
Methode. *°
(2) Innerhalb der Fehlergrenze vernachlässigbar. cd
Verschiedene DNP-Peptidderivate wurden in 0,05 m Tris-HCl-Puffer
vom pH 7,5 mit einem Gehalt an 0,15 m HaCl, 5 mM CaCIp und
0,02 $> Rinderserumalbumin gelöst, so daß eine Konzentration von
5x10^ molar erzielt wurde. Je 0,1 ml der Peptidderivatlösungen
wurde mit dem gleichen Volumen gereinigter Collagenase (6,2 Einheiten/ml) oder nicht spezifischer Peptidasen vermischt und während
verschiedener Zeitabschnitte bei 370C inkubiert. Nach dem
Unterbrechen der Enzymreaktion durch Zugabe von 0,5 ml 1 m HCl wurden die freigesetzten DNP-Peptidfragmente durch kräftiges
Schütteln mit 1 ml Äthylacetat oder Äthylacetat-n-Butanol (1:0,15;
Volumen/Volumen) extrahiert und wie in Beispiel 12 aufgearbeitet. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle
4 zusammengefaßt.
DNP-Peptidderivate
Hydrolyserate** durch
Collagenase nicht spezifische Peptidasen
(CD365/h) (OD365/h)
DNP-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH*
DNP-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH
DNP-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-D-Arg-OH*
DNP-PrO-GIn-GIy-LeU-AIa-GIy-GIn-D-Z1Tg-OH*
DNP-Pro-Ala-Gly-Leu-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH
DNP-Pro-Ala-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH
| 0,093 | O |
| 0,276 | O |
| 0,157 | 0,021 |
| 0,243 | 0,031 |
| 0,120 | 0,051 |
| 0,070 | 0,010 |
D:iP-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH*
DNP-Ala-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH
O
O
O
O 0,016
* Die durch das Enzym freigesetzten DiJP-Peptidfragmente wurden
mit Äthylacetat-n-Butanol (Volum-Verhältnis 1:0,15) extrahiert.
50/065C': ;;
** Durchschnittswerte aus drei Versuchen. Beispiel 16 ·
NABS-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH wurde in 20 # Äthanol-0,05
m Tris-HCl-Puffer vom pH 7,8 mit einem Gehalt an 0,15 m NaCl
und 5 mti CaCl« bi3 zum Erzielen einer Konzentration von 5xlO~*
molar gelöst. 0,5 ml der Lösung wurde mit 0,1 ml gereinigter Collagenase (17,4 Einheiten/ml) vermischt und 60 Minuten bei
370C inkubiert. Nach dem Unterbrechen der Enzymreaktion durch Zugabe
von 0,1 ml 5 η Chlorwasserstoffsäure wurden die freigesetzten
NABS-Peptidfragmente mit 1 ml Äthylacetat extrahiert, wonach 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 3000 bis 5000 Upm zentrifugiert
wurde. Der Hydrolysegrad wurde durch Messen der Absorption der organischen Schicht bei 389 nm bestimmt. Dabei wurde ein Wert
der 0D389/h/ml von 0,100 erhalten.
PAB-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH wurde in 0,05 m Tris-HCl-Puffer
vom pH 7,8 mit einem Gehalt an 0,15 m NaCl und 5 mM CaCl2 gelöst, so daß eine Konzentration von 5x10"^ molar
erzielt wurde. 0,1 ml der lösung wurde mit 0,1 ml gereinigter Collagenase (17,4 Einheiten/ml) vermischt und 60 Minuten bei
37 C inkubiert. Nach dem Unterbrechen der Enzymreaktion durch Zugabe von 0,5 ml 1 η Chlorwasserstoffsäure wurden die freigesetzten
PAB-Peptidfragmente nach dem Sättigen mit Natriumchlorid mit 1 ml A'thylacetat extrahiert und wie in Beispiel 16 aufgearbeitet.
Der Hydrolysegrad wurde durch Messung der Absorption der organischen Schicht bei 325 nm bestimmt. Dabei wurde ein
V/ert der OD325/h/ml von 1,117 erhalten.
0654
Claims (20)
- PATENTANSPRÜCHEin der A eine hydrophobe, neutrale oder saure chromophore Gruppe, Y eine Gruppe B oder Pro-B bedeuten, wobei B für einen Amino-Bäurerest steht, C He oder Leu, E GIn-D-Arg-OH oder D-Arg-OH bedeuten und alle Aminosäurereste, ausgenommen GIy, in der L-Konfiguration vorliegen,wenn nichts anderes angegeben ist.
- 2. Peptidderivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß B der Rest einer in Proteinen vorkommenden oc-Aminosäure mit bis zu 15 Kohlenstoffatomen ist.
- 3. Peptidderivate nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß B der Rest von Alanin, Prolin, Leucin oder Glutamin ist.
- 4. Peptidderivate nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß A eine 2,4-Dinitropheny1-, p-(4-Hydroxy-lnaphthylazo)-benzolsulfonyl- oder p-Phenylazobenzoylgruppe ist.
- 5. 2,4-Dinitrophenyl-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH.
- 6. 2,4-Dinitrophenyl-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-D-Arg-OH.
- 7. 2,4-Dinitropheny 1-Pro-Gln-Gly-Leu-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH.
- 8. 2,4-Dinitrophenyl-Pro-Ala-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH.
- 9. 2,4-Dinitrophenyl--Pro-Ala-Gly--Leu-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH.
- 10. 2,4-Dinitrophenyl-Pro-Ieu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH.
- 11. 2,4-Dinitrophenyl-Pro-Pro-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH.
- 12. p-(4-Hydroxy-l-naphtbylazo)-benzolsulfonyl-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH.
- 13. p-Phenylazobenzoyl-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH.
- 14. 2,4-Dinitrophenyl-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH.
- 15. 2,4-Dinitrophenyl-Ala-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-D-Arg-OH.
- 16. Verfahren zur Messung der Collagenaseaktivität, dadurch gekennzeichnet , daß man eine Verbindung der
StrukturA-Pro-B-Gly-C-Ala-Gly-Eim wässrigen Medium mit Collagenase in Berührung hält, die die Gruppe A enthaltenden freigesetzten Peptidfragmente mit einem organischen lösungsmittel extrahiert und den Extrakt durch KoIo-rimetrie analysiert, wobei A eine hydrophobe, neutrale oder saure chormophore Gruppe, B einen Aminosäurerest, C He oder Leu, E Gln-D-Arg-OH oder D-Arg-OH bedeuten und alle Aiainosäurereste, ausgenommen GIy, in der L-Konfiguration vorliegen, wenn nichts anderes angegeben ist. - 17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man das angegebene Peptidderivat und die Collagenase bei einer Temperatur von 30 bis 450C und einem pH-Wert von 6 bis 9 miteinander in Berührung hält.
- 18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung verwendet, in der A eine 2,4-Dinitrophenylgruppe, B den Rest von Alanin, Leucin oder Glutamin, C lie und E Gln-D-Arg-OH bedeuten.
- 19. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet , daß man die Collagenaseaktivität berechnet, indem man von der unter Verwendung der Verbindung der StrukturA-Pro-B-Gly-C-Ala-Gly-E (I)durch Kolorimetrie erhaltenen Absorptiondie Absorption abzieht, die durch Ersatz dieser Verbindung (I) durch die Verbindung A-B-Gly-C-Ala-Gly-E (II) erhalten wird.
- 20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung II verwendet, in der A eine 2,4-7098S0/06S*Dinitrophenylgruppe, B Gin oder Ala, C lie und E GIn-D-Arg-OH bedeuten.709860/06S4
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| JP10350576A JPS5843389B2 (ja) | 1976-08-30 | 1976-08-30 | ペプチド遊導体及びペプチド誘導体を用いるコラゲナ−ゼ活性の測定方法 |
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