DE2643215A1 - Cancerostatisch wirksame praeparationen aus tumorzellen und ein verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents
Cancerostatisch wirksame praeparationen aus tumorzellen und ein verfahren zu ihrer herstellungInfo
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Description
Bayer Aktiengesellschaft
Zentral bereich Paxente, Marken und Lizenzen
5090 Leverkusen, Bayerwerk
Er/Di
2 4. Sep. 197S
Cancerostatisch wirksame Präparationen aus Tumorzellen und
ein Verfahren zu ihrer Herstellung
Die vorliegende Erfindung "betrifft neue cancerostatisch wirksame
Präparationen aus Tumorzellen und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Es ist bereits bekannt geworden, daß man verschiedene Tumoren mittels immunbiologischer Methoden beeinflussen kann. Diese
Methoden sind in der Regel sehr aufwendig.
Es wurde nun gefunden, daß man Tumorzellen in einfacher Weise durch Behandlung mit einem elektrischen Wechselstrom in wäßriger
Suspension dahingehend verändern kann, daß sie ihre Pathogenität und Cancerogenität verlieren und nur noch eine
das Immunsystem stimulierende antigene Wirkung gegen sich selbst besitzen.
Weiterhin wurde gefunden, daß man nach bekannten physikalischchemischen Methoden auch aus den mit Wechselstrom behandelten
wäßrigen Tumorzellsuspensionen immunogen wirksame Fraktionen gewinnen kann.
Es ist neu und überraschend, daß mit Hilfe eines elektrischen Wechselstromfeldes in solch einfacher Weise ein derartiger
Effekt bei Tumorzellen erreicht werden kann.
Le A 17 519 - 1 -
8Q98U/0035
ORiGfNAL INSPECTED
si
Das erfindungsgemäße Verfahren stellt somit einen großen und überraschenden Fortschritt auf dem Gebiet der Human-
und Veterinärmedizin dar.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird in einem Reaktionsgefäß unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Als zweckmäßig
hat sich dabei die aus Figur 1 ersichtliche Apparatur herausgestellt. Die Apparatur besteht aus einer flachen Flasche
aus Glas mit 3 Öffnungen. Die Öffnung am Flaschenhals (3) ist durch einen Stopfen enthaltend ein Auslaufrohr verschlossen,
die anderen beiden Öffnungen sind ebenfalls durch Stopfen verschlossen, durch welche die Elektroden aus Edelmetall
(beispielsweise Gold, Platin oder Silber, vorzugsweise Silber, aber auch Edelmetalllegierungen sind möglich) geführt werden,
welche an eine elektrische Wechselstromspannungsquelle angeschlossen sind. Zur Kontrolle ist in der Flasche ein Thermometer
angebracht (5) .-Im Glasgefäß befindet sich die mit dem elektrischen
Wechselstrom zu behandelnde Suspension der Tumorzellen. Die zu wählenden Versuchsbedingungen (Temperatur,
Dauer der Behandlung mit elektrischem Wechselstrom, Wechselstromspannung, Strom.stärke, pH-Wert usw) sind von der Beschaffenheit
des zu behandelnden pathogenen und cancerogenen Zellmaterials abhängig. Außerdem ist die Wirkung der einzelnen
Faktoren, zum Teil miteinander gekoppelt, so daß man eine niedrigere Stromstärke beispielsweise durch eine
längere Einwirkungszeit des Wechselstrom ausgleichen kann.
Man kann zur Erreichung höherer Spannungs- und Stromstärkewerte das Gefäß auch mit einem Kühlmantel versehen.
Als Tumorzellen kann man beim erfindungsgemäßen Verfahren sämtliche
in der Literatur bekannt gewordene Tumoren einsetzen, als Beispiele seien im einzelnen aufgeführt;
Le A 17 519 - 2 -
8098U/0035
Mäuseleukämie-Tumoren (ζ. B. ML III und ML IV und EARAD 1), Jensen Sarkom, Walker-Tumor, Menschliches Colon - Karzinom,
Chondro-Sarkom, Adeno-Karzinom, Rauscher-Virus-Leukämie, verschiedene
Mamma-Tumoren, Ehrlich-Karzinom, Leukämie L 1210-Tumor,
Mammakarzinom (benzidin induziert), Plasmocytom und andere.
Folgende Verfahrensbedingungen haben sich im einzelnen als zweckmäßig erwiesen.
Wechselstromspannung; i. a. arbeitet man zweckmäßigerweise
mit der vorliegenden Netzspannung, welche bei unseren Versuchen 220 V betrug, natürlich kann man auch mit anderen Spannungswerten, beispielsweise 110 oder 330 V arbeiten. In einem
solchen Falle sind die anderen Reaktionsbedingungen anzugleichen.
Stromstärke; als zweckmäßig hat sich bei einer Wechselspannung
von 220 V eine Stromstärke von 200 - 300 mA erwiesen. Natürlich sind in Abhängigkeit von der Stromspannung auch andere
Stromstärkewerte denkbar.
Die Behandlung mit dem elektrischen Wechselstrom wird i. a. bei Temperaturen von 4 bis 600C, vorzugsweise bei 20 bis 40°C
und insbesondere bei 370C (physiologische Temperatur) durchgeführt.
Die angewandte Temperatur ist beispielsweise abhängig Ύοη der Thermostabilität der eingesetzten Tumorzellen. Man
kann die Temperatur der zu behandelnden Tumorzellen-Suspension bei gleichbleibender Stromspannung einstellen, in dem man die
Stromstärken in dem Maße variiert, daß ein konstanter Temperaturwert in der zu behandelnden Tumorzellen-Suspension
vorliegt.
Dauer der Behandlung mit elektrischem Wechselstrom Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, die Tumorzellen von
1 bis 120 Stunden, insbesondere von 10 bis 48 Stunden in einem elektrischen Wechselstromfeld zu behandeln. Es sind
809814/0035
Le A 17 519 - 3 -
aber in Abhängigkeit in der Natur der eingesetzten Tumorzellen
und der angewandten Verfahrensbedingungen (wie z. B. Art der Elektroden, Temperaturen, Suspensionsmittel, Stromspannung
und Stromstärke) und Zeitwerte unterhalb 1 bzw. oberhalb 120 Stunden möglich.
Als Ausgangsmaterialien dienen die entsprechenden soliden Tumoren, die man mit Hilfe von Enzymen wie z. B. Trypsin
nach an sich bekannten Methoden in eine wäßrige Zellsuspension überführt. Ebenso geeignet sind im Falle der leukämischen
Tumoren die aus der sog."Buffy coat"isolierbaren Zellen.
Die verfahrensgemäß erhaltene Suspension der mit elektrischen Wechselstrom behandelten Tumorzellen wird entweder als solche
appliziert oder zur Gewinnung definierter Antigenfraktionen
nach an sich bekannten physikalisch-chemischen Methoden, wie z. B. Zentrifugieren fraktionierte Präzipitation, Dialyse etc.
weiter aufgetrennt und danach für Applikationszwecke eingesetzt.
Hierbei wurden die mit elektrischen Wechselstrom behandelten Tumorzellen bzw. die gegebenenfalls daraus isolierten
Antigenfraktionen gegebenenfalls unter Zusatz von Formulierhilfsstoffen zum cancerostatisch wirksamen Präparationen
verarbeitet.
Als derartige Formulierhilfsstoffe kommen beispielsweise in
Frage:
Trägerstoff, Emulgier- bzw. Dispergiermittel wie:
Wasser, nichttoxische organische Lösungsmittel bzw. Verdünnungsmittel
wie Paraffine (z. B. Erdölfraktionen), pflanzliche Öle (z. B. Erdnuß-/Sesam-Öl), mehrwertige Alkohole wie Glycerin,
Glykole (z. B. Propylenglykol, Polyäthylenglykol), feste Trägerstoffe,wie z. B. natürliche Gesteinsmehle (z. B.
hochdisperse Kieselsäure, Silikate), Zucker (z. B. Rohr-, Milch- und Traubenzucker); Emulgiermittel, wie nichtionogene
Le A 17 519 80"9^Γ4/0035
und anionische Emulgatoren (z. B. Polyoxyäthylen-Fettsäure-Ester,
Polyoxyäthylen-Fettalkohol-Äther, Alkylsulfonate und
Arylsulfonate), Dispergiermittel (z. B. Lignin, Methy!cellulose,
Stärke und Polyvinylpyrrolidon) und Gleitmittel (z. B. Magnesiums te ar at, .Talkum, Stearinsäure und Natriumlaurylsulfat).
Die Applikationsmengen bei der Behandlung des menschlischen und tierischen Organismus müssen von Fall zu Fall ermittelt
v/erden.
Le A 17 519 - 5 -
809814/0035
COFr
Aus Tumorzellen (Mäuseleukämie Stamm ML III isoliert aus den soliden Tumor von NMRI-Mäusen) wird mit Hilfe von
Trypsin eine wäßrige Zellsuspension hergestellt.
Diese wäßrige Zellsuspension wird bei 370C, 24 Stunden lang
einem elektrischen Wechselstromfeld (220 V Spannung, 230 mA
Stromstärke, Silber-Elektroden) ausgesetzt. Mit der so behandelten Tumorzellsuspension wurden folgende Versuche durchgeführt
.
Immunisierungsversuche mit im elektrischen Feld veränderten.
ganzen Mäuseleukämie ML III - Tumorzellen
Von den Zellen wird eine Suspension hergestellt, die pro 0,1
7
ml 10' Zellen enthält. Von dieser Ausgangssuspension werden Verdünnungen in Zehnerpotenzen hergestellt, die dann 10 , 10-3 ... etc. bis 10° = 1 Zelle enthalten. Mit der Ausgangssuspension und den Verdünnungsstufen werden sodann Mäuse subkutan geimpft und 6 Wochen später mit einer in der Regel
ml 10' Zellen enthält. Von dieser Ausgangssuspension werden Verdünnungen in Zehnerpotenzen hergestellt, die dann 10 , 10-3 ... etc. bis 10° = 1 Zelle enthalten. Mit der Ausgangssuspension und den Verdünnungsstufen werden sodann Mäuse subkutan geimpft und 6 Wochen später mit einer in der Regel
7
letalen Dosis von 10 unbehandelten Tumorzellen infiziert.
letalen Dosis von 10 unbehandelten Tumorzellen infiziert.
Die Ergebnisse sind im Detail nachstehender Tabelle zu entnehmen. Die Kontrollmäuse entwickelten in den ersten 4 Wochen
nach der Infektion Tumoren und starben daran.
Tab.: Ergebnisse von Immunisierungsversuchen mit Hilfe von im elektrischen Feld behandelten Tumorzellen bei Verwendung
von Silberelektroden bei Mäusen (Stamm NMRI) am Beispiel der Leukämie ML III.
Le A 17 519 - 6 -
80981 A/0035
Alter
der
Mäuse
Anzahl geimpfter Mäuse
Dosis Überlebensrate (Zeil- tot / lebend zahl) nach 6 Wochen
Überleb ensrate nach Belastung mit 10' Tumorzellen tot / lebend
4 Wochen 10 10 10 10 10 10 10 10
10'
10I
10-
10-102
10C
1
0
0
2
1
0
0
0
0
0
2
1
0
0
0
/ 9 / 10
/ ίο
/ 8 / 9 / 10 / 10 / 10
3 6 5 2 7 10
9 10
6 4 5 6 2 0 1 0
5 Tage
10 10 10 10 10 10 10 10
10'
10I
ίο-
101 10C
2
1
2
0
0
1
1
0
1
2
0
0
1
1
0
/ 8 / 9 / 8 / 10 / 10 / 9 / 9 / 10
1 2 4 8 9 8 9 8
7 7
4 2 1 1 0 2
0 Tage
10 10 10 10 10
10Z
10C
2
0
0
0
0
0
0
/ 8 / 10 / 10 / 10 / 9
4 2 5
10 8
4 8 5 0
Anschließend werden aus der gemäß Beispiel 1 mit elektrischen Wechselstrom behandelten Tumorzellensu.spension Antigenfraktionen
wie folgt isoliert:
(1) Die Zellsuspension wird 20 Min. bei 2200 g zentrifugiert.
(2) Sediment und Überstand werden getrennt und separat aufgearbeitet:
Das Sediment zur Gewinnung des "kleinen",
809814/0035
Le A 17 519 - 7 -
ätherstaMlen Antigens mit einem Molekulargewicht von
2400 genannt "p 24"; der Überstand zur Gewinnung des "größeren" Antigens mit einem Molekulargewicht von ca.
60 000, genannt "gp" (-Glykoproteid).
(3) "p24"-Gewinnung:
Das Sediment wird im Verhältnis 1 : 8 in Boratpuffer (pH 8.55) aufgenommen und mit Hilfe eines mechanischen
Zerkleinerungsgerätes (z. B. Ultraturax) im Eisbad homogenisiert und anschließend dreimal bei -6O0C eingefroren und
aufgetaut. Es folgt eine Zentrifugierung (2200 g; 10 min.);
dann wird 1 Teil Überstand mit 2 Teilen Äthyläther gemischt und 30 min. lang bei 40C geschüttelt. Anschließend wird
wieder zentrifugiert (2200 g, 10 min.), das Sediment verworfen und der Äther über Vakuum ausgetrieben. Was
übrig bleibt, wird als "p24" verwendet.
(4) "gp"-Gewinnung:
Der Überstand von (2) wird mit Ammoniumsulfat versetzt (30 g je 100 ml Überstand) und 1 Std. gerührt. Danach
lagert man 72 Std. bei + 40C. Anschließend wird der
klare Überstand verworfen und der übrige Teil 30 min. lang bei 1500 g zentrifugiert. Der Überstand wird wieder
verworfen und das Sediment in PBS (Phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung) aufgenommen (in einer Menge, die
einem Zehntel des Ausgangsvolumen entspricht. Nach der
Lagerung über Nacht bei 40C wird wieder zentrifugiert (1500
g, 15 min) und das Sediment verworfen. Der Überstand wird in der Vakuumdialyse auf 1/100 des ursprünglichen Volumes ■■
eingeengt und danach 1 Std. bei 30 000 g zentrifugiert. Die Reinigung erfolgt dann mit Hilfe einer Säule mit
CON A-Sepharose ^, (eine Agarose der Firma Pharmacia Fine
Chemicals, Uppsala, Schweden). Beide Antigene werden zum Nachweis von Antikörpern spezifischer Natur bei der Rinder- und
Mäuseleukose (bisher) bzw. -leukämie und zur Immunisierung verwendet.
Le A 17 519 - 8 -
8Q98U/0035
JO
Leerseite
Claims (2)
- Patentansprüche:(l). Verfahren zur Herstellung von cancerostatisch wirksamen Präparationen aus Tumorzellen, dadurch gekennzeichnet, daß man wäßrige Suspensionen von Tumorzellen, gegebenenfalls unter Zusatz von Hilfsstoffen unter sterilen Bedingungen einem elektrischen Wechselstromfeld aussetzt, die so behandelten Tumorzellen-Suspensionen als solche isoliert und gegebenenfalls unter Zusatz von an sich bekannten Formulierhilfsstoffen zu cancerostatischen Präparationen verarbeitet oder gegebenenfalls aus der mit elektrischen Wechselstrom behandelten Tumorzellen-Suspension nach an sich bekannten physikalischen Methoden spezielle Antigenfraktionen abtrennt und diese gegebenenfalls unter Zusatz von an sich bekannten Formulierhilfsstoffen zu cancerostatischen Präparationen verarbeitet.
- 2. Cancerostatisch wirksame Präparationen hergestellt nach dem Verfahren von Anspruch 1.Le A 15 719 - 9 -8098U/0035
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19762643215 DE2643215A1 (de) | 1976-09-25 | 1976-09-25 | Cancerostatisch wirksame praeparationen aus tumorzellen und ein verfahren zu ihrer herstellung |
| JP11346777A JPS5341411A (en) | 1976-09-25 | 1977-09-22 | Antitumor agent from tumor cells and its preparation |
| US05/835,922 US4150150A (en) | 1976-09-25 | 1977-09-23 | Carcinostatically active formulations obtained from tumour cells and a process for their preparation |
Applications Claiming Priority (1)
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| DE19762643215 DE2643215A1 (de) | 1976-09-25 | 1976-09-25 | Cancerostatisch wirksame praeparationen aus tumorzellen und ein verfahren zu ihrer herstellung |
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| Publication Number | Publication Date |
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| DE2643215A1 true DE2643215A1 (de) | 1978-04-06 |
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ID=5988827
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DE19762643215 Pending DE2643215A1 (de) | 1976-09-25 | 1976-09-25 | Cancerostatisch wirksame praeparationen aus tumorzellen und ein verfahren zu ihrer herstellung |
Country Status (3)
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Cited By (4)
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| FR2414919A1 (fr) * | 1978-01-19 | 1979-08-17 | Jaeger Karl | Procede de preparation d'un complexe de substance active immunologique dirige contre la croissance maligne a partir de cellules |
| DE2842691A1 (de) * | 1978-09-30 | 1980-04-10 | Karl Dr Med Theurer | Energetische anregung biologischer arzneimittel |
| EP0019167A2 (de) * | 1979-05-10 | 1980-11-26 | Hans Dr. Limburg | Arzneipräparat zur Behandlung von Carcinomen und Verfahren zu dessen Herstellung |
| EP0173951A2 (de) * | 1984-09-06 | 1986-03-12 | BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft | Tumortherapeutikum und Verfahren zu seiner Herstellung |
Families Citing this family (2)
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|---|---|---|---|---|
| DE3152851A1 (de) * | 1981-05-19 | 1983-05-19 | Stephen Sugaar | Stark antigene tumorspezifische stoffe und verfahren zum nachweis von krebs unter verwendung dieser stoffe |
| US5030621A (en) * | 1987-04-23 | 1991-07-09 | Bystryn Jean Claude | Shed melanoma antigen compositions |
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| US3526697A (en) * | 1966-10-06 | 1970-09-01 | Nevada Pharm Inc | Therapeutic method |
| US4053586A (en) * | 1971-10-08 | 1977-10-11 | Intermountain Laboratories, Inc. | Preparation for treating squamous cell carcinoma and method for making same |
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| US4042457A (en) * | 1975-11-10 | 1977-08-16 | Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center | Preparation of tissue invasion inhibitor and method of treatment utilizing the inhibitor |
-
1976
- 1976-09-25 DE DE19762643215 patent/DE2643215A1/de active Pending
-
1977
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- 1977-09-23 US US05/835,922 patent/US4150150A/en not_active Expired - Lifetime
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| EP0019167A3 (en) * | 1979-05-10 | 1981-09-09 | Hans Dr. Limburg | Medicinal preparation for the treatment of carcinoma and process for preparing it |
| EP0173951A2 (de) * | 1984-09-06 | 1986-03-12 | BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft | Tumortherapeutikum und Verfahren zu seiner Herstellung |
| EP0173951A3 (en) * | 1984-09-06 | 1988-06-08 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Tumour therapeutic agent and process for its preparationtumour therapeutic agent and process for its preparation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5341411A (en) | 1978-04-14 |
| US4150150A (en) | 1979-04-17 |
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|---|---|---|---|
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