DE2605469A1 - Spaltprodukt des tollwut-virus, verfahren zu seiner gewinnung und dieses enthaltender impfstoff - Google Patents

Description

BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg (Lahn)

Aktenzeichen: Hoe 76/B 005 - Ma 260

Datum: 10. Februar 1976

Spaltprodukt des Tollwut-Virus, Verfahren zu seiner Gewinnung und diese s_enthaltender Impfstoff

Es ist bekannt, das Tollv/ut-Virus einer Spaltung zu unterwerfen, bei der eine Reihe von Spaltpro*dukten entsteht. Die Spaltung v/ird insbesondere mit Hilfe nichtionischer oberflächenaktiver Stoffe. z.B. Triton X 100 (Reaktionsprodukt aus 1 Mol t-Octylphenol und 9-10 Mol Äthylenoxyd) ausgeführt. Die wichtigsten Produkte dieser Spaltung, die sich elektrophoretisch isolieren lassen, sind eine iJucloprotein-Fraktion (IT), eine Gl3/coprotein-Fraktion (G) und zvei Fraktionen, die im wesentlichen aus Membran-Proteinen bestehen (M^ und Mp). Es ist-auch bekannt, dass die immunogene Wirkung nach der Spaltung in der Glycoprotein-Fraktion (G) erscheint. Diese Fraktion wurde bisher aufgrund ihres elektrophoretxschen Verhaltens als einheitlich angesehen.

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Es wurde nun gefunden,dass die G-Fraktion einer weiteren Aufspaltung zugänglich ist, wobei sich wiederum die immunogene Aktivität in einer Fraktion isolieren lässt, wenn man die diese Fraktion bildendenGLycoproteine einer Selektierung hinsichtlich ihrer isol elektrischen Punkte unterwirft.

In diesem Sinne ist der Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung eines Spaltproduktes des Tollwut-Virus, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man die in bekannter Weise durch Spaltung des Tollwut-Virus erhaltene Glycoprotein-Fraktion in Fraktionen unterschiedlicher isolelektrischer Punkte auftrennt und diejenige Fraktion isoliert, die einem isoelektrischen Punkt von etwa 7 entspricht.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Spaltprodukt des Tollwut-Virus, das gekennzeichnet ist durch die Parameter eines Produkts, das nach dem genannten Verfahren gewonnen verden kann.

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Gegenstand der Erfindung ist endlich auch ein Impfstoff, der als wirksamen Bestandteil das erwähnxe Spaltprodukt enthält.

Zur Gewinnung des Spaltprodukts geht man zweckmässig von einem in der Zellkultur gezüchteten Tollwut-Virus aus. Der Charakter des Virus-Starames spielt keine entscheidende Rolle. Auch der Charakter der für die Züchtung verwendeten Zellkultur ist von untergeordneter Bedeutung. Bewährt hat sich in einer grösseren Zahl von Experimenten eine Züchtung des ERA-Tollwut-Virus-Stammes in einer Kultur von BHK 21-Zellen. Die Züchtung des Tollwut-Virus in Zellkulturen ist bekannt.

Die Spaltung des Virus mit einem niclrfcioni sehen oberflächenaktiven Stoff ist ebenfalls bekannt. Die Art ihrer Durchführung ist für die Gewinnung der erfindungsgemäss v/eiterzuverarbeitenden Glycoprotein-Fraktion nicht entscheidend, sofern sie nur zu einer ausreichenden Spaltung des Virus führt. Vorzugsweise erfolgt die Spaltung durch Einwirkung einer Lösung, die etwa 0,2 bis 3% eines nicht-ionischen oberflächenaktiven Stoffes enthält, bei einer Temperatur von 5 - 35°C während 10 Minuten bis 6 Stunden.

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Die Isolierung der Glycoprotein-Fraktioii aus dein Spaltansatz kann beispielsweise auf elektrophoretischera Wege erfolgen. Es kann aber auch das Nucleoproteid durch Zentrifugierung bei hohen g-V'erten abgeschieden werden und der Überstand unmittelbar der nachfolgenden Auftrennung nach isolelektrischen Punkten unterworfen werden. Zweckmässig wird dieser Überstand zuvor einer Dialyse unterworfen, um niedermolekulare Bestandteile abzutrennen.

Die so erhaltene Glycoprotein-Fraktion, die in etwa 0,05 0,4%iger wässriger Dispersion vorliegt, wird sodann in Fraktionen unterschiedlicher isolelektrischer Punkte aufgeteilt. Hierfür eignen sich Verfahren, die die Auftrennung von Polypeptid-Gemischen nach ihren isoelektrisehen Punkten ermöglichen. Besonders vorteilhaft ist die als "isoäLektrische " Fokussierung" bekannte Arbeitsmethode, bei der in einer Flüssigkeitssäul-e mit Hilfe geeigneter zwitterionischer Verbindungen wie Polyamino-Polycarboxy-Alkanen (Ampholite) ein < pH-Gradient aufgebaut wird und in diesem eine Auftrennung des auf die Säule gegebenen Gemisches erfolgt.

Die Säule zur iscelektrischen Fokussierung wird mit einer etwa 0,2 - 5$>igen Lösung einer zwitterionischen Verbindung, zweckmässig in einem Dichtegradienten, z.B. eirem solchen von 0 - ^0% einer nicht-ionischen wasserlöslichen Verbindung wie einer Polyhydroxyverbindung, vorzugsweise eines PoIysacharids beschickt. Die Fokussierung erfolgt in einem solchen Sytem unter einer elektrischen Spannung, die der für die Säule optimalen Spannung entspricht, während etwa 24 Stunden bis etwa 8 Tage.

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Im Anschluss an die isoelektrische Fokussierung wird der Säuleninhalt in Fraktionen aufgetrennt. Die Bestandteile del· G—Fraktion konzentrieren sich in 3 Bereichen um die pH-Werte 4,5; 7,0 und 8,0. Die Fraktion entsprechend einem pH-Wert von 7,0 (etwa 6,8 bis 7,4) v;ird getrennt aufgefangen. Sie enthält in reiner Form das erfindungsgemässe Spalt-* produkt frei von anderen hochmolekularen Bestandteilen. Zur Abtrennung der bei der isoelektrischen Fokussierung und den vorausgehenden Operationen angewandten Hilfsstoffe kann sie einer weiteren Reinigung, z.B. durch Dialyse, Sedimentation, Chromatographie oder Zentrifugierung unterworfen v/erden.

Die das erfindungsgemässe Spaltprodukt enthaltende Fraktion' kann unmittelbar als Impfstoff gegen Tollwut eingesetzt werden. Gegenüber den *aus dem intakten Virus gewonnenen Impfstoffen zeichnet sie sich durch eine etwa gleichgrosse antigene Aktivität bei geringeren Nebenwirkungen aus."

Die das Spaltprodukt enthaltende Fraktion kann, um ihre Haltbarkeit oder Wirksamkeit zu erhöhen, mit bekannten Adjuvantien und Stabilisatoren versetzt und/oder lyophilisiert werden.

*in bekannter Weise

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Beispiel

Eine Tollvutvirus-Kultur (ERA-Stamm) wurde in BHK-21-Zellen plaque-gaklont.

Die Virusvermehrung wurde in Rollkulturen von BHK-21-C-I3-Zellen vorgenommen. Die Kulturbedingungen sind in Schneider, L.G., M. Horzinek und H.D. Matheka, 1971, "Purification of rabies virus from tissue culture", Arch. ges. Virusforsch. 3^:351-359 beschrieben. Die infektiösen Zellkulturflüssigkeiten und infizierten Zellen mirdai abgeerntet, nachdem eine deutliche cytopathologische ¥irkung (CPE) offenbar war.

Die Viren aus dem geklärten Überstand wurden 120 Minuten bei h C in einem Beckman -R-19-Rotor bei 19000 U./min. abgeschleudert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet über Nacht in einer geringen Menge 0.15M NaCl, 0,01M Tris-HCl von pH 7i5» 0,001 EDTA-(STE)-Puffer eluiert. Das Eluat wurde durch langsames Zentrifugieren geklärt, auf einen vorgeformten 10-30/faigen (Gew./Vol.) Sucrose-Gradienten geschichtet und 90 Minuten bei k°C in einem Beckman -SW-27-Rotor bei 25 000 U./min. zentrifugiert. Die Virusbande wurde gesammelt und reichlich gegen STE-Puffer dialysiert. Die Behandlung der Tollwutviren mit Triton X-IOO wurde im Prinzip.; wie bei Helenius und Söderlund "Stepwr_ise dissociation of the semliki forest virus membrane with Triton X-100", Bxochem. Biophys. Acta 307 : 287 300, beschrieben}vorgenommen. Zu einer Suspension von 5 ^mg Tollwutviren in 5 ml ST-Puffer wurde Triton X-100 bis zu einer Endkonzentration von Vp zugesetzt (Protein:Triton-Verhältnis 1:10). Die Mischung wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur gehalten und dann im Eisbad abgekühlt. Die immer noch trübe Lösung wurde 60 Minuten bei 4°C in einem Beckman· SW,65-Rotor bei 45 000 U./min. zentrifugiert. Der Überstand wurde zurückgehalten und das Pellet wieder im ST-Puffer, der 2M LiCl und 5 mg/ml Digitonin enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und 60 Minuten bei

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4°C im Beckman -SW 65-Rotor.bei k5 000 U./min. zentrifugiert. Der Überstand wurde aufbewahrt und das Pellet verworfen.

Der nach Zentrifugieren bei 120 000 χ g gewonnene Überstand von mit Triton X-100 behandelten Viren wurde ausgiebig gegen I^iges (Gew./Vol.) Glycin und 1$-iges (Gew./Vol.) Glycerin in dest. Wasser dialysiert. Nach Zugabe von Λ^€/ο Arrphoiin^ /pH 3»5 10, (LKB₁ Uppsala, Schweden) wurde der Triton X-1OO-Extrakt 10 Minuten bei 5OOO χ g geklärt und eine Probe von 5 ml wurde auf einen 5—hOfo±g&n (Gew./Vol.) Sucrose-Gradienten geschichtet, der 0,1 °/> Triton X-100 und 1$ Ampholin von pH 3,5 - 10 enthielt. Die Zubereitung wurde 72 Stunden in einer LKB-Säule von 110 ml wie bei Priesen et al. beschrieben elektrofokussiert (Friesen, A.D., J.C. Jamieson und P.E. Ashton, 1971, "Effect of nonionic detergent on fractionation of proteins by isoelectric focusing", Anal. Biochem. 4i:14°-157)· Anschliessend wurde der Gradient fraktioniert, die pH 7-Fraktion gesammelt und 2 Tage ausgiebig gegen dest. Wasser dialysiert, um die Triton X-100-Konzentration zu verringern und Ampholin sowie Sucrose zu entfernen, und schliesslich lyophilisiert.

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Claims (3)

1. Ma 260

   Patentansprüche

   Ii Verfahren zur Gewinnung eines Spaltproduktes des Tollwut-Virus, dadurch gekennzeichnet, dass man clxe aus dem Virus durch Spaltung erhaltene Glycoprotein-Fraktion einer Auftrennung in Fraktionen unterschiedlicher isoelektrischer Punkte unterwirft und die Fraktion mit einem isoelektrischen Punkt zwischen 6,8 und 7»^ isoliert.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Auftrennung durch isoelektrische Fokussierung erfolgt.
3. 3. Spaltprodtikt des Tollwut-Virus, gekennzeichnet durch die Parameter eines nach Anspruch 1 erhaltenen Produkts.

   k. Impfstoff gegen Tollwut gekennzeichnet durch einen Gehalt an dem Spaltprodukt getnäss Anspruch 1 .

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