DE2602803A1

DE2602803A1 - Octapeptidderivate und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE2602803A1
Application number: DE19762602803
Authority: DE
Inventors: Robert Henry Mazur
Original assignee: GD Searle LLC
Current assignee: GD Searle LLC
Priority date: 1975-01-27
Filing date: 1976-01-26
Publication date: 1976-07-29
Also published as: CH618960A5; CA1064913A; BE837895A; ES444625A1; US3975365A; IE42249L; AU1056676A; NL7600764A; GB1537856A; ATA48976A; DK29876A; FR2298336A1; FR2298336B1; ZA76420B; SE7600754L; AT357698B; JPS51100074A; IE42249B1

Description

RECHTSANWÄLTE

DR. JUR. DiPL-CHEM. WALTER BEtI

ALFRED HOEPPENER

DR. JUR. CiPL-CHiM. H.-J. WOlfl»

DR. JUR. HAN3 CHR. BEIL

Mt FRANKFURTAM MAiN-HOCHSf

4DtUMStSASSiSi

2602803 '. Jan. 1976

Unsere Nr. 20 320 Pr/br

G.D. Searle & Co. Skokie, 111., V.St.A.

Octapeptidderivate und Verfahren zu deren Herstellung

Die Erfindung betrifft Octapeptidderivate, die durch einen sauerstoff- oder schwefelhaltigen Rest am endständigen C-Atom gekennzeichnet sind, und ein Verfahren zu deren Herstellung. Insbesondere betrifft die Erfindung Verbindungen der folgenden allgemeinen Formel

X - Arg - VaI - Tyr - Y - His - Pro - NH - CH - CO„H

CH₂-A-R

worin X einen Sarcosin- oder Asparaginsäurerest, Y den Isoleucin- oder Valinrest, A ein Sauerstoffatom, einen

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ORIGINAL INSPECTED

Thio-, SuIfinyl- oder Sulfonylrest und R einen Alkylrest mit 1 bis 7 C-Atomen, einen Arylalkylrest der Formel

worin m 1 oder 2 und W ein Wasserstoff- oder Halogenatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen sind, oder einen Alkoxyrest mit 1 bis 4 C-Atomen bedeuten, wobei die Aminosäurereste stereochemische L- oder DL-Konfiguration besitzen.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft Ver- > bindungen, die durch folgende allgemeine Formel dargestellt werden können

X-Arg-VaI-Tyr-Y-His-Pro-NH-CH-CO ₂H

I (ID

CH₉

S -

\J

worin X und Y vorstehende Bedeutung haben, W ein Wasserstoff- oder Halogenatom und die Aminosäurereste stereochemische L- oder DL-Konfiguration besitzen.

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Die Abkürzungen bezeichnen die Aminosäuren, wie sie gemäß den Nomenklaturregeln, veröffentlicht durch IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature in Archives of Biochemistry and Biophysics, 150, 1-8 (1972), definiert sind. Die Aminosäuren können stereochemische L- ader DL-Konfiguration besitzen.

Beispiele für von R umfaßte Reste sind Methyl, Äthyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl und deren verzweigtkettige Isomeren.

Beispiele für von W umfaßte Alkylreste sind Methyl, Äthyl, Propyl, Butyl und deren verzweigtkettige. Isomeren, Beispiele für von W umfaßte Halogene sind Chlor, Brom, Fluor

und Jod,

Beispiele für von W umfaßte Alkoxyreste sind Methoxy, Äthoxy, Propyoxy, Butoxy und deren verzweigtkettige Isomeren.

Die Herstellung de'r erfindungsgemäßen "Verbindungen erfolgt zweckmäßigerweise nach Verfahren, wie sie zur Synthese von Peptiden üblich sind. So wird die Aminosäure am endständigen C-Atom, die gegebenenfalls mit Schutzgruppen substituiert ist, mit einem aktiven Ester der entsprechenden N-geschützten Aminosäure gekuppelt, um das entsprechende N-geschützte Dipeptid zu ergeben. Ein aktiver Ester ist ein solcher, der leicht mit einer Aminosäure, die gegebenenfalls mit einer Schutzgruppe substituiert' ist, reagiert, um eine Amidbindung zu ergeben. Beispiele für solche Estergruppen sind solche, die von 2,ⁱl,5-Trichlorphenyl und N-Hydroxysuccinimid stammen.

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Nach Entfernen der N-Schutzgruppe erfolgt auf gleiche Weise ein Kuppeln mit dem aktiven Ester der erforderlichen N-geschützten Aminosäure, um das gewünschte Tripeptid zu ergeben. Diese aufeinanderfolgende Arbeitsweise wird fortgesetzt, bis das gewünschte Angiotensin II-Derivat erhalten worden ist.

Als spezifisches Beispiel wird S-Benzyl-L-cystein mit N-(tert.-Butoxycarbonyl)-L-prolin-2,4,5-trichlorphenylester in Gegenwart von N-Methylmorpholin gekuppelt; das dabei entstehende N-(tert.-Butoxycarbonyl)-L-prolyl-S-benzyl-L-cystein wird mit -Trifluoressigsäure behandelt, um das Trifluoressigsäuresalz von L-Prolyl-S-benzyl-L-cystein zu ergeben; letzteres wird^.wie vorstehend beschrieben mit N,im-bis(tert.-Butoxycarbonyl)-L-histidin-2,4,5-trichlorphenylester gekuppelt, um das geschützte Tripeptid zu ergeben, und diese Arbeitsweise wird aufeinanderfolgend wiederholt unter Verwendung der entsprechenden N-geschützten Aminosäuren, wobei man nach Entfernung der Schutzgruppen L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-S-benzyl-L-cystein erhält.

Die vorstehend beschriebenen Arbeitsweisen erfolgen vorzugsweise nach in der organischen Chemie üblichen Standardtechniken, wobei jedes Zwischenpeptid wie vorstehend beschrieben hergestellt und vor dem Kuppeln mit dem nächsten geeigneten N-geschützten aktiven Aminosäureester isoliert wird. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, daß die aufeinanderfolgende Herstellung durch Pestphasen-Peptidsynthese erfolgen kann, die darin besteht, daß man zuerst die gegebenen-

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falls N-geschützte Aminosäure am endständigen C-Atom an einen Polymerträger bindet, wie beispielsweise chlormethyliertes Copolystyrol-l^-Divinylbenzolpolymer, anschließend die N-Schutzgruppe entfernt und in Gegenwart eines geeigneten Reagens, z.B. Dicyclohexylcarbodiimid nacheinander mit jeder der geeigneten N-geschützten Aminosäuren kuppelt.

Auf die gleiche Weise wird eine Verbindung der Formel

Arg-Val-Tyr-Y-His-Pro-NH-CH-CO-Polymer-Träger

I (III)

CH₂-A-R

worin Y, A und R vorstehende Bedeutung haben, mit N-geschütztem Sarcosin oder Asparaginsäure in einem polaren nichtprotischen Lösungsmittel in Gegenwart eines Dehydratisierungsmittels, beispielsweise Dicyclohexylcarbodiimid, gekuppelt und anschließend der Polymer-Träger entfernt, wobei man eine Verbindung der Formel (I) erhält.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können außerdem durch Kuppeln aktiver Ester der N-geschützten Peptidblocks geeigneter Größe, die ihrerseits durch stufenweise Synthese, wie vorstehend beschrieben, erhalten werden, in einem polaren nichtprotischen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, in Gegenwart einer organischen Base, wie N-Methylmorpholin, vorzugsweise bei Raumtemperatur und anschließender Entfernung der Schutzgruppen hergestellt werden.

So wird ein aktiver Ester des N-geschützten Pentapeptids der Formal

X - Arg - VaI - Tyr - Y (IV)

. 609831 /1 01 S

worin X und Y vorstehende Bedeutung haben, mit einem gegebenenfalls N-geschützten Tripeptid der Formel

His - Pro -NH-CH-

f ²' (V)

CH₂-A-R

worin A und R vorstehende Bedeutung haben, in Dimethylformamid in Gegenwart von N-Methylmorpholin bei Raumtemperatur gekuppelt, wobei man nach Entfernen der Schutzgruppen eine Verbindung der Formel (I) erhält.

Auf die gleiche Weise wird ein aktiver Ester des N-geschützten Heptapeptids der Formel

X - Arg - VaI - Tyr - Y - His - Pro (VI)

worin X und Y \orstehende Bedeutung haben, mit einer gegebenenfalls N-geschützten Aminosäure der Formel

H₀N-CH-CO-H
² ' ² (VII)

CH₀-A-R

worin A und R vorstehende Bedeutung haben, in Dimethylformamid in Gegenwart von N-Methylmorpholin bei Raumtemperatur gekuppelt, um nach Entfernen der Schutzgruppen eine Verbindung der Formel (I) zu ergeben.

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Äquivalente zu den freien Octapeptiden der Formel (I) im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind deren nichttoxische pharmazeutische verträgliche Säureadditionssalze.

Zu den Salzen gehören solche, die von anorganischen Säuren abstammen, wie Salzsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure; und von organischen Säuren, wie Essigsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure und verwandte Säuren.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind pharraakologisehe Mittel, die sich insbesondere als Angiotensinhib.itoren eignen„ und sind außerdem vorteilhaft im Hinblick auf ihr günstigesJAntagonist/Agonist-Verhältnis. Ihre Inhibit or ei genschaft wird durch die Wirkung in nachstehenden Versuchen demonstriert:

200 bis 250 g schwere unbefruchtete Charles River-Rattenweibchen wurden 2H und 48 Stunden vor ihrer Verwendung mit 1 mg/kg Diäthylstilbesterol, gelöst in Maisöl, subkutan injiziert. Die Ratben wurden durch zervikale Dislokation getötet, der Uterus entfernt und ein Abschnitt der Gebärmutterhörner in einem 2 ml-Gewebebad befestigt, das eine modifizierte Tyrode-Lösung enthielt, die bei 30°C gehalten wurde und durch die 95£iger Sauerstoff und 5£iges Kohlendioxid geblasen wurde. Eine Reihe von Kontrollkontraktionen wurde durch abwechselnde Zugabe von Angiotensin II, antidiuretisches Hormon (ADH) und Bradykinin ausgelöst. Anstelle der reinen Tyrode-Lösung wurde dann einejLösung der Te st verbindung verwendet,und die Behandlungskontraktionen wurden nach einer Gleichgewichtseinstellungszeit von 15 oder 30 Minuten er-

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halten. Während -der Gleichgewichtseinstellungszeit wurden in regelmäßigen Zeitabständen Kontraktionen ausgelöst, um die Zeitabschnitte der Agonistzugaben aufrechtzuerhalten. Es wurde der Durchschnittswert von 3 Kontroll- und 3 Behandlungskontraktionen festgestellt, um die mittlere prozentuale Veränderung zu erhalten. Die Verbindung wurde als wirksam bewertet, wenn sie eine bedeutende Verringerung der Kontraktionen bewirkte, die durch die Wirkung des Agonisten hervorgerufen wurden.

Der Blutdruck wurde bei Charles River-Albinoratten gemessen, die mit Pentobarbitalnatrium (50 mg/kg) anästhetisiert und mit Phenoxybenzamin (30 mg/kg) und Propanolol (15 mg/kg) vorbehandelt wurden, während die Körpertemperatur auf 32 C gehalten wurde. Der Druck wurde mit einem Linear-Kerndruck-Umwandler des Typs P-IOO Physiograph von der großen Halsschlagader aufgenommen. Beide Jugularvenen wurden mit Kanülen versehen, wobei eine Vene zur Infusion von Antagonisten und die andere für Bolusinjektionen von Angiotensin II verwendet wurde. Vor jedem Test der Antagonisten wurde eine Angiotensin II-Dosis-Empfindlichkeitskurve bestimmt, so daß jedes Tier als sein eigenes Kontrolltier diente. Eine weitere Gruppe von Tieren wurde getestet, um die Wirkungen einer 15minütigen Placebo-Infusion von Salzlösung auf Angiotensin II-Empfindlichkeiten zu bestimmen. Nach Bestimmung der Angiotensin-II-Dosis-Empfindlichkeitskurve wurde eine Placebo- oder Inhibitor-Infusion eingeleitet und 15 Minuten lang aufrechterhalten. Unmittelbar nach der Infusion wurde die Dosis-Empfindlichkeitskurze wiederholt. Im Falle von Angiotensin II wurde die Dosis-Empfindlichkeitskurve während der Infusion und dann unmittelbar danach in einem Versuch ermittelt, um die Dauer der Inhibierung zu bestimmen. Die

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relative Wirksamkeit wird dadurch bestimmt, daß man das Verhältnis der berechneten Dosen von Angiotensin II, die erforderlich sind, um den Blutdruck um 25 mm/Hg zu erhöhen, vor und nach dem Inhibitor vergleicht.

Eine Gruppe von 7 Kaninchen wurde chirurgisch mit chronischen aortischen und venösen Dauerkathedern versehen, durch eine Modifizierung der Methode nach Bazaral et al., J. Appl. Physiol., 29, 113 (1970). Man ließ die Kaninchen sich von dem chirurgischen Eingriff erholen, währenddessen sie periodisch in das Labor gebracht wurden, um sie an die Behandlungsund erforderlichen Einsperrprozeduren zu gewöhnen. Der Blutdruck wurde durch den aortischen Katheder gemessen _t und die Injektionen wurden durch den Jugularkatheder gemacht. Blutdruckempfindlichekeiten wurden auf einem 4-Kanal-Bürstenrekorder (Modell ^i40) aufgenommen.

Am Tag des Testes wurden die Tiere an einer Aufnahmeeinrichtung angeschlossen,und man ließ sie sich mindestens 30 bis 60 Minuten stabilisieren, bevor man die Injektionen fortsetzte. Kontrollempfindlichkeiten wurden mit Angiotensin-II erhalten, das intravenös in einer Dosis von 1 mcg/kg vor der intramuskulären Verabreichung der Testverbindung verabreicht wurde.

Die Dosen des Agonisten wurden 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 120, 150 und 180 Minuten nach jeder Dosis der Testverbindung wiederholt. Die mittleren Empfindlichkeiten während jeder Periode wurden für jede Behandlung berechnet und statistisch mit dem mittleren Kontrollwert verglichen, unter Verwendung von Students Test bei einer 95#igen Zuverlässigkeit (P<OjO5). Die Verbindung wurde als wirksam bewertet,

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wenn sie die Wirksamkeit des Agonisten in dem vorstehend genannten statistischen Zuverlässigkeitsgrad inhibiert.

Nachstehende Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. In diesen Beispielen werden die Materialmengen als Gewichtsteile angegeben, außer, wenn etwas anderes vermerkt ist. Das Verhältnis zwischen Gewichtsteilen und Volumenteilen ist das gleiche wie zwischen Gramm und Millilitern. NMR-Spektren wurden mit einem 60 mega-Hertz-Instrument bestimmt, unter Verwendung von Tetramethylsilan als Bezugssubstanz und werden in Hertz (Zyklen je Sekunde) angegeben. Spezifische Drehungswerte beziehen sich auf die D-Linie des Natriums (589 nm), wobei das Lösungsmittel Wasser ist, bei Raumtemperatur. Bei den spezifischen Drehungen werden die Konzentrationen (c) in g/cm^ angegeben.

Beispiel 1

211 Teile S-Benzy!cystein wurden in 2000 Volumenteilen Dimethylformamid suspendiert.und 101 Teile N-Methylmorpholin wurden zugesetzt. kj>k Teile tert.-Butoxycarbonylprolin-2,4,5-trichlorphenylester wurden zugesetzt und das Gemisch 48 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Es entstand eine klare Lösung. Der größte Teil des Dimethylformamids wurde unter stark vermindertem Druck bei 40⁰C abdestilliert. Der rückständige Sirup wurde mit 2000 Volumenteilen Äthylacetat verdünnt. Die Lösung wurde 4 χ mit je 2000 Volumenteilen 0,2M Kaliumbisulfat gewaschen, die organische Schicht über wasserfreien Natriumsulfat getrocknet und das Äthylacetat unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wurde

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26Q28Q3

mit Äther geschüttelt, wobei man ein weißes Pulver erhielt. Mit Hilfe des NMR-Spektrums wurde die Struktur des Produktes als

BzI
I

Boc-Pro-Cys

identifiziert.

40,8 Teile dieses Materials wurden in 200 Volumenteilen eiskalter Trifluoressigsäure gelöst. Die ursprüngliche heftige Gasentwicklung klang nach etwa 15 Minuten ab,und man ließ die Lösung 1 Stunde lang bei Raumtemperatur stehen. Die Trifluoressigsäure (TPA) wurde unter vermindertem Druck ^! abdestilliert und der Rückstand mit Äther verrieben. Pro-(BzI)Cys·TFA wurde als weißer Peststoff erhalten.

,42,2 Teile des vorstehenden Salzes, Pro-(BzI)Cys·TFA, wurden in 220 Volumenteilen Dimethylformamid gelöst,und 20,2 Teile N-Methylmorpholin wurden zugesetzt. Die klare Lösung wurde dann mit 58,8 Teilen N,im-bis-(tert.-Butoxycarbonyl)histidin-2,4,5-trichlorphenylester versetzt,und man ließ die Reaktion 24 Stunden bei Raumtemperatur fortschreiten. DünnschichtChromatographie zeigte, daß sich das gesamte Prolyl-S-benzylcystein umgesetzt hatte. Das Dimethylformamid wurde unter stark vermindertem Druck bei ¹IO⁰C abdestilliert und der rückständige Gummi in 1 000 Volumenteilen Äthylacetat gelöst. Die Äthylacetatlösung wurde 4 χ mit je 1000 Volumenteilen 0,2M Kaliumbisulfat gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Äthylacetat unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückst an djwur de in

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- 12 - 2802803

100 Volumenteilen Äthylacetat gelöst und in 2000 Volumenteile Äther unter sehr schnellem Rühren getropft. Das dabei entstehende weiße Pulver hatte die Formel

Boc BzI
ι 1
Boc-His-Pro-Cys

64,5 Teile dieses Produktes, N,im-bis(tert.-Butoxycarbonyl)-histidyl-prolyl-S-benzylcystein wurden in 65 Volumenteilen Dioxan gelöst, auf 0°C gekühlt, wonach 130 Volumenteile 6m Salzsäure in Dioxan unter heftigem Rühren zugesetzt wurden. Nach wenigen Minuten begann das Produkt zu kristallisieren. Nach 2stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde das Produkt filtriert und mit 500 Volumenteilen?i§i?aschen, wobei man

Boc BzI
I I
His-Pro-Cys-HCl

erhielt.

544 Teile Carbobenzoxytyrosin-2,4,5-trichlorphenylester wurden einer Suspension von 13I Teilen Isoleucin in 2000 Volumenteilen Dimethylformamid zugesetzt. Nach Zugabe von 101 Teilen N-Methylmorpholin wurde das Gemisch 48 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Es lag noch nichtumgesetztes Isoleucin vor. 500 Volumenteile Wasser wurden zugesetzt und aas Rühren weitere 48 Stunden fortgesetzt. Das Gemisch wurde bei stark vermindertem Druck bei 40°C zur Trockne eingeengt.

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Der Rückstand wurde in 2000 Volumenteilen Äthylacetat gelöst, die Äthylacetatlösung 4 χ mit je 2000 Volumenteilen 0,2M Kaliumbisulfat gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Äthylacetat unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in 1000 Teilen Chloroform gelöst und die Lösung tropfenweise unter heftigem Rühren 20 000 Teilen Äther zugesetzt. 42,8 Teile des dabei entstehenden weißen Pulvers, Carbobenzoxytyrosylisoleucin,wurden in 500 Volumenteilen 90#iger Essigsäure gelöst und bei 4,22 kp/cm Druck bei Raumtemperatur über 4,3 Teilen Palladium'schwarζ hydriert. Die Wasserstoffaufnähme hörte nach 2 Stunden auf. Der Katalysator wurde abfiltriert und das Piltrat unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde mit Äther verrieben, wobei man Tyrosylisoleucin erhielt.

29.4 Teile Tyrosylisoleucin wurden in 300 Volumenteilen Dimethylsulfoxid suspendiert,und 10,1 Teile N-Methylmorpholin wurden zugesetzt. Es wurde Carbobenzoxyvalin-2,4,5-trichlorphenylester zugesetzt und das Gemisch 48 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die klare Lösung wurde in öOOOVolumenteile 0,1N Salzsäure gegossen und das Gemisch gerührt, bis das ursprünglich .ölige Produkt erstarrte. Das Rohprodukt wurde nach Waschen mit Wasser und Trocknen mit 1000 Teilen Äther gekocht. Das gewünschte Tripeptid, Carbobenzoxyvalyltyrosylisoleucin, Z-VaI-Tyr-He, wurde als weißes Pulver erhalten.

52.5 Teile dieses geschützten Tripeptide wurden in 500 Volumenteilen 90#iger Essigsäure gelöst und über 5,3 Teilen Palladium schwarz-Katalysator bei Raumtemperatur und 4,22 kp/cm Druck hydriert. Nach Entfernen des Katalysators

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- l4 -

wurde die Lösung zur Trockne abgestreift und der Rückstand mit 1000 Teilen Äther zerrieben. Das gewünschte Produkt, Valyltyrosylisoleucin, Val-Tyr-Ile, wurde erhalten.

93,2 Teile N^a-Carbobenzoxy-N^w,N^w-bis(isobornyloxycarbonyl)-arginin-2,4,5-trichlorphenylester wurden in 1000 Teilen Dimethylformamid gelöst. Erst wurden 39,3 Teile Valyltyrosylisoleucin und dann 10,1 Teile N-Methylmorpholin zugesetzt. Das Gemisch wurde 48 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die dabei entstehende klare Lösung wurde zu einem Gummi bei 40°C unter stark vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde in 2000 Volumenteilen Äthylacetat gelöst, die Äthylacetatlösung 4 χ mit 0,2M Kaliumbisulfat gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Äthylacetat wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mit Äther geschüttelt, wobei man ein weißes Pulver der Formel

(IbC)₂

Z-Arg-Val-Tyr-Ile

erhielt.

104,3 Teile dieses geschützten Tetrapeptide wurden in 2000 Volumenteilen 90-SSiger Essigsäure gelöst und über 10,5 Teilen Palladium-schwarz-Katalysator bei 4,22 kp/cm Druck und Raumtemperatur hydriert. Nachdem die Wasserstoffaufnähme aufgehört hatte, wurde der Katalysator entfernt und die Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde mit Äther verrieben, wobei man N ,N -Bis(isobornyioxycarbonyl)arginylvalyltyrosylisoleucin der Formel

(Ibc)_o

Arg-Val-Tyr-Ile
609831/1Q1 a

erhielt.

90 Teile des vorstehenden Tetrapeptide, 55,3 Teile Carbobenzoxyasparaginsäure-cc-(2,4,5-trichlorphenyl )ester-ß-(tert.-butyl)ester und 10,1 Teile N-Methylraorpholin wurden in 1000 Volumenteilen Dimethylformamid gelöst. Man ließ die Lösung 24 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen. Das Dimethylformamid wurde unter stark vermindertem Druck bei 40⁰C entfernt und der Rückstand in 2000 Volumenteilen Äthylacetat gelöst. Die Äthylacetatlösung wurde 4 χ mit 0,2M Kaliumbisulfat gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und da» Äthylacetat unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde gerührt und mit 2000 Volumenteilen Äther erhitzt, wobei man Carbobenzoxy-ß-(tert.-butyl)-asparagin-N^w,N^w-bis(isobornyloxycarbonyl)-arginylvalyltyrosylisoleucin der folgenden Formel

(Ibc) _o

I I ²

Z - Asp - Arg - VaI - Tyr - He

erhielt.

12,14 Teile dieses geschützten Peptide wurden in 120 Volumenteilen Dimethylformamid gelöst und 1,73 Teile N-Hydroxysuccinimid wurden zugesetzt. Die Lösung wurde auf 0°C gekühlt, und 2,27 Teile Dicyclöhexylcarbodiimid wurden zugesetzt. Die Lösung wurde 4 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach wenigen Minuten begann Dicyclohexylharnstoff auszufallen.

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Der rohe aktive Ester der Formel

(₀

I I ²

Z-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-ONSu

wurde zuerst mit 5,82 Teilen im-(tert.-Butoxycarbonyl)-histidylprolyl-S-benzylcysteinhydrochlorid und anschließend mit 2,02 Teilen N-Methylmorpholin versetzt. Das Gemisch wurde 48 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Dünnschichtchromatographie zeigte, daß während der letzten 24 Stunden keine Veränderung eingetreten war und daß eine kleine Menge des Tripeptide mit-dem endständigen C-Atom geblieben war. Das Gemisch wurde filtriert, um Dicyclohexylharnstoff zu entfernen,und das Filtrat unter stark vermindertem Druck bei 40°C zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in 100 Volumenteilen Methanol gelöst und die Lösung 2000 Volumenteilen 0,2M Kaliumbisulfat unter schnellem Rühren zugesetzt. Das dabei entstehende Pulver wurde filtriert, mit 2000 Volumenteilen Wasser gewaschen und getrocknet, wobei man das rohe Angiotensin II-Analog der folgenden Formel

OBu¹' (Ibc)- Boc BzI

i I ² I I

Z-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Cys. erhielt.

Zwei Teile dieses rohen Peptids wurden durch Gegenstromverteilung in n-Butanol/Essigsäure/Wasser 4:1:5 unter Verwendung einer automatischen Apparatur mit 240 Rohren und 3 ml-Phasen gereinigt. Die Abtrennung des gewünschten Produktes von Verunreinigungen erforderte 960 Durchgänge. Nach Vereinigung und

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Entfernen der entsprechenden Fraktionen wurden 1,41 Teile des homogenen Materials gewonnen. Auf dieser Basis ergab die letzte Kupplungsstufe eine Ausbeute von 68 %, Das NMR-Spektrum dieses Produktes stimmte mit der gewünschten Struktur überein.

1,219 Teile des vorstehenden geschützten Octapeptids wurde in 24 Volumenteilen Essigsäure gelöst, worauf 12 Volumenteile 6m Bromwasserstoff in Essigsäure zugesetzt wurden. Die Lösung wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der Rückstand erstarrte unter Äther. Das dabei entstehende Hydrobromid wurde in einem Mindestvolumen Wasser gelöst und auf eine Säule gegeben, die 100 Teile IRC-50, ein Carbonsäurekationenaustauscherharz, enthielt. Das Octapeptid wurde durch Lineargradient-Eluierung unter Verwendung von 0 bis 100 % Essigsäure erhalten. Das Gesamtvolumen an verwendetem Lösungsmittel betrug 3 l,und es wurden 10 ml-Fraktionen gesammelt.

Die das reine Material enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und die Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in 50 Volumenteilen Wasser gelöst und die Lösung lyophilisiert, wobei man Asparagyl-arginylvalyl-tyrosyl-isoleucyl-histidyl-prolyl-S-benzyl-cystein erhielt.

Beim Wiederholen des vorstehenden Verfahrens unter Verwendung des jeweiligen S-substituierten Cysteins, wurden folgende Produkte erhalten:

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Asparagyl-arginyl-valyl-tyrosyl-isoleucyl-histidyl-prolyl-S-(p-chlorbenzyl)cystein;

Asparagyl-arginyl-valyl-tyrosyl-isoleucyl-histidyl-prolyl-S-(p-methoxybenzyl)-cystein;

Asparagyl-arginyl-valyl-tyrosyl-isoleueyl-histidyl-prolyl-S-(p-äthoxybenzyL)-cystein;

Asparagyl-arginyl-valyl-tyrosyl-isoleucyl-histidyl-prolyl-S-(p-methylbenzy1)-cys tein;

Asparagyl-arginyl-valyl-tyrosyl-isoleucyl-histidyl-prolyl-S-(p-äthylbenzyl)-cystein;

Asparagyl-arginyl-valyl-tyrosyl-isoleucyl-histidyl-prolyl-S-(p-brorabenzyl)-cystein;

Asparagyl-arginyl-valyl-tyrosyl-isoleucyl-histidyl-prolyl-S-methyl-cystein;

Asparagyl-arginyl-valyl-tyrosyl-isoleucyl-histidyl-prolyl-S-(tert.-butyl)-cystein.

Beispiel 2

Beim Wiederholen des Verfahrens nach Beispiel 1 unter Verwendung der entsprechenden L-Aminosäuren und des entsprechenden S-substituierten Cysteins erhielt man folgende Produkte:

L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-

histidyl-L-prolyl-S-benzyl-L-cystein,

als ein weißes lockeres Pulver.

L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-

histidyl-L-prolyl-S-(p-chlorbenzyl)-Ii-eystein;

L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-

his tidyl-L-prolyl-S-(p-methoxybenzyl)-L-cystein;

L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-

histidyl-L-prolyl-S-(p-äthoxybenzyl)-L-cystein;

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L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidy1-L-prolyl-S-(p-methylbenzyl)-L-cystein; L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-S-(p-äthylbenzyl)~L-cystein; L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-S-(p-brombenzyl)-L-cystein; L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-S-methyl-L-cystein; L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-S-(tert.-butyl)-L-cystein.

Beispiel 3

Beim Wiederholen des Verfahrens nach Beispiel 1' unter Verwendung von Valin anstelle von Isoleucin erhielt man Asparagyl-arginyl-valyl-tyrosyl-valyl-histidyl-prolyl-S-benzyl-cystein.

Bei Verwendung der entsprechenden L-Aminosäuren erhielt man L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-S-benzyl-Ii-cystein, /.~~a_7_D = -68° in Wasser (c = 0,5).

Beispiel 4

Beim Wiederholen des Verfahrens nach Beispiel 1 unter Verwendung von Sarcosin anstelle Asparaginsäure und Valin anstelle von Isoleucin erhielt man Sarcosyl-arginyl-valyltyrosyl-valyl-histidy1-prolyl-S-benzyl-cystein.

Unter Verwendung der entsprechenden L-Aminosäuren erhielt man Sarcosyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidy1-L-proly1-S-benzy1-L-cystein.

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Beispiel 5

Beim Wiederholen des Verfahrens nach Beispiel 1 unter Verwendung von Sarcosin anstelle Asparaginsäure erhielt man Sarcosyl-arginyl-valyl-tyrosyl-isoleucyl-histidyl-prolyl-S-benzyl-cystein.

Unter Verwendung der entsprechenden L-Aminosäuren erhielt man Sarcosyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-S-benzyl-L-cysteini Das Produkt wurde durch NMR-Peaks in Deuterotrifluoressigsäure bei 503, 453, 444, 437, 429, 420, 412 und I87 Hertz characterisiert.

Bei der Verwendung von O-Phenäthyl-serin im Verfahren gemäß Beispiel 1 erhielt man Asparagyl-arginyl-valyl-tyrosyl-isoleucyl-histidyl-prolyl-O-phenäthyl-serin.

Unter Verwendung der entsprechenden L-Aminosäuren erhielt man L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidy1-L-prolyl-O-phenäthy1-L-serin.

Beispiel 7

4 Volumenteile 60%lge Perchlorsäure wurden tropfenweise unter Rühren bei Raumtemperatur einer Lösung aus 0,5 Teilen Ammoniummolybdat und 30 Volumenteilen Wasser zugesetzt. Die Lösung wurde etwa 5 Minuten lang gekocht und der sich bildende weiße Niederschlag abfiltriert. Das Piltrat wurde mit 22 Teilen S-Eenzyl-L-cystein versetzt und die Suspension in einen:

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Eisbad gekühlt, während 38 Volumenteile 3O£iges Wasserstoffperoxid tropfenweise unter Rühren zugesetzt wurden. Das Reaktionsgemische wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und der sich bildende Niederschlag abfiltriert, mit Wasser, Äthanol und Äther gewaschen und dann aus Wasser umkristallisiert, wobei man S-Benzyl-L-cysteinsulfon mit einem Schmelzpunkt von etwa 181 bis 184°C erhielt.

13,2 Teile des vorstehenden Produktes wurden in 100 Volumenteilen Wasser und 100 Volumenteilen Dioxan suspendiert. Diese Suspension wurde mit 13 »5 Volumenteilen ¹IN Natriumhydroxid und 8,6 Teilen tert.-Butoxycarbonylazid in einer Portion bei Raumtemperatur versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht mit 4N Natriumhydroxidlösung gerührt, die tropfenweise mit Hilfe eines automatischen Titrators zugesetzt wurde, um einen pH-Wert von 10,5 aufrechtzuerhalten. Dieses Reaktionsgemisch wurde dann mit 125 Volumenteilen 3N Zitronensäure versetzt und das ausgefallene Geraisch mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Schicht wurde abgetrennt und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und auf eine kleine Menge eingeengt, aus der N-ttert.-ButoxycarbonylJ-S-benzyl-L-cysteinsulfon auskristallisierte .

7,3 Teile des vorstehenden Produktes wurden in einer Lösung gelöst, die aus 250 Volumenteilen Äthanol und 200 Volumenteilen V/asser bestand. Diese Lösung wurde mit 3*^5 Teilen Cäsiumcarbonat in 25 Volumenteilen in einer Portion unter Rühren bei Raumtemperatur versetzt. Diese Lösung wurde etwa weitere 5 Minuten gerührt und das Lösungsmittel abgedampft.

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Der Rückstand wurde in einer kleinen Menge Wasser gelöst und gefriergetrocknet, wobei man Cäsium-N-(tert.-butoxycarbony l)-S-benzyl-L-cysteinsulfon erhielt.

20 Teile chlormethyliertes Polystyrol-l£-Divinylbenzolharz wurden mit 8,56 Teilen Cäsium-N-Ctert.-butoxycarbonyD-S-benzyl-L-cysteinsulfon in l60 Volumenteilen Dimethylformamid bei 55°C etwa 24 Stunden lang gerührt. Das Gemisch wurde dann filtriert und nacheinander mit Dimethylformamid, Äthanol, Essigsäure, Äthanol und Methylenchlorid gewaschen und dann unter vermindertem Druck getrocknet, wobei man das N-(tert.-Butoxycarbonyl)-S-benzyl-L-cysteinsulfon-chlormethylierte Polystyrol-1#-Divinylbenzolharz-Produkt erhielt. Elementar-und Aminosäureanalysen zeigten, daß das Produkt 0,6 maq./g N-(tert.-Butoxycarbonyl)-S-benzyl-L-cysteinsulfon enthielt.

15 Teile des vorstehenden Produktes wurden mit 37#iger Trifluoressigsäure in Methylenchlorid etwa 30 Minuten lang behandelt und anschließend mit 5#igem Triäthylamin in Methylenchlorid neutralisiert, um die tert.-Butoxycarbony1-schutzgruppe zu entfernen. Das ungeschützte Aminosäureharzprodukt wurde mit 3,9 Teilen N-(tert.-ButoxycarbonyI)-L-prolin in Gegenwart von 3,7 Teilen Dicyclohexylcarbodixmid in Methylenchlorid etwa 16 Stunden lang gekuppelt, worauf die tert.-Butoxycarbony!schutzgruppe wie vorstehend beschrieben entfernt wurde, wobei man das L-Prolyl-S-benzyl-L-cysteinsulfonharzprodukt erhielt. Dieses Dipeptidharz wurde nacheinander mit 14,2 Teilen N-(tert.-Butoxycarbcro'l)-

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im-(2,4-dinitrophenyl)-L-histidin, 8,6 Teilen N-(tert.-Butoxycarbonyl)-L-isoleucin, 13,4 Teilen N-(tert.-Butoxycarbonyl)-0-benzyl-L-tyrosin, 7,8 Teilen N-(tert.-Butoxycarbonyl)-L-valin, 11 Teilen N^a-(tert.-Butoxycarbonyl)-L-nitroarginin und 13,8 Teilen N-(tert.-Butoxycarbonyl)-ßbenzyl-L-asparaginsäure auf gleiche Weise gekuppelt, wobei man das ß-Benzyl-L-asparagyl-L-nitroarginyl-L-valyl-O-benzyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-im-(2,M-dinitropheny1)-L-histidyl-L-prolyl-S-benzyl-L-cysteinsulfonharzprodukt erhielt. Das Octapeptidharzprodukt wurde mit 95 Volumenteilen Dimethylformamid, 20 Volumenteilen Triäthylamin und 5 Volumenteilen 2-Mercaptoäthanol etwa 1 1/2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, filtriert und nacheinander 3 x mit Dimethylformamid, Äthylacetat, Methylenchlorid und Methanol gewaschen und anschließend unter vermindertem Druck bei 5O°C getrocknet. Das erhaltene Produkt wurde mit einem Gemisch, das aus Fluorwasserstoffsäure und Anisol im Verhältnis von 10:1 bestand, etwa 3 Minuten lang bei 0⁰C behandelt. Die Fluorwasserstoffsäure und das Anisol wurden dann unter vermindertem Druck entfernt und das rohe Octapeptid mit Gemischen aus Wasser und Essigsäure extrahiert und dann hydrolysiert. Das Rohprodukt wurde durch Gegenstromverteilung und Ionenaus tausch Chromatographie gereinigt, wobei man L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-S-benzyl-L-cysteinsulfon erhielt.

Beispiel 8

Ein Gemisch aus 21,1 Teilen S-Benzyl-L-cystein, 500 Volurcenteilen Wasser und l40 Volumenteilen 30#igem Wasserstoffperoxid wurde auf einem Dampfbad 30 Minuten lang erhitzt.

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Das Reaktionsgemisch wurde dann schnell in einem Eisbad auf 15°C abgekühlt, wobei
als Niederschlag erhielt.

auf 15°C abgekühlt, wobei man S-Benzyl-L-cysteinsulfoxid

Wenn man im Verfahren des Beispiels J eine äquivalente Menge an S-Benzyl-L-cysteinsulfoxid verwendete, erhielt man L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidy1-L-prolyl-S-benzyl-L-cysteinsulfoxid.

Beispiel 9

9,5^ Teile des geschützten Heptapeptids (tert.-Butoxycarbonyl)-sarcosy1-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidy1-L-prolin_/wurden in 100 Volumenteilen Dimethylformamid gelöst, wonach 1,67 Volumenteile 6N Salzsäure in Dioxan zugesetzt wurden. Auf diese Weise wurde die Seitenkette von Arginin selektiv protoniert und die Bildung von Nebenprodukten während des Kuppeins verhindert. Diese Lösung wurde mit 2,96 Teilen S-Benzyl-L-cystein-tert.-butylester und anschließend mit 2,27 Teilen Dxcyclohexylcarbodiimid versetzt. Man ließ die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur stehen. Das Gemisch wurde filtriert, um Dxcyclohexylharnstoff zu entfernen,und das Piltrat unter kO C zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde mit Äther verrieben, wobei man einen körnigen Peststoff erhielt, der aus Methanol umkristallisiert wurde, wobei man (tert.-ButoxycarbonyD-aarcosyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-S-benzyl-L-cysteintert.-butylester erhielt. Das NMR-Spektrum dieses Produktes stimmte mit der gewünschten Struktur überein.

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12,4 Teile des vorstehenden geschützten Octapeptids wurden in 70 Volumenteilen Trifluoressigsäure bei 5°C gelöst, worauf man die Lösung 1 Stunde lang bei Raumtemperatur stehen ließ. Die Trifluoressigsäure wurde unter vermindertem Druck unter 4O°C entfernt und der Rückstand mit Äther verrieben, wobei man ein weißes Pulver erhielt.

50 Teile IR-45, ein schwach basisches Änxonenaustauschharz,wurr den in eine 1 cm-Säule gefüllt und in die Acetatform überführt, indem man 2000 Volumenteile 50#ige Essigsäure durch die Säule führte. Das vorstehende Octapeptid wurde in 100 Teilen 50#iger Essigsäure gelöst und die Lösung durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von 20 Volumenteilen je Stunde geführt. Die Säule wurde mit weiteren 100 Volumenteilen 50#iger Essigsäure gewaschen. Die Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck unterhalb 40 C entfernt. Der Rückstand wurde in 50 Volumenteilen Wasser gelöst und die Lösung lyophilisiert, wobei man Sarcosyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidy1-L-preIyI-S-benzyl-L-cystein als weißes Pulver erhielt. Das NMR-Spektrum dieses Produktes stimmte mit der gewünschten Struktur überein.

Beispiel 10

Nachstehend werden typische pharmazeutische, die erfindungsgemäßen Verbindungen enthaltende Formulierungen beschrieben.

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Tabletten

Bestandteile Menge (mg)/l Tablette

Eine erfindungsgemäße Verbindung (z.B. Sarcosyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-S-benzyl-L-cystein) 0,1

Lactose 60,0

Maisstärke 17,1

Polyvinylpyrrolidon 2,4

Magnesiurastearat 0,4

Der Wirkstoff wurde in Isopropylalkohol gelöst und auf Lactose verteilt. Das Gemisch wurde luftgetrocknet und durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 0,42 mm gegeben. Maisstärke und Polyvinylpyrrolidon wurden dem Gemisch zugesetzt, sorgfältig vermischt und durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 0,42 mm gegeben. Das Gemisch wurde dann mit Isopropylalkohol granuliert, auf Trockenbleche gesprüht und bei 49°C 16 Stunden lang getrocknet. Das getrocknete Granulat wurde dann gesiebt. Das Granulat wurde sorgfältig mit Magnesiumstearat vermischt und das Gemisch zu Tabletten verpreßt.

Kapseln

Bestandteile Menge (mg)/l Kapsel

Eine erfindungsgemäße Verbindung (z.B. Sareosyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-S-benzyl-L-cystein) 0,1

Maisstärke 72,7

Lactose 72,7

Talk 4,5

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Der Wirkstoff wurde sorgfältig mit Maisstärke und Lactose vermischt, durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von Ο,Ί2 ram gegeben und nochmals vermischt. Es wurde Talk zugesetzt und das Gemisch sorgfältig vermischt und in entsprechende Hartgelatinekapseln mit Hand oder Maschine gefüllt unter Verwendung von 150 mg Füllstoff je Kapsel.

Andere pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe zur Verwendung in den vorstehenden Formulierungen sind beispielsweise Zucker, wie Lactose, Saccharose, Mannit oder Sorbit; Stärken, wie Maisstärke, Tapiocastärke oder Kartoffelstärke; Cellulosederivate, wie Natriumcarboxymethylcellulose, Äthylcellulose oder Methylcellulose; Gelatine; Calciumphosphate, wie Dicalciumphosphat oder Tricalciumphosphat; Natriumsulfat; Calciumsulfat; Polyvinylpyrrolidon; Polyvinylalkohol; Stearinsäure; Erdalkalimetallstearate, wie Magnesiumstearat; Stearinsäure-haltige Pflanzenöle, wie Erdnußöl, Baumwolleamenöl, Sesamöl, Olivenöl oder Maisöl; oberflächenaktive Stoffe (nichtionische, kationische, anionische); Äthylenglykolpolymere; ß-Cyclodextrin; Fettalkohole; hydrolysierte Getreidefeststoffe; sowie andere nichttoxische verträgliche Füllstoffe, Binder, Sprengmittel und Gleitmittel, wie sie üblicherweise in pharmazeutischen Formulierungen verwendet werden.

Suppositorien

Bestandteile Menge (mg)/Suppositorium

Theobroma-Öl (Kakaobutter) 249,9

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Die Kakaobutteifwurde geschmolzen, vorzugsweise auf einem Wasser- oder Dampfbad, um überhitzung zu vermeiden, und anschließend wurde der Wirkstoff in der Schmelze suspendiert, Schließlich wurde die Masse in gekühlte Metallformen, die verchromt waren, gegossen, wobei die Schmelze schnell erstarrte.

Andere pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe für ein Suppositorien-Produkt sind beispielsweise Triglyceride von Olein-, Palmitin- und Stearinsäuren ( Kakaobutter), partiell hydriertes Baumwollsamenöl, verzweigtkettige gesättigte Fettalkohole, wie Supposxtoriengrundstoff G, hydrierte Kokosnußöl-triglyceride von C --C₁n-Fettsäuren, wasserdxspergierbare Vehikel, wie die Polyäthylenglykole, Glycerin, Gelatine, Polyoxyl-40-stearate, Polyäthylen-4-sorbitanmonostearate und Materialien, die den Schmelzpunkt des Suppositoriengrundstoffs erhöhen können, wie Bienenwachs, Spermaceti usw.

Parenteral

Bestandteile Menge (mg)/5

Wasser zur Injektion, U.S.P. q.s. 5»0

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Der Wirkstoff wurde in Wasser zur Injektion gelöst, die Lösung filtriert, in Ampullen gefüllt und die Ampullen wurden versiegelt. Die Ampullen wurden durch ein geeignetes Sterilisationsverfahren sterilisiert.

Andere pharmazeutisch verträgliche Trägerstoffe für ein parenterales Produkt sind beispielsweise Pflanzenöle, wie Erdnuß-, Mais-, Baumwollsamen- oder Sesamöl, Benzylalkohol, Kochsalzlösungen, Phosphatpuffer, Äthylenglykolpolymere, Harnstoff, Dimethylacetamid,Triton, Dioxolane, Äthylcarbonat, Äthyllactat, Glycerinformal, Isopropylmyristat, oberflächenaktive Mittel (nichtionisch, kationisch, anionisch), Polyalkohole oder Äthanol.

In den vorstehend beschriebenen Formulierungen liegen die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer Menge vor, von der man denkt, daß sie die gewünschte Wirkung hervorruft. Obgleich 0,1 mg je Dosierungseinheit oft zweckmäßig ist, kann gegebenenfalls wesentlich mehr oder WBnig&Wirkstoff in jede Dosierungseinheit eingearbeitet werden. Die tägliche Dosis dieser Verbindung hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie von der jeweiligen verwendeten Verbindung, vom Zweck, für den die Verbindung verabreicht wird und von der Empfindlichkeit des jeweiligen Patienten.

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Claims

Patentansprüche

worin X einen Sarcosin- oder Asparaginsäurerest, Y den Isoleucin- oder Valinrest, A ein Sauerstoffatom, einen Thio-, SuIfinyl- oder Sulfonylrest und R einen Alkylrest mit 1 bis 7 C-Atomen, einen Aralkylrest der Formel

worin m 1 oder 2 und W ein Wasserstoff- oder Halogenatom oder einen Alkylrest mit 1 bis 4 C-Atomen sind, oder einen Alkoxyrest mit 1 bis k C-Atomen bedeuten, wobei die Aminosäurereste stereochemische L- oder DL-Konfiguration besitzen.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin die Aminosäuren die stereochemische L-Konfiguration besitzen _Λ

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3. Verbindung der Formel

X-Arg-Val-Tyr-Y-His-Pro-NH-CH-CC^H

worin X und Y vorstehende Bedeutung haben, W¹ ein Wasserstoff- oder Halogenatom bedeutet und die Aminosäurereste stereochemische L- oder DL-Konfiguration besitzen.

4. Verbindung nach Anspruch 1, worin X einen Asparaginsäurerest und Y einen Isoleucinrest bedeuten.

5. L-Asparägyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucy1-L-histidyl-L-prolyl-S-benzyl-L-cystein.

6. Sarcosyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-S-benyzl-L-cystein.

7. L-Aspragy1-L-arginyl-L-valy1-L-tyrosy1-L-isoleucy1-L-histidyl-L-prolyl-S-Cp-chlorbenzylJ-L-cystein.

8. L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-O-phenäthyl-L-serin.

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Verfahren zur Herstellung einer der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) einen aktiven Ester des N-geschützten Peptids mit einem gegebenenfalls N-geschützten Peptid oder einer Aminosäure in der entsprechenden Reihenfolge kuppelt, wobei die Reaktion in einem polaren, nichtprotischen Lösungsmittel in Gegenwart einer organischen Base bei Raumtemperatur durchgeführt wird, und anschließend die N-Schutzgruppen entfernt oder

b) eine Verbindung der Formel

Arg-Val-Tyr-Y-His-Pro-NH-CH-CO-Polymer-Träger (III)

-R

CH_n-A-I

worin Y, A und R vorstehende Bedeutung haben, mit N-geschützter Sarcosin- oder Asparaginsäure in einem polaren, nichtprotischen Lösungsmittel in Gegenwart eines Dehydratisierungsmxttels bei Raumtemperatur kuppelt und anschließend den Polymer-Träger entfernt.

10. Verfahren nach Anspruch 9 zur Herstellung von L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-S-benzyl-L-cystein, dadurch gekennzeichnet, daß man N-Carbobenzoxy-ß-(tert.-butyl)-L-asparagy1-N^W,N^w-bis-(isobornyloxycarbonyl)-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosy1-L-isoleucin-succinimidylester mit im-(tert.-Butoxycarbonyl)-L-histidyl-L-prolyl-S-benzyl-L-cystein in Dimethylformamid in Gegenwart von N-Methylmorpholin kuppelt und anschließend die Schutzgruppen entfernt.

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11. Verfahren nach Anspruch 9 zur.:· Herstellung von Sarcosyl-L-arginy1-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidy1-L-proly 1-S-benzyl-L-cystein, dadurch gekennzeichnet, daß man Sarcosyl-N^w,N^w-bis(isobornyloxycarbonyl)-L-arginy1-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucin-succinimidylester mit im-(tert.-Butoxycarbonyl)-L-histidy1-L-proly1-S-benzyl-L-cystein in Dimethylformamid in Gegenwart von N-MethyI-morpholin kuppelt und anschließend die Schutzgruppen entfernt.

12. Verfahren nach Anspruch 9 zur Herstellung von L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-S-(p-chlorbenzyl)-L-cystein, dadurch gekennzeichnet, daß man N-Carbobenzoxy-ß-(tert.-butyl)-L-asparagyl-N^w,N -bis(isobornyloxycarbonyl)-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L--isoleucin-succinimidylester mit im-(tert.-Butoxycarbonyl)-L-histidyl-L-prolyl-S-(p-chlorbenzyl)-L-cystein in Dimethylformamid in Gegenwart von N-Methylmorpholin kuppelt und anschließend die Schutzgruppen entfernt.

13. Verfahren nach Anspruch 9 zur Herstellung von L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidy1-L-proly 1-O-phenäthyl-Ii-serin, dadurch gekennzeichnet, daß man N-Carbobenzoxy-ß-(tert.-butyl)-L-asparagy1-N^W,N^W-bis(isobornyloxycarbonyl)-L-arginyl-L-valy1-L-tyrosyl-L-isoleucin-succinimidylester mit im-(tert.-Butoxycarbonyl)-L-histidyl-L-prolyl-O-phenäthyl-L-serin in Dimethylformamid in Gegenwart von N-Methylmorpholin kuppelt und anschließend die Schutzgruppen entfernt.

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14. Verfahren nach Anspruch 9 zur Herstellung von L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-S-benzyl-L-cystein, dadurch gekennzeichnet, daß man L-Arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-S-benzyl-L-cystein auf einem Polymer-Träger mit N-geschü£zter Asparaginsäure in Methylenchlorid in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid kuppelt und anschließend die Schutzgruppe und den Polymer-Träger entfernt.

15. Verfahren nach Anspruch 9 zur Herstellung von Sarcosyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-S-benzyl-L-cystein, dadurch gekennzeichnet₉ daß man L-Arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-S-benzyl-cystein auf einem Polymer-Träger mit N-geschütztem Sarcosin in Methylenchlorid in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid kuppelt und anschließend die Schutzgruppe und den Polymerträger entfernt.

16. Verfahren nach Anspruch 9 zur Herstellung von L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleueyl-L-histidyl-L-prolyl-S-(p-chlorbenzyl)-L-cystein, dadurch gekennzeichnet, daß man L-Arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-S-(p-chlorbenzyl)-L-cystein auf einem Polymer-Träger mit N-geschützter Asparaginsäure in Methylenchloriä in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid kuppelt und anschließend die Schutzgruppe und den Polymer-Träger entfernt.

17. Verfahren nach Anspruch 9 sur Herstellung von L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-O-phenäthyl-L-serin, dadurch gekennzeichnet, daß rr.an

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L-Arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-O-phenäthyl-L-serin auf einem Polymer-Träger mit N-geschützter Asparaginsäure in Methylenchlorid in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid kuppelt und anschließend die N-Schutzgruppe und den Polymer-Träger entfernt.

18. Pharmazeutisches Mittel, enthaltend eine oder mehrere der Verbindungen der Ansprüche 1 bis 8 gegebenenfalls zusammen mit üblichen Hilfs- und Trägerstoffen.

19. Veterinärmedizinisches Mittel, enthaltend eine oder mehrere der Verbindungen der Ansprüche 1 bis 8 gegebenenfalls zusammen mit üblichen Hilfs- und Trägerstoffen.

Für: G. D. Seavlfß & Co.

f, V.St.A

'-.Ή. $ .Wolff Rechtsanwalt

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