DE2558090A1 - Verfahren zur herstellung von 4-androsten-3,17-dion-derivaten - Google Patents

Verfahren zur herstellung von 4-androsten-3,17-dion-derivaten

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Description

Verfahren zur Herstellung von 4— Androsten-3sl7~d.ion-Derivaten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 4-Androsten-3,17-dion-Derivaten der allgemeinen Formel I
(D,
X eine 1,2-Methylengruppe oder eine in der 1- oder 2-Stellung befindliche Methylgruppe darstellt, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Sterin-Derivat der allgemeinen Formel II
(II),
worin X die obengenannte Bedeutung besitzt, die Bindung eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung bedeutet und R-, den
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8 bis 10 Kohlenstoff atome enthaltenden Kohlenwasserstoffrest eines Sterins darstellt,
mit einem zum Seitenkettenabbau von Sterinen befähigten Mikroorganismenkultur fermentiert.
Unter einem 8 bis 10 Kohlenstoff atome enthaltenden Kohlenwasserstoffrest E-, soll ein Rest verstanden werden, wie er in den gegebenenfalls hydrierten Seitenketten von natürlich vorkommenden Zoo- oder Phytosterinen, wie zum Beispiel Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, Brassicasterin oder den Sitosterinen vorliegt.
Geeignete Sterin-Derivate der allgemeinen Formel II sind beispielsweise solche Verbindungen, die durch die allgemeine Formel II a
?2
(II a),
worin X und ..... die obengenannte Bedeutung besitzen und Rg ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe oder eine Ithylgruppe bedeutet, charakterisiert werden können.
Geeignete Ausgangsverbindungen für das erfindungsgemäße Verfahren sind beispielsweise solche Sterine, in denen der Substituent X eine Ια-Methyl gruppe, eine lß-Methyl gruppe, eine lcc,2a-Methylengruppe oder eine lß,2ß-Methylengruppe bedeutet. Als geeignete
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* 2S5B09Q
Ausgangsverbindungen seien beispielsweise genannt: das 1α-Methyl~ 4-cholesten-3-on, das lß-Methyl-4—cholesten-3-on, das 1α,2α-Methylen-4~cholesten-3-on, das Ια,2a-Methylen-4-,6-cholestadien-3-on, das Ια-Methyl-^--stigmasten^-on, das la,2a-Methylen-4-stigmasten-3-on,das lal2a-Methylen-4,6-stigmastadien-3-on oder die entsprechenden Sitosterinderivate.
Es ist bekannt, daß zahlreiche Mikroorganismen (so zum Beispiel solche der Gattungen Arthrobacter, Brevibacterium, Microbacterium, Protaminobacter, Bacillus, Norcardia, Streptomyces und insbesondere Mycobacterium) die natürliche Fähigkeit besitzen, Zoo- und Phytosterine zu Kohlendioxyd und Wasser abzubauen und daß bei diesem Abbau intermediär 4—Androsten-3,17-dion und 1,4—Androstadien-3,17-<ϋon gebildet werden.
Ferner ist bekannt,, daß es mithilfe von Inhibitorzusätzen oder mutierten Mikroorganismen möglich ist, den Abbau der Sterine so zu lenken, daß ein Abbau des gebildeten 4—Androsten-3,17-dions oder l,4-Androstadien-3i 17-CLi-CmS vermieden wird (siehe deutsche Offenlegungsschriften 1 5^3 269 und 1 593 327 sowie US-Patentschrift 3 684 657).
Für den Fachmann ist es überraschend, daß unter den bekannten Bedingungen auch die Seitenketten von Sterin-Derivaten der allgemeinen Formel II abgebaut werden, weil bekannt ist, daß der Seitenkettenabbau von Sterinen durch ein sehr komplexes Fermentsystem bewirkt wird und man nicht erwarten konnte, daß alle am Seitenkettenabbau natürlicher Steroide mitwirkenden Enzyme die Fähigkeit besitzen, auch den Seitenkettenabbau der in der Natur
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nicht vorkommenden Sterin-Derivate der allgemeinen Formel II zu "bewirken. Darüberhinaus konnte man nicht vorhersehen, daß die den Abbau des l,4-Androstadien-3,17-dions und des 4—Androsten-3,17-dions bewxrkenden Enzymsysteme nicht befähigt sind, die 4-Androsten-3,17-dion-Derivate der allgemeinen Formel I abzubauen.
Bei der fermentativen Umsetzung von Sterin-Derivaten der allgemeinen Formel II mit einer Δ -Doppelbindung wird diese überraschenderweise hydriert.
Abgesehen von der Verwendung anderer Ausgangsverbindungen und von der Tatsache, daß die Umsetzung in Abwesenheit von Inhibitoren durchgeführt werden kann, wird das erfindungsgemäße Verfahren unter den gleichen Fermentationsbedingungen durchgeführt, welche man auch bei den bekannten mikrobiologischen Seitenkettenabbau-Reaktionen von Sterinen anwendet.
Erfindungsgemäß wird die Fermentation unter Verwendung der Mikroorganismenkulturen durchgeführt, welche man üblicherweise zum Seitenkettenabbau von Sterinen verwendet. Geeignete Kulturen sind beispielsweise zum Seitenkettenabbau von Sterinen befähigte Bakterienkulturen der Gattungen Arthr ob act er, Brevibacterium, Microbacterium, Protaminobacter, Streptomyces oder insbesondere der Gattung Mycobacterium. Als geeignete Mikroorganismen seien beispielsweise genannt: Microbacterium lactum IAM-1640, Protand.no— bacter alboflavus IAM-1040, Bacillus roseus IAM-1257, Bacillus
- 5 709827/0986
ßphäricus A!M?O-7O55, Norcardia gardneri IAM-105, Norcardia minima IAM-374-, Norcardia corallina IFO-3338, Streptomyces rubescens IAM-74- oder insbesondere die Mikroorganismen Mycobacterium avium IFO-3082, Mycobacterium phlei IFO-3158, Mycobacterium phlei (Institut für Gesundheitswesen, Budapest Nr. 29), Mycobacterium phlei ATCC-354-, Mycobacterium smegmatis IFO-3084-, Mycobacterium smegmatis ATCC-20, Mycobacterium smegmatis' (Institut für Gesundheitswesen, Budapest Nr. 27), Mycobacterium smegmatis ATCC-19979i Mycobacterium fortuitum CBS-49566, Mycobacterium spec. NERL-B-3805 und Mycobacterium spec. NEEL-B-3683.
Unter den für diese Mikroorganismen üblicherweise verwendeten Kulturbedingungen werden in einem geeigneten Nährmedium unter
Belüften, Submerskulturen angezüchtet. Dann setzt man den Kulturen. das Substrat (in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst oder vorzugsweise in emulgierter Form) zu und fermentiert, bis eine •maximale Substratumwandlung erreicht ist.
Geeignete Substratlösungsmittel sind beispielsweise Methanol, Äthanol, Glykolmonomethyläther, Dimethylformamid oder Dimethylsülfoxyd). Die Emulgierung des Substrats kann beispielsweise bewirkt werden, indem man dieses in mikronisierter Form oder in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel (wie Methanol, Äthanol, Aceton, Glykolmonomethyläther, Dimethylformamid oder Dimethylsulfοxyd) gelöst unter starker Turbulenz in (vorzugs-
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weise entkalkt em) Wasser, welches die üblichen Emulgationshilf en enthält, eindüst. Geeignete Emulgationshiifen sind nichtionogene Emulgatoren, wie zum Beispiel Äthylenoxydaddukte oder Fettsäureester von Polyglykolen. Als geeignete Emulgatoren seien die handelsüblichen Netzmittel Tegin^R\ Tagat^, Tween^' und ßpanv ' beispielsmäßig genannt. '
Die optimale Substratkonzentration, Substratzugabezeit und Fermentationsdauer ist von der Struktur des verwendeten Substrates und der Art des verwendeten Mikroorganismus abhängig. Diese Größen müssen, wie dies bei mikrobiologischen Steroidumwandlungen allgemein erforderlich ist, im Einzelfall durch Vorversuche, wie sie dem Fachmann geläufig sind, ermittelt werden.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren herstellbaren 4—Androsten-3i17-dion-Derivate der allgemeinen Formel I sind wertvolle Zwischenprodukte zur Synthese pharmakologisch wirksamer Steroide. So kann man beispielsweise die 17-Ketogruppe der 4-Androsten-3,17-dion-Derivate, gegebenenfalls nach Eetalisierung der 3-Oxogruppe reduzieren oder mit einer metallorganischen Verbindung der allgemeinen Formel IV
(IV),
worin R^ einen niederen gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffrest darstellt und Me ein Alkalimetall atom oder ein Magnesiumhaiοgenidrest bedeutet, umsetzen und erhält nach Abspaltung der gegebenenfalls vorhandenen Ketalgruppe, die 17ß-
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Hydroxy-A-androsten-3-on-Derivate der allgemeinen Formel III
. OH
worin X die obengenannte Bedeutung besitzt und R, das gleiche wie R^, bedeutet oder ein Wasserstoff atom darstellt.
Unter einem niederen gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoff rest R, soll vorzugsweise ein Methylrest, ein Äthylrest, ein Vinylrest oder ein Ithinylrest verstanden werden.
Die Reduktion der 17-Ketogruppe der 4~Aadrosten-3,17-dion-Derivate der allgemeinen Formel I erfolgt mittels der dem Fachmann wohlbekannten Arbeitsmethode (siehe zum Beispiel John Fried: Organic Reactions in Steroid Chemistry-van Nostrand Reinhold Comp. New York etc. 1972, Volume 1, Seite 61 ff). So kann man diese Verbindungen beispielsweise nach Ketalisierung mit Fat riumborhydrid oder Lithiumaluminiumhydrid umsetzen und erhält nach Spaltung der Ketale die entsprechenden 17ß-Hydroxy-4-androsten-3-on-Derivate der allgemeinen Formel III, welche bekanntlich eine anabole und/oder androgene Wirksamkeit besitzen.
Ebenso bekannt sind die Methoden, die 17-Ketogruppe zu alkyl i er en (siehe zum Beispiel John Fried: Organic Reactions in Steroid Chemistry - van Nostrand Reinhold Comp., New York etc. 1972, Volume 2, Seite 55 ££)· So kann man die 4-Androsten-3,17-dion-Derivate der
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allgemeinen Formel I gegebenenfalls nach Ketalisierung der 3-0xogruppe beispielsweise mit Alkylmagnesiurahalogeniden Vinyllithium oder Alkalimetallacetyliden umsetzen und erhält nach Spaltung der gegebenenfalls vorhandenen Ketalgruppen die 17aR-17ß-hydroxy-4-androsten-3-on-Derivate der allgemeinen Formel III, welche bekanntlich pharmakologisch wirksame Substanzen sind oder Zwischenprodukte zur Herstellung von pharmakologisch wirksamen Steroiden.
Die als Ausgangsverbindungen verwendeten Sterin-Derivate der allgemeinen Formel II können aus den entsprechenden Sterinen mittels der Methoden hergestellt werden, welche man konventionellerweise zur Einführung der entsprechenden 1- und/oder 2-ständigen Substituenten in Steroide anwendet.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.
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A) Ausführungsb ei spiele betreffend den mikrobiologischen Seitenkettenabbau
Beispiel 1
Ein 2 1 Erlenraeyerkolben mit 500 ml sterilem Nährmedium, enthaltend 1% Hefe extrakt, 0,4-5 % Dinat riumhydro genpho sphat, 0,54- % Kaliumdihydrogenphosphat und 0,2 % Tween'E' 80 - eingestellt auf pH = 6,7 wird mit einer Suspension einer Mycobacterium spec. NEEL B-3805 Trockenkultur beimpft und drei Tage lang bei J0° C mit 190 Umdrehungen pro Minute geschüttelt.
20 Erlenmeyerkolben mit jeweils 100 ml sterilen Nährmediums, enthaltend 2,0 % Corn steep liquor, 0,5 % Di ammoniumhydro genpho sphat und 0,25 % Tween^ 80 - eingestellt auf pH = 6,5 - werden mit jeweils 5 ml der Mycobacterium spec. Anzuchtskultur beimpft und 24 Stunden lang bei 30° G mit 220 Umdrehungen pro Minute geschüttelt.
Dann setzt man jeder Kultur 100 mg l<x,2cc-Methylen-4,6-cholestadien-3-on in 1 ml Dimethylformamid gelöst zu und fermentiert weitere 96 Stunden lang bei 30° C.
Die vereinigten Kulturen werden mit Äthylenchlorid extrahiert, der Extrakt im Vakuum eingeengt, der Rückstand durch Chromatographie über eine Ki es el gel säule gereinigt und man erhält, nach Umkristallisation aus Diisopropyläther 0,9g la,2a-Methylen-4-androsten-3»17-dion vom Schmelzpunkt 155° C.
- 10 709827/0986
Herstellung der Ausgangsverbindung:
a) 111 g 3ß-Hydroxy-5-cholesten werden in 2,2 1 Toluol und 111 ml Cyclohexan zum Sieden erhitzt und eine Lösung von 55»5 g Aluminiumsopropylat in 666 ml Toluol zugetropft, anschließend wird 90 Minuten bei langsamen Abdestillieren weiter erhitzt. Die abgekühlte Reaktionslösung wird mit Äther verdünnt, mit verdünnter Schwefelsäure und Wasser gewaschen und eingeengt. Der Rückstand wird mit Wasserdampf destilliert und das nach Methylenchloridexfcraktion erhaltene Rohprodukt an Silicagel chromatographiert. Aus Methanol umkristallisiert werden 70 g 4-Cholesten-3-on vom Schmelzpunkt 79 - 80,5° 0 erhalten.
b) 60 g 4-Cholesten-3-on werden in 2 1 Äther und 1 ml Bromwasserstoffsäure in Essigsäure 37 %ig gelöst und unter Rühren mit einer Lösung von 52,4 g Brom in 300 ml Essigsäure versetzt und 15 Minuten nachgerührt. Es wird dann noch mit etwas Äther verdünnt und nacheinander mit Wasser, Natrxumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen und Eindampfen wurden 90 g rohes 2,6-Dibrom-4—cholesten-3-on als öl erhalten.
c) 90 g rohes 2,6-Dibrom-4-cholesten-3-on werden in 900 ml Dimethylformamid mit 36,9 g Lithiumcarbonat und 43,3 g Lithiumbromid 20 Stunden bei 100° C gerührt. Es wird dann in Eiswasser eingerührt, der Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und in Methylenchlorid aufgenommen. Nach dem Trocknen und Eindampfen wird der Rückstand an Silicagel chromatographiert und es werden 42 g l,4,6-Cholestatrien-3-on als öl erhalten.
709827/0986 - Il -
d) 3119 g Trimethylsulfoxoniumjodid werden in 1 1 Dimethylsulfoxid mit 5»6 g pulverisiertem Natriumhydrid 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Diese Lösung wird dann zu 40 g 1,4,6-Cholestatrien-3-on, gelöst in 200 ml absolutem Tetrahydrofuran, gegeben und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Es wird in essigsaures Eiswasser eingerührt, vom ausgeschiedenem öl abdekantiert und dieses dann in Äther aufgenommen. Nach dem Trocknen und Eindampfen werden nach Chromatographie umkristallisiert aus Methanol 10,5 g loc,2a-Methylen-4,6-cholestadien-3-on vom Schmelzpunkt 68 - 69 C.
Beispiel 2
In 20 Erlenmeyerkolben werden unter den Bedingungen des Beispiels jeweils 100 mg la-Methyl-4-cholesten-3-on mit einer Mycobacterium spec. NRRL B 3805 Kultur umgesetzt aufbereitet und man erhält das α-Methyl-4-androsten-3il7-cl.io:n vom Schmelzpunkt 134-137° 0«
Das als Ausgangsverbindung verwendete loc-Methyl-4-cholesten-3-on ist bekannt (CA. 61, 1964, 8367 f).
- 12 -
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B) Ausführungsbeispiele betreffend die chemische Weiterverarbeitung der 4~Andro sten-3,17-dion-Derivat e.
Beispiel 1
3,2 g la,2a-Methylen-4-androsten-3»17~dion werden in 50 ml absolutem Äthanol gelöst, auf 0° abgekühlt und anteilweise mit 0,5 g Natriumborhydrid versetzt. Nach einer Reaktionszeit von 3 Stunden bei Eiskühlung wird in 50 ml halb ge satt igte Natriumdihydrogenphosphatlösung eingerührt, das ausgefallene Produkt abfiltriert und mit Wasser ausgewaschen. Nach Umkristallisieren aus Äthanol erhält man 1,95 g 17ß-Hydroxy-la,2a-methylen-zl—androsten-3-on, die nach Acetylierung mit Acetanhydrid-Pyridin bei Raumtemperatur das stark anabol wirksame 17ß-Acetoxy-la,2a-methylen-4,6-androsten-3-on ergeben. (Arzneim. Forschung IJ?, 1168 (1965)).
Beispiel 2
Unter den Bedingungen des Beispiels 1 wird das la-rMethyl-4— androsten-3,17-dion in das stark anabol wirksame 17ß-Acetoxy-la-methyl-4-androsten-3-on überführt. (Arzneim. Forschung jL5_, 1168 (1965)).
- 13 -
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Claims (3)

SCHERING AG Gewerblicher Rechtsschutz Patentansprüche
1) Verfahren zur Herstellung von 4-Androsten-3,17-dion-Derivaten der allgemeinen iOrmel I
(D,
worin
X eine 1,2-Methylengruppe oder eine in der 1- oder 2-Stellung
befindliche Methylgruppe darstellt,
dadurch gekennzeichnet,
daß man ein Sterin-Derivat der allgemeinen Formel II
(II),
worin X die obengenannte Bedeutung besitzt, die Bindung eine Einfachbindung oder eine Doppelbindung bedeutet und R-^ den
709827/0986 - 14 ORIGINAL INSPECTED
Vorstand: Dr. Christian Bruhn · Hans-Jürgen Hamann · Dr. Heinz Hannse
Karl Otto Mittelstenscheid · Dr. Horst Witzel Steife: Dr. Herbert Asmis
Vorsitzender des Aufsichtsrats: Dr. Eduard v. Schwartzkoppen SHz der Gesellschaft Bertin und Bergkamen
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H3 ED IV 170«
8 bis 10 Kohlenstoff atome enthaltenden Kohlenwasserst off rest eines Sterins darstellt,
mit einer zum Seitenkettenabbau von Sterinen befähigten Mikroorganismenkultur fermentiert.
2) Verfahren zur Herstellung von 17ß-Hydroxy-4-androsten-3-on-Derivaten der allgemeinen Formel III
worin
X eine 1,2-Methylengruppe oder eine in der 1- oder 2-Stellung befindliche Methylgruppe und R, ein Wasserstoffatom oder einen niederen gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffrest bedeutet,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die 17-Ketogruppe eines gemäß Anspruch 1 hergestellten 4-Androsten-3,17-dion-Derivats der allgemeinen Formel I gegebenenfalls nach Ketalisierung der 3-Oxogruppe reduziert oder mit einer metallorganischen Verbindung der allgemeinen lOrmel IV
4 (IV),
worin R^, einen niederen gesättigten oder ungesättigten Kohlen-
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wasserstoffrest und Me ein Alkalimet all atom oder einen Magnesiumhalogenidrest darstellt, umsetzt und eine gegebenenfalls in der 3-Stellung vorhandene Ketalgruppe spaltet.
3) Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Fermentation eine zum Seitenkettenabbau von Sterinen befähigte Mikroorganismenkultur der Gattungen Arthrobacter, Brevibacterium, Microbacterium, Protaminobacter, Bacillus Norcardia, Streptomyces oder insbesondere der Gattung Mycobacterium verwendet.
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