DE2530898A1 - Sulfonsaeuresalze von s-adenosylmethionin, verfahren zu deren herstellung und die genannten salze enthaltende therapeutische zusammensetzungen - Google Patents

Description

PATENTANWALT* PROF. DR. DR. J. REITSTÖTTER O C O Π O Q Q DR.-ING. WOLFRAM BUNTE L 0 O U O CJ 0 DR. WERNER KINZEBACH

Ο··ΟΟΟ MÖNCHEN AO, BAUERaTRAMB XZ · FERNRUF (Ο·θ) 97 ·Β SS · TELEX BS1B2OS ISAR O POSTANSCHRIPTi D-SOOO MÜNCHEN 43, POSTFACH 7SO

München, den 10. Juli 1975 M/16 170

EUROTERAPICI S.A.S. Via Marcona 37, Mailand, Italien

Sulfonsäuresalze von S-Adenosylmethionin, Verfahren zu deren Herstellung und die genannten Salze enthaltende therapeutische

Zusammensetzungen

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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue von S-Adenosy!.methionin und organischen Sulfonsäuren sowie gemischte Salze der letzteren, von Schwefelsäure und S-Adenosylmethionin, auf ein Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende therapeutische Zusammensetzungen. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf neue, extrem stabile Salze von S-Adenosyl-L-methionin (SAM), auf ein Verfahren zu deren einfacher und ökonomischer Herstellung in industriellem Maßstab und auf neue pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese als aktiven Bestandteil enthalten, zur Verwendung auf zahlreichen Gebieten der menschlichen Therapie.

SAM ist bekanntlich ein Produkt natürlichen Ursprungs, das in allen lebenden Organismen von Bakterien bis Pflanzen, von einzelligen Organismen bis zu höheren Säugetieren einschließlich Menschen gefunden wird; seine Struktur ist seit

es
einiger Zeit bekannt und/wird durch die folgende Formel

identifiziert;
NH,

CH- NH₀

,3 ,2

CH-CH-CH-CH-CH₀-S-CH₉-CH₀-Ch-COOH

Il

OH OH
0 1 X"

worin X einjbeliebiges Anion ist.

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In lebenden Organismen wird SAM durch die Einwirkung von Enzymen (S-Adenosylmethioninsynthetase oder S-Adenosyltransferase) im cytoplasmatischen Bereich ausgehend von Methionin vermutlich mit den Nährstoffen oder von ATP, das in jeder lebenden Zelle als Energiereserve vorhanden ist, gebildet.

Seit geraumer Zeit ist auch bekannt, das SAM ein Produkt von fundamentaler Wichtigkeit bei einer großen Anzahl von biologischen Reaktionen der enzymatisehen Transmethylierung ist, weswegen es immer als sehr wichtiges Reagens in der Biochemie angesehen wurde.

Das große Problem mit dieser Substanz war jedoch immer ihre extreme Instabilität bei oder oberhalb Umgebungstemperaturen, und die Verfahren zu deren Herstellung sind sehr arbeitsaufwendig und können nicht leicht im industriellen Maßstab durchgeführt werden.

In den letzten Jahren war die auf die Stabilisierung von SAM in einem derartigen Ausmaß, um seine Verwendung auf dem Gebiet der biologischen Forschung möglich zu machen, gerichtete Forschung auf die Herstellung von Salzen gerichtet, die unter normalen Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen stabil sind. Auf diese Weise wurden das Chlorid und das Sulfat von SAM hergestellt, jedoch sind sie lediglich als Reagentien in der Biochemie und lediglich während kurzer Zeiträume verwendbar, da sogar im trockenen Zustand ihre Stabilität zeitmäßig auf niedrige Temperaturen beschränkt ist. Weiterhin sind ihre Herstellungsverfahren zur Produktion

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<4

geringer Mengen anwendbar, jedoch sicherlich nicht für die Produktion im industriellen Maßstab.

Es wurden nun völlig überraschenderweise neue Salze von SAM gefunden, die zeitmäßig bei Temperaturen bis zu 45°C unbeschränkt stabil sind und die durch ein neues Verfahren hergestellt werden können, das leicht ökonomisch im industriellen Maßstab unter Erzielung hoher Ausbeuten durchgeführt werden kann, überraschenderweise wurde gefunden, daß diese Salze auf vielen Gebieten der menschlichen Therapie eine starke Heilwirkung besitzen, wobei zwischen ihnen oft keine offensichtliche Wechselbeziehung besteht. Die neuen Salze gemäß der vorliegenden Erfindung sind Doppelsalze von SAM mit Sulfonsäuren entsprechend der Formel

SAM.4RSO₃H,

worin RSO₃H eine der folgenden Säuren ist: Methansulfon, CH₃SO₃H; Äthansulfon, C₂H₅SO₃H; n-Dodecansulfon, C₁₂H ,-SO₃H; 1-Octadecansulfon, C.gH -SO₃H; 2-Chloräthansulfon, ClC₂H₄SO₃H; 2-Bromäthansulfon, BrC₂H₄SO₃H; 2-Hydroxyäthansulfon, HOC₂H₄SO₃H; 3-Hydroxypropansulfon, HOC₃H₆SO^H; d,1-1O-Kampfersulfon, C₁₀H₁₇OSO₃H; d-, 1-, d,l-3-Bromkampfer-10-sulfon, C₁₀H₁₆BrOSO₃H; Cystein, C₃HgNSO₃H. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Salze von SAM mit Sulfonsäuren entsprechend der allgemeinen Formel

SAM.3RSO₃H,

worin RSO₃H eine der folgenden Säuren ist: Benzolsulfon, C₆H₅SO₃H; p-Chlorbenzolsulfon, ClCgH₄SO₃H; 2-Mesitylbenzol-. sulfon, (CH₃J₃CgH₂SO₃H; 4-Biphenylsulfon, C-^i₀ ⁸⁰S¹*'*

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1-Naphthalinsulfon, C₁₀H₇SO₃H; 2-Naphthalinsulfon, C₁₀H₇SO₃H; 5-Sulfosalicyl, C₇H₅O₃SO₃H; p-Acetylbenzolsulfon, CgH₇OSO₃H. Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf Salze von SAM mit den folgenden Säuren: 1,2-Äthandisulfon entsprechend der Formel

SAM.2C₃H₄(SO₃H)₂; o-Benzoldisulfon entsprechend der Formel

SAM.1,5C₆H₄(SO₃H)₂ und Chondroitinschwefel entsprechend der Formel

SAM.4C₁₄H₂₁NO₁₄S.

Schließlich bezieht sich die Erfindung auf die folgenden Doppelsalze zwischen Schwefelsäure und einer der oberwähnten Sulfonsäuren entsprechend den allgemeinen Formeln: SAM⁺.HSO₄".H₂SO₄.RSO₃H und SAM⁺.HSO₄".H₂SO₄.2RSO₃H, worin RSO₃H eine der oberwähnten Sulfonsäuren bedeutet oder die äquivalente Säure im Falle der Äthandisulfon-, o-Benzoldisulfon- oder Chondroitinschwefelsäure darstellt.

Der durch diese neuen Salze erzielte große technische Fortschritt besteht in ihrer Stabilität während eines langen Zeitraumes bei 45t im trockenen Zustand.

Der SAM-Gehalt aller Säuren gemäß der vorliegenden Erfindung bleibt sogar nach 360 Tagen bei 45°C im trockenen Zustand unverändert. Die beiden bis jetzt bekannten stabilsten Salze von SAM, das Chlorid und das Sulfat, zeigen nach 30 Tagen bei 45°C im trockenen Zustand einen SAM-Gehalt von 20 bzw. 50 %; nach 60 Tagen ist ersteres völlig zersetzt, während das Sulfat lediglich 5 % des ursprünglichen SAM enthält.

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Das Verfahren zur Herstellung der neuen Salze gemäß der vorliegenden Erfindung besteht im wesentlichen aus folgenden Stufen:

a) Herstellung einer an SAM reichen Lösung entweder durch Extrahieren aus natürlichen Substanzen, die dieses enthalten, oder durch enzymatische Synthese aus Adenosintriphosphat (ATP) und Methionin.

b) Ausfällung des in der filtrierten wässerigen Lösung vorhandenen SAM durch eine gesättigte wässerige Lösung von Picrolonsäure oder durch Lösungen der gleichen Säure in in Wasser löslichen organischen Lösungsmitteln, wie Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, η-Butyl· oder Isobutylalkohol·; oder Aceton, Methyläthylketon, Methylisobutylketon, Äthylacetat, Tetrahydrofuran, 2-Methoxyäthanol, 2-Äthoxyäthanol, Dioxan oder Dimethylformamid.

c) Lösen des filtrierten Niederschlags in einer Lösung einer der oberwähnten Säuren in Alkohol, wie Methanol, Äthanol, 1-Propanol, 2-Propanol, 1-Butanol, 2-Butanol, sek.Butanol, 2-Methoxyäthanol oder 2-Äthoxyäthanol. ;

d) Zusetzen eines mit dem verwendeten Alkohol mischbaren organischen Lösungsmittels, wie Benzol, Toluol, Diäthyläther, Diisopropylather, Aceton, Methyläthylketon, Methylisobuty lketon, Äthyl- oder Methylacetat, Tetrahydrofuran oder Chloroform zu der Lösung.

e) Abtrennen der organischen Flüssigkeit und erneutes Lösen des Niederschlages in einer Lösung der in Stufe c) verwendeten Säure in einem der Alkohollösungsmittel der Stufe c) und Behandeln der Lösung mit Aktivkohle.

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f) Zusetzen eines organischen Lösungsmittels, das das reine SAM-SaIz in einer gutkristallinen und leicht filtrierbaren Form ausfällen kann, aus der Gruppe der in Stufe d) angegebenen, zu der Lösung.

Die ersten beiden Stufen des Verfahrens zur Gewinnung der Doppelsalze mit Schwefelsäure sind identisch, während die nachfolgenden Stufen wie folgt durchgeführt werden können: c¹) Lösen des filtrierten Niederschlages in einer Mischung, bestehend aus gleichen Volumsteilen eines Lösungsmittels, das mit Wasser teilweise mischbar ist, wie Methyläthylketon, Methylisobutylketon, n-Butanol oder Isobutanol, und einer wässerigen Lösung gleicher Normalität einer der oberwähnten Sulfonsäuren und Schwefelsäure.

d¹) Abtrennen der organischen Schicht und Zusetzen eines Ketons oder eines alkoholischen Lösungsmittels, das in Wasser vollständig löslich ist, zu der wässerigen Lösung. e¹) Erneutes Lösen des Niederschlages in einer 10 bis 20 %igen Lösung der in Stufe c¹) verwendeten Säure in einem der alkoholischen Lösungsmittel der Stufe c) und Behandeln der Lösung mit Aktivkohle.

f) Zusetzen eines organischen Lösungsmittels, das das reine SAM in einer gut kristallinen und leicht filtrierbaren Form ausfällen kann..

Gemäß einer Ausführungsform werden die Doppelsalze

dadurch erhalten, daß das am Ende der oberwähnten Stufe d) erhaltene einfache Salz folgenden Schritten unterworfen wird:

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e") Erneutes Lösen des Niederschlages in einer wässerigen Lösung gleicher Normalität der Schwefelsäure und der in der vorhergehenden Stufe c) verwendeten Säure und Behandeln der Lösung mit Aktivkohle.

f") Zusetzen eines organischen Lösungsmittels, das das reine SAM-SaIz in einer gut kristallinen und leicht filtrierbaren Form aufallen kann.

Wie angegeben, kann die Stufe a) des Verfahrens auf verschiedene Weisen durchgeführt werden, die alle für die Zwecke der Gewinnung einer konzentrierten SAM-Lösung gleich wirksam sind.

Gemäß einer Ausführungsform wird Hefe (Saccharomyces Cerevisiae, Torulopsis utilis, Candida utilis usw.), die durch Zusatz von Methionin unter geeigneten Bedingungen mit SAM angereichert ist (Schlenk, Enzymologia 29, 283 (1965)), mit Äthylacetat und dann mit Schwefelsäure mit einer Normalität von 0,1 bis 0,5, vorzugsweise 0,35, bei Umgebungstemperatur behandelt, wodurch die Auflösung der Zellen und das Inlösunggehen von praktisch 100 % des vorhandenen SAM bewirkt wird.

Vorzugsweise werden Mengen an Wasser und Acetat von 1/20 bis 1/5 des Gewichtes der feuchten Zellen verwendet^ und die Behandlung wird für 15 bis 45 Minuten, vorzugsweise für 30 Minuten, fortgesetzt.

Dann wird Schwefelsäure zugesetzt und die Auflösung .wird für eine Stunde bis 2 Stunden, vorzugsweise für 1 1/2

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fortgesetztes sei bemerkt, daß die Auflösung der Hefezellen, die mit einer Mischung des organischen Lösungsmittels und verdünnter Schwefelsäure durchgeführt wird, wesentlich zweckmäßiger ist als jene, die gewöhnlich mit Perchlorsäure bei Umgebungstemperatur oder mit Ameisen- oder Essigsäure bei 6O⁰C und dergleichen bewirkt wird, da sie nicht nur bei Umgebungstemperatur stattfindet, was für die Stabilität des SAM sehr günstig ist, sondern auch unter derartigen Bedingungen erfolgt, daß die Lösung leicht von den Zellrückständen filtriert werden kann und keinerlei Verunreinigungen enthält, die vorhanden sind, wenn andere Auflösungsmittel verwendet werden, und gemäß den bekannten Verfahren zur herstellung von reinem SAM schwer zu entfernen sind.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die Stufe a) dadurch durchgeführt, daß das SAM durch enzymatische Synthese durch Einwirkung des Enzyms ATP-Methionin-Adenosy.ltransferase (E.C. 2.4.2.12) auf eine Adenosyltriphosphat (ATP) und Methionin enthaltene Inkubationsmischung hergestellt wird. '

Die wesentliche Bedingung für die industrielle Durchführung dieses Verfahrens ist, daß das Enzym rein und in einer Form ist, die sowohl von der ursprünglichen Inkubationsmischung als auch vom gebildeten SAM leicht isoliert wird.

Es wurde nun ein Verfahren zum Reinigen des Enzyms ATP-Methionin-Adenosyltransferase durch Affinitätschromatographie und eine Säulenreaktionsmethode gefunden,

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das die Erzielung der oberwähnten Vorteile ermöglicht.

Die Affinitätschromatographie des spezifischen Enzyms gemäß der vorliegenden Erfindung wird durch Filtrieren einer dieses enthaltenden Lösung, beispielsweise eines Rohextrakts von Hefe oder Escherichia coil durch eine Säule, die mit einem Trägerfeststoff gefüllt ist, an welchen eine Gruppe covalent gebunden ist, die als konkurrierender Inhibitor des Enzyms wirkt, durchgeführt.

überraschenderweise wurde gefiinden, daß eine ausgezeichnete Füllung für eine derartige Reinigungssäule aus einem aktivierten Gel von Polysacchariden besteht, an welches L-Lysinjcovalent gebunden worden ist. Die Affinität des spezifischen Enzyms für den an die feste Matrix gebundenen Lysinrest bewirkt eine Verzögerung bei der Eluierung des Enzyms durch die Säule, und somit ist es möglich, eine Trennung von den anderen Proteinen in einer sehr reinen Form zu erzielen.

Jedoch ergab die Trennung des Enzyms von dem Eluat, das dieses enthält, zur Verwendung bei der nachfolgenden ; enzymatischen Synthesestufe völlig unbefriedigende Ergebnisse, da, wenn es einmal abgetrennt ist, seine Stabilität mit der Zeit abnimmt und es außerdem nach lediglich einmaliger Verwendung bei der Synthese des SAM bei den .nachfolgenden SAM-Isoliervorgängen zerstört wird.

Es wurde nun gefunden, daß ausgezeichnete Ergebnisse erhalten werden, wenn anstelle dessen das das spezifische

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Enzym auf einem geeigneten Trägerfeststoff enthaltende Eluat adsorbiert und die katalytische Reaktion zwischen Methionin und ATP in der Säule durchgeführt wird, was zur Bildung des SAM führt. Ein geeigneter fester Träger besteht aus einem Polysaccharid, das durch ein zur Bindung von Proteinen an feste Träger geeignetes Reagens, wieCyanogenbromid, aktiviert ist.

Durch Filtrieren einer Lösung von ATP und Methionin in einer geeigneten Pufferlösung durch die Säule wird an der Basis der Säule ein das SAM enthaltendes Eluat erhalten.

Die Stufe b) des Verfahrens ermöglicht, daß das SAM in sehr reiner Form abgetrennt werden kann. Tatsächlich ist die einzige Verbindung, die durch Picrolonsäure in saurer Umgebung ausgeSllt wird, SAM, wie durch Dünnschichtchromatographie gemäß Anal.Biochem.4, 16-28 (1971) gezeigt.

Picrolonsäure hat somit eine außerordentlich und überraschend selektive Wirkung. Die anderen bisher zugesetzten Fällmittel, wie Pikrinsäure, Reineckesalz oder Borsäure,_

ergaben sehr unreine Niederschläge, so daß das SAM stets durch Ionenaustauschsäulenchromatographie, ein Verfahren, das außerordentlich kostspielig und industriell schwer durchzuführen ist, nachfolgend gereinigt werden mußte. Es ist auch sehr schwierig, das Produkt in der erforderlichen Reinheit zu erhalten.

Die Verwendung von wässerigen Picrolonsäurelösungen oder Lösungen dieser Säure in den oberwähnten organischen

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Lösungsmitteln ergibt keine besonderen Probleme und stellt einen Vorgang dar, der bei Umgebungstemperatur durchgeführt wird.

Die Stufe c) wird vorzugsweise mit Lösungen, die eine der oberwähnten Sulfonsäuren in Konzentrationen von 0,25 bis 1,5n, vorzugsweise in, enthalten, und mit einem der angegebenen alkoholischen Lösungsmittel durchgeführt. Die Zersetzung der SAM-Zufuhr mit der Picrolonsäure ist beendet, wenn der Feststoff zur Gänze gelöst ist.

Die Stufe d) des Verfahrens wird vorzugsweise unter Verwendung von 4 bis 10 Volumina (in Bezug af das Volumen der alkoholischen Lösung) eines Lösungsmittels aus der Gruppe Benzol, Toluol, Diäthyläther, Diisopropylather, Aceton, MethyIisobutylketon, Methyl- oder Äthylacetat oder Tetrahydrofuran durchgeführt.

Die Stufe e) des Verfahrens bildet mit der nachfolgenden Stufe f) den Endvorgang zur Gewinnung des gewünschten SAM-Salzes. Dieses Salz, das aus der vorhergehenden

Stufe d) stammt, wird in einer Lösung mit einer Normalität von 0,1 bis 0,5n, vorzugsweise 0,2n, der in der vorhergehenden Stufe c) verwendeten Säure in einem Lösungsmittel aus der Gruppe der Alkohole mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, 2-Methoxyäthanol und 2-Äthoxyäthanol wieder gelöst. Die nachfolgende Stufe f) wird vorzugsweise unter Verwendung von 4 bis 8 Volumina (in Bezug auf das Volumen der alkoholischen Lösung) eines organischen Lösungsmittels aus der Gruppe Benzol,

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Toluol, Diäthyläther, Diisopropylather, Aceton, Methyläthy1-keton, MethyIisobutylketon, Methyl- oder Äthylacetat, Tetrahydrofuran und Chloroform durchgeführt.

Die gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen einfachen SAM-Salze können im trockenen Zustand unbegrenzt praktisch ohne Änderung, wie bereits angegeben, aufbewahrt werden.

Das vorliegende Verfahren schließt Wasser in allen Stufen nach der Ausfällung mit Picrolonsäure aus, wodurch die völlige Abwesenheit minimaler Spuren von in Wasser löslichen Verunreinigungen gewährleistet ist. Doppelsalze von SAM mit Schwefelsäure und einer der Sulfonsäuren, die bei der ersten Ausführungsform angegebaisind, werden dadurch erhalten, daß vorzugsweise die Stufe c¹) des Verfahrens mit wässerigen Lösungen, die eine der oberwähnten Sulfonsäuren und Schwefelsäure in Konzentrationen zwischen 0,05 und 0,2n, vorzugsweise 0,1n, in einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser teilweise mischbar ist, wie Methyläthylketon

oder n-Butanol, durchgeführt wird. Die Verwendung des organischen Lösungsmittels ermöglicht, daß die wässerigen Säurelösungen sehr stark reduziert werden können und praktisch die gesamte Picrolonsäure entfernt wird. Die Stufe d¹) des Verfahrens wird dadurch durchgeführt, daß vorzugsweise 4 bis 8 Volumina (hinsichtlich des Volumens der wässerigen Lösung) eines Lösungsmittels aus der Gruppe Aceton, Methylalkohol, Äthylalkohol und Propylalkohol verwendet werden.

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Uberraschenderweise wurde auch gefunden, daß, wenn in Stufe e') die minimale Menge an Alkohol, der notwendig ist, den aus der Stufe d¹) stammenden Niederschlag zu lösen, verwendet wird, sich in der nachfolgenden Ausfällstufe f) das Doppelsalz SAM⁺.HSO₄".H₃SO₄.2R-SO₃H abtrennt.

Wenn jedoch in Stufe e') ein Alkoholvolumen verwendet wird, das zumindest das Doppelte des notwendigen Volumens beträgt, trennt sich in der nachfolgenden Ausfällstufe f) das Doppelsalz SAM⁺.HSO₄".H₃SO₄.R-SO₃H ab.

Die Verwendung von dazwischenliegenden Alkoholmengen führt zur Bildung von Mischungen der beiden Salze.

R-SO₃H bedeutet. eine der oberwähnten Sulfonsäuren oder die äquivalente Säure im Falle von Äthandisulfonsäure oder Chondroitinsulfonsäure.

Die Endausfällung des einen oder anderen der neuen Salze gemäß der vorliegenden Erfindung (Stufe f) erfordert die Verwendung eines organischen Lösungsmittels aus der Gruppe Benzol, Toluol, Diäthyläther, Diisopropyläther, Chloroform, Aceton, Methyläthylketon, MethyIisobutylketon, Methyl- oder Äthylacetat, Isoamylalkohol oder Tetrahydrofuran.

Wie oben angegeben, können die gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltenen Doppelsalze von SAM in trockenem Zustand praktisch·ohne Veränderung unbeschränkt aufbewahrt werden.

Die Herstellung der Doppelsalze von SAM mit Schwefelsäure und einer der oberwähnten Sulfonsäuren unter Anwendung der zweiten Ausführungsform besteht im Wiederauflösen

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(Stufe e") des in Stufe d) erhaltenen Salzes in einer Lösung gleicher Normalitäten, gewöhnlich zwischen 0,05 und O,2ri, vorzugsweise 0,1n, von Schwefelsäure und der in der vorhergehenden Stufe c) verwendeten Säure in einem der Alkohole mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder in 2-Methoxyäthanol oder 2-Äthoxyäthanol.

überraschenderweise wurde auch gefunden, daß, wenn in Stufe e") die minimale Menge an Alkohol, die notwendig ist, den von der Stufe d) stammenden Niederschlag zu lösen, verwendet wird, sich in der nachfolgenden Ausfällstufe f") das Doppelsalz SAM⁺.HSO₄".H₂SO₄.2R-SO₃H (worin R-SO₃H eine der Sulfonsäuren anzeigt oder die äquivalente Säure aus der Gruppe Athandisulfonsäure oder Chondroitinschwefelsäure darstellt) abtrennt.

Wenn jedoch ein Methanolvolumen in Stufe e") verwendet wird, das zumindest das Doppelte des notwendigen minimalen Volumens beträgt, scheidet sich in der nachfolgenden Ausfällstufe f") das Doppelsalz SAM⁺.HSO₄"".H₂SO₄.R-SO₃H ab.

Die Verwendung von dazwischenliegenden Alkoholmengen führt zur Bildung von Mischungen der beiden Salze.

Die Endausfällung des einen oder anderen der Doppelsalze (Stufe f") erfordert die Verwendung eines organischen Lösungsmittels aus der Gruppe Benzol, Toluol, Diäthyläther, Diisopropylather, Chloroform, Alkoholen mit 4 oder 5 Kohlenstoffatomen, Äthyl- und Methylacetat, Tetrahydrofuran,

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Aceton, Methyläthylketon und Methylisobutylketon.

Die folgenden Beispiele erläutern das Verfahren zur Herstellung der neuen Salze gemäß der Erfindung, ohne daß die Erfindung jedoch hierauf beschränkt sein soll.

Beispiel 1: Zu 90 kg an mit SAM angereicherter Hefe (6,88 g/kg) gemäß Schlenk (Enzymologia 29, 283 (1965)) wurden 111 Äthylacetat und 11 1 Wasser bei Umgebungstemperatur zugesetzt. Nach starkem Rühren während 30 Minuten wurden 50 1 0,35ii Schwefelsäure zugesetzt, wobei das Rühren weitere 1 1/2 Stunden fortgesetzt wurde. Nach Filtrieren und Waschen mit Wasser wurden 140 1 Lösung erhalten, die 4,40 g/l SAM enthielt, was 99,5 % des im Ausgangsmaterial vorhandenen SAM entspricht. Eine Lösung von 2,3 kg Picrolonsäure in 25 1 Methyläthylketon wurde zu der obigen Lösung unter Rühren zugesetzt. Nach Stehenlassen während einer Nacht wurde der Niederschlag abzentrifugiert und mit Wasser gewaschen.

Der Niederschlag wurde unter Rühren bei Umgebungs- . temperatur in 6,2 1 einer 1ri Lösung von Methansulfonsaure in Methanol gelöst. Nach Abfiltrieren von Spuren unlöslichen Materials wurden 5O 1 Aceton zur Lösung zugesetzt. Nach vollständiger Ablagerung des Niederschlages wurde die überstehende Lösung dekantiert und der unlösliche Rückstand mit ein wenig Aceton gewaschen.

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Der Niederschlag wurde in 25 1 einer O,25n Lösung von Methansulfonsäure in Methanol gelöst, Aktivkohle zugesetzt und die Lösung filtriert. 125 1 Methylisobutylketon wurden dem Filtrat zugesetzt.

1089 g eines gut kristallinen und leictt: filtrierbaren Salzes fielen aus, das zu mehr als 20 % in Wasser unter Bildung einer farblosen Lösung löslich ist. Das Salz war in üblichen organischen Lösungsmitteln nur schwach löslich. Aus der Dünnschichtchromatographie gemäß Anal.Biochem.4, 16-28 (1971) ging hervor, daß das Produkt frei von Verunreinigungen war. Die analytischen Daten sind in Tabelle I angegeben und entsprechen einer Verbindung der Formel

^C15^H23^N6°5^S-^4CH4°3^S·

Die neue Verbindung wurde auch durch die enzymatische Methode auf Basis von enzymatischer Methylierung von Nikotinamid und Guanidinessigsäure mit SAM identifiziert. (G.L.Cantoni, J.Biol.Chem. 189, 745 (1951); G.De La Hoba, B.A. Jameison, S.H. Mudd und H.H.Richards, J.Am.Chem.Soci 81, 3975 (1959).

Bei Wiederholung des Verfahrens, jedoch unter Verwendung von n-Dodecansulfonsäure und 1-n-Octadecansulfonsäure wurden Salze der folgenden Formeln erhalten:

^C15^H23^N6°5^S-^4C14^H26°3^{S und C}15^H23^N6^O5^S'^4C18^H38^O3^S' deren analytische Daten in Tabelle I angegeben sind.

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Beispiel 2: 1,15 kg Picrolonsäure, gelöst in 10 Isobutylalkohol, wurden zu 70 1 der von der Auflösung von Hefezellen stammenden Lösung zugesetzt, welche unter Verwendung des gleichen Rohmaterials und nach dem gleichen Verfahren wie im Beispiel 1 erhalten wurde.

Nach Stehenlassen während einer Nacht wurde der gebildete Niederschlag abzentrifugiert.

Der Niederschlag wurde unter Rühren bei Umgebungstemperatur in 3,1 1 einer Iti Lösung von Äthansulfonsäure in Äthanol gelöst. Nach Abfiltrieren einer kleinen Menge an unlöslichem Material wurden 25 1 Diäthyläther der Lösung zugesetzt. Nach Stehenlassen wurde die Mischung filtriert und der Feststoff mit ein wenig Äther gewaschen. Der Feststoff wurde in 12,5 1 einer O,25n Lösung von Äthansulfonsäure in Äthanol gelöst, Aktivkohle zugesetzt und die Mischung filtriert. 63 1 Benzol wurden dem Filtrat zugesetzt.

585 g Salz wurden ausgefällt, filtriert und getrocknet. Die Verbindung ist in Wasser zu mehr als 20 % löslich und in üblichen organischen Lösungsmitteln schwach löslich. Durch Dünnschichtchromatographie, wie in Beispiel 1, geht hervor, daß die Verbindung frei von Verunreinigungen ist. Die analytischen Daten sind in Tabelle I angegeben und ., entsprechen einem Produkt der Formel

^Ci5^H23^li6°5^S-^4C2^H6°3^S· Die nette Verbindung wurde auch durch die im Beispiel

1 angegebene enzymatische Methode identifiziert.

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Bei Wiederholung des Verfahrens auf identische Weise, jedoch unter. Verwendung von 2-Bromäthansulfonsäure und 2-Chloräthansulfonsäure wurden Salze der folgenden Formeln erhalten:

C₁5H₂₃N₆O₅S.4C₂H₅SO₃Br und C₁₅H₂₃N₆O₅S^C₂H₅SO₃Cl, deren analytische Daten in Tabelle I angegeben sind.

Beispiel 3: 1,15 kg Picrolonsäure, gelöst in 12 1 n-Butanol, wurden zu 70 1 einer Lösung, die von der Auflösung von Hefezellen stammt, welche durch das gleiche Auflösungsverfahren und mit dem gleichen Rohmaterial wie im Beispiel 1 erhalten wurde, zugesetzt. Nach Stehenlassen über Nacht wurde der Niederschlag abzentrifugiert. Der Niederschlag wurde bei Umgebungstemperatur unter Rühren in 3,1 1 einer 1n Lösung von D,L-1O-Kampferschwefelsäure in 1-Propanol gelöst. 25 1 Benzol wurden dann zugesetzt. Der abgetrennte Feststoff wurde in 12,5 1 einer O,25n Lösung von Kamperschwefelsäure in 1-Propanol gelöst und nach Zusetzen von Kohle und Filtrieren wurden 63 1 Aceton dem Filtrat zugesetzt.

Es wurden 928 g Salz erhalten. Die Verbindung däb in Wasser zu mehr als 20 % löslich und in üblichen organischen Lösungsmitteln nur schwach löslich. Aus der Dünnschichtchromatographie geht hervor, daß die Verbindung frei von Verunreinigung ist. *

Die analytischen Daten sind in Tabelle I angegeben und entsprechen einem Produkt der Formel

^C15^H23^N6^O5^S-^4C1O^H16°4^S·

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Die neue Verbindung wurde auch durch die im Beispiel 1 angegebene enzymatische Methode identifiziert.

Bei Wiederholung des Verfahrens auf identische Weise, jedoch unter Verwendung von d-3-Kampfer-iO-schwefelsäure wurde ein Salz der Formel

^C15^H23^N6°5^S-^4C1O^H15°4^SBr erhalten, dessen analytische Daten in Tabelle I angegeben

sind.

Beispiel 4: Reinigung des spezifischen Enzyms.

50 ml Sepharose (ein von der Fa. Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala-Schweden hergestelltes Polysaccharid) zusammengebackt und suspendiert in Wasser, wurden mit Cyanogen- ■ bromid in an sich bekannter Weise zwecks Bindung von Aminogruppen enthaltenden Substanzen an aus Polysaccharid bestehende Matrices behandelt. Dem so hergestellten Gel wurde ein Überschuß an L-Lysin zugesetzt. Nach der Reaktion wurde wiederholt mit destilliertem Wasser, mit einer pH-8,5-Puffermischung und mit einer pH-4,5-Puffermischung gewaschen. Dann wurde das Gel zum Füllen einer Kolonne mit einem Durchmesser von 1,5 cm und einer Höhe von 30 cm verwendet. Eine Puffermischung aus 0,05 M Triäthanolamin und 0,01 M H₃SO₄ mit einem pH-Wert von 8,0 wurde durch die Säule geleitet, bis ein vollständiges Gleichgewicht erreicht war. 2 ml das spezifische Enzym enthaltender Hefeextrakt, erhalten durch/Schallbehandlung oder durch Homogenisierung mit trockenem Eis und möglichst nach Anreicherung mit dem spezifischen Enzym, wurden auf der Säule abgelagert. Dann

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- Λβ -

wurde die Säule mit der gleichen Puffermischung, die zur Herstellung des Gleichgewichtes verwendet wurde, eluiert, worauf die Proteine im Eluat durch üV-spektrophotometrische Messungen verteilt wurden. Gleichzeitig wurde die Synthetaseaktivitat in den verschiedenen Fraktionen gemäß J.A.Stekol, Methods in Enzymology, Band 6, Seite 566 (1963), gemessen. Jene Fraktionen, die eine relevante Synthetaseaktivitat zeigten, wurden zusammengegeben, und die so erhaltene Lösung zeigte eine spezifische Aktivität, die zumindest 20-mal größer v/ar als jene des Rohextraktes. Das Enzym kann in dieser Lösung durch Ausfällung mit Salzen, mit organischen Lösungsmitteln oder gemäß anderen bekannten Verfahren zum Konzentrieren von Proteinlösungen vd.ter konzentriert werden.
Herstellung von SAM

30 ml gebacktes Sepharosegel wurden mit Cyanogenbromid oder durch irgend ein anderes Verfahren zum Binden von Proteinen an Polysaccharidgelmatrices aktiviert. 4 ml einer Lösung des spezifischen Enzyms, gereinigt wie oben beschrieben und enthaltend etwa 100 mg Protein, wurden dem aktivierten Gel zugesetzt. Die aktivierte Gelsuspension und die Enzymlösung wurden 18 Stunden lang bei 4°C gerührt. Das Harz wurde mit Wasser gewaschen. Die Waschflüssigkeit enthielt etwa 70 % der gesamten enzymatischen Aktivität, die anfänglich in der Lösung des spezifischen Enzyms vorhanden war. Durch Inkubation der Sepharose, hergestellt

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wie oben beschrieben, durch das oberwähnte Verfahren zum Bestimmen der Synthetaseaktivität, wurde beobachtet, daß annähernd 20 % der gesamten Aktivität an das Polysaaharid gebunden waren.

Die oben hergestellte Sepharose wurde zum Füllen einer Säule mit einem Durchmesser von 1,5 cm und einer Höhe von 20 cm verwendet. Eine 0,675 M Triäthanolamin, 0,150 M Magnesiumsulfat, 0,05 M ATP, 0,05 M M-Methionin und 0,01 M KCl enthaltende Lösung wurde durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/Stunde und bei einer Temperatur von 25 bis 27°C geleitet.

Das Eluat aus der Säule, das hinsichtlich des SAM-Gehaltes analysiert wurde, zeigte, daß die Umwandlungsrate 30 % betrug.
Herstellung von SAM-p-Chlorbenzolsulfonat

103 ml Eluat, enthaltend 6 g/l SAM, wurden mit Schwefelsäure angesäuert, bis ein pH-Wert von 3 erreicht war, und dazu wurde unter Rühren eine Lösung von 2 bis 3 g Picrolonsäure in 25 ml Methyläthylketon zugesetzt. Nach Stehenlassen über Nacht wurde der Niederschlag filtriert und mit Wasser gewaschen. Der Niederschlag wurde in 6,2 ml einer 1n Lösung von p-Chlorbenzolsulfonsäure in 2-Methoxyäthanol wieder gelöst. Dann wurden 50 ml Toluol zugesetzt. Der abgetrennte Feststoff wurde in 12,5 ml

einer O,25n Lösung von p-Chlorbenzolsulfonsäure in 2-Methoxyäthanol gelöst und nach Zusetzen von Kohle und Filtrieren wurden dem Piltrat 60 ml Chloroform zugesetzt.

509885/1165

Es wurden 1,43 g Salz erhalten. Die Verbindung war in Wasser zu mehr als 20 % löslich und in üblichen organischen Lösungsmitteln lediglich schwach löslich. Aus Dünnschichtchromatographie geht hervor, daß das Salz frei von Verunreinigungen ist.

Die analytischen Daten sind in Tabelle I angegeben und entsprechen einer Verbindung der Formel

^C15^H23^N6°5^S-^3C6^H5^C1O3^S·

Die neue Verbindung wurde auch durch die im Beispiel

1 beschriebene enzymatische Methode identifiziert.

Bei Wiederholung des Verfahrens auf identische Weise, jedoch unter Verwendung von p-Acetylbenzolsulfon-"' säure, o-Benzoldisulfonsäure, 4-Biphenylsulfonsäure, 2-Mesitylensulfonsäure und 5-Sulfosalicylsäure wurden Salze der folgenden Formeln erhalten:

^Ci5^H23^N6°5^S-^3C8^H8°4^{Si C}15^H23^N6°5^S-* '^5C6^H6°6^S2^{; C}15^H23^N6°5^S-^3C12^H1O°3^{S; C}15^H23^N6°5^S-^3C9^H12°3^S;

^C15^H23^N6°5^S*^3C7^H6°6^S'

deren analytische Daten in Tabelle I angegeben sind. ;

Beispiel 5: Der Niederschlag, der nach Zusetzen von Picrolonsäure zu 70 1 der Lösung nach Beispiel 1 erhalten wurde, wurde bei Umgebungstemperatur unter Rühren in 3,1 1 einer 1n Lösung von 1,2-Äthandisulfonsäure in' Methanol gelöst.

Dann wurden 25 1 Aceton zugesetzt. Der abgetrennte Feststoff wurde in 12,5 1 einer O,25n Lösung von 1,2-Äthandisulfonsäure in Methanol gelöst und nach Zusetzen von

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Kohle und Filtrieren wurden dem Filtrat 60 1 Methylisobutylketon zugesetzt.

Es wurden 546 g Salz erhalten. Die Verbindung ist zu mehr als 20 % in Wasser löslich und in üblichen organischen Lösungsmitteln nur schwach löslich. Aus Dünnschichtchromatographie geht hervor, daß die Verbindung frei von Verunreinigungen ist.

Die analytischen Daten sind in Tabelle I angegeben und entsprechen einem Produkt der Formel

^C15^H23^N6°5^S-^2C2^H6°6^S2· Die neue Verbindung wurde auch durch die in Beispiel

1 beschriebene enzymatische Methode identifiziert.

Beispiel 6: Der Niederschlag, der durch Zusetzen von Picrolonsäure zu 70 1 der Lösung gemäß Beispiel 1 erhalten wurde, wurde bei Umgebungstemperatur unter Rühren in 3,1 1 einer 1n Lösung von 2-Hydroxyäthansulfonsäure in Äthanol gelöst.

Dann wurden 25 1 Methylisobutylketon zugesetzt.

Der abgetrennte Feststoff wurde in 12,5 1 einer 0,25η Lösung von 2-Hydroxyäthansulfonsäure in Äthanol gelöst und nach Zusetzen von Kohle und Filtrieren wurden 80 1 Tetrahydrofuran dem Filtrat zugesetzt. Es wurden 632 g -' Salz erhalten. Die Verbindung war in Wasser zu mehr als 20 % löslich und in üblichen organischen Lösungsmitteln nur schwach löslich. Aus Dünnschichtchromatographie geht hervor, daß die Verbindung frei von Verunreinigungen ist.

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~ 34 -

Die analytischen Daten sind in der Tabelle I angegeben und entsprechen einem Produkt der Formel

^C15^H23^N6°5^S-^4C2^H6°4^S·
Die neue Verbindung wurde auf die im Beispiel 1

beschriebene enzymatische Methode identifiziert.

Bei Wiederholung des Verfahrens auf identische Weise, jedoch unter Verwendung von 3-Hydroxypropansulfonsäure wurde ein Salz der Formel

^C15^H23^N6°5^S-^4C3^H8°4^S
erhalten, dessen analytische Daten in Tabelle I angegeben

Beispiel 7: Der Niederschlag, der nach Zusetzen von Picrolonsäure zu 70 1 der Lösung gemäß Beispiel 1 erhalten wurde, wurde bei Umgebungstemperatur unter Rühren in 3,1 1 einer 1n Lösung von 1-Naphthalinsulfonsäure in Methanol gelöst.

Dann wurden 25 1 Methyläthylketon zugesetzt. Der abgetrennte Feststoff wurde in 12,5 1 einer O,25n

Lösung von 1-Naphthalinsulfonsäure in Methanol gelöst und nach Zusetzen von Kohle und Filtrieren wurden dem Filtrat 70 1 Methyläthylketon zugesetzt.

Es wurden 717 g Salz erhalten. Die Verbindung war in Wasser/feu mehr als 20 % löslich und in üblichen organischen Lösungsmitteln nur schwach löslich. Aus Dünnschichtchromatographie geht hervor, daß die Verbindung frei von Verunreinigungen ist.

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Die analytischen Daten sind in Tabelle I angegeben und entsprechen einem Produkt der Formel

^C15^H23^N6°5^S-^3C1O^H8°3^S·
Die neue Verbindung wurde auch durch die im Beispiel

1 beschriebene enzymatische Methode identifiziert.

Beispiel -8: Der Niederschlag, der nach Zusetzen von Picrolonsäure zu 70 1 der Lösung gemäß Beispiel 1 erhalten wurde, wurde bei Umgebungstemperatur unter Rühren bei 3/1 1 einer 1n Lösung von 2-Naphthalinsulfonsäure in 2-Propanol gelöst.

Dann wurden 25 1 Diisopropyläther zugesetzt. Der abgetrennte Feststoff wurde in 12,5 1 einer Ο,25ή Lösung von 2-Naphthalinsulfonsäure in Methanol gelöst und nach Zusetzen von Kohle und Filtrieren wurden dem FiItrat 70 1 Äthylacetat zugesetzt.

Es wurden 710 g Salz erhalten. Die Verbindung war in Wasser zu mehr als 20 % löslich und in üblichen organischen Lösungsmitteln nur schwach löslich. Aus Dünnschichtchromatographie geht hervor, daß die Verbindung frei von Verunreinigungen ist.

Die analytischen Daten sind in Tabelle I angegeben und entsprechen einem Produkt der Formel

^C15^H23^N6°5^S*^3C1O^H8°3^S·
Die neue Verbindung wurde auch durch die in Beispiel 1

beschriebene enzymatische Methode identifiziert.

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Beispiel 9: Der Niederschlag, der nach Zusetzen von Picrolonsäure zu 70 1 der Lösung gemäß Beispiel 1 erhalten wurde, wurde bei Umgebungstemperatur unter Rühren in 3,1 1 einer 1n Lösung von Benzolsulfonsäure in 2-Butanol gelöst. Dann wurden 25 1 Diisopropyläther zugesetzt. Der abgetrennte Feststoff wurde in 12,5 1 einer O,25n Lösung von Benzolsulfonsäure in Methanol gelöst und nach Zusetzen von Kohle und Filtrieren wurden dem Filtrat 65 1 Äthylacetat zugesetzt.

Es wurden 612 g Salz erhalten. Die Verbindung war in Wasser zu mehr als 20 % löslich und in üblichen organischen Lösungsmitteln nur schwach löslich. Aus Dünnschichtchromatographie geht hervor, daß die Verbindung frei von Verunreinigungen ist.

Die analytischen Daten sind in Tabelle I angegeben und entsprechen einem Produkt der Formel

^C15^H23^N6°5^S-^3C6^H6°3^S·
Die neue Verbindung wurde auch gemäß der im Beispiel

1 beschriebenen enzymatischen Methode identifiziert.

Beispiel 10: Der nach Zusetzen von Picrolonsäure zu 103 ml der Lösung gemäß Beispiel 4 erhaltene Niederschlag wurde bei Umgebungstemperatur unter Rühren in 6,2 ml einer 1n Lösung von Chondroitinschwefelsäure in Methanol gelööt. Dann wurden 50 ml Aceton zugesetzt.

Der abgetrennte Feststoff wurde in 25 ml einer O,25N Lösung von Chondroitinschwefelsäure in Methanol gelöst und nach Zusetzen von Kohle und Filtrieren wurden

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125 ml Methyl!sobutylketon dem Filtrat zugesetzt.

Es wurden 3,27 g Salz erhalten. Die Verbindung war in Wasser/feu mehr als 20 % löslich und in üblichen organischen Lösungsmitteln nur schwach löslich. Aus Dünnschichtchromatographie geht hervor, daß die Verbindung frei von Verunreinigungen ist.

Die analytischen Daten sind in Tabelle I angegeben und entsprechen einem Produkt der Formel

^C15^H23^N6°5^S-^4C14^H21^NO14^S· Die neue Verbindung wurde auch durch die in Beispiel

1 beschriebene enzymatische Methode identifiziert.

Beispiel 11: Der nach Zusetzen von Picrolonsäure zu 103 ml der Lösung gemäß Beispiel 4 erhaltene Niedersdiag wurde bei Umgebungstemperatur unter Rühren in 6,2 ml einer 1n Lösung von Cysteinsäure in 2-Äthoxyäthanol gelöst. 50 ml Dimethylacetat wurden darauf zugesetzt. Der abgetrennte Feststoff wurde in 25 ml einer O,25n Lösung von Cysteinsäure in 2-Äthoxyäthanol gelöst und nach

Zusetzen von Kohle und Filtrieren wurden 125 ml Methylacetat dem Filtrat zugesetzt. 1,53 g Salz wurden erhalten. Die Verbindung war in Wasser zu mehr als 20 % löslich und in üblichen organischen Lösungsmitteln nur schwach löslich. Aus Dünnschichtchromatographie geht hervor, daß die Verbindung frei von Verunreinigungen ist. Die analytischen Daten sind in Tabelle I angegeben und entsprechen einem Produkt der Formel

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^C15^H23^N6°5^S-^4C3^H7^NO5^S·
Die neue Verbindung wurde auch nach der im Beispiel

1 beschriebenen enzymatisehen Methode identifiziert.

Beispiel 12: Herstellung von Doppelsalzen von SAM von Schwefelsäure und Methansulfonsäure

103 ml eines Eluats, enthaltend 6 g/l SAM, erhalten wie im Beispiel 4 beschrieben, wurden mit H SO, angesäuert, bis ein pH-Wert von 3 erreicht war; dazu wurde unter Rühren eine Lösung von 2,3 g Picrolonsäure in 25 ml Methyläthylketon (Lösungsmittel -ä) zugesetzt. Nach Stehenlassen über Nacht wurde der Niederschlag filtriert und mit Wasser gewaschen. Der Niederschlag wurde in 18 ml einer O,1n Lösung von H^SO. und Methansulfonsäure und in 18 ml Methyläthylketon (Lösungsmittel a) wieder gelöst.

Nach Rühren und Stehenlassen wurde die organische Schicht abgetrennt und die wässerige Schicht mit ein wenig Methyläthylketon geschüttelt, um die letzten Picrolonsäurespuren zu entfernen. Nach Abtrennen der Wasserschicht wurde Aktivkohle zugesetzt und die Mischung filtriert. 16,5 ml einer wässerigen farblosen Lösung wurden erhalten, die 33,8 g/l SAM enthielt, was 90 % des in der ursprünglichen Lösung enthaltenen SAM entspricht. Bei Analyse durch Dünnschichtchromatographie zeigte sich, daß die Lösung lediglich* SAM enthielt.

16,5 ml der Lösung wurden in 100 ml Aceton (Lösungsmittel b) gegossen. Nach Rühren und Stehenlassen wurde

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- Λθ -

die Flüssigkeit abdekantiert. Der Feststoff wurde in 6,6 g einer 15 %igen Lösung von Methansulfonsäure in Methanol (Lösungsmittel c) gelöst.

Nach Zusetzen von Aktivkohle und Filtrieren wurde die Lösung in 25 ml Äthyläther (Lösungsmittel d) gegossen. Sie wurde nach Stehenlassen filtriert und das erhaltene gut kristalline Salz wog 1,2g und hatte die folgende Zusammensetzung:

SAM⁺.HSO₄".H₂SO₄.2CH₃SO₃H.

Die analytischen Daten sind in Tabelle II angegeben.

Bei Wiederholung des Verfahrens auf identische Weise, jedoch unter Verwendung von Sulfonsäuren und Lösungsmitteln, wie in Tabelle II angegeben, wurden die in Tabelle II angeführten Doppelsalze erhalten, deren analytische Daten ebenfalls dort angeführt sind.

Bei Wederholung des Verfahrens auf identische Weise, jedoch unter Verwendung von 3,3 g einer 15 %igen Lösung von Methansulfonsäure in Methanol, ergab die folgende Ausfällstufe mit 25 ml Äthyläther (Lösungsmittel d) 3,05 g eines Salzes der Zusammensetzung

SAM⁺. HSO₄"". H₂SO₄. CH₃SO₃H ,
dessen analytische Daten in Tabelle III angegeben sind. .

Bei Wiederholung des Verfahrens auf identische Weise, jedoch unter Verwendung von Sulfonsäuren und Lösungsmitteln, die in Tabelle III angegeben sind, wurden Doppel-

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salze erhalten, die ebenfalls in Tabelle III zusammen mit ihren analytischen Daten angeführt sind.

Beispiel 13: Herstellung von Doppelsalzen von SAM mit Schwefelsäure und 2-Hydroxyäthansulfonsäure

Das bei der ersten Ausfällung von SAM mit 2-Hydroxyäthansulfonsäure wie im Beispiel 6 erhaltene Salz wurde in 20 1 einer Lösung von O,1n Schwefelsäure und 0,1η 2-Hydroxyäthansulfonsäure in Methanol (Lösungsmittel a) wieder gelöst. Nach Zusetzen von Aktivkohle wurde filtriert und 100 Methylisobutylketon (Lösungsmittel b) wurden dem Filtrat zugesetzt. Die Mischung wurde nach Stehenlassen filtriert und 587 g eines Salzes der folgenden Zusammensetzung

SAM⁺.HSO₄".H₂SO₄.2C₂HgO₄S

wurden erhalten, dessen analytische Daten in Tabelle IV angegeben sind.

Bei Wiederholung des Verfahrens auf identische Weise, jedoch unter Verwendung von 10 1 einer Lösung von 0,1 η Schwefelsäure und 0,1 η 2-Hydroxyäthansulfonsäure in Methanol (Lösungsmittel a), ergab die nachfolgende Ausfällung mit Methylisobutylketon (Lösungsmittel b) 505 g eines Salzes der Zusammensetzung

SAM⁺.HSO₄".H₂SO₄.C₂H₆O₄S, dessen analytische Daten in Tabelle V angegeben sind.

Bei Wiederholung des Verfahrens auf identische Weise, jedoch unter Verwendung von die in Tabelle V angegebenen Anionen enthaltenden einfachen SAM-Salzen und unter Verwendung

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der In Tabelle V anegebenen Lösungsmittel wurden die In Tabelle V zusammen mit ihren analytischen Daten angeführten Doppelsalze erhalten. Bei Wiederholung des Verfahrens auf identische Weise, jedoch unter Verwendung von 3,3 g einer 15 %igen Lösung von p-Toluolsulfonsäure in Methanol ergab die nachfolgende Ausfällstufe mit 25 ml Äthyläther 1,18 g eines Salzes der Zusammensetzung

SAM⁺,HSO₄".H₂SO₄.2CH₃CgH₄SO₃H,

das die gleichen Eigenschaften aufweist, wie für das Produkt gemäß Beispiel 1 angegeben.

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ANION	GMJNDFOPMEL	Tabelle I	N berech net	% gefun den	S berech net	% ε gefun den	AM berech net	max 260 nm E1% (6N H2SO4)
Methansulfonat	C19H39NgO17S5	% gefun den	10,72	20,30	20,45	50,3	50,96	188
DodfiCftnsi ilfojw t;	C71H127N6°17S5	10,51	5,61	10,91	10,70	26,37	26,68	98
1-Cctadecan- sulfonat	C87H75N6O17S5	5,55	4,84	9,50	9,22	22,75	22,99	85
Äthansulfonat	C23H47N6°17S5	4,72	10,01	18,62	19,08	47,12	47,55	175
a% 2-Branäthan- JjJ sulfonat	C23H43N6O17S5Br4	9,82	7,28	13,68	13,88	34,67	34,58	127
CD co 2-Chloräthan- tn sulfonat	C23H43N6°17S5C14	7,35	8,59	16,31	16,39	40,89	40,84	151
-* 10-Kanpfersulfonat	C55H87N6°21S5	8,58	6,33	11,53	12,06	29,52	30,06	111
lTi d-3-Brankapfer- 10-sulfonat	C55H83N6O21S5Br4	5,97	5,11	9,81	9,75	24,02	24,30	89
2-Hydraxyäthan- sulfonat	C23H47N6°21S5	5,14	9,30	17,25	17,73	43,82	44,19	163
p-Acetylbenzol- sulfonat	C39H47N6°21S4	8,91	7,90	12,01	12,05	37,31	37,54	138
o-Benzoldisulfonat	C24H32N6°14S4	7,75	11,08	16,76	16,90	52,75	52,64	194
4-Biphenylsulfonat	C51H53N6°14S4	11,10	7,63	11,52	11,64	36,50	36,25	134
2-Mesitylensulfo- nat	C42H59N6°14S4 "	7,49	8,41	12,67	12,82	40,11	39,94	147
	8,50

CD OO CD OO

Tabelle I (Fortsetzung)

5-Sulfosalicylat	C36H41N6°23S4	7,99	7,97	12,01	12,17	37,68	37,90	140
1,2-Äthandlsulfo- nat	C19H35N6°17S5	10,31	10,78	20,03	20,55	50,68	51,22	189
sulfonat	C27H55N6°21S5	8,79	8,75	16,55	16,70	41,32	41,61	153
Cysteat	C27H51N1O°25S5	12,50	13,02	14,68	14,90	36,92	37,12	137
Chondroitinsulfat cn. ® Benzolsulfonat	C71H1O7N1O°61S5 C33H41N6°14S4	5,83 9,34	6,26 9,62	6,84 14,22	7,17 14,67	17,21 45,18	17,86 45,69	66 169
O0 p-Chlorbenzol- Oi sulfonat	C33H38N6°14S4C13	8,10	8,60	12,72	13,12	40,53	40,87	151
-» 1-Naphthalin- ""* sulfonat cn	C45H47N6°14S4	8,03	8,20	12,03	12,52	38,73	39,00	144
m 2-Naphthalin- sulfonat	C45H47N6°14S4	7,83	8,20	11,95	12,52	38,52	39,00	144

CD OO CO OO

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Tabelle V

SAM .HSO₄ .RSO₃H

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ANION ·	LOSUNGSf a	HTTEL b	GRUNDFORMEL	%] net	gefun den	% berech net	S gefun den '	% S/ berech net	ge fun- - den	E1%bei 1cm 260 nm (6N H2SO4)
2-Hydroxy-- äthansul- fonat	Methanol	Methyliso- butylte- ton		11,66	11,45	17,79	17,95	55,42	55,15	204
3-Hydraxy- propan- sulfonat	2-ÄtiXKy~ ätha- nol	Äthyl äther		11,44	11,62	17,45	17,01	54,36	54,30	201
d-3-Brcni- kanpfer- 10-sulfo- nat	n-Buta- nol	Chloro- forxn		9,28	9,08	14,16	14,20	44,10	43,91	163
1-Naphtha- linsulfo- nat	Äthanol	Äthyl äther	=25^ΛΟ1634	10,47	10,59	15,97	16,12	49,75	49,62	183
ibenzol- sulfonat	Äthanol	Msthyl- iscbutyl- keton	C21H32N6°16S4	11,16	11,22	17,03	16,95	53,06	53,15	196
o-Benzol- disulfo- nat	2- äthanol	Benzol		11,78	11,53	17,97	17,62	55,97	55,65	206

CD OO CD OO

Seit einigen Jahren ist es aus der biochemischen Forschung bekannt, daß SAM der einzige spezifische Donator von Methylgruppen in lebenden Organismen für die biochemischen Reaktionen der Überführung der CI^-Gruppe ist, die fundamentale Reaktionen im lipidischen, protidischen und glukidischen Metabolismus sind. Beispielsweise werden im nachstehenden einige der wichtigsten SAM-abhängigen Transmethylierungsreaktionen angegeben.

a) N-Transmethylierung: Adenin, Carnitin, Carnosin, Kreatin, 2,6-Diaminopurin, Adrenalin, Guanin, Hordenin, N'-Nikotinamid, Phosphatidilcolin, Ricinin;

b) O-Transmethylierung: N-Acetylserotonin, Dopamin, Epinin, d-Adrenalin, 1-Adrenalin, Ergosterol, 1-Noradrenalin, Pektin, übichinon;

c) S-Transmethylierung: 2,3-Dimercaptopropanol, H₂S, Methionin, Methylmercaptan, S-Mercaptopropionsäure, S-Mercaptoäthanol, Thiopyrimidin, Thiouracyl;

d) C-Transmethylierung: Cytosin, Thymin.

Das bedeutet, insbesondere in Bezug auf den menschT liehen Onpnismus, das SAM in folgenden metabolischen Prozessen wirksam ist: Biosynthese von Cholin; Biosynthese von Phosphatidy]ctolin; Aktivität von Enzymen, die SH-Gruppen erfordern; Metabolismus von Brerdcatechinaminen; Metabolismus von biogenen centroencephalisehen Aminen; Metabolismus von Serotonin; Metabolismus von Histamin; Metabolismus von Vitamin B12 und Folsäure; Metabolismus von Kreatin; Metabolismus von Myosin; Metabolismus von Histonen; Metabolis-

509885/1165

- 36 -

mus von Ribonucleinsäure; Metabolismus von DNA; Metabolismus von Proteinsubstarsen; Metabolismus einiger Hormone des Cyclopentanperhydrophenantrenkernes, deren Hauptvertreter die östrogene sind? Metabolismus von Trig^ceriden.

Es ist auch seit einiger Zeit bekannt, daß SAM, wenn es einmal durch die Methyltransferaseenzyme demethyliert ist, in S-Adenosilhomocystein (SAO) übergeführt wird, das ein indirekter Donator der Hydrosulfidgruppen ist und deshalb eine außerordentliche Wichtigkeit für den Metabolismus aller Verbindungen aufweist, die SH-Gruppen benötigen, um ihre biologische Wirksamkeit auszuüben. Insbesondere wichtig unter diesen sind einige Thioanzyme und die sulfurierten Aminosäuren .

SAO seinerseits wird im Organismus decarboxyliert und das decarboxylierte Produkt ist der Hauptdonator der Aminopropy lgruppe, die gemäß der neusten biochemischen Erkenntnis für die Biosynthese von Polyaminen unerläßlich ist. Das Verfahren wird durch verschiedene Enzyme einschließlich der spezifischen Aminopropy!transferase katalysiert. .

Zusammenfassend kann gesagt werden, daß es bekannt ist, daß SAM im menschlichen Organismus mit allen biochemischen Reaktionen der

A - Transmethylierung (die spezifisch die CH₃-Gruppe ergibt), B - der Transsulfurierung (die spezifisch die SH-Gruppe ergibt) und
C - der Transaminopropylierung (die spezifisch die

Aminopropylgruppe ergibt) eng verknüpft ist.

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Die Summe dieses Wissens könnte zu der Annahme führen, daß SAM eine gewisse therapeutische Wirkung bei der Behandlung von pathologischen Zuständen aufweisen könnte, welche mit v'erknappungs- oder anderen Mangelzuständen im Organismus hinsichtlich einiger der vielen oberwähnten Produkte verknüpft sind.

Jedoch verhinderten die extreme Instabilität von SAM und das bis zu diesem Zeitpunkt vorhandene Fehlen eines Verfahrens, es während eines ausreichenden Zeitraumes unter normalen Umgebungsbedingungen stabil zu machen, daß dieses Produkt pharmakologisehen oder klinischen Versuchen unterworfen wurde, so daß auf dem Gebiet der menschlichen Therapie keinerlei praktische Verwendung hiefür gefunden werden konnte. Lediglich nach Herstellung der neuen SAM-Salze gemäß der vorliegenden Erfindung, d.h. Salze, die bei Umgebungstemperatur praktisch unbegrenzt stabil sind, war es möglich, ein systematisches pharmakologisches und klinisches Studium durchzuführen, das zu der Entdeckung geführt hat, daß die neuen Salze therapeutische Eigenschaften besitzen, die in ihrer Qualität und Intensität völlig überraschend sind.

Aus der Unzahl von pharmakologisehen und klinischen Daten, die für dieses neue Produkt gesammelt wurden, werden im folgenden lediglich einige angeführt, die ausreichend sein dürft'en, dem Fachmann a£ diesem Gebiet die wesentlichen Merkmale des neuen Produktes und seine Hauptverwendungszwecke in der menschlichen Therapie anzugeben.

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Der Einfachheit halber werden die neuen Salze gemäß der vorliegenden Erfindung wegen ihrer absoluten identischen Verwendung lediglich als "SAM-SaIz" bezeichnet.

Bei den pharmakologischen und klinischen Daten wird das verabreichte Salz immer allgemein mit SAM angegeben und die verabreichte Salzmenge als Menge von SAM, die darin enthalten ist, ausgedrückt, so daß es klar sein dürfte, daß sich die Daten in identischer Weise auf das eine oder andere Salz gemäß der vorliegenden Erfindung beziehen. Toxizität

Die SAM-Salze gemäß der vorliegenden Erfindung erwiesen sich als absolut frei von akuter Toxizität, chronischer Toxizität, lokaler Unverträglichkeit bzw. Sekundäreffekten.

Insbesondere ist die DL₅ bei Mäusen größer als 2,5 g/kg/os und 1 g/kg/intraperitoneal.

Die Versuche hinsichtlich Verträglichkeit und chronischer Toxizität wurden an Ratten der Art Wistar und

Sprague-Dowley durchgeführt, welchen 12 Monate lang 4 bis 8 mg/kg täglich das Produkt verabreicht worden war. Am Ende der Behandlung zeigten die verschiedenen Organe und Systeme keine pathologische Änderung. Die Teratogeneseversuche wurden an Kaninchen und Ratten durchgeführt: Sogar bei der Verabreichung von massiven SAM-Dosen, die annähernd das 10-fache der maximalen thera-

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peutischen Dosen betrugen, wurden keine teratogenen Wirkungen oder irgendwelche Mißbildungen in den Embryos oder den Endföti festgestellt.

Der Zusatz des Produktes in Dosen bis zu 0,05 bis 0,10 mg^i in überlebende Kulturen von menschlichen Lymphocyten oder hepatischen Mäusezellen ergab keine Änderung im keimbildenden Index für die Zellelemente.

Die intravenöse Verabreichung von Dosen bis zu 16 mg/kg ergab bei Kaninchen keine fiebererregenden Anzeichen.

Die venöse Verabreichung an Kaninchen und Katzen in einer Dosis von 16 mg/kg bewirkte keine Änderung des Kopfschlagaderdruckes, der Herz- und Atemfrequenz oder der elektrocardiographischen Kurve.

Die lokale Verträglichkeit von intramuskulären Injektionen, sogar nach wiederhiten Verabreichungen während 180 Tagen, und von intravenösen Injektionen in die Randvene der Ohrmuschel der Kaninchen war ausgezeichnet.

Bei Menschen zeigte bei jungen gesunden Versuchspersonen beiderlei Geschlechts, die einer Verabreichung ' durch schnelle intravenöse Methode oder durch Phleboclyse von SAM-Dosen entsprechend 5 bis 150 mg (Durchschnittsgewicht 70 kg), unterworfen wurden, die gleichzeitige Prüfung des minimalen und maximalen Druckes und der Puls- und Atemfrequenz 1,5, 15, 20, 30, 60 Minuten und 2, 3, 6, 8, 10, 12, 24 Stunden nach der Verabreichung keine Abweichung von den Normalwerten.

Die elektrocardiographische Kurve zeigte keine

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Änderung des PQ-Intervalls, des ST-Teiles bzw. keine Anzeichen von Extrarystolen oder andere Änderungen

30 Sekunden, 1, 2, 3, 5, 10 und 20 Minuten nach der Verabreichung. Im blutbildenden System und in der Leber- und Nierentätigkeit wurden keine Abweichungen vom Normalzustand festgestellt, die statistisch bemerkenswert wären.
Pharmakologie

Es sei darauf hingewiesen, daß, wenn im vorliegenden von der Verabreichung von SAM gesprochen wird, damit gemeint ist, daß irgendeines der einfachen oder Doppelsalze der vorliegenden Erfindung verabreicht worden ist, da ihre Wirksamkeit völlig äquivalent ist. Um einen einzigen Bezugsparameter zu erhalten, wird immer auf den SAM-Gehalt der verschiedenen Salze bezuggenommen.

Um zu bestimmen, wie SAM in den Geweben verteilt

1 4 wird, wurde S-Adenosilmethion (Methyl C ) hergestellt.

Die Verteilung dieses Produktes in Ratten wurde studiert, indem eine Dosis von 4,2 mg/kg/e.v. entsprechend etwa > 10 yuci an radioaktivem Produkt verabreicht wurde. Die spezifische Wirksamkeit des Produktes betrug 58 mCi/mMol. Parallel dazu wurde an Mäusen ein autoradiographisches Studium durchgeführt. Die Ergebnisse dieser beiden Experimente zeigen, daß SAM in allen Geweben sehr schnell verteilt wird.

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-4A-

Im folgenden ist beispielsweise ein Teil der bezüglichen Daten hinsichtlich einiger der in Betracht kommenden Organe angegeben:

Verteilung von SAM in einigen Rattengeweben. Die Werte sind als ,ugr/gr ausgedrückt.

Gewebe	15 Minuten	1 Stunde	4 Stunden	8 Stunden	24 Stunden
Leber	1,7	3,0	5,5	5,6	5,7
Nebennieren	1,9	3,4	4,8	4,5	4,4
Milz	1,3	1,2	3,5	2,6	2,8
Hypophyse	2,3	2,5	8,0	4,5	4,2
Hypothalamus	0,3	0,65	1,0	1,3	1,3
Haut	0,25	0,45	0,75	8,5	9,4
Plasma	7,5	2,1	2,3	2,0	1,1

Demgemäß wurde gefolgert, daß die neuen Salze gemäß der vorliegenden Erfindung die CH -Gruppe an alle Gewebe spenden, die Methyltransferaseaktivität aufweisen. Mit

anderen Worten wurde die Fähigkeit der neuen Produkte der Erfindung gefolgert, sich in allen Organen mit Methyltransferasesystemen wahlweise zu lokalisieren.

Dies wurde durch nachfolgende pharmakologische Versuche bestätigt. Eine Reihe von an Ratten durchgeführten Versuchen.zeigte, daß die neuen Verbindungen eine erhebliche schützende und entzündungshemmende Wirkung bei Leberverfettung durch Hyperlipid-Hyperprotein-Nahrung gemäß Handler, bei der .Verfettung durch akute Alkoholvergiftung und durch andere

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- 4β -

Giftstoffe (Tetrachlorkohlenstoff, Brombenzol usw.) durch Verabreichung von lediglich 6 mg/kg/intraperitoneal besitzen; sowohl vom morphohistochern!sehen als auch vom analytischen Standpunkt vermindert das SAM die Anhäufung von Lipiden am Hepatocitspiegel, während es die Wiederherstellung normaler Spiegel an Phospholipiden, die nach

Γ— Vergiftung mit CCl₄ reduziert sind, begünstigt. Hepatische

—J Phospholipide bei Ratten nach Vergiftung mit CCl₄ und

Behandlung mit SAM.

Behandlung Gesamtphospholipide

(mg/g) '

Physiologische Lösung 30,57 + 1,18

CCl₄ 18,87 + 1,06

CCl₄ + SAM 15 mg/kg/intraperitoneal 27,20 + 1,25

CCl₄ + SAM 115 mgAg/intraperitoneal 20,87 + 0,42

CCl₄ + Ad+Met 15 mgOcg/iitaperitcneal 19,9 +0,92

Die Werte sind Durchschnittswerte + E.S. von 10 : Werten für jede Gruppe. Beim Studium der leberschützenden Wirksamkeit wurde eine Versuchseinrichtung verwendet, die bei Ratten die sogenannte hepatische Cholesterindegenerierung bewirkt (Ridout und Coll., Biochem. J. 52, 99 (-1952).

Bei diesem Verfahren wurde mittels einer geeigneten Diät bei den Tieren eine deutliche Zunahme der gesamten hepatischen Fette und des hepatischen Cholesterins erhalten. Die Substanzen, die im lipidischen Metabolismus wirken, ver-

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mindern oder eliminieren diese Zunahme.

Die Tiere wurden in sechs Gruppen geteilt. Der ersten Gruppe wurde eine Diät verabreicht, die willkürlich verändert wurde. Der zweiten Gnppe wurden die Grunddiät von Ridout (20 g/Ratte/Tag) verabreicht; den anderen Gruppen wurde die gleiche Diät in den gleichen Dosen, die jedoch mit Cholesterin bis zu einem Ausmaß von 0,2 g/Ratte/Tag angereichert war, verabreicht. Die Behandlung dauerte 3 Wochen.

Den Gruppen 4, 5 und 6 wurde SAM in den folgenden Dosen verabreicht: 0,4, 0,8 und 2 mg/kg/intraperitoneal pro Tag.

Am Ende der drei Wochen wurden alle Tiere getötet," die Lebern wurden entnommen und die Gesamtfette (Best und Coll., Biochem. J. 40, 368, 1966) und Cholesterin (Sperry und Brand, J.Biol.Chem. 150, 315, 1943) wurden bestimmt.

Die Ergebnisse zeigten, daß die der Behandlung mit SAM in Dosen von 0,4 bis 0,8 mg/kg/intraperitoneal unterzogenen Tiere wenig geschützt waren, während die ^; mit 2 mg/kg/intraperitoneal behandelten Tiere völlig geschützt waren.

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Hepatisches Cholesterin und Gesamtfette am Ende des Versuches (Durchschnitt pro Gruppe)

Gruppe	Frische Leber	Gesamtfette	%	Cholesterin	%
	Gewicht g	g	9,4	mg	2,6
I	15	1,41	10,6	40	3,7
II	18	1,93	24,0	68	5,7
III	16	3,84	21 ,6	92	5,2
IV	17	3,70	21 ,9	90	4,1
V	16	3,5	12,5	67	3,8
VI	16	2,0	61

Ein anderer pharmakologischer Aspekt, der untersucht wurde, war die entzündungshemmende und analgetische Wirksamkeit von SAM.

Von den verschiedenen Versuchen sei der klassische Versuch nämlich das ödem durch Carrageenin und durch Eiereiweiß als Test für akute Entzündung, Granuloiri durch Baumwollpellets und Arthritis durch Adjuvans als Versuch für chronische Entzündung erwähnt. In allen Fällen erwiös sich SAM sowohl bei oraler Verabreichung (Dosis zwischen 8 und 40 mg/kg) als auch bei parenteraler Verabreichung (Dosis zwischen 4 und 8 mg/kg) im Vergleich mit anderen bekannten Heilmitteln (Ibuprofen-Indometacina) als aktiv. Die Analcjesieversuche wurden als Heißplattentest und Verätzen durch Essigsäure sowie als Randal·- und Selitto-Test bei Ratten durchgeführt. Die Heilmittel erwiesen sich auch

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bei diesen Versuchen im Vergleich mit bekannten studierten Heilmitteln als aktiv.

Ein weiterer in Betracht gezogener Aspekt war die mögliche Wirkung des SAM auf die Schlafzeit durch Barbiturate.

Zu diesem Zweck wurde ein Versuch, bei welchem Gruppen von Mäusen Hexobarbital in einer Dosis von 80 mg/kg/irtraperitoneal gemäß dem Verfahren von Holten und Larsen (Acta Pharmacol. Toxicol. 1956, 12, 346) erhielten, durchgeführt; eine Gruppe war die Kontrollgruppe und die zweite erhielt SAM in einer Dosis von 4 mg/kg/intraperitoneal (Tabelle).

Kontrollen Schlafzeit (Minuten)

24,4 + 2,7

SAM 4 mg/kg/intraperitoneal 41,2 + 5,8

Eine Prüfung der Daten zeigte, daß SAM beim Verlängern der durch Hexobarbital hervorgerufenen Schl^fzeit wirksam ist.

Klinische Versuche _;

Wenn im folgenden die Verabreichung von SAM erwähnt

wird, bedeutet dies die Verabreichung eines der Salze gemäß der vorliegenden Erfindung.

Entsprechend der aus den pharmakologischen Versuchen erhaltenen Information wurden die klinischen Versuche auf pathologische Affektionen gerichtet, bei welchen folgende Metabolismen in erster Linie oder sekundär affiziert erscheinen:

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1 - Metabolismus von Lipiden

2 - Metabolismus von Protiden und Gluciden

3 - Metabolismus von Brenzkatechinaminen und Biogenaminen

1. Aus den Versuchen, die klinisch an hunderten Personen unter Verwendung von an SAM. über einen weiten Bereich variierenden Dosen durchgeführt wurden, ging hervor, daß die neuen Verbindungen

ein schnelles Fallen der hepatischen Lipide

bei der Hepatosteatose der am meisten variierten Pathogenese

sogar 60 Tage nach Ende der Behandlung hervorrief, was/durch eine die Biopsie betreffende Prüfung

identifizierbar ist, die am Ende des Behandlungszyklus wiederholt wurde.

Die Verabreichung des Produktes bewirkt auch ein merkliches Falten der hohen Werte der Gesamtcholesterinamie und der Hypertriglyceridämie und normalisiert die Veränderten ß/ot-Lipoproteinverhältnisse bei Personen mit Hyperdislipüämie im unkompensierten Zustand.

Diese hypocholesterinämisierende und hypolipämisierende Wirkung wird sogar in Dosen von etwa 8 bis 1,5 mg, 2-bis 3-mal täglich verabreicht, verifiziert und ist zur Dosis proportional.

Bei deutlicher Arteriosklerose mit klinischen Manifestationen der psychoaffektiven Sphäre mit Gedächtnisstörungen und sekundären Centroencephaliden (Verschlechterung durch arteriosklerotische Encephalopathie) und Erscheinungsformen von Cerebralhypoxie zeigte die Verabreichung von SAM durch intramuskuläre oder (Ln schwereren Fällen) durch

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intravenöse Injektion oder durch langsame Phleboclyse, in Dosen von 8 bis 16 mg drei- bis viermal täglich, eine sehr günstige Modifikation der Symptomatologie. Insbesondere war bei deutlichen hypoxydotischen Zuständen die Wiedererlangung der Funktionen sehr schnell und statistisch bemerkenswert.

Bei post-apoplektischen Syndromen wurde eine größere Schnelligkeit der Verbesserung des klinischen Systems festgestellt.

2· Hunderte Personen wurden klinisch behandelt, welche mit sekndärer Hypoprotidämie und Disprotidämie; dauernder und aggreaäver chronischer Hepatopathie; yiäzirrhoti sehen und zirrhotischen Zuständen, Syndronen schlecher Absorption und protiddispergierenden Syndromen affiziert waren. Die Verabreichung von Dosen in einer Menge von 20 bis 80 mg SAM/Tag durch intramuskuläre oder intravenöse Injektion oder oral, je nach der Schwere des Falles, bewirkt eine statistisch merkliche Zunahme der Gesamtprotidämie, eine Zunahme des Albuminspiegels und eine ·, Tendenz, die geänderten Prozentverhältnisse zwischen den elektrophoretischen Fraktionen des Serums zu normalisieren. Dieser proteinanabolisierenden Wirksamkeit folgte eine oft sehr wichtige Verbesserung der subjektiven Symptomologie und der allgemeinen objektiven Bedingungen sowie die Normalisierung aller Versuche der Leberfunktionsfähigkeit.

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3. Besonders überraschende Ergebnisse wurden bei klinischen Anwendungen des neuen enzymatischen Salzes gemäß der Erfindung erhalten, wo pathologische Zustände vorhanden waren, die klar mit Modifikationei}beimAustausch von biogenaminen im Zusammenhang standen, beispielsweise

a) Pathologische Zustände neuropsychiatrischer Pertinenz,

b) Parkinson'sehe Krankheit und Parkinsonismus verschiedener Eziopathogenesen,

c) Antiphologistische und analgetische Wirkung bei der Behandlung von Osteoarthritis und antalgische Wirksamkeit bei bestimmten neurologischen Manifestationen,

d) Störungen des Schlaf-Wach-Rhythmus.

Was Punkt a) betrifft, zeigte eine ausgedehnte klinische Kasuistik, die durch Prüfen des klinischen Verhaltens und die Versuche von Hamilton und Wittenberg durchgeführt wurde, klar, daß die Verabreichung von Dosen zwischen 8 und 20 mg SAM drei- bis viermal täglich während eines Zeitraumes von 5 bis 15 Tagen, ohne irgendeine andre Therapieform, eine merkliche Remission der Hauptparameter, die für die Diagnose depressiver Formen berücksichtigt werden, hervorruft.

Was Punkt b) betrifft, wurde in Bezug auf die Behandlung der Parkinson'sehen Krankheit und von Parkinsonismus gefunden:

Die Verabreichung von SAM in Dosen von 4 bis 16 mg/ Tag durch intramuskuläre oder intravenöse Injektion oder

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oral - je nach der Schwere des Falles - in Verbindung mit der üblichen Therapie mit Levodopa/ gibt Anlaß zu einer statistisch merklicheren Verbesserung der Akinesie/ünd Rigidität im Vergleich mit jener, die bei Patienten, welche nur mit Levodopa behandelt wurden, auftritt. Günstige Modifikationen wurden auch bei Parkinson 'schein Tremor festgestellt, der durch Levodopa allein nicht modifiziert werden kann.

Die Verabreichung von SAM verbessert die levodopaabhängigen psychischen Störungen, insbesondre mit Bezug auf die depressiven Zustände und psychischen Manifestationen irritativer Art deutlich.

Die Verabreichung von SAM in den oberwähnten Dosen verhindert die Folgen von Levodopanebeneffekten auf die verschiedenen Organe und Systeme, insbesondere bei Nausea, Brechreizen, Appetitlosigkeit, Hypotonie, Asthenie, Cephaiea, Schweißausbrüchen und Schlaflosigkeit.

War Punkt c) !»trifft, erwies sich SAM, dessen pharmakologische Ergebnisse zeigen, daß es eine intensive antiphlogistische und analgetische Wirksamkeit besitzt, bei allen Osteoarthritisformen, die mit einer Dosis von 13 mg zweimal täglich durch intramuskuläre oder intravenöse Injektion und 13 bis 20 mg oral viermal täglich behandelt wurden, als aktiv.

Nach lediglich 7-tägiger Behandlung wurden die Muskelkrämpfe, die Beschränkung cer Bewegung, lokalisierte

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Schmerzen und Rigidität in statistisch bemerkenswerter Weise hinsichtlich des Placebos beeinflußt. In keinem Fall von 90 behandelten Fällen wurde Magenpyrosis festgestellt. Die Nachforschung nach verborgenem Blut in deniFäkalien zeigte niemals irgend eine Modifix ation während der Behandlung.

Es zeigte sich, daß SAM im Vergleich mit einem antiphlogistischen Nicht-steroid-Heilmittel, das allgemein in einem Doppelblindversuch verwendet wird, eine therapeutische Wirksamkeit besitzt, die Indomethacin gleich ist.

Die antalgische Wirksamkeit von SAM wurde auch bei verschiedenen Personen mit unterschiedlichen neurologischen Zuständen getestet: Neuritis, Polyneuritis, Anthralgie, -■ Ischias, Radiocolitis, Torticollis.

Der therapeutische Effekt war vom ersten Tag der Verabreichung einer Dosis von 6 mg zweimal täglich durch intramuskuläre Injektion oder 13 bis 20 mg drei- bis viermal täglich aal vorhanden. Analoge Ergebnisse wurden bei Personen mit wiederkehrender und resistenter Cephalaljie bei oraler Verabreichung des Heilmittels in kaubaren Tabletten erhalten.

Was Punkt d) betrifft, d.h. die Störungen des

Schlaf-Wach-Rhythmus, mit besonderem Bezug auf Schlaflosigkeit, ist das neue Produkt gemäß der vorliegenden Erfindung in einer Dosis von 4 bis 13 mg oral imstande, die geänderten Schlaf-Wach——Verhältnisse durch Hervorrufen eines physiologischen Schlafes, ohne Rückkehr zur Verwendung von Barbituraten oder anderen Substanzen mit cortikaler und centroencephali-

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tischer depressiver Wirkung erheblich zu verbessern.

Aus der oben angegebenen Zusammenfassung sind die zahlreichen unerwarteten Perspektiven, die durch das neue Heilmittel auf dem Gebiet der menschlichen Therapie eröffnet wurden, ersichtlich. Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die bereits festgestellten Verwendungszwecke folgende sind* Behandlung von Hepatopiase, Hyperdislipidämie, allgemeine oder lokale Arteriösklerose, psychiatrische Manifestationen depressiver und neurologischer Art, degenerative Arthropathien, neurologische Schmerzmanifestationen und Störungen des Schlaf-Wach-Rhythmus, während viele andere Verwendungszwecke noch geprüft und gefunden werden müssen. Die neuen SAM-Salze werden vorzugsweise durch intramuskuläre oder intravenöse Injektion oder in oralen oder subliigualen Tabletten oder in Kapseln verabreicht,

Einige pharmazeutische Zusammensetzungen sind im nachstehariden angegeben:
a) Eine 400 mg-Tablette enthält SAM 28 mg

Exzjpienten; Stärke Lactose

Magnesiumstearat
Talk
Aroma q.n. auf 400 mg

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SC

b) Eine 250 mg Kapsel enthält

SAM 28 mg

Ex zjpienten;

Stärke

Lactose

Magnesiumstearat

Na₃PO₄ q.n. auf 250 mg

c) Eine gefriergetrocknete Phiole enthält

SAM 4,6 mg

Eine Muskellösungsmittelphiole enthält Lidocain 20 mg

Lösung von Phosphatpuffern q.n. auf 3 ml

d) Eine gefriergetrocknete Phiole enthält

SAM 14 mg

Eine Muskellösungsmittelphiole enthält Lidocain 20 mg

Lösung von Phosphatpuffern q.n. auf - 3 ml

e) Ein 2 g-Suppositorium enthält

SAM 46,6 mg

Suppositorienmasse q.n. auf 2,0 g

Andere Verabreichungsformen sind

a) trinkbare Flaschen

b) Flüssigkeiten für Augeneintropfung

c) Flüssigkeiten für Naseneintropfung

d) Flüssigkeiten für Aerosol- oder Sprühanwendung

e) Flüssigkeiten und Salben zur topischen Verwendung,

in welchen der aktive Bestandteil in üblichen pharmazeutisch

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verwendbaren Lösungsmitteln verdünnt ist (Tecnologia Farmaceutica, 2.Band, Silvano Casadio, 2.Ausgabe, Cisalpino-Goliarica, Mailand, 1972).

Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die therapeutischen Dosen von SAM 2 bis 125 mg/Tag, je nach der besonderen Art und Schwere der zu behandelnden Affektion, betragen.

Wenn notwendig, können im Hinblick auf das absolute Fehlen von Toxizität der Salze gemäß der Erfindung größere Dosen verwendet werden.

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Claims (21)

1. Patentansprüche :

   / 1. Stabile Salze von S-Adenosyl-L-methionin (SAM) mit Sulfonsäure, aus der Gruppe Methansulfonsäure, Xthansulfonsäure/ 1-n-Dodecansulfonsäure, 1-n-Octadecansulfonsäur·, 2-Chloräthansulfonsäure, 2-Bromäthansulfonsäure, 2-Hydroxyäthansulfonsäure, 3-Hydroxypropansulfonsäure, d-, 1-, d,1-1O-Kampfersulfonsäure, d-, 1-, d,1-3-Bromkampfer-10-sulfonsäure, Cysteinsäure, Benzolsulfonsäure, p-Chlorbenzolsulfonsäure, 2-Mesitylbenzolsulfonsäure, 4-Biphenylsulfonsäure, 1-Naphthalinsulfonsäure, 2-Naphthalinsulfonsäure, 5-Sulfosalicylsäure, p-Acetylbenzolsulfonsäure, 1,2-Äthandisulfonsäure, o-Benzoldisulfonsäure und Chondroitinschwefelsäure, und dessη Doppelsalze mit den genannten Sulfonsäuren und Schwefelsäure.
2. 2. Stabile SAM-Salze nach Anspruch 1, entsprechend der allgemeinen Formel

   SAM.4RSO₃H ,

   worin RSO₃H aus der folgenden Gruppe gewählt ist: Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, 1-n-Dodecansulfonsäure, 1-n-Octadecansulfonsäure, 2-Chloräthansulfonsäure, 2-Bromäthansulf onsäure, 2-Hydroxyäthansulfonsäure, 3-Hydroxy-' propansulfonsäure, d-, 1-, d,1-1O-Kampfersulfonsäure, d-, 1-, d,1-3-Bromkampfer-10-sulfonsäure, Cystein-und Chondroitinsulfonsäure, und die Doppelsalze dieser Salze mit Schwefelsäure.

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3. 3. Stabile SAM-Salze nach Anspruch 1, entsprechend der allgemeinen Formel

   SAM.3RSO₃H ,

   worin RSO₃H aus der folgenden Gruppe gewählt ist: Benzolsulfonsäuren p-Chlorbenzolsulfonsäure, 2-Mesitylbenzolsulfonsäure, 4-Biphenylsulfonsäure, 1-Naphthalinsulf onsäure, 5-Sulfosalicylsäure und p-Acetylbenzolsulfonsäure, und Doppelsalze dieser Salze mit Schwefelsäure.
4. 4. Stabile SAM-Salze nach Anspruch 1, entsprechend der allgemeinen Formel

   SAM.2R(SO₃H)₂ ,

   worin R(SO₃H)₂ insbesondere 1,2-Äthandisulfonsäure ist, und die Doppelsalze dieser Salze mit Schwefelsäure.
5. 5. Stabile SAM-Salze nach Anspruch 1, entsprechend der allgemeinen Formel

   SAM.1,5R(SO₃H)₂ ,

   worin R(SO₃H)₂ insbesondere o-Benzoldisulfonsäure ist, und die Doppelsalze dieser Salze mit Schwefelsäure.
6. 6. Stabile SAM-Doppelsalze nach Anspruch 1, entsprechend der allgemeinen Formel

   SAM⁺.HSO₄".H₂SO₄.RSO₃H i

   RSO₃H eine der genannten einwertigen Sulfonsäuren oder die äquivalente Säure der genannten mehrwertigen Sulfonsäuren darstellt.
7. 7. Stabile SAM-Doppelsalze nach Anspruch 1, ent-

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   sprechend der allgemeinen Formel

   SAM⁺.HSO₄".H₂SO₄.2RSO₃H ,

   worin RSO₃H eine der genannten einwertigen Sulfonsäuren oder die äquivalente Säure der genannten mehrwertigen Sulfonsäuren darstellt.
8. 8. Verfahren zur Herstellung von stabilen Sulfonaten von S-Adenosil-L-methionin, dadurch gekennzeichnet, daß

   a) eine konzentrierte Lösung von SAM hergestellt wird,

   b) das in der wässerigen Lösung vorhandene SAM mit einer gesättigten Lösung von Picrolonsäure in Wasser oder in einem organischen Lösungsmittel, das in Wasser löslich ist, ausgefällt wird,

   c) das ausgefällte Picrolonat in einer Lösung einer Sulfonsäure aus der Gruppe Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, 1-n-Dodecansulfonsäure, 1-Octadecansulfonsäure, 1-n-Octadecansulfonsäure, 2-Chloräthansulfonsäure, 2-Bromäthansulfonsäure, 2-Hydroxypropansulfonsäure, 3-Hydroxypropansulfonsäure, d-, 1-, d,1-10-Kampfersulfonsäure,

   d-, 1-, d,1-3-Bromkampfer-10-sulfonsäure, Cysteinsäure und Chondroitinschwefelsäure oder in einer Lösung der genannten Sulfonsäuren und Schwefelsäure gelöst wird,

   d) das Salz durch Zusetzen eines organischen Lösungsmittels, das mit dem in der vorhergehenden Stufe verwendeten lösungsmittel zur Gänze mischbar ist, ausgefällt vird.

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9. 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe a) durch Hervorrufen der Auflösung der Hefezellen durch Behandlung mit Äthylacetat und Schwefelsäure bei Umgebungstemperatur bewirkt wird.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 8/ dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe a) durch enzymatische Synthese durch die Wirkung des spezifischen Enzyms ATP-Methioninadenosiltransferase hoher Reinheit auf eine Mischung von Adenosiltriphosphat (ATP) und Methionin durchgeführt wird.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das spezifische Enzym ATP-Methioninadenosiltransferase mit hoher Reinheit durch selektives Eluieren einer dieses enthaltenden Lösung durch eine Säule aus mit L-Lysin behandeltem aktivierten Polysaccharidgel erhalten wird.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Synthese von SAM durch ATP und Methionin durch Durchleiten einer die beiden Reagentien

    enthaltenden Lösung durch eine Säule aus aktiviertem Polysaccharidgel, an welche das spezifische Enzym mit hoher Reinheit gebunden ist, durchgeführt wird.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe b) als in Wasser lösliches organisches Lösungsmittel ein mehrwertiger Alkohol mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Aceton, Methyläthylketon, Methylisobutylketon, Äthylacetat, Tetrahydrofuran, 2-Methoxyäthanol, 2-Äthoxyäthanol, Dioxan

    oder Dimethylformamid verwendet wird.

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14. 14. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe c) eine alkoholische oder alkoxyalkoholische Lösung mit einer Normalität von 0,25 bis 1,5N einer der angegebenen Sulfonsäuren eingesetzt wird.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe c) eine wässerige Lösung eingesetzt wird, die aus einer der angegebenen Sulfonsäuren und Schwefelsäure in gleichen Normalitäten zwischen 0,05 und 0_r2N in Mischung mit einem gleichen Volumen eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels besteht.
16. 16. Verfahren nach den Ansprüchen 8 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe d) das Sulfonat durch Zusetzen eines organischen Lösungsmittels aus der Gruppe Benzol, Toluol, Diäthylather, Diisopropyläther, Aceton, Methyläthylketon, MethyIisobutylketon, Äthylacetat, Methylacetat, Tetrahydrofuran und Chloroform ausgefällt wird.
17. 17. Verfahren nach den Ansprüchen 8 und 15, dadurch

    gekennzeichnet, daß in Stufe d) das Doppelsalz der SuIfonsäure und der Schwefelsäure aus der wässerigen Schicht durch Zusetzen eines Lösungsmittels auf Basis von Keton oder eines alkoholischen Lösungsmittels, das in Wasser vollständig löslich ist, ausgefällt wird.
18. 18. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das in Stufe d) erhaltene einfache Sulfonatsalz mit Schwefel-

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    säure durch Lösen desselben in einer wässerigen Lösung gleicher Normalitäten von 0,05 bis O,2N von Schwefelsäure und der im behandelten SuIfonat vorhandenen SuIfonsäure und Ausfällen des Doppelsalzes durch Zusetzen eines Lösungsmittels auf Basis von Keton oder eines alkoholischen Lösungsmittels, das in Wasser vollständig löslich ist, übergeführt wird.
19. 19. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das in Stufe d) ausgefällte Doppelsulfinschwefelsäuresalz in einer alkoholischen Lösung gleicher Normalitäten zwischen 0,05 und 0,2N von Sulfonsäure und Schwefelsäure wieder gelöst und dann mit einem organischen Lösungsmittel, das mit dem verwendeten Alkohol vollständig löslich ist, wieder ausgefällt wird.
20. 20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß,wenn die minimale Menge an alkoholischer Lösung, die zum Lösen des Doppelsalzes notwendig ist, verwendet wird, das Doppelsalz SAM⁺.HSO₄"".H₃SO₄.2R-SO₃H in der nachfolgenden Ausfällstufe ausgefällt wird.
21. 21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß, wenn ein Volumen an alkoholischer Lösung verwendet wird, das zumindest das Doppelte jenes beträgt, das zum Lösen deä Doppelsalzes notwendig ist,

    das Doppelsalz SAM .HSO₄".H₃SO₄.2R-SO₃H in der nachfolgenden

    Ausfällstufe ausgefällt wird.

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