DE2462314A1 - PROCESS FOR ENZYMATIC HYDROLYSIS OF RIBONUCLEIC ACID - Google Patents
PROCESS FOR ENZYMATIC HYDROLYSIS OF RIBONUCLEIC ACIDInfo
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Description
11 Verfahren zur enzymatisehen Hydrolyse von Ribonucleinsäure " 11 Process for the enzymatic hydrolysis of ribonucleic acid "
Priorität: 14. Februar 1973, Japan, Nr. 17 449/73 24. März : 1973, Japan, Nr. 33 088/73Priority: February 14, 1973, Japan, No. 17 449/73 March 24 : 1973, Japan, No. 33 088/73
, Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatisehen Hydrolyse von Ribonucleinsäure (RNS) unter Bildung von Nucleosid-3',5'-cyc1ophosphaten. The invention relates to a process for enzymatic hydrolysis of ribonucleic acid (RNA) to form nucleoside-3 ', 5'-cyclophosphates.
Adenosin-3',5'-cyclophosphat hat bekanntlich eine Mittlerrolle bei hormonbedingten Stoffwechselvorgängen. 3f,5'-c-AMP und die übrigen Hucleosid-31,5l-cyclophosphate sind neben ihrer Bedeutung als Reagentien für biochemische und medizinische Untersuchungen auch als Arzneistoffe von Bedeutung. - ·Adenosine 3 ', 5'-cyclophosphate is known to have a mediator role in hormone-related metabolic processes. 3 f , 5'-c-AMP and the other hucleoside-3 1 , 5 l -cyclophosphates are important as drugs in addition to their importance as reagents for biochemical and medical investigations. - ·
Bisher wurde die enzymatische Hydrolyse von RNS zu Nucleosid-S'.S'-cyclophosphaten in der Literatur nicht beschrieben. Es ist lediglich bekannt, daß 3',5'-C-AMP durch Umsetzung von Adenosintriphosphat mit Adenylcyclase, die aus Mikroorganismen oder durch fermentative Verfahren erhalten worden ist, entstehen.So far, the enzymatic hydrolysis of RNA has been to nucleoside S'.S'-cyclophosphates not described in the literature. It is only known that 3 ', 5'-C-AMP by conversion of adenosine triphosphate with adenyl cyclase, which has been obtained from microorganisms or by fermentative processes.
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Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur enzymatisehen Hydrolyse von IiNS unter Bildung von Nucleosid-31,5'-cyclophosphaten zur Verfugung zu stellen, das sich leicht großtechnisch durchführen läßt.The object of the invention is to provide a process for hydrolysis of enzymatisehen IINS to form nucleoside 3 1, 5'-cyclic phosphates of jointing, which is easy to carry out industrially.
Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß bei der Einwirkung von intakten Mikroorganismenzellen, die eine Ribonucleaseaktivität aufweisen, in Gegenwart eines Chelatbildners und Phosphationen auf RNS Nucleosid-3',5'-cyclophosphate erhalten werden können.It was found according to the invention that when intact microorganism cells which have a ribonuclease activity have, obtained in the presence of a chelating agent and phosphate ions on RNA nucleoside-3 ', 5'-cyclophosphate can be.
Gegenstand' der Erfindung ist ein Verfahren zur enzymatischen Hydrolyse von Ribonucleinsäure zu Nucleosid-31,5'-eyclophosphaten, dadurch gekennzeichnet, daß man Ribonucleinsäure mit intakten Zellen von Ribonuclease-Aktivität aufweisenden Mikroorganismen der Species Escherichia coli oder von Aerobacter aerogenes ATCG 8329, Salmonella typhosa ATCC 9992, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246, Hansenula anomala ATCC 20144, Kloeckera apiculata ATCC 18212 oder Torulopsis sphaerica ATCC 8549 in wäßrigem Medium in Gegenwart von Äthylendiamintetraessigsäure, Cyclohexandiamintetraessigsäure oder Hydroxyäthylendiamintriessigsäure als Chelatbildner und in Gegenwart von mindestens 0,17 m Phosphationen umsetzt.The invention relates to a process for the enzymatic hydrolysis of ribonucleic acid to nucleoside-3 1 , 5'-eyclophosphates, characterized in that ribonucleic acid with intact cells of ribonuclease activity having microorganisms of the species Escherichia coli or Aerobacter aerogenes ATCG 8329, Salmonella typhosa ATCC 9992, Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246, Hansenula anomala ATCC 20144, Kloeckera apiculata ATCC 18212 or Torulopsis sphaerica ATCC 8549 in an aqueous medium in the presence of ethylenediaminetetraacetic acid, cyclohexanediamine tetraacetic acid in the presence of at least 0.17 methylenediamine tetraacetic acid in the presence of chhosphate-formed and hydroxyethylenediaminate.
. Beispiele für Nucleosid-3',S'-cyclophosphate, die sich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten lassen, sind 3·, S'-Cyclophosphat (3',5'-C-MP), Guanosin-3' ,S'-cydophosphat (3!,5'-C-GMP), Uridin-S'^'-cyclophosphat (31,5'-C-UMP) und Cytidin-3',5'-cyclophosphat.. Examples of nucleoside-3 ', S'-cyclophosphates which can be obtained by the process according to the invention are 3 ·, S'-cyclophosphate (3', 5'-C-MP), guanosine-3 ', S'-cydophosphate (3 !, 5'-C-GMP), uridine-S '^' -cyclophosphate (3 1 , 5'-C-UMP) and cytidine-3 ', 5'-cyclophosphate.
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Bei der Durchführung der Reaktion bei höheren Phosphationenkonzentrationen werden selektiv Nucleosid-3',5'-cyclophosphate gebildet. Bei der.Einhaltung einer mittleren Phosphationenkonzentration entstehen neben den 3',5'-Cyclophosphate auch 2 ', 3' -Cyclo.phosphate.When carrying out the reaction at higher concentrations of phosphate ions selectively nucleoside-3 ', 5'-cyclophosphate educated. When maintaining a medium phosphate ion concentration also arise in addition to the 3 ', 5'-cyclophosphates 2 ', 3' -cyclophosphate.
Im erfindungsgemäßen Verfahren können alle Mikroorganismen der Species Escherichia coIi eingesetzt werden, die eine Ribonuclease-Aktivität aufweisen. Um festzustellen, ob ein bestimmter Mikroorganismus eine Ribonuclease-Aktivität aufweist, können übliche Verfahren angewendet werden.In the method according to the invention, all microorganisms of the species Escherichia coli can be used which have a Have ribonuclease activity. To see if a For a certain microorganism exhibiting ribonuclease activity, conventional methods can be used.
■ Die im erfindμngsgemäßen Verfahren verv/endeten Mikroorganismen werden nach üblichen Züchtungsverfahren für Bakterien oder Hefengezüchtet. Beispielsweise können die Mikroorganismen in einem eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und andere Nährstoffe enthaltenden Nährmedium gezüchtet werden. Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate, wie Glucose und Saccharose. Organische Säuren, Alkohole und Kohlenwasserstoffe können ebenfalls verwendet werden, sofern der verwendete Mikroorganismus zur Assimilation dieser Kohlenstoffquellen befähigt ist. Beispiele für Stickstoffquellen sind organischeThe microorganisms used in the method according to the invention are grown according to the usual breeding methods for bacteria or yeast. For example, the microorganisms in a a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts and other nutrient-containing nutrient media. Examples of carbon sources are carbohydrates, such as Glucose and sucrose. Organic acids, alcohols and hydrocarbons can also be used if the one used Microorganism for the assimilation of these carbon sources is capable. Examples of nitrogen sources are organic
Stickstoff .Nitrogen.
und anorganische /verbindungen, sowie natürliche organische Substanzen, wie Pepton* Maisquellwasser und Hefeextrakt. Fernerand inorganic / compounds, as well as natural organic substances, such as peptone * corn steep liquor and yeast extract. Further
kann das Nährmedium mit Phosphaten, wie Kaliumdihydrogenphosphat und Dikaliumhydrogenphosphat und Metallsalzen, wie Magnesiumsulfat, versetzt werden.can the nutrient medium with phosphates, such as potassium dihydrogen phosphate and dipotassium hydrogen phosphate and metal salts, such as Magnesium sulfate.
Die Züchtungsbedingungen werden je nach dem verwendeten Mikroorganismus ausgewählt. Nach beendeter Züchtung v/erden die Zellen beispielsweise durch Zentrifugation von der Gärmaische abgetrennt .The cultivation conditions are different depending on the microorganism used selected. After cultivation is complete, the cells are separated from the fermentation mash, for example by centrifugation .
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen RNS-Hydrolyseverfahrens v/erden die Zellen in einem wäßrigen Medium in einer Konzentration von 10 bis 40 mg/ml, vorzugsweise etwa 20 mg/ml, bezogen auf das Trockengewicht der Zellen, suspendiert. Die Suspension wird mit RNS, einem Chelatbildner und einer bestimmten Menge ' · Phosphationeh versetzt.For carrying out the RNA hydrolysis process according to the invention v / ground the cells in an aqueous medium at a concentration of 10 to 40 mg / ml, preferably about 20 mg / ml on the dry weight of the cells. The suspension is filled with RNA, a chelating agent and a certain amount of '· Phosphate ion added.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete RNS wird nach üblichen Verfahren gewonnen und stammt im allgemeinen aus Mikroorganismen. Zur Hydrolyse wird sie in einer Menge von 1 bis 40 mg/ml, vorzugsweise 10 bis 20 mg/ml verwendet.The RNA used in the process according to the invention is processed according to conventional Process obtained and generally derived from microorganisms. For hydrolysis it is used in an amount of 1 to 40 mg / ml, preferably 10 to 20 mg / ml is used.
■ Die Chelatbildner werden im erfindungsgemäßen Verfahren in einer Konzentration von 5 bis 30 millimolar, vorzugsweise 10 bis 30 millimolar eingesetzt.■ The chelating agents are in the process according to the invention in a concentration of 5 to 30 millimolar, preferably 10 to 30 millimolar used.
■■6 09845/0841■■ 6 09845/0841
Wie bereits erwähnt,"wird im erfindungsgemäßen Verfahren die die Menge an Nucleosid-3·,5f-cyclophosphaten neben Nucleosid-2'^'-cyclophosphaten durch die Konzentration der Phosphationen im Reaktionsmedium beeinflußt.As already mentioned, “in the process according to the invention, the amount of nucleoside 3 ·, 5 f -cyclophosphates in addition to nucleoside 2 '^' - cyclophosphates is influenced by the concentration of the phosphate ions in the reaction medium.
Beispielsweise wird Escherichia coli ATCC 10798 in 50 ml eines 30 mg/ml Glucose, 6 mg/ml Hefeextrakt, 8,5 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat, 11 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und Oi25 mg/ml Magnesiumsulfat enthaltenden Puffers vom pH-Wert 6,8 16 Stunden bei 380C in einem 3 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben gezüchtet. Nach beendeter Züchtung werden die Zellen durch Zentrifugieren von der Gärmaische abgetrennt. Anschließend werden 2,5 g (Trockengewicht) dieser Zellen in jeweils 100 ml Wasser, 0,10 m, 0,15 m, 0,16 m, 0,17 m und 0,3 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 suspendiert. Die Suspensionen werden mit 0,5 g RNS und 292 mg Äthylendiamintetraessigsäure versetzt und 48 Stunden bei 40°C zur Umsetzung gebracht. Anschließend wird die Menge der gebildeten Nucleosid-21,3'-cyclophosphate und der Nucleosid-31,5'-cyclophosphate bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt. For example, Escherichia coli ATCC 10798 is in 50 ml of a 30 mg / ml glucose, 6 mg / ml yeast extract, 8.5 mg / ml potassium dihydrogen phosphate, 11 mg / ml dipotassium hydrogen phosphate and Oi25 mg / ml magnesium sulfate buffer containing pH 6.8 Cultivated for 16 hours at 38 ° C. in a 3 liter Erlenmeyer flask. When the cultivation is complete, the cells are separated from the fermentation mash by centrifugation. Then 2.5 g (dry weight) of these cells are suspended in 100 ml of water, 0.10 m, 0.15 m, 0.16 m, 0.17 m and 0.3 m phosphate buffer with a pH of 7.5 . The suspensions are mixed with 0.5 g of RNA and 292 mg of ethylenediaminetetraacetic acid and reacted at 40 ° C. for 48 hours. The amount of nucleoside-2 1 , 3'-cyclophosphates and nucleoside-3 1 , 5'-cyclophosphates formed is then determined. The results are shown in Table I.
mg/ml2 f , 3'-cyclophosphates,
mg / ml
mg/ml3 ', 5'-cyclophosphates,
mg / ml
60984 5/084160984 5/0841
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, .daß die FlIiS in Abwesenheit von Phosphationen selektiv zu Nucleosid-2',3'-cyclophosphaten hydrolysiert wird. Bei steigender Phosphationenkonzentration nimmt die Bildung von Nucleosid-21,3'-cyclophosphaten ab, während die Menge der gebildeten Nucleosid-31,5'-cyclophosphaten zunimmt. Bei einer Phosphationenkonzentration von 0,17 m oder mehr wird die RNS praktisch selektiv zu Nucleosid-3',5'-cyclophosphaten hydrolysiert.The above results show that the fluid is selectively hydrolyzed to nucleoside-2 ', 3'-cyclophosphates in the absence of phosphate ions. With increasing phosphate ion concentration, the formation of nucleoside-2 1 , 3'-cyclophosphates decreases, while the amount of nucleoside-3 1 , 5'-cyclophosphates formed increases. At a phosphate ion concentration of 0.17 m or more, the RNA is hydrolyzed practically selectively to nucleoside-3 ', 5'-cyclophosphates.
Man erhält also nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bei Phosphationenkonzentrationen von 0,17 m und höher Reaktionsprodukte, die hauptsächlich aus ITucleosid-3', 5'-cyclophosphaten bestehen.The process according to the invention thus gives reaction products at phosphate ion concentrations of 0.17 m and higher, which mainly consist of ITucleoside-3 ', 5'-cyclophosphates exist.
Als Quelle für Phosphationen können verschiedene Phosphate verwendet v/erden, die Phosphationen an das wäßrige Medium abgeben. Besonders geeignete Phosphatquellen sind in den folgenden Beispielen aufgeführt.Various phosphates can be used as a source of phosphate ions v / earth, which release phosphate ions to the aqueous medium. Particularly suitable sources of phosphate are in the following examples listed.
Im allgemeinen wird die Reaktion zwischen RI1IS, den Mikroorganismenzellen, dem Chelatbildner und den Phosphationen 1 bis 96 Stunden, vorzugsweise 24 bis 48 Stunden, bei Temperaturen von 35 bis 450C, Vorzüge-.reis ο 33 bis 420C, durchgeführt. Während der Umsetzung viird der pH-V/ert im Bereich von 4 bis 9 gehalten.In general, the reaction between RI 1 IS, the microorganism cells, the chelating agent and the phosphate ions is from 1 to 96 hours, preferably 24 to 42 0 C, carried out to 48 hours, at temperatures from 35 to 45 0 C, Advantages-.reis ο 33 . The pH value is kept in the range from 4 to 9 during the reaction.
609845/0841609845/0841
0AD OHiQiNAL0AD OHiQiNAL
24623U24623U
Pur die selektive Bildung von Nucleoside*,i'-cyclophosphaten wird der pH-Wert vorzugsweise im Bereich von 8 gehalten.Pur the selective formation of nucleosides *, i'-cyclophosphates the pH is preferably kept in the range of 8.
Geeignete wäßrige Reaktionsmedien sind verschiedene Pufferlösungen, wie Acetatpuffer und Phosphatpuffer. Im Hinblick auf die Einstellung des pH-Wertes ist die Verwendung von Phosphatpuffern "bevorzugt. . ·Suitable aqueous reaction media are various buffer solutions, such as acetate buffer and phosphate buffer. With regard to the adjustment of the pH value, the use of phosphate buffers is recommended "preferred. . ·
Nach beendeter Umsetzung werden die Reaktionsprodukte isoliert und nach üblichen Verfahren gereinigt. Beispielsweise werden die Zellen aus dem Reaktionsgemisch durch Abfiltrieren entfernt. Das zellfreie Filtrat wird der Adsorption an Aktivkohle oder einem synthetischen Adsorptionsmittel unterworfen und anschließend mit alkalischem, wäßrigem Methanol oder einem Gemisch aus Aceton und Wasser eluiert. Das Eluat wird eingeengt und an einem Ionenaustauscherharz, beispielsweise Dowex 1x2 (Cl~-Form) (stark basisches Anionenaustauscherharz der Firma The Dow Chemical Co.), adsorbiert. Anschließend wird mit einer neutralen Salzlösung, beispielsweise einer wäßrigen Ammoniumhydrogencarbonatlösung eluiert. Durch Gefriertrocknung oder Kristallisation erhält man aus dem Eluat ein Gemisch aus Nucleosid-21,3!-cyclophosphaten, das 21,3'-C-AMP, 2·,3'-C-GMP, 2',3'-C-TOlP und 2',3'-C-CMP enthält oder e;Ln Gemisch aus Mucleosid-3',5'-cyolophosphaten, das 3',5'-c-AMP, 3'',5'-c-GMP, 3', 5'-C-UI-IP und 3',5'-C-CMP enthält.After the reaction has ended, the reaction products are isolated and purified by customary methods. For example, the cells are removed from the reaction mixture by filtration. The cell-free filtrate is adsorbed on activated carbon or a synthetic adsorbent and then eluted with alkaline, aqueous methanol or a mixture of acetone and water. The eluate is concentrated and adsorbed on an ion exchange resin, for example Dowex 1x2 (Cl ~ form) (strongly basic anion exchange resin from The Dow Chemical Co.). It is then eluted with a neutral salt solution, for example an aqueous ammonium hydrogen carbonate solution. A mixture of nucleoside-2 1 , 3 ! Is obtained from the eluate by freeze-drying or crystallization. -cyclophosphates containing 2 1 , 3'-C-AMP, 2 ·, 3'-C-GMP, 2 ', 3'-C-TOlP and 2', 3'-C-CMP or e; Ln mixture of Mucleoside-3 ', 5'-cyolophosphates, the 3', 5'-c-AMP, 3 '', 5'-c-GMP, 3 ', 5'-C-UI-IP and 3', 5'- C-CMP contains.
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, Wenn als Reaktionsprodukt ein Gemisch aus Nucleosid-2',3'-cyclophosphaten und Nucleosid-3',5'-cyclophosphaten erhalten wird, kann dieses leicht in die einzelnen Nucleosid-cyclophosphate aufgetrennt werden. Beispielsweise werden die ZellenIf the reaction product is a mixture of nucleoside-2 ', 3'-cyclophosphates and nucleoside-3 ', 5'-cyclophosphates is obtained, this can easily be converted into the individual nucleoside-cyclophosphates be separated. For example, the cells
* vom Reaktionsgemisch abfiltriert. Sodann wird das Filtrat mit einer Säure, wie Salzsäure oder Phosphorsäure, auf einen pH-Wert von 3,5 bis 4,0 eingestellt. Nach dem Einengen des Filtrates fallen die Nucleosid-3',5'-cyclophosphate aus. .: ;* filtered off from the reaction mixture. The filtrate is then with an acid such as hydrochloric acid or phosphoric acid to pH set from 3.5 to 4.0. After the filtrate has been concentrated, the nucleoside 3 ', 5'-cyclophosphates precipitate. .:;
". - -_- - —' : ^ Die als Fest-". - -_- - - ': ^ The as festival
/ stoff erhaltenen Nucleosid-3',5f-cyclophosphate können anschließend in einem schwach alkalischen Lösungsmittel vom pH-Wert mindestens 7,5 gelöst werden. Die auf diese Weise erhal-. tenen ." "j' ,5·'-Cyclophosphate können auf die vorstehend •'. beschriebene Weise gereinigt werden.Nucleoside 3 ', 5 f -cyclophosphates obtained from the substance can then be dissolved in a weakly alkaline solvent with a pH of at least 7.5. Which are obtained in this way. tenen. "" j ', 5 ·' -Cyclophosphates can refer to the above • '. be cleaned in the manner described.
Die erhaltenen 31,5'-Cyclophosphate lassen sichThe 3 1 , 5'-cyclophosphates obtained can be
leicht nach bekannten Verfahren in die einzelnen Komponenten auftrennen. Beispielsweise wird ein Gemisch auseasily separate into the individual components according to known methods. For example, a mixture of
• ,. 3'^'-Cyclophosphaten auf eine mit einem Anionenaustauscherharz,•,. 3 '^' - cyclophosphates on one with an anion exchange resin,
wie Dowex 1x2 (Cl""-Form) beschickte Säule gegeben. Die Elution wird stufenweise unter Verwendung von 0,1 bis 1,0 m Lösungen neutraler Salze, wie Ammoniumhydrogencarbonat, durchgeführt. Durch wiederholte Säulenchromatographie lassen sich diesuch as Dowex 1x2 (Cl "" form) loaded column. The elution is carried out in stages using 0.1 to 1.0 M solutions of neutral salts such as ammonium hydrogen carbonate. By repeated column chromatography, the
3',5'-Cyclophosphate in die einzelnen Komponenten auftrennen.3 ', 5'-cyclophosphates into the individual components cut open.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.The examples illustrate the invention.
6 09 845/0841 ' ■6 09 845/0841 '■
24623H24623H
— 9 Beispiel 1- 9 Example 1
EschericMa coli ATGG 10798 wird in 500 ml eines 30 mg/ml Glucose, 50 mg/ml Maisquellwasser, 8,5 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat, 11 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und 0,25 mg/ml Magnesiumsulfat enthaltenden Nährmediums vom pH-Wert 6,5 16 Stunden bei 38 G in einem 3 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben gezüchtet. Anschließend werden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrennt.EschericMa coli ATGG 10798 is available in 500 ml of a 30 mg / ml Glucose, 50 mg / ml corn steep liquor, 8.5 mg / ml potassium dihydrogen phosphate, 11 mg / ml dipotassium hydrogen phosphate and 0.25 mg / ml Nutrient medium containing magnesium sulphate with a pH value of 6.5 16 Hours at 38 G in a 3 liter Erlenmeyer flask bred. The cells are then separated off by centrifugation.
4,4 g der erhaltenen Zellen v/erden in 200 ml 0,33 ra. Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 2 g RNS und 876 mg Äthylendiamintetraessigsäure versetzt. Sodann, wird das Gemisch 48 Stunden bei 4O0G umgesetzt. Man erhält im Reaktionsgemische 7,2 mg/ml eines Gemisches aus Nucleosid-31,5'— cyclophosphaten.4.4 g of the cells obtained are suspended in 200 ml of 0.33% phosphate buffer with a pH of 8.0. The suspension is mixed with 2 g of RNA and 876 mg of ethylenediaminetetraacetic acid. Then, the mixture was reacted for 48 hours at 4O 0 G. In the reaction mixtures of 7.2 mg / ml to obtain a mixture of nucleoside 3 1, 5'cyclophosphates.
Anschließend werden die Zellen abfiltriert. Das Filtrat wird an einem Kunstharz adsorbiert. Die Elution wird mit 50prozentigem Aceton durchgeführt, und das erhaltene Eluat wird eingeengt. Die eingeengte Lösung wird an Dowex 1x2 (Cl"-Form adsorbiert. Die Elution wird mit einer Calciumchlorid-Salzsäure-Pufferlösung durchgeführt. Sodann wird das Eluat eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält 0,6 g eines pulverförmigen Gemisches aus Nucleosid-31,5'-cyclophosphaten von 86prozentiger Reinheit. The cells are then filtered off. The filtrate is adsorbed on a synthetic resin. Elution is carried out with 50% acetone and the eluate obtained is concentrated. The concentrated solution is adsorbed on Dowex 1x2 (Cl "form. The elution is carried out with a calcium chloride-hydrochloric acid buffer solution. The eluate is then concentrated and freeze-dried. 0.6 g of a powdery mixture of nucleoside-3 1 , 5 is obtained '-cyclophosphates of 86 percent purity.
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24623H24623H
- ίο -- ίο -
Beispiel 2^Example 2 ^
Aerobacter aerogenes ATCC 8329 wird in 500 ml eines 10 mg/ml Glucose, 6 mg/ml Hefeextrakt, 8,5 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat, 11 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und 0,25 mg/ml Magnesiumsulfat enthaltenden Nährmediums vom pH-Y.rert 6,8 8 Stunden bei 380C in einem 3 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben gezüchtet. Anschließend werden die Zellen abzentrifugiert.Aerobacter aerogenes ATCC 8329 is dissolved in 500 ml of a nutrient medium containing 10 mg / ml glucose, 6 mg / ml yeast extract, 8.5 mg / ml potassium dihydrogen phosphate, 11 mg / ml dipotassium hydrogen phosphate and 0.25 mg / ml magnesium sulfate at pH-Y. r ert 6.8 for 8 hours at 38 0 C in a 3 liter Erlenmeyer flask grown. The cells are then centrifuged off.
2,5 g der so erhaltenen Zellen werden in 100 ml 0,40 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 800 mg RNS und 584 mg Äthylendiamintetraessigsäure versetzt. Das Gemisch wird 36 Stunden bei 400C umgesetzt. Nach beendeter Reaktion erhält man 4,3 mg/ml eines Gemisches aps Nucleosid-31,5'-cyclophosphaten. 2.5 g of the cells thus obtained are suspended in 100 ml of 0.40 M phosphate buffer with a pH of 8.0. 800 mg of RNA and 584 mg of ethylenediaminetetraacetic acid are added to the suspension. The mixture is reacted at 40 ° C. for 36 hours. After the reaction is obtained 4.3 mg / ml of a mixture aps nucleoside 3 1, 5'-cyclic phosphates.
Das Reaktionsgemisch wird anschließend gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Man erhält 133 mg eines pulverförmigen Gemisches aus 31i5'-Cyclophosphaten von 83prozentiger Reinheit.The reaction mixture is then worked up as in Example 1. This gives 133 mg of a powdery mixture of 3-cyclohexene 1 i5' phosphates of 83prozentiger purity.
Salmonella typhosa ATCC 9992 wird in 500 ml eines Nährmediums der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 116 Stunden bei 280C in einem 3 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben gezüchtet. Anschließend werden die Zellen abzentrifugiert.Salmonella typhosa ATCC 9992, in 500 ml of a nutrient medium of the same composition as bred 116 hours at 28 0 C in a 3 liter Erlenmeyer flask in an example. The cells are then centrifuged off.
2 g der erhaltenen Zellen werden in 100 ml 0,36 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 1,5 g RNS und 730 mg Äthylendiamintetraessigsäure versetzt. Das Gemisch wird 44 Stunden bei 430C umgesetzt. Man erhält 9>1 mg/ml eines2 g of the cells obtained are suspended in 100 ml of 0.36 M phosphate buffer with a pH of 8.0. 1.5 g of RNA and 730 mg of ethylenediaminetetraacetic acid are added to the suspension. The mixture is reacted at 43 ° C. for 44 hours. 9> 1 mg / ml of one are obtained
609845/0841609845/0841
Gemisches aus Nucleosid-3'>5'-eyclophosphaten.Mixture of nucleoside 3 '> 5'-cyclophosphates.
Beispiel 4Example 4
Man verfährt wie in Beispiel 1, verwendet aber Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246 anstelle von Escherichia coli ATCC 10798. Man erhält 371 /ig/ml eines Gemisches aus Nucleosid-31,5'-cyclophosphaten. The procedure is as in Example 1 but using Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246 Escherichia coli ATCC instead of 10,798th obtained 371 / ig / ml of a mixture of nucleoside 3 1, 5'-cyclic phosphates.
Hansenula anomala ATCC 20144 wird in 500 ml eines 40 mg/ml Glucose, 5 mg/ml Pepton, 2 mg/ml Hefeextrakt, 2 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat, 2 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat, 1 mg/ml Magnesiumsulfat und 20 mg/ml Malzextrakt enthaltenden Nährmediums vom pH-Wert 6,5 28 Stunden bei 28°C in einem 3 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben gezüchtet. Nach beendeter Züchtung werden die Zellen abzentrifugiert. Sodann v/erden 2,5 g der Zellen in 100 ml 0,33 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 1 g RNS und 500 mg Hydroxyäthylendiamintriessigsäure versetzt und 72 Stunden bei 40°C umgesetzt. Nach beendeter Reaktion erhält man 3>6 mg/ml eines Gemisches aus Nucleosid-3f,5'-cyclophosphaten. Sodann wird das Reaktionsgemisch gemäß Beispiel 4 aufgearbeitet. Man erhält 47 mg eines pulverförmigen Gemisches aus Nucleosid-31,5f-cyclophosphaten von. 76prozentiger Reinheit.Hansenula anomala ATCC 20144 is dissolved in 500 ml of a 40 mg / ml glucose, 5 mg / ml peptone, 2 mg / ml yeast extract, 2 mg / ml potassium dihydrogen phosphate, 2 mg / ml dipotassium hydrogen phosphate, 1 mg / ml magnesium sulfate and 20 mg / ml malt extract culture medium containing pH 6.5 for 28 hours at 28 ° C in a 3 liter Erlenmeyer flask. When the cultivation is complete, the cells are centrifuged off. 2.5 g of the cells are then suspended in 100 ml of 0.33 M phosphate buffer, pH 8.0. The suspension is mixed with 1 g of RNA and 500 mg of hydroxyethylenediamine triacetic acid and reacted at 40 ° C. for 72 hours. After the reaction has ended, 3> 6 mg / ml of a mixture of nucleoside-3 f , 5'-cyclophosphates are obtained. The reaction mixture is then worked up as in Example 4. 47 mg of a powdery mixture of nucleoside-3 1 , 5 f -cyclophosphates of. 76 percent purity.
- Ί2 -- Ί2 -
Kloeckera apiculata ATCC 18212 wird gemäß Beispiel 5 gezüchtet, mit der Ausnahme, daß die Züchtungsdauer 32 Stunden beträgt. Anschließend werden die Zellen abzentrifugiert. Sodann werden 3 g der erhaltenen Zellen in 100 ml 0,33 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 1 g RNS und 692 mg Cyclohexandiamintetraessigsäure versetzt. Das Gemisch wird 72 Stunden bei 400C umgesetzt. Nach beendeter Umsetzung erhält man 3>5 mg/ml eines Gemisches aus Nucleosid-3',5'-cyclophosphaten. Das Reaktionsgemisch wird gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet. Man erhält 42 mg eines pulverförmigen Gemisches aus 31,5'-Cyclophosphaten von 74prozentiger Reinheit.Kloeckera apiculata ATCC 18212 is grown according to Example 5, with the exception that the cultivation time is 32 hours. The cells are then centrifuged off. Then 3 g of the cells obtained are suspended in 100 ml of 0.33 M phosphate buffer of pH 8.0. 1 g of RNA and 692 mg of cyclohexanediaminetetraacetic acid are added to the suspension. The mixture is reacted at 40 ° C. for 72 hours. After the reaction has ended, 3> 5 mg / ml of a mixture of nucleoside-3 ', 5'-cyclophosphates are obtained. The reaction mixture is worked up as in Example 1. This gives 42 mg of a powdery mixture of 3 1, 5'-cyclic phosphates of 74prozentiger purity.
B e i s ρ i e 1 7 "B e i s ρ i e 1 7 "
2,5 g gemäß Beispiel 5 erhaltene Zellen von Torulopsis sphaerica ATCC 8549 v/erden in 100 ml 0,33 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 1 g RNS und 438 mg Athylendiamintetraessigsäure versetzt. Sodann wird das Gemisch 48 Stunden bei 40°C umgesetzt. Nach beendeter Reaktion erhält man 523 ug/ml eines Gemisches aus Nucleosid-31,5'-cyclophosphaten. 2.5 g of Torulopsis sphaerica ATCC 8549 cells obtained according to Example 5 were suspended in 100 ml of 0.33 M phosphate buffer of pH 8.0. 1 g of RNA and 438 mg of ethylenediaminetetraacetic acid are added to the suspension. The mixture is then reacted at 40 ° C. for 48 hours. After completion of the reaction, 523 of a mixture of nucleoside 3 1 receives ug / ml, 5'-cyclic phosphates.
Γ). fl fi U R / Π R. U 1Γ). fl fi U R / Π R. U 1
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