DE2406811B2 - Process for the preparation of nucleoside-2'3'cyclophosphates - Google Patents
Process for the preparation of nucleoside-2'3'cyclophosphatesInfo
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Description
Aerobacter aerogenes ATCC 8329, Salmonella typhosa ATCC 9992, Pseudomonas aeruginosa ATCC15246, Hansenula anomala ATCC 20144, Kloeckera apiculata ATCC18212 oder Torulopsis sphaerica ATCC 8549Aerobacter aerogenes ATCC 8329, Salmonella typhosa ATCC 9992, Pseudomonas aeruginosa ATCC15246, Hansenula anomala ATCC 20144, Kloeckera apiculata ATCC18212 or Torulopsis sphaerica ATCC 8549
in wäßrigem Medium in Gegenwart von Äthylendiamintetraessigsäure, Cyclohexandiamintetraessigsäure oder Hydroxyäthylendiamintriessigsäure als Chelatbildner und gegebenenfalls in Gegenwart von 0 bis 0,17 m Phosphationen umsetztin an aqueous medium in the presence of ethylenediaminetetraacetic acid, cyclohexanediaminetetraacetic acid or hydroxyethylenediaminetriacetic acid as Reacts chelating agents and optionally in the presence of 0 to 0.17 M phosphate ions
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Escherichia coli ATCC10798 verwendet2. The method according to claim 1, characterized in that the microorganism Escherichia coli ATCC10798 was used
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert des Mediums auf etwa 5 einstellt3. The method according to claim 1, characterized in that the pH of the medium is increased sets about 5
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Nucleosid-2'3'-cyclophosphaten durch enzymatische Hydrolyse von Ribonucleinsäure.The invention relates to a method of manufacture of nucleoside-2'3'-cyclophosphates by enzymatic hydrolysis of ribonucleic acid.
Adenosin-2'3'-cyclophosphat (2'3'-C-AMP), ein Nucleosid-2'3'cyclophosphat war in letzter Zeit Gegenstand zahlreicher wissenschaftlicher Untersuchungen. Die Bedeutung von 2'3'-C-AMP ist darauf zurückzuführen, daß es im Zentralnervensystem von höheren Tieren zu finden ist Obwohl die Rolle von 2'3'-c-AMP im Zentralnervensystem noch nicht vollständig geklärt ist wird angenommen, daß diese Verbindung eine wichtige Rolle bei der Nervenleitung spielt Deshalb gelten 2'3'-c-AMP und andere Nucleosid-2',3'-cyclophosphate als wertvolle Arzneistoffe und werden gegenwärtig bei verschiedenen in vivo-Tierversuchen verwendet Ferner sind diese Produkte wertvolle biochemische Reagentien zur Untersuchung von Stoffwechselvorgängen.Adenosine 2'3'-cyclophosphate (2'3'-C-AMP), a nucleoside 2'3'cyclophosphate, has recently been the subject of numerous scientific investigations. The importance of 2'3'-C-AMP is due to the fact that it is in the central nervous system of higher animals can be found Although the role of 2'3'-c-AMP in the central nervous system has not yet been fully clarified it is believed that this connection plays an important role in nerve conduction therefore apply 2'3'-c-AMP and other nucleoside-2 ', 3'-cyclophosphates are valuable drugs and are currently being used at used in various in vivo animal studies. Furthermore, these products are valuable biochemical reagents for the investigation of metabolic processes.
Es ist bekannt daß bei der Umsetzung von Ribonucleinsäure (RNS) mit bestimmten Ribonucleasearten, »vie Ribonuclease T2, saure Ribonuclease und Blatt-Ribonuclease, die RNS zuerst zuIt is known that when ribonucleic acid (RNA) is reacted with certain types of ribonuclease, such as ribonuclease T 2 , acidic ribonuclease and leaf ribonuclease, the RNA becomes first
Nucleosid-2'3'-cyclophosphaten,wie Adenosin-2'3'-cyclophosphat (2'3'-C-AMP), Guanosin-2'3'-cyclophosphat (2',3'-C-GMP), Uridin-2'3'cyclophosphat (2'3'-C-UMP) und Cytidin-2',3'-cyclophosphat(2',3'-c-CMP)Nucleoside 2'3'-cyclophosphates, such as Adenosine 2'3'-cyclophosphate (2'3'-C-AMP), Guanosine-2'3'-cyclophosphate (2 ', 3'-C-GMP), Uridine 2'3'cyclophosphate (2'3'-C-UMP) and Cytidine-2 ', 3'-cyclophosphate (2', 3'-c-CMP)
hydrolysiert. Diese Zwischenprodukte werden schließlich zu den entsprechenden Nucleosid-3'-phosphaten und Nucleosid-2'-phosphaten zersetzt.hydrolyzed. These intermediates eventually become the corresponding nucleoside 3'-phosphates and nucleoside-2'-phosphates decomposed.
Ferner ist es bekannt daß die Anwesenheit eines Chelatbildner bei der enzymatischen Hydrolyse von RNS die Spaltung von Nucleosid^'.S'-cyclophosphaten zu Nucleosid-2-(3')-phosphaten hemmt. Beispielsweise ist es bekannt, RNS durch kristalline Ribonuclease aus Rhizopus nivens in Gegenwart eines Chelatbildner zu Nucleosid^'.S'-cyclophosphaten zu hydrolysieren; vgl.It is also known that the presence of a chelating agent in the enzymatic hydrolysis of RNA cleavage of nucleoside ^ '. S'-cyclophosphates to nucleoside-2- (3 ') - phosphates. For example it is known to generate RNA by crystalline ribonuclease from Rhizopus nivens in the presence of a chelating agent Hydrolyze nucleoside ^ '. S'-cyclophosphates; see.
S. Mantani et aL, Agr. BioL Chem, Bd. 36, Nr. 2 (1972), S. 242 bis 248. In ähnlicher Weise erhält man beim Abbau von RNS mit kristalliner Ribonuclease gemäß R. Markham und J. D. Smith, Biochemical Journal, Bd. 52 (1952), S. 52, größere Mengen an cyclischen Pyrimidinnudeotiden und Spurenmengen an cyclischer Guanyl- und Adenylsäurc. Jedoch ist die Verwendung von hochgereinigter Ribonuclease bei der Hydrolyse von RNS nicht zweckmäßig, da zu ihrer HerstellungS. Mantani et aL, Agr. BioL Chem, Vol. 36, No. 2 (1972), pp. 242 to 248. Similarly, when RNA is broken down with crystalline ribonuclease according to R. Markham and J.D. Smith, Biochemical Journal, Vol. 52 (1952), p. 52, larger amounts of cyclic pyrimidine nucleotides and trace amounts of cyclic guanyl and adenylic acid c. However, the use of highly purified ribonuclease in the hydrolysis of RNA not suitable for its production
ίο komplizierte Verfahrensschritte notwendig sind; bei Verwendung von nur teilweise gereinigter Ribonuclease bilden sich jedoch im Reaktionsgemisch zusätzlich zu den gewünschten Produkten eine Reihe von Nebenprodukten.ίο complicated procedural steps are necessary; at However, the use of only partially purified ribonuclease also forms in the reaction mixture a number of by-products in the desired products.
durchführen läßtcan be carried out
Einwirkung von intakten Mikroorganismenzelien von bestimmten Stämmen in Gegenwart eines Chelatbildners auf RNS in hohen Ausbeuten Nucleosid-2'3'-cyclophosphate ohne nennenswerte Bildung von Nebenprodukten als Hydrolyseprodukte entstehen.Exposure to intact cells of microorganisms certain strains are formed in the presence of a chelating agent on RNA in high yields of nucleoside-2'3'-cyclophosphates without significant formation of by-products as hydrolysis products.
Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentansprüchen definiertThe subject matter of the invention is defined in the claims
Werden unter Bedingungen, die denen des erfindungsgemäßen Verfahrens entsprechen, zur Hydrolyse von RNS an Stelle von intakten Zellen von z. B.Are under conditions which correspond to those of the process according to the invention, for hydrolysis of RNA instead of intact cells from e.g. B.
Escherichia coli durch Ultraschallbehandlung aufgebrochene Escherichia coli-Zellen eingesetzt so bildet sich eine Vielzahl von Abbauprodukten.Escherichia coli Escherichia coli cells broken open by ultrasound treatment are used in this way a variety of breakdown products.
Es wird angenommen, daß in der Reaktionsmischung, die die aufgebrochenen Zellen enthält, zahlreicheIt is believed that in the reaction mixture containing the ruptured cells, numerous
r> verschiedene Enzyme vorhanden sind, die sowohl auf die RNS als auch auf J ren Abbauprodukte einwirken. Demgegenüber wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die RNS durch die Wirkung einer Ribonuclease hydrolysiert die an der Oberfläche derr> different enzymes are present that act on both the RNA as well as J ren degradation products act. In contrast, according to the invention Process the RNA through the action of a ribonuclease which hydrolyzes on the surface of the
keine weiteren Enzyme befinden, die den Abbau vonthere are no other enzymes that break down
phosphate praktisch selektiv gebildet werden.phosphates are formed practically selectively.
Mikroorganismen werden nach üblichen Züchtungsverfahren für Bakterien oder Hefen gezüchtet Beispielsweise können die Mikroorganismen in einem eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und andere Nährstoffe enthaltenden NährmediumMicroorganisms are grown according to conventional breeding methods for bacteria or yeasts. For example, the microorganisms in a A nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts and other nutrients
■">() gezüchtet werden. Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate, wie Glucose und Saccharose. Organische Säuren, Alkohole und Kohlenwasserstoffe können ebenfalls verwendet werden sofern der verwendete Mikroorganismus zur Assimilation dieser Kohlenstoff■ "> () are grown. Examples of carbon sources are Carbohydrates such as glucose and sucrose. Organic acids, alcohols and hydrocarbons can can also be used provided the microorganism used to assimilate this carbon quellen befähigt ist Beispiele für Stickstoffquellen sind organische und anorganische Stickstoffverbindungen, sowie natürliche organische Substanzen, wie Pepton, Maisquellwasser und Hefeextrakt Ferner kann das Nährmedium mit Phosphaten, wie Kaliumdihydrogen-sources of nitrogen are examples of nitrogen sources organic and inorganic nitrogen compounds, as well as natural organic substances such as peptone, Corn steep water and yeast extract Furthermore, the nutrient medium with phosphates, such as potassium dihydrogen
w) phosphat und Dikaliumhydrogenphosphat bis zur angegebenen Konzentration und Metallsalzen, wie Magnesiumsulfat versetzt werden.w) phosphate and dipotassium hydrogen phosphate up to the specified concentration and metal salts, such as Magnesium sulfate are added.
Die Züchtungsbedingungen werden je nach dem verwendeten Mikroorganismus ausgewählt Nach been-The cultivation conditions are selected depending on the microorganism used.
hs deter Züchtung werden die Zellen durch Zentrifugation von der Gärmaische abgetrennt.The cells are cultivated by centrifugation separated from the fermentation mash.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen RNS-Hydrolyseverfahrens werden die Zellen in einem wäßrigenTo carry out the RNA hydrolysis process according to the invention, the cells are in an aqueous
Medium in einer Konzentration von 10 bis 40 mg/ml, vorzugsweise etwa 20 mg/ml, bezogen auf das Trockengewicht der Zellen, suspendiert Die Suspension wird mit RNS und einem Chelatbildner versetztMedium at a concentration of 10 to 40 mg / ml, preferably about 20 mg / ml, based on the dry weight of the cells, suspended. The suspension is mixed with RNA and a chelating agent
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete RNS wird nach üblichen Verfahren gewonnen und stammt im allgemeinen aus Mikroorganismen. Zur Hydrolyse wird sie in einer Menge von 1 bis 40 mg/ml, vorzugsweise 10 bis 20 mg/ml verwendetThe one used in the method of the invention RNA is obtained by conventional methods and generally comes from microorganisms. To the For hydrolysis, it is used in an amount of 1 to 40 mg / ml, preferably 10 to 20 mg / ml
Die Chelatbildner werden im erfindungsgemäBen Verfahren in einer Konzentration von 5 bis 30 millimolar, vorzugsweise 10 bis 30 millimolar eingesetztThe chelating agents are used in the process according to the invention in a concentration of 5 to 30 millimolar, preferably 10 to 30 millimolar used
Im allgemeinen wird die Reaktion 1 bis % Stunden, vorzugsweise 24 bis 48 Stunden, bei Temperaturen von 35 bis 45°Q vorzugsweise 38 bis 420C, durchgeführt Während der Umsetzung wird <.'«· pH-Wert im Bereich von 4 bis 9 gehalten.Generally, the reaction 1% hours, preferably 24 to 48 hours, preferably at temperatures of 35 to 45 ° Q 38 to 42 0 C, carried out during the reaction. '''· PH value in the range 4-9 held.
Wenn im Reaktionsaisiyin Ph<-' ^ ionen vorhanden sind, bilden sich neo». Nucleoüdi, -eyclophosphaten auch Nucleosid-J.S'-cydophosphate Her folgende Versuch zeigt, wie im erfindungsgerr 5en Verfahren die Menge an N;ioeosid-2',3'-cycIophospha ten durch die Konzentration der Phosphationen im Reaktionsmedium beeinfluB?. wird.If Ph ions are present in the reaction aisiyin, neo are formed. Nucleoüdi, -eyclophosphaten also nucleoside-J.S'-cydophosphate Her following experiment shows how in erfindungsgerr 5en Method the amount of N; ioeoside-2 ', 3'-cyclophospha influenced by the concentration of phosphate ions in the reaction medium. will.
Escherichia coli ATCC 1079« wird in 50 ml eines 30 mg/ml Glucose, 6 mg/ml Hefeextrakt, 8,5 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat, 11 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und 0,25 mg/ml Magnesiumsulfat enthaltenden Puffers vom pH-Wert 6,8 16 Stunden bei 380C in einem 3 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben gezüchtet Nach beendeter Züchtung werde» die Zellen durch Zentrifugieren von der Gärmaische abgetrennt Anschließend werden 23 g (Trockengewicht) dieser Zellen in jeweils 100 ml Wasser, 0,10 m, 0,15 m, 0,16 m, 0,17 m und 0,3 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 suspendiert Die Suspensionen werden mit <V> g RNS und 292 mg Äthylendiamintetraessigsäure versetzt und 48 Stunden bei 40° C zur Umsetzung gebracht Anschließend wird die Menge der gebildeten Nucleosid-2',3 -cydophosphate und der Nucleosid-3'4'cyclophosphaie benimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.Escherichia coli ATCC 1079 «is dissolved in 50 ml of a buffer containing 30 mg / ml glucose, 6 mg / ml yeast extract, 8.5 mg / ml potassium dihydrogen phosphate, 11 mg / ml dipotassium hydrogen phosphate and 0.25 mg / ml magnesium sulfate with a pH value of 6 , 8 cultivated for 16 hours at 38 ° C. in a 3 liter Erlenmeyer flask. After cultivation is complete, the cells are separated from the fermentation mash by centrifugation. 0.15 m, 0.16 m, 0.17 m and 0.3 m phosphate buffer with a pH of 7.5 suspended. <V> g RNA and 292 mg ethylenediaminetetraacetic acid are added to the suspensions and at 40 ° C. for 48 hours The amount of nucleoside-2 ', 3 -cydophosphate and nucleoside-3'4'cyclophosphaie formed is then determined. The results are shown in Table I.
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß die RNS in Abwesenheit von Phosphationen selektiv zu Nucleosid-2',3'-cyclophosphaten hydrolysiert wird. Bei steigender Phosphationenkonzentration nimmt die Bildung von Nucleosid-2'3'-cydophosphaten ab, während die Menge der gebildeten Nucleosid-S'^'-cyclophosphate zunimmt. Bei einer Phosphationenkonzentration von 0,17 m oder mehr wird die RNS praktisch selektiv zu NucIeosid-S'.S'-cyclophosphaten hydrolysiert.The above results show that the RNA is selectively hydrolyzed to nucleoside-2 ', 3'-cyclophosphates in the absence of phosphate ions. With increasing In the phosphate ion concentration, the formation of nucleoside-2'3'-cyclophosphates decreases, while the amount of nucleoside-S '^' -cyclophosphates increases. At a phosphate ion concentration of 0.17 m or more, the RNA is hydrolyzed practically selectively to nucleoside-S'.S'-cyclophosphates.
Man erhält also nach dem erfindungsgemäBen Verfahren bei Phosphationenkonzentrationen im Reaktionsmedium von 0 bis 0,15 m Reaktioa-produkte. die hauptsächlich aus Nudeosidr^'-cydophosphaten bestehen.The process according to the invention thus gives reaction products at phosphate ion concentrations in the reaction medium of from 0 to 0.15 m. the consist mainly of Nudeosidr ^ '- cydophosphaten.
Bei einer Konzentration von 0,15 m bis 0,17 m werden praktisch gleichviel 2*3'- und 3',5'-Cydophosphate gebildetAt a concentration of 0.15 m to 0.17 m practically the same number of 2 * 3'- and 3 ', 5'-Cydophosphate educated
Für die selektive Bildung von Nudeosid-2'3'-cvck>-Ui phosphaten wird der pH-Wert vorzugsweise bei etwa 5 gehalten.For the selective formation of Nudeoside-2'3'-cvck> -Ui phosphates, the pH is preferably about 5 held.
Geeignete wäßrige Reaktionsmedien sind verschiedene Pufferlösungen, wie Acetatpuffer.Suitable aqueous reaction media are various buffer solutions, such as acetate buffers.
Nach beendeter Umsetzung werden die Reaktions-ϊ produkte isoliert und nach üblichen Verfahren gereinigt Zunächst werden die Zellen aus dem Reaktionsgemisch durch Abfiltrieren entfernt Das zellfreie Fiitrat wird der Adsorption an Aktivkohle oder einem synthetischen Adsorptionsmittel unterworfen und anschließend mitAfter the reaction has ended, the reaction products are isolated and purified by customary methods First, the cells are removed from the reaction mixture by filtration. The cell-free filtrate becomes the Subjected to adsorption on activated carbon or a synthetic adsorbent and then with alkalischem, wäßrigem Methanol oder einem Gemisch aus Aceton und Wasser eluiert Das Eluat wird eingeengt und an einem Anionenaustauscherharz (C) ~-Form) adsorbiert Anschließend wird mit einer neutralen Salzlösung, beispielsweise eintr wäßrigenalkaline, aqueous methanol or a mixture of acetone and water. The eluate is eluted concentrated and adsorbed on an anion exchange resin (C) ~ form) neutral saline solution, for example antr aqueous Ammoniumhydrogencarbonatlösung eluiert Durch Gefriertrocknung oder Kristallisation erhält man aus dem Eluat ein Gemisch aus Nucleosic-2'3'-cyclophosphaten, das 2'3'-c-AMP, 2'3' c-GMP, 2'3'-c-UMP und 2\3'-c-CMP enthältAmmonium hydrogen carbonate solution eluted by freeze drying or crystallization is obtained from the Eluate a mixture of nucleosic-2'3'-cyclophosphates, which contains 2'3'-c-AMP, 2'3'-c-GMP, 2'3'-c-UMP and 2 \ 3'-c-CMP
κι Wenn als Reaktionsprodukt ein Gemisch ausκι If the reaction product is a mixture of
clophosphaten erhalten wird, kaivn dieses leichtclophosphates is obtained, this kaivn easily aufgetrennt werden.be separated.
r> Säure, wie Salzsäure oder Phosphorsäure, auf einen pH-Wert von 3,5 bis 4,0 eingestellt Nach dem Einengen des Filtrates fallen die Nucleosid-S'^'-cyclophosphate aus. Nach dem Abtrennen der NucIeosid-S'^'-cyclophosphate durch Filtrieren werden die 2'3'-Cyclophosphater> acid, such as hydrochloric acid or phosphoric acid, to one pH adjusted from 3.5 to 4.0. After the filtrate has been concentrated, the nucleoside-S '^' - cyclophosphates fall the end. After the nucleoside-S '^' -cyclophosphates have been separated off by filtration, the 2'3'-cyclophosphates are
4(i aus dem Fiitrat erhalten. Die auf diese Weise erhaltenen 2'3'-Cyclopho.,phate können auf die vorstehend beschriebene Weise gereinigt werden.4 (i obtained from the filtrate. The obtained in this way 2'3'-Cyclophophates can be purified in the manner described above.
Die erhaltenen 2'3'-Cyclophosphate lassen sich leicht nach bekannten Verfahren in die einzelnen Komponen-The obtained 2'3'-cyclophosphates can be easily according to known processes into the individual components
4i ten auftrennen. Beispielsweise wird ein Gemisch aus 2'3'-Cyclophosphaten auf eine mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz (Cl -Form) beschickte Säule gegeben. Die Elution wird stufenweise unter Verwendung von 0,1 bis 1,0 m Lösungen neutraler Salze,Separate 4i th. For example, a mixture of 2'3'-Cyclophosphaten on a loaded with a strongly basic anion exchange resin (Cl form) Pillar given. The elution is carried out in stages using 0.1 to 1.0 m solutions of neutral salts,
-χι wie Ammoniumhydrogencarbonat, durchgeführt Durch wiederholte Säulenchtcmatographie lassen sich die 2',3'-Cyclophosphate in dit einzelnen Komponenten auftrennen. Die Beispiele erläutern die Erfindung.-χι such as ammonium hydrogen carbonate, carried out by repeated column chromatography reveals the 2 ', 3'-cyclophosphates in the individual components cut open. The examples illustrate the invention.
Escherichia coli ATCC 10798 wird in 500 ml eines 30 mg/ml Glucose, 6 mg/ml Hefeextrakt, 8,5 mg/ml Kaliumdihydrogenphüsphat, 11 mg/ml Dikaliumhydro-Escherichia coli ATCC 10798 is made in 500 ml of a 30 mg / ml glucose, 6 mg / ml yeast extract, 8.5 mg / ml Potassium dihydrogen phosphate, 11 mg / ml dipotassium hydrogen
h,i genphosphat und 0,25 mg/ml Magnesiumsulfat enthaltenden Puffers vom pH-Wert 6,8 16 Stunden bei 38°C in einem 3 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben gezüchtet. Anschließend werden die Zellen durch Abzentrifugieren von der Gärmaische abgetrennt.h, i gene phosphate and 0.25 mg / ml magnesium sulfate-containing buffer with a pH value of 6.8 16 hours at 38 ° C in cultured in a 3 liter Erlenmeyer flask. The cells are then centrifuged off separated from the fermentation mash.
hi Sodann werden 4 g (in sämtlichen Beispielen beziehen sich die Gewichtsangaben der Zellen auf das TrocKengewicht) Zellen in 200 m! Wasser suspendiert. Die Suspension wird mit 3 g RNS und 876 mghi Then 4 g (in all examples the weights of the cells refer to the Dry weight) cells in 200 m! Suspended in water. The suspension is made with 3 g of RNA and 876 mg
Äthylendiamintetraessigsäure versetzt Das Gemisch wird 48 Stunden bei 40° C umgesetzt Nach der Umsetzung haben sich im Reaktionsgemisch 14 mg/ml eines Gemisches aus Nucleosid-2'3'-cyelophosphaten gebildetEthylenediaminetetraacetic acid added. The mixture is reacted for 48 hours at 40 ° C Implementation have 14 mg / ml of a mixture of nucleoside-2'3'-cyelophosphates in the reaction mixture educated
Die Zellen werden vom Reaktionsgemisch abfiltriert und das Fdtrat wird über eine mit einem stark basischen Anionenaustauscher (CI--Form) beschichte Säule gegeben. Die Ehition wird mit einer wäßrigen Ammoniumhydrogencarbonatlösung durchgeführt Das Eluat wird eingeengt und gefriergetrocknet Man erhält ifi g eines pulverförmiger! Gemisches aus Nucleosid-2'3'-cyclopnosphaten von 90prozentiger Reinheit, das 2'3'-c- AMP, 2'3'-C-GMP, 2'3'-C-UMP und 2'3'-C-CMP enthält The cells are filtered off from the reaction mixture and the filtrate is passed through a column coated with a strongly basic anion exchanger (CI form). The heating is carried out with an aqueous ammonium hydrogen carbonate solution. The eluate is concentrated and freeze-dried. Ifi g of a powdery! Mixture of nucleoside 2'3'-cyclopnosphates of 90 percent purity, the 2'3'-c- AMP, 2'3'-C-GMP, 2'3'-C-UMP and 2'3'-C-CMP contains
23 g der gemäß Beispiel 1 erhaltenen Zellen von Escherichia coli ATCC 10798 werden in :00 ml Wasser suspendiert Die Suspension wird mit 1 g RNS und 519 mg Cyclohexandiamintetraessigsäure versetzt Das Gemisch wird sodann 48 Siunden bei 40° C umgesetzt Nach beendeter Reaktion erhält man 6,2 mg/ml eines Gemisches aus Nucleosid-2'3'-cyclophosphaten im Reaktionsmedium.23 g of the Escherichia coli ATCC 10798 cells obtained according to Example 1 are dissolved in: 00 ml of water suspended 1 g of RNA and 519 mg of cyclohexanediaminetetraacetic acid are added to the suspension The mixture is then reacted for 48 hours at 40 ° C. After the reaction has ended, 6.2 mg / ml of one is obtained Mixture of nucleoside-2'3'-cyclophosphates in the reaction medium.
Escherichia coli ATCC 10798 wird in 500 ml eines 30 mg/ml Glucose, 50 mg/ml Maisquellwasser, 83 mg/ml Kaliumdihydrogenphosphat, 11 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und 0,25 mg/ml Magnesiumsulfat enthaltenden Nährmediums vom pH-Wert 63 16 Stunden bei 38°C in einem 3 Liter fassenden Erlenmeyer-Kolben gezüchtet AnschlieBend werden die Zellen durch Zentrifugieren abgetrenntEscherichia coli ATCC 10798 is dissolved in 500 ml of a 30 mg / ml glucose, 50 mg / ml corn steep liquor, 83 mg / ml potassium dihydrogen phosphate, 11 mg / ml dipotassium hydrogen phosphate and nutrient medium containing 0.25 mg / ml magnesium sulphate with a pH of 63 16 Cultured for hours at 38 ° C in a 3 liter Erlenmeyer flask the cells separated by centrifugation
Sodann werden 2g der Zellen in 100ml "/asser suspendiert Die Suspension wird mit 13 g RWS und 500 mg Hydroxyäthylendiamintriessigsäure versetzt. Nach beendeter Reaktion erhält man im Realt ei fmsrrtdium ein Gemiscn aus 9,7 mg/ml eines Gemis< 'es a is Nucleosid^^'-cyclophosphaten.Then 2g of the cells in 100ml "/ water suspended 13 g of RWS and 500 mg of hydroxyethylenediamine triacetic acid are added to the suspension. After the reaction has ended, realt ei fmsrrtdium is obtained a mixture of 9.7 mg / ml of a Gemis a is Nucleoside ^^ '- cyclophosphates.
Aerobacter aerogenes, IAM 1133, ATCC 832^' wird in 500 ml eines i0 mg/ml Glucose, !0 mg/ml ivlaisquellwasser, 83 mg/ml K.ä!iumdihydrogenpiiosphat, 11 mg/ml Dikaliumhydrogenphosphat und 0 2:5 mg/ml Magnesiumsulfat enthaltenden Nährmediums vom pH-Wert 6,8 8 Stunden bei 28°C in einem 3 Liter fassenden Erlcnmeyer-Kolben gezüchtet. Nach der Züchtung werden die Zellen abzentrifugiertAerobacter aerogenes, IAM 1133, ATCC 832 ^ 'is in 500 ml of a 10 mg / ml glucose,! 0 mg / ml ivlais spring water, 83 mg / ml K.ä! Iumdihydrogenpiiosphat, 11 mg / ml dipotassium hydrogen phosphate and 0 2: 5 mg / ml Nutrient medium containing magnesium sulfate with a pH of 6.8 8 hours at 28 ° C in a 3 liter Erlcnmeyer flasks with a capacity. After During cultivation, the cells are centrifuged off
73 g der so erhaltenen Zeilen werden hi 300 ml 0,05 m Acetatpuffer vom pH-Wert 53 suspendiert Die Suspension wird mit 3 g RNS und 1752 mg Äthylendiamintetraessigsäure versetzt Das Gemisch wird sodann 24 Stunden bei 40° C umgesetzt Nach beendeter Reaktion erhält man im Reaktionsgemisch 5,6 mg/ml eines Gemisches aus Nucleosid^^'-cyclophosphaten.73 g of the lines obtained in this way become 300 ml 0.05 m Acetate buffer of pH 53 suspended. The suspension is mixed with 3 g of RNA and 1752 mg of ethylenediaminetetraacetic acid The mixture is then reacted for 24 hours at 40 ° C. After the reaction has ended, 5.6 mg / ml are obtained in the reaction mixture a mixture of nucleoside ^^ '- cyclophosphates.
Die Zellen werden aus dem Reaktionsgemisch abfiltriert, und das Filtrat wird an einem KunstharzThe cells are filtered off from the reaction mixture, and the filtrate is attached to a synthetic resin
ίο adsorbiert Die Elution wird mit einem Gemisch aus Aceton und Ammoniaklösung durchgeführt Das Eluat wird eingeengt und anschlieBend mit Wasser verdünnt Die verdünnte Lösung wird über eine mit einem stark basischen Anionenaustauscher (Cl "-Form) beschickteίο adsorbed The elution is made with a mixture Acetone and ammonia solution carried out. The eluate is concentrated and then diluted with water The diluted solution is fed through a strongly basic anion exchanger (Cl "form)
is Säule gegeben. Die Elution wird mit einer wäßrigen Atnmoniumhydrogencarbonatlösung durchgeführt Das Eluat wird eingeengt und gefriergetrocknet Man erhält 0,7 g eines pulverförmigen Gemisches aus Nucleosid-2'3'-cyclophosphaten von 85prozentiger Reinheitis given column. Elution is with an aqueous Ammonium hydrogen carbonate solution carried out. The eluate is concentrated and freeze-dried. This gives 0.7 g of a powdery mixture of nucleoside-2'3'-cyclophosphates of 85 percent purity
Salmonella typhosa TCC 9992 wird in 500 ml eines Nährmediums der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1 16 Stunden bei 28° C in einem 3 LiterSalmonella typhosa TCC 9992 is dissolved in 500 ml of a nutrient medium of the same composition as in Example 1 16 hours at 28 ° C in a 3 liter
r> fassenden Erienmeyer-Kolben gezüchtet Anschließend werden die Zellen abzentrifugiertThe cells are then centrifuged off
1,8 g der so erhaltenen Zellen werden in 100 ml 0,05 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,8 suspendiert. Die Suspension wird mit 1 g RNS und 438 mg Äthylendi-1.8 g of the cells obtained in this way are in 100 ml 0.05 m Phosphate buffer suspended at pH 6.8. The suspension is mixed with 1 g of RNA and 438 mg of ethylenedi-
)<i amintetraessigsäure versetzt Das Gemisch wird 15 Stunden bei 40° C umgesetzt Es bilden sich 63 mg/ml eines Gemisches aus Nucleosid^'ß'-cyclophosphaten.) <i amine tetraacetic acid added Reacted for hours at 40 ° C. 63 mg / ml of a mixture of nucleoside ^ 'ß'-cyclophosphates are formed.
Sodann wird das Reaktionsgemisch gemäß Beispiel 4 aufgearbeitet Man erhält 170 mg eines pulverförmigenThe reaction mixture is then worked up as in Example 4. 170 mg of a powdery product are obtained
r> Gemisches aus 2'3'-Cyclophosphaten von 82prozentiger Reinheitr> Mixture of 2'3'-cyclophosphates from 82 percent purity
Pseudomonas aeruginosa ATCC 15246 wird gemäßPseudomonas aeruginosa ATCC 15246 is according to
4(i Beispiel 1 gezüchtet Nach dem Züchten werden die Zellen abzentrifugiert. 23 g der so erhaltenen Zellen werden in 100 ml 0,05 m Acetatpuffer vom pH-Wert 5,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 13 g RNS und 584 mg Äthylendiamintetraessigsäure versetzt. Das4 (i Example 1 bred After growing, the Cells centrifuged off. 23 g of the cells obtained in this way are dissolved in 100 ml of 0.05 M acetate buffer with a pH of 5.0 suspended. 13 g of RNA and 584 mg of ethylenediaminetetraacetic acid are added to the suspension. That
4-, Gemisch wird 43 Stunden bei 38° C umgesetzt. Man erhält 9 mg/ml eines Gemisches aus Nucleosid-2',3'-cyclophosphaten. 4-, mixture is reacted at 38 ° C. for 43 hours. Man receives 9 mg / ml of a mixture of nucleoside-2 ', 3'-cyclophosphates.
Das Reaktionsgemisch wird gemäß Beispiel 4 aufgearbeitet. Man erhält 144 mg eines pulverförmigen Vi Gemisches aus Nucleosid^^'-cyclophosphaten von 78prozentiger Reinheit.The reaction mixture is worked up as in Example 4. 144 mg of a powdery one are obtained Vi mixture of nucleoside ^^ '- cyclophosphates of 78 percent purity.
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