DE2454105B2

DE2454105B2 - Vorrichtung zur isotachophoretischen trennung

Info

Publication number: DE2454105B2
Application number: DE19742454105
Authority: DE
Priority date: 1973-11-14
Filing date: 1974-11-14
Publication date: 1976-05-13
Also published as: JPS5653695B2; US3948753A; DE2454105A1; SE7315417L; FR2250993A1; GB1475200A; JPS5081397A; FR2250993B1; SE386742B

Description

Scnärfe der Probenkomponentenzonen, wie diese in der Säule nach vollendeter Trennung vorliegen, könnte nur mit großer Schwierigkeit erzielt werden und der Nachweis bei präparativer Trennung wird gewöhnlich nach einer Eluierung der Probenkomponenten durchgeführt und zwar mit der genannten Verminderung der Trennschärfe. Die Eluierung einer Makrosäule wird erschwert durch die Anwesenheit der Stabilisierungsmedien, beispielsweise Gel, welches in solchen Säulen bei Trennungen verwendet wird.

Verbesserte Schärfe der Abtrennung nach der Eluierung aus einer Makrosäule könnte mittels einer Säule erzielt werden, wo die unterschiedlichen Probekomponenten, durch das elektrische Feld beeinflußt, zu dem einen Ende der Säule wandern und dann, in richtiger Weise durch das elektrische Feld noch beeinflußt, aus der Säule eluiert werden. Eine solche Vorrichtung ist in der deutschen Patentschrift 2101 885 beschrieben. Diese Vorrichtung ist für Proben im Makromaßstab vorgesehen.

Es ist jedoch wünschenswert, auch sehr kleine Probememgen präparativ abzutrennen. Eine Vorrichtung zur präparativen isotachophoretischen Trennung im Mikromaßstab, d. h. unter Benutzung einer Kapillarsäule, ist nicht bekannt.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung einer Vorrichtung der eingangs genannten Art, mittels welcher isotachophoretische Trennung präparativ im Mikromaßstab vollzogen werden kann. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß ein Abzweigrohr in unmittelbarer Nähe des Anzeigers von der Säule abgezweigt und daß am äußeren Ende des Abzweigrohres, welches mit einem Deckel verschließbar ist, e^:ne Aufnahmevorrichtung für die Probezonen vorgesehen ist.

Vorteilhaft ist bei der Erfindung, daß man in kurzen Trennzeiten Trennungen mit hoher Schärfe erzielt. Die getrennten Probenkomponentenzonen können schon vor dem Eluieren mit großer Schärfe nachgewiesen werden.

Eine Weiterbildung der Erfindung besteht darin, daß die Aufnahmevorrichtung einen mit einer bestimmten Geschwindigkeit am äußeren Ende des Abzweigrohres vorbtiführbaren Träger aufweist, wobei ein Luftspalt zwischen dem Rohrende und dem Träger vorgesehen ist. Ferner kann der Träger aus einem Filterpapierstreifen bestehen.

In der Zeichnung ist ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung dargestellt. An Hand dieser Zeichnung soll die Erfindung noch näher erläutert werden. Es zeigt

F i g. 1 a und 1 b schematisch das Prinzip der Isotachoporese und

Fig.2 schematisch eine bevorzugte Ausführungsform.

In den Fig. la und 1 b bezeichnet die Bezugszahl 1 eine Säule, in welche eine Anode 2 und eine Kathode 3 eingeführt sind. In Fig. la wird die Probe, welche getrennt werden soll, in denjenigen Teil der Säule eingeführt, welcher mit 5 bezeichnet ist. Diese Probe weist Salze mit drei unterschiedlichen AnionenC,-, C₂- uüd C,~ auf, wobei angenommen wird, daß C₁" eine größere Beweglichkeit besitzt als G,", von welchem wiederum angenommen wird, daß dieses eine größere Beweglichkeit als C₃ ^-besitzt. Der Teil der Säule, welcher mit L bezeichnet ist, wird mit dem oben erwähnten Leitelektrolyten eefüllL welcher das Anion A^- aufweist, welches größere Beweglichkeit besitzt als alle Anionen der Probe. Der Teil T der Säule, weicher der Kathode zugewandt ist, ist mit einem Endelektrolyten gefüllt, der ein Anion B~ enthält, welches eine Beweglichkeit besitzt, die geringer ist als alle interessierenden Anionen in der Probe. In L befinden sich Kationen, ein sogenanntes Gegenion R⁺, welches zweckmäßig Puffereigenschaften besitzen sollte. Wenn eine Gleichspannung an die Elektroden 2 und 3 angelegt ίο wird, so wandern die Kationen nach der Kathode 3 hin und bilden ein gemeinsames Kation für alle Anionen, während die Anionen zur Anode 2 hinwandern. Als Folge der unterschiedlichen Beweglichkeit der Anionen steigert sich dann stufen- und zonenweise die elektrische Feldstärke über die Zonen L, S bzw. T hinweg. Dies führt jedoch dazu, daß die Anionert in der Zone 5 gemäß ihrer Beweglichkeit getrennt werden, so daß die Ionen C₁", weiche die größere Beweglichkeit besitzen, eine Zone bilden, die dem Leitelektrolyten am nächsten ist, worauf eine Zone aus C₂" und schließlich eine Zone aus C₃ ^-folgt, welch letztere dem Endelektrolyten am nächsten ist (s. Fig. 1 b). Natürlich ergeben sich entsprechende Bedingungen bei der Trennung der Kationen.
^a5 In F i g. 2 bezeichnet die Bezugsziffer 4 eine Säule aus einem Kapillarrohr, in welchem die Trennung ausgeführt wird. Die Bezugszahl 5 bezeichnet die eine Elektrode, welche sich in einem Elektrodengefäß 6 befindet, welches mit einem Leitelektrolyten gefüllt ist. Es sei angenommen, daß die Wanderung, welche die Trennung vollzieht, in Richtung des Pfeiles erfolgt. Die Bezugszahl 7 bezeichnet die andere Elektrode, welche in einem Elektrodengefäß 8 enthalten ist, welches den Endelektrolyten enthält. Derjenige Teil der Säule, welcher sich zwischen der Probe und dem Elektrodengefäß 6 befindet, enthält den Leitelektrolyten, während jener Teil der Säule, welcher sich zwischen der Probe und dem Elektrodengefäß 8 befindet, den Endelektrolyten enthält. Die Säule ist gegen die Elektrodengefäße durch semipermeable Membranen 9 bzw. 10 abgegrenzt. Die Elektroden 5 und 7 sind mit einer in der Zeichnung nicht gezeigten Spannungsquelle verbunden. Die Bezugszahl 11 bezeichnet einen Kühlmantel, welcher einen Kühlkanal 12 bildet, der die Säule umschließt. Der Kühlkanal 12 enthält ein fließfähiges Kühlmedium. Die Bezugzahl 13 bezeichnet eine Lichtwegvorrichtung mit einem Lichtweg 14, der die Säule von einer in der Zeichnung nicht gezeigten Lichtquelle her, welche auf der einen Seite des Kühlmantels gelagert ist, zu einem ebenfalls in der Zeichnung nicht gezeigten fotometrischen Anzeiger, der auf der anderen Seite des Kühlmantels gelagert ist, durchquert. In unmittelbarer Nähe des Lichtweges zweigt von der Säule ein Abzweigrohr 15 ab. Das Abzweigrohr ist durch einen Zylinder 16 aus Plexiglas od. dgl. mechanisch stabilisiert, wobei der Zylindei durch die öffnung 17 des Kühlmantels 11 hindurch geführt ist. Zwischen dem Kühlmantel und dem Zylinder ist eine Dichtung 18 angebracht. An demjenigen Teil der Säule, welcher sich zwischen dem Lichtweg 14 und dem Elektrodengefäß 6 befindet, ist eine Pumpe 19 angeordnet. An demjenigen Teil der Säule, welcher sich zwischen dem Anzeiger und dem Elektrolytgefäß 8 befindet, ist eine Probeneinspritzvorrichtung 20 angeordnet. Die Bezugszahl 21 bezeichnet einen Streifen Filterpapier, welcher über in der Figur nicht gezeigte Rollen läuft, wobei

dieser Streifen' eine Aufnahmevorrichtung für die erhaltenen Probenkomponenten bildet.

Bei einer präparativen isotachophoretischen Trennung wird das Probengemisch in die Säule mit der Probeneinspritzvorrichtung 20 eingeführt, welche als Scheidewand ausgebildet sein kann, die durch eine Injektionsspritze durchstoßen wird. Dann wird der Leitelektrolyt in die Säule zwischen der Probe und der Membrane 9, sowie der Endelektrolyt zwischen der Probe und der Membrane 10 eingeführt werden. Das äußere Ende des Abzweigrohres 15 wird dann durch einen Deckel geschlossen, welcher in der Zeichnung nicht gezeigt ist. An die Elektroden 5 und 7 wird Spannung angelegt und die Probenkomponenten wandern isotachophoretisch in Richtung auf die Lichtwegvorrichtung 13 zu. Wenn der zur Verfügung stehende Wanderungsabstand zu kurz ist, so kann die Trennung mittels eines Gegenstromes vollzogen werden, welcher durch die Pumpe 19 gemäß der deutschen Patentschrift 21 27 391 erzeugt wird. Bevor die Probenzonen den Anzeiger passiert haben, wird der Deckel des Abzweigrohres 15 abgehoben und die Pumpe 19 beim Transport der Aufnahmevorrichtung 21 in Gang gesetzt. Unmittelbar nach dem Nachweis werden die Probertkomponentenzonen durch das Abzweigrohr 15 herausgeführt. Das Abzweigrohr besitzt einen geringeren Querschnitt als die Säule.

S Das Material, welches durch das Abzweigrohr hindurch herausgeführt wird, wird durch die Aufnahmevorrichtung 21 gesammelt, welche bevorzugt aus einem Träger besteht, der mit gegebener Geschwindigkeit am äußeren Ende des Abzweigrohres vorbeigeführt wird, wobei zwischen dem Ende des Rohres und dem Träger ein Luftspalt belassen- wird. Der Träger besteht zweckmäßig aus einem Streifen porösen Materials, beispielsweise Filterpapier, welches geeigneten Zufuhrrollen zugeliefert wird. Da isotachophoretische Bedingungen während des Austretens der Probenkomponenten vorliegen sollten, ist zwischen den Elektroden 5 und 7 Spannung angelegt, welche eine Potentialdifferenz zwischen dem Träger in der Sammelvorrichtung und dem äußeren Ende

»o des Abzweigrohres erzeugt. Bei einer bestimmten Tropfengröße, welche von der Potentialdifferenz und der Breite des Luftspaltes abhängig ist, springt der gebildete Tropfen auf den Träger über und bildet auf diesem einen kreisförmigen Fleck.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

1 2 trophoresis«, sowie in der deutschen Patentschrift Patentansprüche: 21 27 391 beschrieben. Bei einer isotachophoretischen Trennung von Ionen

1. Vorrichtung zur isotachophoretischen Tren- erzielt man eine große Trennschärfe und eine scharfe ■ung mit einer von einem Kapillarrohr gebildeten 5 Trennungslinie zwischen den Zonen, welche durch Säule, welche zwischen zwei Elektroden ange- die Ionen gebildet werden. Die Konzentration der ordnet ist, wobei die der Trennung unterworfene Ionen in den verschiedenen Probezonen ist von der Probe in der Säule zwischen einem Leit- und Beweglichkeit jedes entsprechenden Ions abhängig einem Endelektrolyten sich befindet und ein An- und demzufolge wird ein bestimmtes Ion im Verxeiger zum Nachweis unterschiedlicher Proben- "> gleich zu seiner Konzentration im anfänglichen Proronen in einer Stellung längs der Säule angeord- bengemisch im allgemeinen konzentriert. Diese spezinet ist, dadurch gekennzeichnet, daß fischen Merkmale der Isotachophorese, welche eine ein Abzweigrohr (15) in unmittelbarer Nähe des Folge der Anwesenheit des Leit- und Endelektrolyten Anzeigers von der Säule (4) abzweigt und daß am sind, machen die isotachophoretische Trennung sehr äußeren Ende des Abzweigrohres, welches mit 15 vorteilhaft im Vergleich zur allgemeinen Zoneneinem Deckel verschließbar ist, eine Aufnahme- elektrophorese, bei welcher jede Probenkomponenvorrichtung (21) für die Probenzonen vorgesehen tenzone sich verbreitert und man beim Durchführen ist. der Trennung wegen Diffusion weniger scharfe

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch ge- Grenzlinien erhält und die Konzentration jeder Prokennzeichnet, daß die Aufnahmevorrichtung (21) ao benkoir.ponenten sich während der Trennung vereinen mit einer bestimmten Geschwindigkeit am mindert. Die Vorteile der Isotachophorese sind beäußeren Ende des Abzweigrohres (15) vorbeiführ- sonders hervorragend in einer Säule, welche aus baren Träger aufweist, wobei ein Luftspalt zwi- einem Kapillarrohr besteht, in welchem stabilisieschen dem Rohrende und dem Träger vorgesehen rende Medien wie Gele nicht angewandt zu werden ist. 25 brauchen.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch ge- Bei der Durchführung einer isotachophoretischen kennzeichnet, daß der Träger aus einem Filter- Trennung ist im allgemeinen ein Anzeiger an der papierstreifen besteht. Säule angeordnet, um die erzielten Zonengrenzlinien

nachzuweisen. Ein Zweck dieses Nachweises besteht 30 in der Beurteilung, wann sich als Anzeige vollendeter

Trennung scharfe Zonengrenzlinien zwischen allen

Probezonen gebildet haben. Ein anderer Zweck eines solchen Nachweises besteht in der Führung eines in vielen Fällen gebrauchten Gegenstromes, damit die

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine 35 Zonengrenzlinie zwischen Leitungselektrolyt und ProVorrichtung zur isotachophoretischen Trennung mit bengemisch in der Säule stationär gehalten wird, wie einer von einem Kapillarrohr gebildeten Säule, welche dies in der obenerwähnten Patentschrift beschrieben zwischen zwei Elektroden angeordnet ist, wobei die ist.

der Trennung unterworfene Probe in der Säule zwi- Oft wird eine elektrophoretische Trennung, bei-

schen einem Leit- und einem Endelektrolyten sich 40 spielsweise eine isotachophoretische Trennung, für befindet und ein Anzeiger zum Nachweis unterschied- analytische Zwecke durchgeführt. Es ist dann von licher Probenzonen in einer Stellung längs der Säule Interesse, die verschiedenen in der Säule anwesenden angeordnet ist. Probezonen bis zur höchstmöglichen Schärfe bei

Eine derartige Vorrichtung ist bekannt (SW-AS Trennung und Nachweis zu studieren. Analytische 3 40 376). 45 Trennungen werden oft mit kleinstmöglichem Proben-

Bei der Isotachophorese wird eine Trennung einer volumen durchgeführt. Dies gestattet kurze Trenionisierten Probe, welche Ionen einer bestimmten nungszeit. Bei der analytischen Isotachophorese verPolarität enthält, durchgeführt. Hierzu wird die Probe wendet man zweckmäßigerweise eine obenerwähnte in eine zwischen zwei Elektroden angeordnete Säule Kapillarsäule. In einer Kapillarsäule ist ein Nachweis eingebracht. Ferner wird ein Leitelektrolyt in den- 5° bis zur großen Schärfe der Probenkomponentenzonen jenigen Teil der Säule gebracht, welcher sich zwi- relativ einfach zu erzielen, beispielsweise mittels eines sehen der Probe und der Elektrode befindet, gegen thermischen oder optischen Anzeigers, welcher an der welche die Ionen der ionisierten Probe wandern, Säule angeordnet ist.

wenn eine Spannung an d^;e Elektroden angelegt wird. In anderen Fällen wird die elektrophoretische

Dieser Leitelektrolyt enthält Ionen der gleichen PoIa- 55 Trennung zu präparativen Zwecken durchgeführt rität. jedoch mit größerer Beweglichkeit als die Probe- wenn es gewünscht wird, die unterschiedlichen Probeionen. Außerdem wird ein Endelektrolyt in denjeni- zonen nach der Abtrennung getrennt zu sammeln. Bei gen Teil der Säule eingebracht, welcher sich zwischen der Zonenelektrophorese in einer Säule wird für die der Probe und der anderen Elektrode befindet, wobei präparative Arbeit die Kolonne von ihrem Inhalt entder Endelektrolyt Ionen der erwähnten bestimmten 60 ieert, nachdem die Abtrennung vollendet und die Polarität, jedoch mit einer geringeren Beweglichkeit Elektrodenspannung abgeschaltet ist. Während des als die Probeionen aufweist. In die gesamte Säule Entleerens verbreitern sich dann die Zonen infolge wird auch eine Ionenart der entgegengesetzten PoIa- Diffusion weiter und die Grenzlinien werden unrität eingeführt, ein sogenanntes Gegenion. Das schärfer, d. h. die Schärfe der Trennung vermindert Gegenion sollte zweckmäßigerweise Puffereigen- 65 sich. Präparative Trennungen werden im allgemeinen schäften besitzen. Die Isotachophorese ist eingehend mit ziemlich großen Probenvolumina durchgeführt, beispielsweise in Analytica Chimica Acta 38 (1967), welche Makrosiiulen und relativ lange Trennzeiten his 237. unter dem Titel »Displacement elec- erfordern. Der Nachweis bis zu ziemlich guter